INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CAMPUS PIÚMA
CURSO SUPERIOR EM ENGENHARIA DE PESCA
BRUNA MORALES PARIS ROSA
POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE FUNGOS NO CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS CONTAMINANTES DO PESCADO
PIÚMA 2018
POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE FUNGOS NO CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS CONTAMINANTES DO PESCADO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Pesca.
Orientadora: Profª. Drª. Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves
PIÚMA 2018
Dados internacionais de catalogação na publicação (CIP) Bibliotecária responsável Ana Muller CRB6/ES 541
R788pRosa, Bruna Morales Paris. 1993-
Potencial antimicrobiano de fungos no controle de micro-organismos contaminantes do pescado / Bruna Morales Paris Rosa. -- 2018.
61 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves.
Monografia (graduação) - Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, Coordenadoria de Curso Superior de Engenharia de Pesca, 2018.
1. Alimentos - Microbiologia. 2. Fungos. 3. Pescados - Contaminação.
4. Pescados - Conservação. I. Gonçalves, Flávia Regina Spago de Camago. II. Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma. III. Título.
CDD: 664.001579
POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE FUNGOS NO CONTROLE DE
MICROORGANISMOS CONTAMINANTES DO PESCADO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Pesca.
Aprovada em
de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
ProP. Dra.: Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves Instituto Federal do Espírito Santo
Orientadora
ProP. MSca.: Monique Lopes Ribeiro
Instituto Federal do Espírito Santo
Profa. Dra.: Leilane Bruna Gomes dos Santos Instituto
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei
para que o melhor fosse feito. Não sou o que eu deveria ser,
mas graças a Deus, não sou o que era antes”
A minha família por todo suporte e confiança.
A minha orientadora Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves por ter aceito o
desafio de me orientar, pela confiança, por todas as oportunidades que me foram dadas
durante minha longa passagem pelo laboratório de Ecologia Microbiana, por todos
conselhos e ensinamentos que me foram transmitidos. O meu muito obrigada!
A todos meus atuais colegas de trabalho, Laura Dayrell e Savyo Veloso, e aos que já
passaram pelo laboratório e que me ajudaram a realizar os trabalhos que me foram
propostos dentro dele, em especial a Olga Emília Baungartem, Vitório Baungarten, Fillipe
Sutil, Alice Bourguignon e Ester Garcindo.
A minha grande amiga, Juliane Ribeiro Rosa, a qual é como uma grande irmã pra mim.
Obrigada pelas tantas horas ao meu lado, me ajudando e incentivando, por ser tão
companheira e prestativa. Dedico esse trabalho a você que fez com que ele fosse concluído.
Obriada por tudo amiga.
A Caroline Bindele do Nascimento, por todos esses anos ao meu lado, pela parceria e
pela torcida para que eu conquiste meus sonhos.
As minhas queridas técnicas de laboratório Suzana Bianchini e Daniella Alves e ao
André Luiz que fez um ótimo trabalho enquanto fazia parte desse Instituto, pela paciência,
pelo companheirismo, por toda vontade em ajudar, pela amizade que construímos e que
continuaremos tendo. Obrigada por todos os ensinamentos que me foram dados.
A todos os membros da banca, pela contribuição para este trabalho.
A todos os professores que tive a oportunidade de conhecer durante as disciplinas e
que contribuíram de alguma forma para minha formação.
A Fapes e ao CNPq, pelo apoio financeiro, por meio das bolsas de estudos que me foram
concedidas.
A peixaria JR, por ceder parte do pescado utilizado durante o projeto
Ao Instituto Federal do Espírito Santo pela oportunidade e todas as pessoas que fazem
parte dessa instituição.
Agradeço à Deus pela família que ganhei durante todos esses anos e que levarei para o
resto da minha vida.
e suscetíveis à deterioração e contaminação. Os conservantes, utilizados para prevenir essa deterioração, são na grande maioria compostos químicos com potencial alergênico e causadores de intoxicações de origem alimentar. Metabólitos secundários produzidos por fungos são vistos como novas ferramentas biotecnológicas capazes de substituir os antimicrobianos atualmente utilizados. Com o aumento da resistência a antimicrobianos pelas bactérias que contaminam os alimentos derivados de pescado, faz-se necessária a busca por compostos mais eficazes no controle desses micro-organismos, mas que sejam menos tóxicos. O presente trabalho teve como objetivo a busca por fungos produtores de metabólitos secundários que possam ser utilizados como conservantes naturais no controle de micro-organismos contaminantes do pescado, prolongando sua vida de prateleira. Foram realizadas coletas de folhas de três gêneros vegetais, em cinco pontos distintos, ambas na região de manguezal no município de Piúma-Es no ano de 2018. Isolou-se 29 fungos endofíticos morfologicamente diferentes. Também foram isolados neste trabalho, 5 fungos marinhos os quais foram submetidos a diversos testes de antagonismo contra contaminantes de pescado. Dos 29 endofíticos, os fungos P1FE e P5FC apresentaram melhores resultados nos testes de antagonismo in vitro contra os patógenos Staphylococcus aureus, Salmonella sp. e Escherichia coli e Vibrio
parahaemolyticus, e apenas o fungo ABD-1 isolado do polvo obteve resultados
satisfatórios no controle dos patógenos acima. Para os testes de aumento de prateleira foi utilizado o peixe da espécie Sarda sarda e os sobrenadantes da cultura dos fungos P1FE e ABD – 1, os quais apresentaram melhores resultados nos testes
in vitro. Foram utilizados 15 pedaços de 25 gramas cada, sendo: cinco pedaços para
o controle (peixe sem fungo) e cinco pedaços para cada extrato fúngico. As análises de micro-organismos contaminantes foram realizadas com 0 dias, dois dias, cinco dias, oito dias, onze dias e quatorze dias de inoculação. Os fungos testados apresentaram bons resultados quando submetidos ao teste de aumento de prateleira, confirmando o potencial dos fungos endofítcos e marinhos como produtores de compostos com atividade antimicrobiana.
ABSTRACT
Fish is one of the most perishable and susceptible to deterioration and contamination protein-rich food. Preservatives, used to prevent this deterioration, are mostly chemical compounds with allergenic potential and cause food poisoning. Secondary metabolites produced by fungi are seen as new biotechnological tools capable of replacing the currently used antimicrobials. With the increase of antimicrobial resistance by the bacteria that contaminate food derived from fish, it is necessary to search for more effective and less toxic compounds in the control of these microorganisms. The present work aim to search for fungi capable of produce secondary metabolites that can be used as natural preservatives in the control of contaminating microorganisms of the fish, prolonging their shelf life. Leaf of three plant genera were collected at five different points in the mangrove region of Piúma-ES municipality in the year 2018. Twenty-nine different morphologically endophytic fungi were isolated. Other five marine fungi were isolated from an octopus. Every fungi isolate were submitted to various tests of antagonism against fish contaminants. Of the 29 endophytes, the fungi P1FE and P5FC presented better results in the tests of antagonism in vitro against the pathogens
Staphylococcus aureus, Salmonella sp. and Escherichia coli and Vibrio parahaemolyticus, and only the ABD-1 fungus isolated from the octopus obtained
satisfactory results in the control of the above pathogens.The Sarda sarda fish and the supernatants of the fungi P1FE and ABD - 1 cultures were used for the shelf increase tests, which presented better results in the in vitro tests. Fifteen pieces of 25 grams each were used: five pieces were used as control (fish without fungus) and five pieces were used with each supernatant. Contaminant microorganism analyzes were performed with zero, with two days, five days, eight days, eleven days and fourteen days of inoculation The fungi tested showed good results when submitted to the shelf increase test, confirming the potential of endophytic and marine fungi as producers of compounds with antimicrobial activity.
Figura 1: Amostras de 25 gramas de pescado, tratadas com o sobrenadante do fungo 2 ... 31 Figura 2: Cultura de fungos endofíticos em BDA: (A) fungo P5FC (B) fungo P1FE ... 36 Figura 3: Fungo isolado de polvo: ABD–1... 37 Figura 4: Atividade antimicrobiana do fungo P1FE contra o patógeno
Staphylococcus aureus ... 38 Figura 5: Atividade antimicrobiana do fungo ABD-1, frente ao patógeno
Staphylococcus aureus ... 42 Figura 6: Caracterização morfológica utilizando microscopia ... 45 Figura 7: Quantidades de bactérias mesófilas presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 47 Figura 8: Quantidades de fungos mesófilos presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 47 Figura 9: Quantidades de bactérias psicrotróficas presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 48 Figura 10: Quantidades de fungos psicrotróficas presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 49 Figura 11: Quantidade de Staphylococcus sp. presentes no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 50 Figura 12: Gráfico com o número de Staphylococcus aureus, presente nas diferentes amostras ... 51 Figura 13: Teor de umidade (g/100g) no pescado, ao longo de 14 dias, sob refrigeração ... 52 Figura 14: Gráfico com a quantidade de Bases Nitrogenadas Voláteis Totais (mg/100g) ... 53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Capacidade de crescimento dos fungo (horas) ... 28 Tabela 2: Pontos de coleta e nomenclatura de identificação dos fungos ... 35 Tabela 3: Antagonismo, in vitro, dos isolados fúngico endofíticos, capazes de inibir, ao menos, um patógeno ... 38 Tabela 4: Antagonismo, in vitro, dos isolados fúngicos, do tegumento do polvo ... 39 Tabela 5: Atividade antimicrobiana do sobrenadante das culturas fúngicas de endófitos (cm) ... 40 Tabela 6: Atividade antimicrobiana do sobrenadante das culturas de fungos isolados do polvo (cm) ... 42 Tabela 7: Atividade antimicrobiana das frações contendo metabólitos secundários, extraídas com solventes orgânicos... 43
AN Ágar Nutriente
A Absorbância
BDA Batata Dextrose Ágar
BNV Bases nitrogenadas voláteis
BP Baird Parker Base
Cm Centímetro °C Graus Celsius EC Caldo E. coli ES Espírito Santo g Grama HCL Ácido clorídrico IMViC Citrato
LIA Ágar Lisina Ferro
LST Caldo Lauril Sulfato Triptose
mg Miligrama
MgO Óxido de magnésio
mL Mililitro
µL Microlitro
nm Nanômetro
P Peso
PCA Plate Count Agar
pH Potencial hidrogeniônico
RP Caldo Rapaport Vassiliadis
SSE Solução salina estéril (0,85% de NaCl)
TCA Ácido tricloroacético
TSI Ágar Triplice Ferro
TT Tetrationato
ufc Unidade formadora de colônia
VB Brilliant Green Agar
VB Caldo Verde Brilhante Bile 2%
VM Vermelho de Metila
VP Voges-Proskauer
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
2 OBJETIVO GERAL ... 18
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
3.1 CONSUMO E VALOR NUTRICIONAL DO PESCADO ... 19
3.2 MICRO-ORGANISMOS DETERIORADORES DO PESCADO... 19
3.2.1 Bactérias contaminantes do pescado ... 20
3.2.1.1. Staphylococcus aureus ... 20
3.2.1.2 Salmonella sp. ... 21
3.2.1.3 Escherichia coli ... 21
3.2.1.4 Vibrio parahaemolyticus ... 21
3.2.2 Controle microbiológico do pescado ... 21
3.3 MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES DE ANTIMICROBIANOS 22 3.3.1 Micro-organismos endofíticos ... 23
3.3.1.1 Fungos endofíticos e suas aplicações ... 24
3.3.2 Micro-organismos marinhos produtores de antimicrobianos 25 4 METODOLOGIA ... 27
4.1 COLETA E ISOLAMENTO DOS FUNGOS ... 27
4.1.1 Fungos endofíticos ... 27
4.1.2 Fungos marinhos ... 27
4.2. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS FUNGOS... 28
4.3 TESTE DE INIBIÇÃO IN VITRO ... 28
4.4 PADRONIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ANTIMICROBIANOS ... 29
4.5 EXTRAÇÃO DO SOBRENADANTE ... 29
4.6 CROMATOGRAFIA LÍQUIDO–LÍQUIDO ... 29
4.7 TESTES DE DIFUSÃO EM DISCO ... 29
4.8 TESTES DE CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS NO PESCADO ... 30
4.8.3 Análise de Salmonella sp. ... 31
4.8.4 Análise de Escherichia coli ... 32
4.8.4.1 Teste presuntivo ... 32
4.8.4.2 Contagem de coliformes totais ... 32
4.8.4.3 Contagem de coliformes termotolerantes ... 33
4.8.5 Análise de Staphylococcus aureus ... 33
4.9 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ... 33
4.9.1 Umidade (método gravimétrico) ... 33
4.9.2 Determinação de bases nitrogenadas voláteis (BNV) ... 34
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35
5.1 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ... 35
5.1.1 Isolamento dos fungos endofíticos ... 35
5.1.2 Isolamento dos fungos do polvo ... 36
5.2 TESTE DE INIBIÇÃO IN VITRO ... 37
5.2.1 Teste de inoculação central ... 37
5.2.1.1 Fungos endofíticos ... 37
5.2.1.2 Fungos isolados do polvo ... 39
5.2.2 Testes de difusão em poços ... 40
5.2.2.1 Fungos endofíticos ... 40
5.2.2.2 Fungos isolados do polvo ... 41
5.2.3 Teste de difusão em disco ... 43
5.2.3.1 Fungos endofíticos ... 43
5.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS FUNGOS P1FE E ABD-1 ... 45
5.4 TESTES DE CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS NO PESCADO ... 45
5.4.1 Micro-organismos mesófilos ... 46 5.4.1.1 Bactérias mesófilas ... 46 5.4.1.2 Fungos mesófilos ... 47 5.4.2 Micro-organismos psicrotróficos ... 48 5.4.2.1 Bactérias psicrotróficas ... 48 5.4.2.2 Fungos psicrotróficos ... 49 5.4.3 Análise de Salmonella ... 50
5.4.4 Análise de Escherichia coli ... 50
5.4.5 Análise de Staphylococcus sp ... 50
5.4.5.1 Staphylococcus aureus ... 51
5.5 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ... 52
5.5.1 Umidade (Método gravimétrico) ... 52
5.5.2 Determinação de bases nitrogenadas voláteis (BNV) ... 53
6 CONCLUSÃO ... 55
1 INTRODUÇÃO
O pescado é uma importante fonte de alimento, pois além de ser rico em proteínas, ele também possui aminoácidos essenciais ao crescimento e a manutenção do organismo humano (FARIAS, 2006). É um dos alimentos mais susceptíveis a deterioração, pois, possui naturalmente uma microbiota que é responsável pela auto decomposição e, por ser altamente perecível necessita de cuidados adequados desde a sua captura até chegar ao consumidor ou a indústria transformadora (ARGENTA, 2012).
Para retardar, inibir ou prevenir o processo de deterioração dos alimentos por micro-organismos são utilizadas substâncias antimicrobianas como, por exemplo, os sulfitos e os nitritos. Os sulfitos são capazes de inibir o crescimento bacteriano, já os nitritos são utilizados como aditivos em produtos cárneos contra bactérias causadoras do botulismo (Clostridium botulinum) (FARIAS, 2006).
O aumento da resistência de micro-organismos frente aos antibióticos e quimioterápicos é um dos principais motivos para a busca de novos compostos de origem natural que possuam atividade antimicrobiana (SILVA, 2004). Dentre os contaminantes do pescado destacam-se as bactérias: Aeromonas sp., Escherichia
coli, Salmonella sp., Shigella sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis (COSTA, 2009).
A produção de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana por certos micro-organismos provenientes do mangue é bem conhecida, e os fungos endofíticos têm sido considerados uma rica fonte destes compostos. (POLONI, 2014). Os fungos endofíticos são aqueles que habitam o interior dos tecidos vegetais sem causar efeitos negativou ou sintomas aparentes de doenças (VAZ, 2012). As substâncias produzidas por esses organismos possuem um grande potencial biotecnológico e são fontes para novos compostos com diversas aplicações, quando uma vez isoladas e caracterizadas, sendo principalmente utilizadas como agentes antimicrobianos (SILVA, 2002).
O ambiente marinho apresenta uma grande biodiversidade, e tem sido cenário de interesse para a descoberta de novas estruturas com diversas atividades (SENGER, 2016). Os fungos marinhos são considerados fontes promissoras de novos compostos naturais, e as substâncias produzidas por eles tem sido de grande interesse para diversos estudos (DEBBAB et al., 2010).
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Atualmente para conservação de uma variedade de alimentos utiliza-se aditivos alimentares, porém, com a resistência dos micro-organismos deterioradores a esses conservantes, faz-se necessário a busca por compostos menos tóxicos e mais eficazes, podendo utilizá-los no controle de micro-organismos patogênicos que deterioram o pescado, tornando o alimento mais seguro e com uma maior vida de prateleira.
2 OBJETIVO GERAL
Isolar fungos capazes de produzir compostos antimicrobianos que controlem micro-organismos contaminantes de pescados.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar fungos capazes de produzir compostos antimicrobianos em condições de laboratório;
Avaliar a atividade antimicrobiana desses fungos no controle de
Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Escherichia coli e Vibrio parahaemolyticus;
Padronizar as condições necessárias para uma maior produção dos antimicrobianos in vitro;
Fracionar os antimicrobianos produzidos, utilizando solventes orgânicos de polaridade crescente;
Avaliar o potencial das frações obtidas no controle dos micro-organismos citados acima e;
Testar os compostos isolados no controle dos patógenos no pescado visando aumentar a vida de prateleira.
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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 CONSUMO E VALOR NUTRICIONAL DO PESCADO
A pesca e a criação de organismos aquáticos, especialmente de peixes, continuam representando importantes setores da produção alimentícia (LOPES et al., 2016), visto que a demanda mundial por pescado tem tido um acréscimo em função do crescimento populacional (BRABO et al., 2016). A produção mundial de pescado, tem crescido nas últimas 5 décadas, e seu consumo mundial per capita aumentou de 9,9 kg nos anos 60 para 19,2 kg em 2012 (FAO, 2014), atingindo um novo recorde de aproximadamente 20 kg em 2014, graças ao crescimento da aquicultura (FAO, 2016). A OMS (Organização Mundial da Saúde) recomenda o consumo de, pelo menos,12 kg/pessoa (MINOZZO, 2011). Em termos per capita, o consumo mundial de pescado foi de 20,3 kg em 2016, e prevê-se que a tendência no consumo aumente para 21, 5 kg até 2030, em todas as regiões e sub-regiões, com um forte crescimento projetado na África, América Latina, Oceania e Ásia (FAO, 2018).
O número de pessoas que optam por consumir pescado, como alternativa de alimentação saudável, vem aumentando durante as últimas décadas (TEIXEIRA; GARCIA, 2014), visto que seu consumo reduz o risco de muitas doenças como: cansaço mental, demência e a doença de Alzheimer, além de controlar o apetite e os níveis de colesterol no sangue, ajudar a constituir um sistema imunológico mais eficaz e aumentar a longevidade (MINOZZO, 2011).
A carne do pescado é privilegiada do ponto de vista nutricional, considerada uma fonte de proteínas de alto valor biológico, constituída de muitos lipídeos e carboidratos, sendo rica em ômega 3 (ácidos graxos poli-insaturados) colaborando para prevenção de doenças cardiovasculares, aumentando a qualidade de vida dos consumidores (LINS, 2011), e apresentando todos os aminoácidos essenciais, como a lisina (SOARES; GONÇALVES, 2012), cisteína e metionina, de excelente valor biológico (SANTOS et al., 2016).
3.2 MICRO-ORGANISMOS DETERIORADORES DO PESCADO
O pescado é um alimento altamente perecível por natureza e é um dos produtos de origem animal mais suscetíveis a deterioração, devido à elevada atividade de água, alta atividade metabólica da biota microbiana que o acompanha, teor de nutrientes facilmente utilizáveis por micro-organismos (FARIAS, 2006), pH próximo da
neutralidade e rápida ação destrutiva das enzimas que se encontram em suas vísceras e seus tecidos (TARCITANO; MESQUITA, 2017).
Após a captura, o pescado sofre diversas modificações bioquímicas, as quais favorecem o crescimento e multiplicação de micro-organismos já pertencentes a sua microbiota (CAMPOS, 2009). Alguns fatores externos como a captura do pescado em águas poluídas, manuseio, transporte, e a má conservação do pescado podem contribuir para a perda de qualidade e deterioração do pescado desembarcado (MINOZZO, 2011).
As principais características da ação microbiana no pescado é a alteração no odor e sabor. Essas mudanças são causadas por contaminantes que são adquiridos pela manipulação indevida e a falta de medidas higiênicas durante o transporte e conservação desde a captura até o processo industrial (SANTIAGO et al., 2013). Segundo a legislação vigente (ANVISA, 2001), há restrições sobre a quantidade de micro-organismos no pescado que será consumido. De acordo com Campos (2009), as bactérias descritas na legislação causadoras de infecções alimentares são:
Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Escherichia coli e Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Vibrio cholerae, Aeromonas e Pseudomonas.
Carvalho (2010) ressalta que após o abate do pescado, as reações que ocorrem nos tecidos irão propiciar a produção de substâncias como aminoácidos, ribose, ureia e outros, que, em conjunto, constituem as substâncias nitrogenadas não-proteicas que serão utilizadas preferencialmente pelas bactérias influenciando na deterioração do pescado.
3.2.1 Bactérias contaminantes do pescado 3.2.1.1 Staphylococcus aureus
O micro-organismo patogênico Staphylococcus aureus é uma bactéria gram positiva e membro da família Staphylococcaceae (VASCONCELOS, 2018), que possui células esféricas, de grande importância nos surtos de infecção alimentar, podendo ser encontrada em diferentes regiões do corpo humano, como mãos, trato intestinal, garganta e faringe, os quais são vias de contaminação cruzada para o pescado. O S.
aureus pode causar intoxicação alimentar como: vômitos, náuseas e diarreia, podendo
ser fatal em crianças e idosos, principalmente se estes apresentarem imunidade baixa (SANTIAGO et al., 2013).
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3.2.1.2 Salmonella sp.
A Salmonella é uma bactéria gram negativa que se apresenta na forma de bastonete, amplamente distribuída na natureza, sendo o trato intestinal do homem e animais de sangue quente seu principal reservatório. Sua penetração no organismo humano ou animal se dá por conta do consumo de água ou alimento contaminados e os principais sintomas que caracterizam a presença deste patógeno no organismo são febre, náuseas, vômito e diarreia (FARIAS, 2006). É considerada como um dos mais importantes agentes patogênicos transmitidos via alimento, mesmo com toda a implementação de sistemas de higiene na indústria alimentícia (KUSHIDA, 2005).
3.2.1.3 Escherichia coli
As bactérias da espécie Escherichia coli, são bacilos gram negativos do grupo dos coliformes termotolerantes, que colonizam o trato intestinal do homem e animais de sangue quente. É a principal causadora de doenças diarreicas via ingestão de água (SANTIAGO et al., 2013), e sua presença em alimentos crus é considerada um indicador de contaminação fecal (SILVA, 2002).
3.2.1.4 Vibrio parahaemolyticus
Bactérias do gênero Vibrio, podem causar intoxicação alimentar através da ingestão de ostras, camarões e mexilhões mal cozidos ou crus contaminados pelo patógeno. A espécie Vibrio parahaemolyticus é uma bactéria gram negativa que apresenta a forma de bastonetes curtos, e causa as infecções mais graves (ORTIZ, 2017), e os principais sintomas causados por ele são: náuseas, dores abdominais, diarréia e vômito (CAMPOS, 2009; SILVEIRA et al., 2016).
3.2.2 Controle microbiológico do pescado
Após a captura do pescado e seu recolhimento para a embarcação, a quantidade de bactérias presentes nos animais aumenta devido á contaminação a bordo podendo atingir de 105 a 106 UFC/cm2.Entretanto, se for realizada uma lavagem com água do mar, após sua separação e classificação, o número de bactérias é reduzido de 1/3 a 1/10 da população contaminante no momento da lavagem (ARGENTA, 2012).
Segundo Farias (2006), as práticas de higiene realizadas por parte dos manipuladores são de grande importância na preservação e conservação da qualidade do pescado,
considerando que o homem é o principal veículo de micro-organismos responsáveis pelas doenças alimentares.
Após ser abatido, o pescado começa a se alterar imediatamente, desta forma, a manipulação cuidadosa é de fundamental importância, o que implica no cumprimento de três principais passos: resfriá-lo imediatamente, o que pode evitar ou controlar a contaminação, evitar grandes alterações de temperatura e manter elevado o grau de limpeza nas imediações da embarcação (SOARES; GONÇALVES, 2012), além de práticas simples de higiene como: lavagem das mãos, higienização dos utensílios e do ambiente em que o pescado vai ser conservado (MINOZZO, 2011).
Todos os tipos de produtos de pescado devem estar com sua microbiota contaminante dentro dos limites impostos pela legislação. Os micro-organismos sobre os quais a legislação brasileira estabelece limite não são aqueles que deterioram os alimentos, mas sim, aqueles que são patogênicos para o homem (FARIAS, 2006).
Os conservantes sintéticos utilizados para aumentar a vida de prateleira desses produtos têm sido cada vez menos satisfatórios, pois muitos desses compostos possuem propriedades que causam intoxicações e doenças de origem alimentar (ARGENTA, 2012). Atualmente para conservação de uma variedade de alimentos utiliza-se aditivos alimentares que incluem, sulfito de sódio, bissulfeto de sódio, dióxido de enxofre, entre outros (RUIZ; GIMÉNIZ, 2009). Com a resistência dos micro-organismos deterioradores a esses conservantes, faz-se necessário estudos relacionados a compostos menos tóxicos e mais eficazes no controle desses agentes patogênicos (ARGENTA, 2012).
3.3 MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES DE ANTIMICROBIANOS
O termo “antibiótico”, foi definido em 1942, por Selman A. Waksman, e originalmente descrevia qualquer produto microbiano antagonista ao crescimento de outros micro-organismos. Atualmente, “antibióticos” se refere a qualquer composto que inibe o crescimento (microstático) ou mata (microbicida) algum tipo de micro-organismo. A maioria dos antimicrobianos usados clinicamente é produzido naturalmente ou se assemelha a produtos naturais (ABAD et al., 2015), devido à grande variedade de metabólitos secundários existentes em espécies de plantas e micro-organismos (SENGER, 2016).
Os produtos naturais são utilizados há milhares de anos pela humanidade, e em geral, são de origem pré-biótica ou originam-se de micro-organismos (CHAPLA, 2014). Os
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micro-organismos são os principais produtores de compostos naturais úteis (TONIAL, 2014). Bactérias e fungos se destacam por estarem presentes em praticamente todos os ambientes do planeta (ROMANO, 2015), e pela sua versátilidade, principalmente quanto a capacidade de produzir metabólitos secundários. Os fungos têm recebido atenção especial pela produção de substâncias com alto valor agregado (PEREIRA, 2017). Dentre a diversidade de compostos produzidos pelos fungos podemos citar os metabólitos primários, que são as substâncias essenciais para vida, e os metabólitos secundários, que possibilitam uma maior sobrevivência e adaptação (BRAUN, 2018). Com o aumento da resistência dos patógenos, há uma demanda crescente por novos compostos bioativos. Os fungos são considerados uma fonte importante para novos conservantes naturais, devido à abundante diversidade de espécies, seus metábolitos secundários e seu melhoramento genético (SENGER, 2016). A produção de antimicrobianos de fungos que vivem em ambientes distintos como os endofíticos de plantas silvestres e fungos marinhos, está sendo investigada para a descoberta de novos compostos mais eficazes no controle biológico de patógenos (DEBBAB et al., 2010).
3.3.1 Micro-organismos endofíticos
Os fungos apresentam uma vasta diversidade de modos de vida, merecendo destaque o endofitismo (SILVA, 2017). O termo endofítico vem do grego (éndon + phyton) e significa “dentro da planta”, ou seja, estes são organismos que habitam os tecidos internos de espécies vegetais sem aparentemente prejudicarem o desenvolvimento do hospedeiro (GODINHO, 2016). Sabe-se que as plantas podem ser hospedeiras de um ou vários micro-organismos endofíticos (VAZ, 2012), e que os metabólitos secundários desses micro-organismos estão diretamente relacionados com a sua planta hospedeira (SILVA, 2017).
Para colonizar as plantas os fungos utilizam a principal porta de entrada que são as raízes (MELO, 2017), se disseminando através das lesões geradas nas raízes secundárias pelo crescimento do vegetal, por aberturas naturais como estômatos e hidatódios (OLIVEIRA, 2014), ou ainda por feridas feitas por insetos e patógenos (SILVA et al, 2018). Os fungos podem ser transmitidos de uma planta para a outra verticalmente, por sementes, ou horizontalmente através de esporos. A população endofítica de uma planta pode variar de acordo com o estado de saúde da mesma,
sugerindo assim que há uma provável ação protetora por conta de alguns destes micro-organismos (TONIAL, 2014).
O mangue é considerado berçário para o desenvolvimento de muitas espécies, um ecossistema com diversas variações naturais, sendo de extrema importância para o equilíbrio do ambiente aquático (SILVA, 2009). Esse ambiente hospeda aproximadamente 70 espécies de plantas, espalhadas em manguezais nas diferentes áreas do mundo. Estima-se que o Brasil possua 7.408 km de litoral, sendo 6.786 km ocupados por florestas de mangue, ou seja, abriga 10% de todos os manguezais do planeta. Os mangues brasileiros são compostos basicamente por três gêneros de plantas, Laguncularia (Combretaceae), Rizophora (Rizophoraceae) e Avicennia (Avicenniaceae), muito utilizadas em estudos de biodiversidade de micro-organismos que habitam esses ambientes (FASANELLA, 2012).
Os fungos colonizam diferentes nichos dos manguezais, podendo ser divididos em terrestres, que são aqueles que colonizam as partes das plantas acima da coluna d’agua e os marinhos que colonizam as partes inundadas pelas águas das marés (SANTOS, 2012). Os fungos endofíticos associados a plantas de manguezal são os que possuem maior potencial de produzir compostos bioativos, devido a características adaptativas para sua sobrevivência neste ecossistema complexo (POLONI, 2014).
3.3.1.1 Fungos endofíticos e suas aplicações
De acordo com Phamphile et al., (2017), os endófitos podem produzir uma variedade de metabólitos secundários bioativos importantes, que são conhecidos apenas em plantas.
Os fungos endofiticos, além de executarem diversas funções nos vegetais em que habitam (MELO, 2017), são considerados uma fonte inestimável de produtos naturais com potencial bioativo (CHAPLA, 2014), e grandes produtores de diversos metabólitos secundários, os quais apresentam um amplo espectro de atividades biológicas como: antiparasitária, antioxidantes, antiviral, antibacteriana, antimalárica, citotóxica e antidiabética (PEREIRA, 2017). Esses metabólitos compreendem uma diversidade de classes químicas, como: compostos fenólicos (ácidos fenólicos, fenóis e flavonoides), alcaloides (aminas e amidas), peptídeos, terpenos e esteroides (TONIAL, 2012), quionas, derivados perilenos, furandionas e citocalasinas (SILVA, 2017).
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Muitos produtos de valor biológico têm sido sintetizados por fungos endofíticos, entre eles estão os antibióticos e outros princípios ativos com diversas propriedades farmacológicas (SEBASTIANES, 2010). Dentre os compostos bioativos, destacam-se os produtos com atividades antimicrobianas produzidos pelos micro-organismos endofíticos (DANTAS, 2017), que podem inibir ou matar agentes causadores de doenças, incluindo os vírus, protozoários, insetos e bactérias (OLIVEIRA, 2013). Do mesmo modo que fungos endofíticos são estudados na inibição de fitopatógenos, eles também são utilizados no antagonismo de bactérias patogênicas (GODINHO, 2016), pelo fato de colonizarem um nicho ecológico semelhante ao ocupado por esses micro-organismos patogênicos, competindo por nutriente, produzindo substâncias antagônicas e até mesmo parasitar o patógeno (ELIAS, 2015).
Atualmente a resistência dos micro-organismos tem sido um problema de grande importância e a busca por compostos naturais, como os metabólitos de origens fúngicas endofíticas, tem sido uma fonte promissora para solucionar estes problemas. Muitos estudos abordam substâncias isoladas desses organismos utilizadas contra bactérias patogênicas (SEBASTIANES, 2010).
3.3.2 Micro-organismos marinhos produtores de antimicrobianos
Uma solução para a crise global de resistência a antibióticos é a descoberta de novos compostos antimicrobianos para aplicação clínica. Em comparação com o ambiente terrestre, que era o foco da indústria farmacêutica, os habitats marinhos permaneceram pouco explorados quanto a sua capacidade de produzir metabólitos bioativos (ABAD et al., 2015).
Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície terrestre, e constituem uma diversidade biológica e química que contém cerca de 230.000 espécies já descritas (SENGER, 2016), entretanto a biodiversidade marinha, especialmente a de micro-organismos ainda é pouco conhecida (SANTOS, et al., 2010).
Dentre os micro-organismos mais encontrados no ambiente marinhos, podemos citar as bactérias e os fungos (AYDOS, 2016). Recentemente foram descobertos muitos produtos naturais produzidos pelos fungos marinhos, como: anticorpos citotóxicos, anticancerígenos, antivirais, atividades antibacterianas ou antifúngicas. Os compostos antibacterianos e antifúngicos aumentaram rapidamente desde 2010, e os fungos marinhos têm sido uma fonte importante desses compostos (DEBBAB et al., 2010).
Os micro-organismos marinhos, incluindo fungos e bactérias, são de considerável importância como promissoras novas fontes de produtos biologicamente ativos (SANTOS, 2010). Segundo Senger (2016), cerca de 20.000 novos compostos de origem marinha foram descritos nas últimas décadas. Muitos dos metabólitos foram isolados de espécies de invertebrados marinhos, que constituem cerca de 50% de toda biodiversidade marinha.
Os fungos marinhos despertaram um grande interesse por possuírem diversas atividades biológicas, como atividade antiviral, antagonismo de fatores de ativação, inibição de ciclo celular e propriedades antimicrobianas e antitumorais (SANTOS et al., 2010).
Segundo Mizuno (2010), muitos são os trabalhos que apresentam investigação química de fungos marinhos, onde, cerca de 45% dos isolados foram obtidos de invertebrados, sendo dividido em 33% de esponjas, 5% de tunicados, 5% de moluscos, 2% crustáceos e 2% de celenterados.
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4 METODOLOGIA
4.1 COLETA E ISOLAMENTO DOS FUNGOS 4.1.1 Fungos endofíticos
Foram realizadas duas coletas, sendo a primeira no dia 06 de setembro e a segunda no dia 01 de outubro do ano de 2016, ambas na região de manguezal (20º50’9” S, 040º43’39” W), no município de Piúma-ES, em cinco pontos distintos.
Os gêneros vegetais selecionados foram: Laguncularia, Rizophora e Avicennia, por serem características de manguezais brasileiros. Após coletadas as folhas foram acondicionadas em sacos plásticos, etiquetadas e colocadas em uma caixa térmica com gelo para o transporte até o Laboratório de Ecologia Microbiana do Instituto Federal do Espírito Santo – Campus Piúma.
Para o isolamento dos fungos foram selecionadas folhas sadias, ou seja, sem danos aparentes ou sintomas de doenças. Cada folha foi submetida ao processo de desinfecção, sendo lavadas em três passos:
1º com água da torneira;
2º com hipoclorito de sódio (2%);
3º água destilada estéril.
Após o processo de lavagem as folhas foram superficialmente desinfectadas com etanol 70%. Posteriormente, as folhas foram cortadas (tamanho de 1 cm), com o auxílio de uma tesoura estéril, inseridas em sacos plásticos com 150 mL de solução salina estéril 0,85% (SSE) e colocadas no homogeneizador (MARCONI/MA 085/CT) por 20 minutos. Seguido o término da homogeneização, foi realizada a diluição seriada fator 10 (até 10-4) para o plaqueamento.
100 µL de cada amostra foram colocados em placas de Petri contendo o meio de cultura seletivo para fungos, Batata Dextrose Ágar (BDA), e com o auxílio da alça de
Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. As placas foram incubadas em estufa
a temperatura de 28 °C, durante 5 dias.
Após o período de incubação, os fungos obtidos foram caracterizados morfologicamente, nomeados e semeados em novas placas de Petri contendo meio de cultura BDA, para obtenção de culturas puras.
Para o isolamento de fungos marinhos foi utilizado um exemplar de polvo (Octupus
insularis), adquirido com pescadores do município de Guarapari–ES. O polvo foi
pescado na praia de Guaibura (20º43’46” S, 040º31’12” W) no dia sete de julho de 2017.
Para o isolamento dos fungos marinhos, passou-se um swab estéril sobre feridas presentes no tegumento do polvo. Os swabs foram colocados em solução salina estéril e a amostra foi inoculada por esgotamento em meio de cultura BDA. As placas foram incubadas a 28 °C por 5 dias. Os fungos foram caracterizados morfologicamente e culturas puras foram obtidas.
4.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS FUNGOS
Para a caracterização dos fungos, observou-se primeiramente a morfologia do micélio nas placas, depois foram preparadas lâminas colando uma pequena amostra do fungo com durex e adicionando uma gota de Azul de Toluidina. Foram observadas no microscópio (LEICA/DM500), estruturas e arranjos apresentados pelos micélios reprodutivos dos fungos.
4.3 TESTE DE INIBIÇÃO IN VITRO
Para os testes de atividade antimicrobiana, as bactérias patogênicas foram repicadas com 24 horas de antecedência, assim como todos os fungos isolados, os quais foram semeados de acordo com sua capacidade de crescimento (Tabela1).
Tabela 1: Capacidade de crescimento dos fungos (horas).
Fungo Tempo de crescimento
P1FD 36 horas P1FE 24 horas P2FA 48 horas P4FC 48 horas P5FC 48 horas B1 72 horas B2 72 horas ABD - 1 72 horas P-ABD 72 horas Polvo-T 72 horas Fonte: Autor
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Cada fungo foi testado contra os patógenos Staphylococcus aureus (λ = 600 nm, 0,03A), Salmonella enteritidis (λ = 600 nm, 0,03A) e Vibrio parahaemolyticus (λ = 590 nm, 0,04A), na concentração de 108 ufc/mL.
Cada patógeno foi inoculado sobre uma placa Petri contendo meio de cultura Ágar Nutriente (AN), utilizando um swab. Posteriormente, o fungo a ser testado quanto à atividade antimicrobiana, foi inoculado no centro da placa com o meio de cultura. As placas foram incubadas a 32°C por 24 horas.
4.4 PADRONIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ANTIMICROBIANOS
Para obtenção dos extratos fúngicos, pedaços de micélios de cada fungo com potencial antimicrobiano foram inoculados em Erlenmeyers (500 mL) contendo 250 mL de meio de cultura Caldo Sabouraud incubados a 28 °C por 28 dias.
Para verificar a atividade antimicrobiana, testes de difusão em poços foram realizados a cada sete dias. Cerca de 2000 µL do cultivo fúngico em caldo Sabouraud foi filtrado em membranas de nitrocelulose (0,22 μm), com o auxílio de uma seringa e filtro holder. Após filtragem, 108 ufc/mL do patógeno foi inoculado em meio de cultura AN utilizando um swab e 150 µL do caldo filtrado foram adicionados aos poços (triplicata) e incubados a 28° C por 24 horas. Após esse período os halos de inibição foram medidos.
4.5 EXTRAÇÃO DO SOBRENADANTE
Após os 28 dias de incubação, os cultivos líquidos foram centrifugados (10000 rpm, 4 °C, 20 minutos) para obtenção do sobrenadante, para posteriores testes.
4.6 CROMATOGRAFIA LÍQUIDO – LÍQUIDO
Para a extração dos metabólitos com atividade antimicrobiana, foi utilizado o método de partição líquido-líquido, utilizando como solventes o hexano, diclorometano e acetato de etila, em ordem de polaridade crescente. Foram obtidas 3 frações sendo elas: fração hexano, fração diclorometano e fração acetato de etila. Cada fração obtida, foi separada do solvente por rota-evaporação (TOPTION/RE – 52AA).
4.7 TESTES DE DIFUSÃO EM DISCO
Os testes de difusão em disco foram realizados com todas as frações rotaevaporadas, em triplicata.
As frações foram dissolvidas no solvente para atingir a concentração 1000 ug/mL. Ao término da homogeneização foram adicionados 10 µL da amostra ao disco de papel filtro e esperou-se 24 horas até a evaporação completa do solvente. Também foi realizado um controle adicionando 10 µL do solvente puro ao disco.
Passando as 24 horas, 108 ufc/mL do patógeno foi inoculado em meio de cultura AN utilizando um swab estéril e, em seguida, o disco contendo o extrato fúngico foi adicionado ao meio (em triplicata). As placas foram incubadas a 32 °C por 24 horas.
4.8 TESTES DE CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS NO PESCADO
Para o teste de controle de micro-organismos no pescado foi utilizado o peixe da espécie Sarda sarda e os sobrenadantes da cultura de dois fungos, sendo eles: P1FE e ABD - 1. Os sobrenadantes utilizados foram aqueles que apresentaram melhores resultados nos testes descritos anteriormente. Foram utilizados 15 pedaços de 25 gramas cada sendo: 5 pedaços para o controle (peixe sem fungo), 5 pedaços para o Fungo 1 (P1FE) e 5 pedaços para o fungo 2 (ABD-1).
As amostras de 25 gramas foram acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados (Figura 1) e com o auxílio de uma micropipeta volumétrica foi aplicado 4,5 ml do sobrenadante filtrado a vácuo nos sacos contendo as amostras para o Fungo 1 e Fungo 2, nos sacos contendo o controle foi adicionado apenas o meio de cultura líquido Sabouraud.
As análises de micro-organismos contaminantes foram realizadas a partir do controle (tempo zero), onde foi analisada a quantidade de micro-organismo que já pertencia ao pescado, e posteriormente com 2 dias, 5 dias, 8 dias, 11 dias e 14 dias de inoculação.
Para a realização das análises microbiológicas, 25 g de cada amostra foram inseridas em sacos plásticos com 225 mL de solução salina estéril 0,85% (SSE) acrescida de 0,1% de peptona bacteriológica, e colocadas no homogeneizador, por 20 minutos. Seguido o término da homogeneização, foi realizada a diluição seriada fator 10, até 10-2 para a análise de Staphylococcus sp. e 10-4 para bactérias mesófilas e psicrotróficas, para posterior plaqueamento (em triplicata).
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Figura 1: Amostras de 25 gramas de pescado, tratadas com o sobrenadante do fungo 2.
Fonte: A autora
Foram realizadas as análises de micro-organismos mesófilos, psicrotróficos,
Staphylococcus sp., S. aureus, Salmonella sp. e coliformes totais e termotolerantes,
seguindo metodologia descrita na IN 62/2003 do MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) com modificações.
4.8.1 Análise de micro-organismos mesófilos
Para a análise de micro-organismos mesófilos, 100 µL de cada amostra, foram colocados em placas de Petri, contendo o meio de cultura seletivo para fungos (BDA) e meio de cultivo seletivo para bactérias, Agar Padrão para Contagem (Agar PCA), e com o auxílio da alça de Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. As placas para a obtenção de fungos mesófilos, foram incubadas em estufa a temperatura de 25 °C, durante 5 dias, e as placas para a obtenção das bactérias mesófilas, foram incubadas em estufa a temperatura de 35 °C, durante 48 horas.
4.8.2 Análise de micro-organismos psicrotróficos
Para a análise de micro-organismos psicrotróficos, foi realizado o mesmo procedimento descrito para os micro-organismos mesófilos, onde 100 µL de cada amostra, foram colocados em placas de Petri, contendo o meio de cultura BDA, e meio PCA, e com o auxílio da alça de Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. Porém, todas placas para a obtenção tanto de fungos quanto de bactérias psicrotróficas, foram incubadas na geladeira a 7 °C, durante 10 dias.
Após o uso dos 225 mL da amostra inicial homogeneizada, a mesma foi incubada a 35 °C durante 24 horas, visando proporcionar um ambiente favorável para o desenvolvimento de Salmonella sp. (fase de pré-enriquecimento). Em seguida, foi transferida 0,1 mL e 1,0 mL da amostra, para 10 mL de dois meios de enriquecimento, seletivos para Salmonella sp., Caldo Rapaport Vassiliadis (RP) e o Caldo Tetrationato (TT), respectivamente. Posteriormente incubou-se o caldo RP a 41,5 °C e o caldo TT a 35 °C, ambos por 48 horas.
Após o término da incubação, as culturas dos caldos foram estriadas em dois meios seletivos para esse micro-organismo, o Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Brilliant Green Agar (VB), para a obtenção de colônia típicas de Salmonella sp. As placas foram incubadas a 35 °C por 48 horas.
Dadas a 48 horas, as colônias típicas de Salmonella foram isoladas em meio AN e incubadas a 35 °C, para posteriores testes bioquímicos: produção de urease em Agar Ureia, descarboxilação ou desaminação da lisina com formação de ácido sulfídrico em Ágar Lisina Ferro (LIA), fermentação de carboidratos e produção de sulfeto de hidrogênio em Ágar Tríplice Ferro (TSI), utilização de citrato como fonte de carbono em Ágar Citrato (IMViC), oxidação da glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos através da prova de Vermelho de Metila (VM) e de Voges-Proskauer (VP) em Ágar MR-VP (Methyl Red, Voges – Proskauer).
4.8.4 Análise de Escherichia coli 4.8.4.1 Teste presuntivo
A partir da amostra inicial homogeneizada, inoculou-se uma alíquota de 0,1 mL, 1 mL e 10 mL, em 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), numa série de 5 tubos de ensaio, contendo tubos de durham ivertido (para a verificação da presença de gás), para cada amostra a ser testada. Os tubos foram incubados a 35 °C por 48 horas, após o tempo de incubação verificou-se se havia ou não presença de gás nos tubos, para prosseguir com as outras etapas.
4.8.4.2 Contagem de coliformes totais
A partir dos tubos de LST com produção de gás, transferiu-se uma alçada de cada cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB). Incubou-se a 35 °C por 48 horas, a fim de observar a produção ou não de gás. O número de tubos com com
33
produção de gás, foram anotados para posterior confirmação da presença de coliformes totais, a partir da Determinação do Número Mais Provável (NMP) /g ou mL.
4.8.4.3 Contagem de coliformes termotolerantes
A partir dos tubos de VB com produção de gás, transferiu-se uma alçada da cultura para tubos de caldo E. coli (EC). Os tubos foram incubados a 45 °C durante 48 horas, e foram observados se havia a presença de gás.
A cultura dos tubos que apresentaram gás, foi estriada em meio AN para o posterior teste de confirmação, pelo método de Coloração de Gram.
4.8.5 Análise de Staphylococcus sp.
Para a análise de S. aureus, cerca de 100 µL de cada amostra, foram colocados em placas de Petri, contendo o meio de cultura Ágar Baird-Parker acrescido de gema de ovo com telurito de potássio (BP), que é seletivo para Staphylococcus sp. Com o auxílio da alça de Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. As placas foram incubadas em estufa a temperatura de 35 °C, durante 48 horas.
Após o período de incubação, as colônias típicas de Staphylococcus sp. foram isoladas em culturas puras em AN e incubadas a 35 °C durante 48 horas. Para a confirmação de Staphylococcus sp. e S. aureus as bactérias foram submetidas às provas bioquímicas de catalase e coagulase e à coloração de Gram.
4.9 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS 4.9.1 Umidade (método gravimétrico)
Para a análise de umidade os cadinhos previamente preparados foram identificados, e colocados em estufa a 35 °C por 40 minutos. Após secagem, os cadinhos foram colocados em um dessecador durante 1 hora, e pesados em uma balança analítica. Posteriormente foram acrescentados nos cadinhos, previamente tarados, cerca de 5 g das amostras a serem analisadas. As amostras foram secas em estufa a 105 °C por 24 horas e pesadas no intervalo de 1 hora até que não houvesse oscilação do peso. Para o cálculo da umidade foi utilizada a seguinte fórmula:
umidade =(peso do cadinho + amostra úmida) − (peso do cadinho + amostra seca) ∗ 100 peso da amostra úmida
4.9.2 Determinação de bases nitrogenadas voláteis (BNV)
Para a análise de bases nitrogenadas voláteis pesou-se num becker cerca de 20 g de peixe previamente triturado, acrescentou-se 120 mL de ácido tricloroacético a 5% (TCA), homogeneizou-se a amostra e a mesma foi deixada decantar por 30 minutos. Após tal procedimento a homogeneização foi filtrada em funil de vidro com filtro de papel e 20 mL do filtrado foi transferido para um tubo digestor de proteínas (triplicata) e acrescentado 1 g de Óxido de magnésio (MgO). Foram adicionados 20 mL de solução receptora Ácido bórico a 5% (H2BO3) e de 3 a 4 gotas de indicador misto e destilada no aparelho micro-kjedahl, para posterior titulação com Ácido clorídrico (HCL a 0,05 N) até ocorrer a passagem da cor verde para rosa claro. O volume de ácido gasto foi anotado para posterior realização do cálculo.
BNV =mL de HCL x N x 14 x 00 x 134 20 x20
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados utilizando-se o programa de análises estatísticas Sisvar 5.3 (Ferreira, 2010), desenvolvido pela Universidade Federal de Lavras—UFLA. Foram analisadas a normalidade e homogeneidade dos dados e os resultados foram submetidos à análise de variância, seguido de teste de Tukey em nível de 5% de significância.
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ISOLAMENTO DOS FUNGOS 5.1.1 Fungos endofíticos
Os fungos endofíticos são aqueles que habitam o interior das plantas sem causar nenhum dano aparente a ela. Braun (2018), afirma que estudos realizados com a comunidade endofítica de manguezal tem sido assunto de interesse para a descoberta de novos fungos e metabólitos produzidos no manguezal, ressaltando a diversidade de seus compostos químicos tais como os antimicrobianos.
Tabela 2: Pontos de coleta e nomenclatura de identificação dos fungos
Ponto Fungos isolados
Ponto 1 P1FA, P1FB, P1FC, P1FD, P1FE, P1FF.
Ponto 2 P2FA, P2FB, P2FC, P2FD, P2FE, P2FF.
Ponto 3 P3FA, P3FB, P3FC, P3FD, P3FE.
Ponto 4 P4FA, P4FB, P4FC, P4FD, P4FE.
Ponto 5 P5FA, P5FB, P5FC, P5FD, P5FE, P5FF, P5FG.
Fonte: A autora
A Tabela 2 apresenta 29 fungos endofíticos, os quais foram isolados por apresentarem características morfológicas diferentes. Os fungos que apresentavam as mesmas características foram descartados por, provavelmente, serem da mesma espécie e possibilidade de apresentarem os mesmos compostos antimicrobianos que os outros. A Figura 2 ilustra dois dos fungos endofíticos isolados de plantas de mangue.
Dentro deste contexto, no estudo realizado por Sebastianes (2010), foi possível isolar 2.800 fungos no manguezal de Bertioga e Cananéia – São Paulo, em duas épocas do ano (verão e inverno), totalizando 4 coletas. Os fungos obtidos eram provenientes dos três mesmos gêneros de plantas de mangues utilizados neste trabalho.
Peixoto et al. (2017), obteveram 38 fungos endofíticos da espécie vegetal nativa de mangue Rhizophora mangle, os quais tinham atividade antimicrobiana contra S.
Figura 2: Cultura de fungos endofíticos, em BDA: (A) fungo P5FC e (B) fungo P1FE
Fonte: A autora
Outros estudos com fungos endofíticos demonstram a grande biodiversidade desses micro-organismos, tal qual Silva (2017), que isolou um total de 315 fungos, sendo 43 deles provenientes da planta Passiflora incarnata. Também é possível verificar o isolamento de endofíticos provenientes de outras espécies plantas, as quais não são oriundas de mangue, como nos trabalhos de Silva (2018), que obteve 6 fungos endofíticos de 80 fragmentos de sementes provenientes de Cruz das Almas, assim como no estudo de Dantas (2017), que foi possível isolar um total de 27 fungos filamentosos fenotipicamente distintos como endofíticos de bambu.
5.1.2 Isolamento dos fungos do polvo
No intuito de isolar diferentes tipos de fungos produtores de antimicrobianos e assim aumentar a chance de conseguir um antimicrobiano com boa atividade na prevenção de micro-organismos contaminantes em pescado, foram retiradas amostras de tegumento de polvo com algumas feridas. Foi possível isolar 5 fungos diferentes sendo eles nomeados como: B1, B2, P–ABD, ABD–1 (Figura 3) e Polvo - T.
Trabalhos realizados por Senger (2016), permitiram o isolamento de 14 fungos associados a organismos marinhos como corais e esponjas. Mizuno (2010), isolou um total de 45 colônias de fungos associados à esponja marinha Dragmacidon
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Nos estudos realizados por Santos e colaboradores (2010), foi possível isolar 116 fungos filamentosos a partir das amostras de cnidários marinhos: Palythoa
caribaeorum, P. variabilis, Mussismilia hispida e Zoanthus solanderi.
Figura 3: Fungo isolado de polvo: ABD–1
Fonte: A autora
5.2 TESTE DE INIBIÇÃO IN VITRO
5.2.1 Atividade antagonista in vitro dos isolados fúngicos frente a patógenos 5.2.1.1 Fungos endofíticos
O pescado sofre uma série de ações deterioradoras, assim como qualquer animal após sua morte, iniciando-se pela ação das enzimas sobre as proteínas e lipídeos. Com isso ocorre a degradação microbiana fazendo com que ocorram mudanças irreversíveis nas partes física e químicas do pescado (GONÇALVES, 2011).
Os principais contaminantes do pescado, que são considerados micro-organismos capazes de causar doenças em humanos causando infecções e/ou intoxicações alimentares são: as espécies de Vibrio, com ênfase na espécie V. parahaemolyticus e V. cholerae, Salmonella sp., Listeria sp., Staphylococcus aureus, e Escherichia coli (CAMPOS, 2009).
Para os testes de inibição realizados contra os patógenos S. aureus, Salmonella sp.,
E. coli e V. parahaemolyticus, os fungos que apresentaram atividade antimicrobiana
Tabela 3: Antagonismo, in vitro, dos isolados fúngicos endofíticos, capazes de inibir, ao menos, um patógeno
Fungo Halos de inibição (cm)
S. aureus Salmonella sp. E. coli V. parahaemolyticus
P1FD 0,1 0 0 0 P1FE 0,6 0 0 0,2* P2FA 0,1 0,1 – 1,1* 0 0 P4FC 0,2 0 0 0 P5FC 0,2 0 0,1 0,1 Fonte: A autora
* Halo de inibição parcial
Cinco fungos endofíticos apresentaram resultado positivo contra o patógeno S.
aureus, sendo o fungo P1FE o que apresentou a maior atividade antimicrobiana, com
um halo de inibição de 0,6 cm (Figura 4).
Figura 4: Atividade antimicrobiana do fungo P1FE contra o patógeno Staphylococcus aureus
Fonte: A autora
Os resultados apresentados na Tabela 3 assemelham-se aos descritos por Melo (2017) onde 5 das estirpes endofíticas obtidas em seus estudos, apresentaram atividade antimicrobiana frente ao mesmo patógeno. Silva e colaboradores (2015), isolaram 17 fungos endofíticos do cacto Opuntia humifusa e estudaram suas
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atividades antibacteriana, porém somente 6 extratos desses fungos obtiveram resultados satisfatórios.
Apenas o fungo P5FC apresentou atividade antimicrobiana frente ao patógeno E. coli. Nascimento et al. (2015), obtiveram resultados positivos, utilizando fungos endofíticos, no controle de micro-organismos de interesse médico, inibindo E. coli, Salmonella sp.
Enterobacter aerogenes, dentre outras.
5.2.1.2 Fungos isolados do polvo
Para os testes de inibição realizados contra os patógenos S. aureus, Salmonella sp.,
E. coli e V. parahaemolyticus os fungos que apresentaram atividade antimicrobiana
estão representados na Tabela 4.
Tabela 4: Antagonismo in vitro dos isolados fúngicos, do tegumento do polvo.
Fungo Halos de inibição (cm)
S. aureus Salmonella sp. E. coli V. parahaemolyticus
B1 0,3 0,1 0 0,2 B2 0,1 0 0 0,6 ABD-1 0,3 0 0 0,2 P-ABD 0,2 0,1* 0 0,5 Polvo-T 0,1 0 0 0 Fonte: A autora
* Halo de inibição parcial
Os resultados obtidos demonstram o grande potencial antimicrobiano de fungos isolados de organismos marinhos. Dos 5 fungos isolados, todos apresentaram atividade antimicrobiana frente ao patógeno S. aureus, conforme demostrado na tabela 4. Apenas o fungo Polvo-T não apresentou atividade inibitória contra a cepa de
V. parahaemolyticus. Para a linhagem de Salmonella sp, apenas dois dos 5 fungos
testados obtiveram resultado positivo, já para a bactéria patogênica E. coli nenhum dos fungos apresentou atividade antimicrobiana.
Outros estudos demostram que fungos marinhos são considerados grandes produtores de metabólitos bioativos, apresentando atividade inibitória contra uma diversidade de patógenos. Os resultados obtidos aqui, corroboram com o estudo de Mizuno (2010), do qual todos os extratos das linhagens fúngicas isoladas da esponja
D. reticulatum, apresentaram atividade inibitória contra Streptococcus mutans e S. sanguinis.
No estudo realizado por Julianti (2011), foi isolada uma linhagem do fungo
Sarocladium strictum, de uma esponja não identificada, o qual apresentou atividade
antimicrobiana moderada contra Micrococus luteus, Salmonella typhimurium e
Proteus vulgaris.
5.2.2 Testes de difusão em poços 5.2.2.1 Fungos endofíticos
Para os testes de difusão em poços, os fungos foram cultivados por 28 dias, para verificar a maior fase de produção de antimicrobianos. Espera-se que com o passar do tempo, a escassez de nutrientes faça com que os fungos produzam metabólitos secundários que os façam se manter no ambiente de cultivo, através de competição por espaço e nutrientes.
Os testes foram realizados a cada 7 dias de incubação, conforme o item 4.4, contra os patógenos S. aureus, Salmonella sp., E. coli e V. parahaemolyticus obteve-se os seguintes resultados (Tabela 5).
Tabela 5: Atividade antimicrobiana do sobrenadante das culturas fúngicas de endófitos (cm)
Fungo 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias
St Sa Ec Vi St Sa Ec Vi St Sa Ec Vi St Sa Ec Vi P1FD 0 0 0 0 0 0 0 0 0,9 0 0 0 0,5 0 0 0 P1FE 0 0,1 0,4 0,4 0,8 0,1 0,4 0,4 0,7 0,1 0,4 0,4 0,6 0,1 04 0,4 P2FA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P4FC 0 0 0 0 0,1 0 0 0 0,8 0 0 0 0,3 0 0 0 P5FC 0 0 0 0,1 0,2 0 0 0,1 0,8 0 0,1 0,1 0,5 0 0 0,1 Fonte: A autora
* Halo de inibição parcial. St – S. aureus, Sa – Salmonella. sp, Ec – E.coli e Vi – V. parahaemolyticus.
De acordo com a Tabela 5, a maioria dos fungos obtidos apresentou halo de inibição frente ao patógeno S. aureus, sendo que o fungo P1FE foi o que obteve o melhor resultado, apresentando um halo de inibição de 0,8 cm de diâmetro, no seu 14º dia de
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inoculação. Esse mesmo isolado foi capaz de inibir todos os outros patógenos, durante toda a fase de crescimento e teste. Os outros fungos não apresentaram atividade antimicrobiana para as linhagens de Salmonella sp., E. coli. Os resultados obtidos corroboram com Poloni (2014), onde, dos 12 extratos fúngicos testados, apenas um apresentou atividade contra a bactéria Gram-negativa E. coli. No estudo realizado por Dantas (2017), foram obtidos 3 fungos isolados de bambu (Bambusa
vulgaris), com atividade antimicrobiana para a linhagem de S. aureus, e 2 fungos, as
quais apresentaram melhores atividades frente ao patógeno E. coli. Além do extrato obtido da cultura de P1FE, o único extrato fúngico que apresentou atividade contra o
V. parahaemolyticus foi o fungo P5FC.
Todos os fungos aumentaram a produção de antimicrobianos próximo ao 14° dia de cultivo, indicando que não é necessário um maior tempo de incubação para a extração desses metabólitos.
Na Tabela 3 descrita no item 5.2.1.1, o fungo P2FA apresentou halos de inibição contra dois dos patógenos testados, porém após a padronização dos extratos fúngicos para a extração do sobrenadante, o mesmo não obteve nenhuma atividade antimicrobiana nos testes de difusão em poço, levantando a hipótese de que seu metabólito possa estar ligado a algum componente de suas células e não seja um produto de seu metabolismo secundário, não estando presente no sobrenadante extraído.
5.2.2.2 Fungos isolados do polvo
Para os testes de difusão em poços realizados a cada 7 dias de incubação contra os patógenos, obteve-se os seguintes resultados.
De acordo com a Tabela 6, é possível notar que os extratos de todos os fungos apresentaram atividade antimicrobiana contra o patógeno S. aureus (Figura 5). Nos testes realizados contra o patógeno V. parahaemolyticus 3 dos extratos fúngicos apresentaram resultado positivo com halos de inibição considerados parciais, por não provocar a morte de todas as células do patógeno. Entretanto, para as cepas de
Salmonella sp. e E. coli, nenhum dos fungos testados obteve resultado positivo.
Quando comparados os resultados obtidos com os fungos endofíticos e os fungos isolados do polvo, percebe-se que o patógeno Staphylococcus aureus foi o mais sensível a ação antimicrobiana dos extratos fúngicos. Já para as cepas de Salmonella
sp, E. coli e V. parahaemolyticus não foi possível obter resultados tão satisfatórios,
apresentando poucos fungos com atividade antimicrobiana frente a eles.
Tabela 6: Atividade antimicrobiana do sobrenadante das culturas de fungos isolados do polvo (cm)
Fungo 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias
St Sa Ec Vi St Sa E c Vi St Sa Ec Vi St Sa Ec Vi B1 0,1 0 0 1* 0,5 0 0 1* 0,3 0 0 1* 0,5 0 0 1* ABD-1 0,4 0 0 0,1 0,7 0 0 0,1 0,4 0 0 0 0,6 0 0 0 B2 0,5 0 0 0 0,4 0 0 0 0,1 0 0 0 0,5 0 0 0 P-ABD 0,4 0 0 0,5 * 0,4 0 0 0,4* 0,2 0 0 0,5 * 0,4 0 0 0,5 * Polvo-T 0,1 0 0 0 0,0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0 0 0 Fonte: A autora
* Halo de inibição parcial. St – S. aureus, Sa – Salmonella. sp, Ec – E.coli e Vi – V. parahaemolyticus.
Nos testes realizados com 4 anibióticos comerciais: Amoxilina, Bactrim, Clindamicina e Rilexine, foi possível verificar que todos os antibióticos são muito eficazes frente aos patógenos testados, sendo o Staphylococcus aureus a cepa com maior susceptibilidade, seguido por E. coli, V. parahaemolyticus e Salmonella sp.
Figura 5: Atividade antimicrobiana do fungo ABD-1, frente ao patógeno Staphylococcus aureus
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5.2.3 Teste de difusão em disco
Para semipurificar os metabólitos contidos nos extratos fúngicos foi realizada uma cromatografia líquido-líquido. Essa etapa teve como intuito aumentar a atividade antimicrobiana, utilizando compostos mais puros. No estudo de Bajpai (2016), a espécie de fungo marinho Penicillium adametzioides, produziu uma substância, que após isolada foi ativa contra as bactérias Aeromonas hydrophilia, Staphylococcus
aureus, Vibrio spp e V. parahaemolyticus; já o fungo endofítico Penicillium chermesinum, isolado da alga marinha Pterocladiella tenuis, produziu quatro
substâncias as quais apresentaram atividade antimicrobiana contra a bactéria
Micrococcus luteus.
5.2.3.1 Fungos endofíticos
Após a extração dos metabólitos secundários, utilizando solventes orgânicos de polaridade crescente, obteve-se três diferentes frações para cada fungo (Tabela 7).
Tabela 7: Atividade antimicrobiana das frações contendo metabólitos secundários, extraídas com solventes orgânicos
Fungo Fração Halos de inibição (cm)
S.aureus Salmonella sp. E. coli V. parahaemolyticus P1FD Hexano 0 0 0,1 0 Diclorometano 0 0,1 0 0 Acetato de etila 0 0 0,1 0 P1FE Hexano 0,1 0 0,1 0 Diclorometano 0,05 0 0,1 0 Acetato de etila 0,1 0 0 0 P4FC Hexano 0,1 0 0,1 0 Diclorometano 1,3 0,2 0 0 Acetato de etila 0,1 0 0 0 P5FC Hexano 0,4 0 0,5 0,4 Diclorometano 0,1 0 0,1 0 Acetato de etila 0,1 0 0 0 Fonte: A autora
