Para o teste de controle de micro-organismos no pescado foi utilizado o peixe da espécie Sarda sarda e os sobrenadantes da cultura de dois fungos, sendo eles: P1FE e ABD - 1. Os sobrenadantes utilizados foram aqueles que apresentaram melhores resultados nos testes descritos anteriormente. Foram utilizados 15 pedaços de 25 gramas cada sendo: 5 pedaços para o controle (peixe sem fungo), 5 pedaços para o Fungo 1 (P1FE) e 5 pedaços para o fungo 2 (ABD-1).
As amostras de 25 gramas foram acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados (Figura 1) e com o auxílio de uma micropipeta volumétrica foi aplicado 4,5 ml do sobrenadante filtrado a vácuo nos sacos contendo as amostras para o Fungo 1 e Fungo 2, nos sacos contendo o controle foi adicionado apenas o meio de cultura líquido Sabouraud.
As análises de micro-organismos contaminantes foram realizadas a partir do controle (tempo zero), onde foi analisada a quantidade de micro-organismo que já pertencia ao pescado, e posteriormente com 2 dias, 5 dias, 8 dias, 11 dias e 14 dias de inoculação.
Para a realização das análises microbiológicas, 25 g de cada amostra foram inseridas em sacos plásticos com 225 mL de solução salina estéril 0,85% (SSE) acrescida de 0,1% de peptona bacteriológica, e colocadas no homogeneizador, por 20 minutos. Seguido o término da homogeneização, foi realizada a diluição seriada fator 10, até 10-2 para a análise de Staphylococcus sp. e 10-4 para bactérias mesófilas e psicrotróficas, para posterior plaqueamento (em triplicata).
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Figura 1: Amostras de 25 gramas de pescado, tratadas com o sobrenadante do fungo 2.
Fonte: A autora
Foram realizadas as análises de micro-organismos mesófilos, psicrotróficos,
Staphylococcus sp., S. aureus, Salmonella sp. e coliformes totais e termotolerantes,
seguindo metodologia descrita na IN 62/2003 do MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) com modificações.
4.8.1 Análise de micro-organismos mesófilos
Para a análise de micro-organismos mesófilos, 100 µL de cada amostra, foram colocados em placas de Petri, contendo o meio de cultura seletivo para fungos (BDA) e meio de cultivo seletivo para bactérias, Agar Padrão para Contagem (Agar PCA), e com o auxílio da alça de Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. As placas para a obtenção de fungos mesófilos, foram incubadas em estufa a temperatura de 25 °C, durante 5 dias, e as placas para a obtenção das bactérias mesófilas, foram incubadas em estufa a temperatura de 35 °C, durante 48 horas.
4.8.2 Análise de micro-organismos psicrotróficos
Para a análise de micro-organismos psicrotróficos, foi realizado o mesmo procedimento descrito para os micro-organismos mesófilos, onde 100 µL de cada amostra, foram colocados em placas de Petri, contendo o meio de cultura BDA, e meio PCA, e com o auxílio da alça de Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. Porém, todas placas para a obtenção tanto de fungos quanto de bactérias psicrotróficas, foram incubadas na geladeira a 7 °C, durante 10 dias.
Após o uso dos 225 mL da amostra inicial homogeneizada, a mesma foi incubada a 35 °C durante 24 horas, visando proporcionar um ambiente favorável para o desenvolvimento de Salmonella sp. (fase de pré-enriquecimento). Em seguida, foi transferida 0,1 mL e 1,0 mL da amostra, para 10 mL de dois meios de enriquecimento, seletivos para Salmonella sp., Caldo Rapaport Vassiliadis (RP) e o Caldo Tetrationato (TT), respectivamente. Posteriormente incubou-se o caldo RP a 41,5 °C e o caldo TT a 35 °C, ambos por 48 horas.
Após o término da incubação, as culturas dos caldos foram estriadas em dois meios seletivos para esse micro-organismo, o Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Brilliant Green Agar (VB), para a obtenção de colônia típicas de Salmonella sp. As placas foram incubadas a 35 °C por 48 horas.
Dadas a 48 horas, as colônias típicas de Salmonella foram isoladas em meio AN e incubadas a 35 °C, para posteriores testes bioquímicos: produção de urease em Agar Ureia, descarboxilação ou desaminação da lisina com formação de ácido sulfídrico em Ágar Lisina Ferro (LIA), fermentação de carboidratos e produção de sulfeto de hidrogênio em Ágar Tríplice Ferro (TSI), utilização de citrato como fonte de carbono em Ágar Citrato (IMViC), oxidação da glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos através da prova de Vermelho de Metila (VM) e de Voges-Proskauer (VP) em Ágar MR-VP (Methyl Red, Voges – Proskauer).
4.8.4 Análise de Escherichia coli 4.8.4.1 Teste presuntivo
A partir da amostra inicial homogeneizada, inoculou-se uma alíquota de 0,1 mL, 1 mL e 10 mL, em 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), numa série de 5 tubos de ensaio, contendo tubos de durham ivertido (para a verificação da presença de gás), para cada amostra a ser testada. Os tubos foram incubados a 35 °C por 48 horas, após o tempo de incubação verificou-se se havia ou não presença de gás nos tubos, para prosseguir com as outras etapas.
4.8.4.2 Contagem de coliformes totais
A partir dos tubos de LST com produção de gás, transferiu-se uma alçada de cada cultura para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB). Incubou-se a 35 °C por 48 horas, a fim de observar a produção ou não de gás. O número de tubos com com
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produção de gás, foram anotados para posterior confirmação da presença de coliformes totais, a partir da Determinação do Número Mais Provável (NMP) /g ou mL.
4.8.4.3 Contagem de coliformes termotolerantes
A partir dos tubos de VB com produção de gás, transferiu-se uma alçada da cultura para tubos de caldo E. coli (EC). Os tubos foram incubados a 45 °C durante 48 horas, e foram observados se havia a presença de gás.
A cultura dos tubos que apresentaram gás, foi estriada em meio AN para o posterior teste de confirmação, pelo método de Coloração de Gram.
4.8.5 Análise de Staphylococcus sp.
Para a análise de S. aureus, cerca de 100 µL de cada amostra, foram colocados em placas de Petri, contendo o meio de cultura Ágar Baird-Parker acrescido de gema de ovo com telurito de potássio (BP), que é seletivo para Staphylococcus sp. Com o auxílio da alça de Drigalski o líquido foi espalhado até a secagem. As placas foram incubadas em estufa a temperatura de 35 °C, durante 48 horas.
Após o período de incubação, as colônias típicas de Staphylococcus sp. foram isoladas em culturas puras em AN e incubadas a 35 °C durante 48 horas. Para a confirmação de Staphylococcus sp. e S. aureus as bactérias foram submetidas às provas bioquímicas de catalase e coagulase e à coloração de Gram.
4.9 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS