Atividade moduladora do treinamento moderado
perante a genotoxicidade induzida pela
doxorrubicina em múltiplos órgãos de ratos
Wistar
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de São Paulo
Campus Baixada Santista,
para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Santos
2012
a genotoxicidade induzida pela doxorrubicina em múltiplos órgãos de ratos Wistar.
Local: Santos - SP Ano: 2012
Atividade moduladora do treinamento moderado
perante a genotoxicidade induzida pela
doxorrubicina em múltiplos órgãos de ratos
Wistar
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de São Paulo
Campus Baixada Santista,
para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Santos
2012
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Atividade moduladora do treinamento moderado perante a genotoxicidade induzida pela doxorrubicina em múltiplos órgãos de ratos Wistar / Renato de Almeida Martins. --Santos, 2012. xii, 64f.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Campus Baixada Santista. Programa de Pós-graduação em Interdisciplinar em Ciências da Saúde
Título em inglês: Physical training modulates genotoxicity induced by doxorubicin in multiple organs of rats.
1.Treinamento físico. 2.Teste do Cometa. 3.Doxorrubicina;. 4.Genotoxicidade. 5.Ratos.
Atividade moduladora do treinamento moderado
perante a genotoxicidade induzida pela
doxorrubicina em múltiplos órgãos de ratos
Wistar
Presidente da banca: Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Rogério Dedivitis Prof. Dr. Rogério Correa Peres
Profa. Dra. Alessandra Medeiros
Profa. Dra. Andrea Cristina Peripato
Aprovada em: 13/02/2012
DEPARTAMENTO DE BIOCIÊNCIAS
Chefe do Departamento de Biociências: Prof. Dr. Odair Aguiar Jr
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
Dedico esse trabalho a todos os envolvidos, diretamente ou indiretamente, que tornaram possível sua realização, pois a sua contribuição, mesmo que mínima, esse trabalho não seria possível ou necessitaria de mais tempo para ser concretizado.
Agradeço ao Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro orientador e amigo, pela sua paciência e principalmente por ter acreditado em mim. Sempre me lembrarei dos bons momentos dentro e fora do ambiente universitário e da oportunidade que me proporcionou. Obrigado.
Ao Prof. Dr. Ronaldo Vagner Thomatieli dos Santos, co-orientador desse trabalho, que possibilitou sua realização e por toda sua ajuda oferecida.
Ao ICB (Instituo de Ciências Biomédicas) da USP que permitiu nossa entrada e que realizássemos todo o treinamento e coleta em suas dependências.
Ao aluno André Araujo Minari parceiro e amigo querido, que me ensinou como realizar o treinamento com os animais e que apesar da sua teimosia me deu um grande apoio durante vários momentos do trabalho.
A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio financeiro, sem essa ajuda seria muito difícil a finalização do mestrado no mesmo intervalo de tempo.
Ao meu amigos do laboratório Carolina Foot , Gustavo Jesus, Juliana Carvalho, Kelly Fernandes, Renan Pozzi, Renata Luri, Victor Hugo, que colaboraram muito com os momentos sérios e de descontração dentro e fora do laboratório.
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SUMÁRIO
Dedicatória ...v
Agradecimentos ...vi
Sumário ...vii
Lista de abreviatura ...ix
Lista de figuras...x Resumo ...xi 1Revisão Bibliográfica...01 1.1Referências ...13 2 Objetivo...18 3 Artigo...19 3.1 Abstract...20 3.2 Introduction...21 3.3 Methods...22 3.3.1 Animals...22 3.3.2 Exercise protocol ...23
3.3.4 Single cell gel (comet) assay...24
3.3.5 Genotoxicity data analysis ...24
3.3.6 Statistical methods ...25 vii 3.3.7 Results………....………...25 3.3.8 Discussion………...28 3.3.9 Acknowledgements ………..30 3.3.10 Conflict of Interest………...30 3.3.11 References……....………...31 4 Anexo ...34 4.1 Comitê de Ética...35 4.2 Prova do Artigo ...37
Lista de Abreviaturas
ANTS Antraciclinas
DNA Ácido desoxirribonucléico DOXO Doxorrubicina
DPM Desvio padrão da média EROS Espécies reativas de oxigênio
HSP72 Proteínas de choque térmico HSP72
IARC Agência Internacional para Pesquisa em Câncer NADPH Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina NFKβ Fator nuclear kappa Beta
NO Óxido nítrico OHˉ Íon hidroxila
OMS Organização Mundial de Saúde SCGE Single cell gel electrophoresis SD Grupo Doxorrubicina sedentário SS Grupo salina sedentário
TS Grupo treinado salina
VO2máx Volume de Consumo Máximo de Oxigênio
ix
Lista de Figuras
Figura 1 - Imagens dos cometas após a execução do ensaio...11
Figure 1 - Danos ao DNA em células de coração de rato ... 26
Figure 2 - Danos ao DNA em células de fígado de rato ... 27
Resumo
A doxorrubicina (DOXO) é um agente quimioterápico utilizado no tratamento de alguns tipos de câncer, a qual promove diversos efeitos colaterais, afetando múltiplos órgãos. Dentre esses, destacam-se genotoxicidade, mielossupressão, náuseas, vômitos, arritmias e cardiopatia severa. Em contrapartida, o exercício físico realizado de forma regular e com intensidade moderada é uma importante ferramenta para manter o bom estado do organismo, enfatizando melhorias nos parâmetros cardiovasculares. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade moduladora do treinamento moderado sobre a genotoxicidade induzida pela DOXO em múltiplos órgãos de ratos Wistar. Foram utilizados 20 ratos Wistar machos, distribuídos em quatro grupos: G1 - Grupo salina sedentário (SS), G2 - Grupo treinado salina (TS), G3 - Grupo DOXO sedentário (SD), G4 - Grupo DOXO treinado (TD). Os animais foram submetidos a um protocolo de treinamento físico de natação, durante nove semanas, por 60 minutos, 5 dias por semana. Após as nove semanas de treinamento, os animais dos grupos tratados (SD e TD), tiveram 15 mg/kg de cloridrato de doxorrubicina injetados, intraperitonialmente. Os grupos controle (SS e TS) receberam 1mL de solução salina. Dois dias após da administração
de seus órgãos (coração, fígado e rim), para realização do teste do cometa. Os resultados revelaram que o treinamento físico foi capaz de evitar a genotoxicidade induzida pela DOXO em células do coração. Por outro lado, o
xi
treinamento físico não impediu a genotoxicidade induzida pela DOXO em células hepáticas e renais, ou seja, sem diferenças estatisticamente significativas (p>0,05) entre os grupos. Em suma nossos, resultados revelam que o treinamento físico pode contribuir para o efeito protetor contra genotoxicidade induzida pela doxorrubicina no tecido cardíaco.
Palavra chave: Treinamento físico; Teste do Cometa; Doxorrubicina;
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O recente aumento nos números de casos de câncer está relacionado ao crescimento e envelhecimento populacional e aos fatores ambientais (Almeida et al., 2005). Um levantamento da Globocan em 2008, divulgado pela Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC), agência vinculada a Organização Mundial de Saúde (OMS), mostra que a maioria dos 12,7 milhões de novos casos de cânceres e as 7,6 milhões de mortes caudadas pela doença em todo o mundo ocorreram principalmente em países com índices de desenvolvimento médio e baixo, sendo que, as regiões menos desenvolvidas são as mais afetadas, tanto em termos de incidência dos novos casos de câncer (56%), quanto de mortalidade (63%) (INCA, 2010).
Os tumores mais comumente diagnosticados em todo o mundo são pulmão (1,61 milhão de casos ou 12,7% do total), mama (1,38 milhão ou 10,9%) e colorretal (1,23 milhão ou 9,7%). O câncer de próstata, pulmão, estômago, cólon e reto são os tipos mais comuns em homens; já para mulheres, o câncer de mama, colo do útero, cólon e reto, estômago e pulmão são os mais freqüentes. Devido ao seu mau prognóstico, o câncer de pulmão foi a principal causa de morte (1,31 milhões), seguido pelo câncer de estômago (780 mil óbitos) e pelo câncer de fígado (699 mil óbitos) (World Cancer Report, 2008).
No Brasil, estimou-se que para os anos de 2010 e 2011 ocorreram, aproximadamente, 489.270 novos casos de câncer. Os tipos mais incidentes são, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma (114 mil casos novos), cânceres de próstata (52 mil) e de pulmão (28 mil) para o sexo masculino, e os
cânceres de mama (49 mil) e do colo do útero (18 mil) para o sexo feminino. A distribuição dos novos casos de câncer segundo localização apresenta-se heterogênea nas regiões Sul e Sudeste, onde se encontram as maiores taxas, enquanto que as regiões Norte e Nordeste estão as menores, e a região Centro-Oeste apresenta um padrão intermediário (INCA, 2010).
Com relação ao tratamento, existem três tipos principais: a cirurgia, radioterapia e quimioterapia e recentemente, normalmente por meio da terapia combinada, tem-se usado a terapia de fotorradiação com derivados hematoporfirínicos e a imunoterapia (Almeida et al., 2005).
O objetivo primário da quimioterapia é destruir células neoplásicas, porém, tais drogas causam alguns efeitos colaterais a citar: náuseas, alopecia e susceptibilidade maior às infecções, pois os quimioterápicos atuam de forma não-específica lesando tanto células malignas quanto normais, principalmente células gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico. Após o tratamento, o corpo recupera-se gradativamente destes inconvenientes, mas mesmo assim o uso dessas drogas exige atenção para seus efeitos colaterais, sendo as vantagens confrontadas com a toxicidade na procura do melhor custo benefício (Almeida et al., 2005).
Os tratamentos de quimioterapia são realizados em múltiplos ciclos. Geralmente, cada ciclo extingue a maioria das células tumorais. Contudo, em grandes tumores, mesmo com um agente antineoplásico eficiente, corre-se o risco de não serem eliminadas a maior parte das células tumorais. Por essa razão, a precocidade no diagnóstico do tumor é essencial para um tratamento eficaz. Muitos estudos, com a combinação de diversos agentes antineoplásicos
estão sendo realizados com o objetivo de aumentar a eficiência da quimioterapia, alcançando-se resultados promissores com índices de cura de 75 a 90% em diversos tipos de câncer (Almeida et al., 2005) .
Dentre os agentes quimioterápicos utilizados para tal finalidade, estão as antraciclinas (ANTS), cuja ação reside na combinação de diferentes mecanismos, o que explica a alta eficiência desta classe de fármacos (Gewirtz, 1999; Zhang et al., 2009; Šimùnek et al., 2009). Os mecanismos propostos são: intercalação em DNA ( Fornari et al., 1996); danos no DNA por meio da inibição da topoisomerase II (Ramachandran et al., 1993); ligação e alquilação de DNA (Cullinane et al.,1994); DNA cross-linking (Skladanowski & Konopaj, 1994 a, b); interferência com o relaxamento do DNA ou separação simples do DNA e atividade helicase (Tuteja et al., 1997; Bachur et al., 1998); formação de radicais livres (Bachur et al., 1978.; Sinha,1989) com consequente dano genético e/ou peroxidação lipídica com efeitos diretos nas biomembranas (Vichi
et al., 1989; Vichi & Tritton, 1992).
A doxorrubicina (DOXO) é um antibiótico com grande efeito antraciclino, que tem sido utilizada com sucesso no tratamento das seguintes neoplasias: leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda, tumor de Wilms, sarcoma de Ewing, neuroblastoma, sarcomas dos tecidos moles e de ossos, carcinoma de mama, carcinoma de ovário, carcinoma avançado do endométrio, carcinoma das células transicionais da bexiga, carcinoma da tireóide, linfomas do tipo Hodgkin e não Hodgkin, câncer testicular refratário, carcinomas de cabeça e pescoço, carcinoma gástrico e carcinoma broncogênico (Adriblastina® RD).
Apesar de sua grande eficácia e de ser considerada como um dos quimioterápicos mais importantes no tratamento contra o câncer, seu uso clínico é limitado devido aos efeitos colaterais causados pela sua utilização. Assim, são utilizadas estratégias de dosagem para diminuir tais efeitos decorrentes do uso da droga como, a administração máxima cumulativa na dose de 550 mg/m² da área da superfície corpórea (Šimùnek et al., 2009; Adriblastina® RD). A DOXO promove diversas alterações sistêmicas, sendo os principais efeitos colaterais a instabilidade genômica, mielossupressão, náuseas, vômitos e arritmias e cardiomiopatia congestiva com severa falha da bomba do músculo cardíaco diminuindo assim, a sobrevida dos pacientes (Singal et al., 2000; Lou et al., 2004).
O risco de cardiomiopatias aumenta em doses cumulativas maiores que 550 mg/m² da área da superfície corpórea. A administração da DOXO deve ser monitorizada por eletrocardiografia, ecocardiografia e curva do pulso da carótida. É recomendada a interrupção do tratamento caso haja uma redução na voltagem da onda QRS em cerca de 30% ou ocorrer um encurtamento da fração em 5% (Šimùnek et al., 2009; Adriblastina® RD).
A DOXO em concentrações clinicamente relevantes é capaz de se intercalar com o DNA, afetando suas funções como a síntese de DNA e RNA (Buschini et al., 2003). Ocorrem rupturas de filamentos únicos e duplos, bem como troca de cromátides irmãs. Acredita-se que a cisão do DNA seja mediada pela ligação do fármaco ao DNA e topoisomerase II, que é uma proteína pertencente a família de enzimas que catalisam as reações de desenrolamento
da dupla hélice para que possa ocorrer transcrição e replicação, ação que impede o reparo genômico (Ramachandran et al., 1993).
De um modo geral, as antraciclinas (ANTS), devido o seu grupo quinona, geram radicais livres, já na presença de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NADPH), reagem com o citocromo P450 redutase, para que a forma intermediária de radicais semiquinonas, possam reagir com o oxigênio para produzir radicais de ânion superóxido. Esses oxidam as bases nitrogenadas do DNA devido a formação de peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila (OHˉ) (Bachur et al., 1978; Sinha, 1989). A interação da DOXO com o ferro, presente no organismo, intensifica a formação de radicais livres. Além disso, as reações de transferência de elétrons intramoleculares dos intermediários semiquinonais resultam da geração de peróxido lipídico, óxido nítrico e outros radicais destrutivos (Vichi et al., 1989; Vichi & Tritton, 1992).
Acredita-se que as defesas enzimáticas, como a superóxido dismutase e a catalase, desempenham um importante papel na proteção das células contra a toxidade das ANTS, podendo ser otimizadas por antioxidantes exógenos como o α - tocofenol ou por um quelante do ferro, o dexrazoxano (antigamente denominado ICRF-187) (Zhang et al., 1996), que protege contra a cardiotoxicidade. As ANTS também podem interagir com as membranas celulares, induzindo peroxidação lipídica e, por conseguinte, alterando suas funções, o que pode desempenhar um importante papel tanto nas ações antitumorais desses fármacos quanto na sua cardiotoxicidade (Vichi et al., 1989; Vichi & Tritton, 1992; Goodman & Gilman, 1996).
A exposição de células às ANTS resulta em apoptose. Os mediadores desse processo incluem o sensor de lesão do DNA, ativação da p53 e caspases (proteases), embora a ceramida, um produto de degradação dos lipídios, e o sistema de receptor fas- ligante também estão relacionados (Kastan et al., 1991).
Devido a administração da DOXO ser intravenosa, esta causa alterações sistêmicas no organismo. Os danos causados pelos radicais livres em cardiomiócitos são os mecanismos mais bem aceitos para tentar explicar a cardiotoxicidade causada pelas ANTS. Doroshow et al., 1985 propuseram que o tecido cardíaco tem atividade antioxidante fraca, uma vez que é desprovido de catalase, e que a DOXO diminui a concentração de glutationa peroxidase. Os cardiomiócitos, são ricos em mitocôndrias que representam até 50% da sua massa, quando expostos a altos níveis de peróxido de hidrogênio originam, assim, espécies reativas de oxigênio (EROS).
No final de 1970, a primeira retrospectiva de estudos clínicos foram publicados e mostraram, de forma convincente, que as perturbações cardíacas observadas podem ser diretamente atribuídas à administração de ANTS. Nesta mesma época, foram estabelecidas as doses acumulativas das ANTS e as perturbações classificadas em quatro tipos:
1 Cardiotoxicidade "aguda", ocorre durante a administração das ANTS ou imediatamente depois, envolve hipotensão, vasodilatação e transitórios distúrbios do ritmo cardíaco.
2 Sub-crônica, cardiotoxicidade extremamente incomum, manifesta-se como uma síndrome pericardite-miocardite dentro de 1-3 dias após o tratamento. 3 Crônica antecipada, desenvolve-se em semanas ou meses, após a conclusão da quimioterapia. É caracterizada por cardiomiopatia dilatada ou, menos frequentemente, restritivas, com o desenvolvimento subsequente de disfunção ventricular esquerda, disfunção contrátil e falha cardíaca congestiva.
4 O último tipo é cardiotoxicidade "atrasada", também chamada de "crônica de início tardio", pode se manifestar décadas após a conclusão do tratamento (Šimùnek et al., 2009).
Além da dose total acumulada da droga, outros principais fatores de risco para desenvolvimento de cardiotoxicidade incluem: idade, tratamento concomitante (ou anterior) com drogas cardiotóxicas e doença cardíaca (Barry
et al., 2007).
Devido a grande utilização da DOXO para o tratamento de muitos tipos de cânceres, diversas estratégias têm sido realizadas como o intuito de prevenir e atenuar os efeitos colaterais do uso da droga, como uso de infusões lentas de antioxidantes (Doroshow et al., 1979; Quiles et al., 2002) suplementação alimentar (Borek et al., 2001; Ferreira et al., 2007) e exercício físico (Di Meo & Venditti et al., 2001; Zaldivar et al., 2006; Wonders et al., 2008; Chicco et al., 2006).
Especificamente, os benefícios do treinamento físico aeróbio sobre o sistema cardiovascular já são bem estabelecidos, como a capacidade de reduzir o risco de doença cardíaca, controle da hipertensão, proteção contra
lesões causadas pelo estresse oxidativo, diminuição nos níveis de apoptose, melhora da sensibilidade à insulina, diminuição do peso corporal, e melhora do estado de humor (Wonders et al., 2008).
O exercício físico induz a expressão de várias proteínas citoprotetoras, como as proteínas de choque térmico 72 (HSP72), e enzimas antioxidantes como a CuZn - superóxido dismutase, e a Mn - superoxide dismutase, além de modular mudanças hormonais, metabólicas, e alterações no fluxo sanguíneo periférico, devido a liberação de óxido nítrico (NO) e angiogênese (Smuder et
al., 2011; Jones et al., 2005).
Dessa maneira, o exercício físico aumenta a capacidade antioxidante do coração em condições de estresse oxidativo. Brown et al. (2003) demonstraram que ratos treinados aumentaram a expressão de sistemas antioxidantes protegendo contra isquemia e reperfusão do miocárdio, uma condição mediada em grande parte, pela liberação de EROS.
Considerando que o estresse oxidativo é o principal meio pelo qual a apoptose é ativada, um aumento do estresse oxidativo, devido a administração da DOXO, pode resultar na estimulação da apoptose do cardiomiócitos. Entretanto, o treinamento físico poderia proteger os cardiomiócitos contra apoptose, após exposição à DOXO. Embora o mecanismo exato ainda não esteja claro, é possível que o treinamento físico altere a regulação das caspases, diminuindo os índices de apoptose, regulando o sistema pró e anti-apoptótico (Wonders et al., 2008).
Evidências indicaram que corações de ratos fisicamente ativos apresentam resistência contra disfunção cardíaca, peroxidação lipídica e apoptose induzida pela exposição aguda à DOXO (Chicco et al., 2006; Ascensão et al., 2005). Da mesma forma, estudos demonstraram que a prática do exercício físico realizado de 30 a 70 % do VO2máx, por 30 a 60 minutos estimula a expressão de NO em células musculares de roedores, pela via fator de transcrição NFKΒ (Silveira et al. 2007). Contudo, quando o exercício físico é praticado em intensidades elevadas (maior que 70 % do VO2máx) pode levar a um quadro de imunodepressão, principalmente pela elevação dos hormônios contra regulatórios (Silveira et al. 2007). Nesse sentido, foi proposto que o exercício físico apresenta uma relação em “U” invertido, ou seja, quando é praticado de forma moderada prepara o organismo a se defender de vários agentes estressores, e quando praticado em intensidades elevadas promove situações imussupressoras semelhantes ao indivíduo sedentário (Zaldivar et
al., 2006).
Estudos realizados em modelo animal apontaram que o exercício físico quando praticado de forma aguda, em diferentes intensidades ou quando realizado um programa de treinamento físico moderado (50 a 70% VO2máx de 30 a 60 minutos) previne os danos cardiotóxicos da DOXO em roedores (Chicco et al., 2006).
Dentre as diferentes técnicas utilizadas para detectar danos causados por substâncias genotóxicas, a eletroforese em gel de células individualizadas (em inglês single cell gel electrophoresis, ou SCGE), também denominada de
ensaio cometa (comet assay) vem sendo utilizada com sucesso em várias espécies de organismos, inclusive em humanos (Rojas et al., 1999).
O SCGE é um método de estudo genotoxicológico altamente sensível, que avalia danos ao DNA de células individuais e possibilita quantificar quebras da fita. Possui custo relativamente baixo, rapidez, precisão e reprodutibilidade. Qualquer tipo celular pode ser avaliado, bastando que as células a serem analisadas apresentem núcleo. Uma característica importante do ensaio do cometa é a necessidade de utilização de apenas pequena quantidade de células para sua realização. O desenvolvimento da técnica se deve principalmente aos trabalhos de Östling & Johanson et al. (1984), pela metodologia de eletroforese do DNA em micro-gel; e de Singh et al. (1988), que aumentaram a sensibilidade do teste por meio do uso de solução alcalina (Tice
et al., 2000).
As células submetidas ao ensaio cometa são inseridas em gel de agarose, de baixo ponto de fusão, e dispostas em fina camada sobre lâminas histológicas previamente embebidas com agarose de ponto de fusão normal. Por meio de solução contendo detergente e alta concentração de sais, as membranas da célula, núcleo e organelas são rompidas; os componentes citoplasmáticos e proteínas nucleares são retirados; o DNA permanece altamente enrolado na presença de proteínas não-histônicas, mas quando são colocadas em uma solução alcalina (pH>13), no chamado processo de desenrolamento, o DNA começa a relaxar. A partir do processo de eletroforese, fragmentos de DNA migram no sentido do ânodo, quanto mais intensa for a indução de danos ao DNA e consequentemente quebras, menores serão os
fragmentos e maior a extensão de migração. Após coloração, observam-se as lâminas, e o DNA danificado revela-se com forma similar a de um cometa, com a cauda correspondendo aos fragmentos que migraram (Figura 1). O dano pode ser quantificado em células individuais, permitindo avaliar o potencial genotóxico de amostras ou de condições ambientais consideradas suspeitas (Tice et al., 1995).
Figura 1. Aparência de cometas após a execução do ensaio. A - célula sem dano e B - célula com danos genéticos. X40, coloração brometo de etídio.
Tradicionalmente, a coloração do material é feita com brometo de etídio e analisada por microscopia de fluorescência, tendo intensidade proporcional à quantidade de DNA presente. No entanto, essa coloração apresenta alguns fatores negativos, como ação mutagênica do corante, necessidade de equipamentos específicos para análise e curta durabilidade da coloração (Reinhardt-Poulin et al., 2000)
O ensaio cometa detecta um amplo espectro de danos no DNA (quebras nas fitas simples e duplas, sítios sensíveis a álcalis, sítios com reparação tardia) e está sendo cada vez mais utilizado como um teste de genotoxicidade in vitro e in vivo em uma grande variedade de organismos.
Comparado com ensaios de genotoxicidade comumente utilizados, as vantagens da técnica incluem: (1) sensibilidade para detectar baixos níveis de
danos no DNA, (2) exigência de pequeno número de células por amostra, (3) baixo custo; (4) facilidade de aplicação; (5) capacidade de realizar estudos usando uma quantidade relativamente pequena de substância-teste e (6) período de tempo relativamente curto (alguns dias) necessário para execução do experimento (Tice et al., 1995).
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2 OBJETIVO
Avaliar a atividade moduladora do treinamento físico de intensidade moderada perante a genotoxicidade induzida pela doxorrubicina em múltiplos
órgãos de ratos Wistar por meio do teste em células individualizadas em gel de agarose (teste do cometa).
3 ARTIGO
Exercise preconditioning modulates genotoxicity induced by doxorubicin in multiple organs of rats #
Renato Almeida Martins1, André Luis Minari1, Marcelo Donizetti Chaves1,
Ronaldo Wagner Thomatieli dos Santos1, Luis Fernando Barbisan2, Daniel Araki
Ribeiro1
1Department of Biosciences, Federal University of São Paulo, (UNIFESP),
Santos, SP, Brazil, 2Department of Morphology, Paulista State University, (UNESP), Botucatu, SP, Brazil
Running head: exercise and genotoxicity Corresponding author:
Daniel A. Ribeiro, DDS, PhD Departamento de Biociências
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP Av. Ana Costa, 95
Vila Mathias Santos - SP Brazil Zip code: 11060-001 Phone: +55 13 32218058 Fax +55 13 32232592
e-mail: daribeiro@unifesp.br, daribeiro@pesquisador.cnpq.br
# Artigo aceito para a publicação na revista “Cell Biochemistry and Function”
The aim of this study was to investigate the effects of exercise in multiple organs of rats treated with doxorubicin. Male adult Wistar rats were distributed into the following groups: sedentary + NaCl; exercise + NaCl; sedentary + doxorubicin; exercise + doxorubicin. Animals were sacrifed 2 days following injections. Central fragments from heart, liver and kidney were collected and minced in 0.9% NaCl being cellular suspensions used for the single cell gel (comet) assay. The results showed that exercise was able to prevent genotoxicity induced by doxorubicin in heart cells. By contrast, exercise was not able to prevent genotoxicity induced by doxorubicin in liver cells. The same occurred to kidney cells, i.e. no statistically significant differences (p>0.05) were found when compared to groups non-exposed to doxorubicin. Taken together, our results support the idea that exercise could contribute to the protective effect against genotoxicity induced by doxorubicin in heart cells.
Key-words: exercise; single cell gel (comet) assay; doxorubicin; DNA damage;
3.2 Introduction
Doxorubicin (DOX), an anthracycline antibiotic, is an excellent anti-tumor drug in treating several types of solid cancer, leukemia and lymphomas. Several mechanisms are considered to be responsible for the anti-tumour effects of DOX, such as: DNA synthesis inhibition; DNA binding and alkylation; DNA cross-linking; interference with DNA strand separation and helicase activity; direct membrane effects; the initiation of DNA damage via the inhibition of topoisomerase I, and free radical formation and lipid peroxidation.1
Currently, the clinical efficacy of this anti-tumor drug is greatly limited because of severe side effects, the most serious being cardiotoxicity.2
Furthermore, renal injury has been reported to occur as part of the toxic syndrome induced by DOX.3
Although improvements in cancer treatment strategies have been addressed in recent decades, DOX toxicity remains a clinical dilemma. Nowadays, there is little information regarding whether regular exercise (EXC) above a certain intensity or duration could have beneficial effects. Accumulating evidence suggests that EXC enhances oxygen consumption, in an intensity dependent fashion, which is associated with augmented generation of immediate oxidative by-products: reactive oxygen species.4 EXC-induced
increases in oxygen radical species production stimulates enzymatic and nonenzymatic antioxidant responses, especially in cases of recurrent efforts.5 In
fact, some studies have postulated that EXC training can protect the heart against DOX toxicity.5,6 However, no studies have been conducted to determine
if, and to what extent, EXC preconditioning can protect against the toxicity of DOX in multiple organs of Wistar rats. This justifies this study and others as well.
One useful method for quantifying DNA damage is the alkaline comet assay (single-cell gel electrophoresis).6 The alkaline version of the single cell gel
(comet) assay used is sensitive for a wide variety of DNA lesions. Among them are single- and double strand breaks, alkali-labile sites including abasic and incomplete repair sites, and DNA-DNA/DNA-protein/DNA-drug cross-linking in any eukaryotic cell.7 Because of its simplicity and sensitivity, the comet assay
has gained fast acceptance as a genotoxicity assay.8 Our group has
consistently demonstrated that the single cell gel (comet) assay is a useful tool for detecting DNA breaks in multiple organs and under different paradigms, such as medium-term carcinogenesis assays, acute EXC, sleep deprivation, drug abuse or even following exposure to xenobiotics present in the environment in vivo.9-12
Thus, the primary purpose of this study was to determine whether EXC preconditioning results in protection against the genotoxicity induced by DOX in multiple organs of Wistar rats.
3.3.1 Animals
The study was performed using male Wistar rats (250-350g) that were bred in the animal facility of CEDEME (Development Center of Experimental Models for Medicine and Biology). The animals were maintained under controlled conditions of temperature (23±1ºC), light-dark periods of 12-12 h, with free access to commercial diet (Nuvilab) and water. All experimental procedures were conducted according to Ethical and Practical Principles of the use of Laboratory Animals guidelines and experimental protocol was approved by the Ethical Committee of the Federal University of Sao Paulo.
3.3.2 Exercise protocol
The EXC protocol was conducted according to Gobbato et al.13 In brief,
rats were trained to swim 60 min/day, 5 days a week, with an overload of 8% body wt. during 9 weeks, in the same device where the first series of experiments took place. EXC sessions lasted 10 min on the first day of the training period and were increased by 10 min each 7 days. At the end of the 7th day the animals swam continuously for 20 min and at the end of the 14th day, they swam for 40 min. Continuous EXC (60 min) was performed from the 21st day until the end of the training period. Sedentary rats placed in shallow water at 31±1°C, 30 min, 5 days/week, were used as controls.
Twenty-four hours following the completion of the EXC training or sedentary period, animals were randomized into four experimental groups: sedentary + NaCl; EXC + NaCl; sedentary + DOX; and EXC + DOX. Sedentary + DOX and EXC + DOX groups were administered a 15 mg/kg i.p. bolus injection of DOX-HCl (Eurofarma, Campinas, Brazil). Rats in the sedentary + NaCl and EXC + NaCl groups received 1 mL injections of 0.9% sterile NaCl in lieu of DOX . All animals were sacrifed 2 days following injections.
The sacrifice was performed in a rapid procedure by decapitation. This short procedure was adopted because DNA damage due to death can occur by one hour postmortem. Central fragments from heart (a total homogenate from all chambers), liver and kidney were collected and minced in 0.9% NaCl. Cellular suspensions (~10 µl) were used for the single cell gel (comet) assay.
3.3.4 Single cell gel (comet) assay
The protocol used for heart, liver and kidney cells followed the guidelines outlined by Tice et al.7 with some modifications. Briefly, a volume of 5 μl from
cellular suspensions from heart, liver or kidney were added to 120 μl 0.5% low-melting-point agarose at 37°C, layered onto a pre-coated slide with 1.5% regular agarose, and covered with a coverslip. Prior to electrophoresis, the slides were left in alkaline buffer (pH>13) for 20 min, and then electrophoresed for another 20 min at 0.7 V/cm, and 300 mA. After electrophoresis, the slides were neutralized in 0.4 M Tris-HCl (pH 7.5), fixed in absolute ethanol, and stored until analysis on a fluorescent microscope at 400× magnification.
3.3.5 Genotoxicity data analysis
A total of 50 randomly captured comets per animal (25 cells from each slide)14 were examined blindly by one expert observer at 400× magnification
using a fluorescent microscope (Olympus). The microscope was connected through a black and white camera to an image analysis system (Comet Assay II, Perceptive Instruments, Suffolk, Haverhill, UK) calibrated previously according to the manufacturer’s instructions. The computerized image analysis system acquires images, computes the integrated intensity profiles for each cell, estimates the comet cell components, and then evaluates the range of derived parameters. Undamaged cells have an intact nucleus without a tail, whereas damaged cells have the appearance of a comet. To measure DNA damage, two image analysis system parameters were considered: tail intensity (% migrated DNA) and tail moment (the product of the tail length and the fraction of DNA in the comet tail).16 Tail moment is a virtual measure calculated by the
computerized image analysis system considering both the length of DNA migration in the comet tail and the tail intensity. This parameter is one of the best indices of induced DNA damage among the various parameters calculated by this method. Since none of the groups showed significant differences between these parameters, we chose tail intensity for the presentation of the results.
3.3.6 Statistical methods
The results obtained in the single cell gel (comet) assay were evaluated statistically with the Kruskal-Wallis non-parametric test followed by the post-hoc Dunn’s test using Sigma Stat for Windows (Jadel Scientific, USA). Values are expressed as mean ± SD. The level of significance was set at p< 0.05.
3.3.7 Results
In this study, we were able to evaluate genetic damage induced by DOX in rats submitted to EXC preconditioning in vivo. Statistically significant differences (p<0.05) in DNA damage were found in heart cells of rats treated with DOX when compared to group non-exposed to anti-tumoral drug (figure 1). Nevertheless, EXC was able to prevent genotoxicity induced by DOX in heart cells. EXC alone did not induce genetic damage.
Figure 1. DNA damage expressed as the mean % tail DNA in rat heart cells
following exposure to DOX and EXC. G1 - sedentary + NaCl; G2 - EXC + NaCl; G3 - sedentary + DOX; G4 EXC + DOX. Values are expressed as Mean + S.D. *p<0.05 when compared to negative control; ** p<0.05 when compared to G3 ( positive control).
By contrast, EXC was not able to prevent genotoxicity induced by DOX in liver cells. The same occurred to kidney cells, i.e. no significant statistically differences (p>0.05) were found when compared to groups non-exposed to DOX. Such findings are shown in Figure 2 and Figure 3. Throughout this study, no animals died during the experiment.
Figure 2. DNA damage expressed as the mean % tail DNA in rat liver cells
following exposure to DOX and EXC. G1 - sedentary + NaCl; G2 - EXC + NaCl; G3 - sedentary + DOX; G4 EXC + DOX. Values are expressed as Mean + S.D. *p<0.05 when compared to negative control.
Figure 3. DNA damage expressed as the mean % tail DNA in rat kidney cells
following exposure to DOX and EXC. G1 - sedentary + NaCl; G2 - EXC + NaCl; G3 - sedentary + DOX; G4 EXC + DOX. Values are expressed as Mean + S.D. *p<0.05 when compared to negative control.
3.3.8 Discussion
The aim of this study was to evaluate protective effects of EXC preconditioning against genotoxicity induced by DOX over different target organs. The investigation was conducted using the single cell gel (comet) assay. To the best of our knowledge, the approach has not been addressed before.
On the basis of tail intensity data, the results of this study displayed that the alkaline single cell gel (comet) assay in the experimental conditions used, was able to detect the presence of DNA damage on heart cells in rats injected
with DOX. Several mechanisms are likely responsible for DOX induced cardiac dysfunction dysfunction including impaired calcium handling,15 alterations in
cardiac contractile proteins,16 impaired mitochondrial respiration5. A large body
of work has been completed indicating that DOX cardiotoxicity is initiated by oxidative stress.17
EXC was able to decrease DNA damage induced by genotoxin. Our results are fully in agreement with previous studies investigating the utility of EXC preconditioning in alleviating the cardiotoxicity of DOX.18,19 Probably,
attenuations in cardiac MDA and caspase activities support our hypothesis that EXC training protects against cardiac oxidative stress and the accompanying upregulation of apoptotic pathways. EXC training has been shown to protect the heart against oxidative stress by increasing glutathione and upregulating cardiac copper/zinc-superoxide dismutase, manganese-superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase activities, and protein expression.20 These
EXC-induced increases in the antioxidant status of the heart have been shown by others to be beneficial under conditions of oxidative stress as far as to prevent genetic damage on cardiomyocytes.
According to the in vivo single cell gel (comet) assay guidelines,7 it is
recommended to analyze cells from liver, since it is a main organ for metabolism. Our results demonstrated that EXC was not also able to prevent DNA breakage induced by DOX on liver cells. As these findings are novel and the underlying mechanisms are still unknown, it is difficult to satisfactorily explain these observations. Independent of a biological mechanism involved in this phenomenon, it seems that liver is a non-sensitive organ closely involved to
EXC. However, it is not clear how EXC is able to exert these biological actions in this metabolic organ since the development of tumours in target cells depends not only on the initial levels of induced DNA damage and its repair, but also on other contributing factors including the production of reactive metabolites, their distribution, and their effect on cell proliferation.21 In this
context, genotoxicity tests do not always reflect carcinogenicity. Furthermore, in vitro and in vivo genotoxicity tests detect compounds that induce genetic damage directly or indirectly by various mechanisms. Nevertheless, no single test is capable of detecting all genotoxic agents. Thus, for a more detailed judgment on the genotoxic potential of EXC and DOX on liver cells, a battery of tests is feasible.
To further elucidate the possible outcomes of acute EXC on kidney exposed to DOX, we were able to evaluate the genotoxicity in this organ as well. Our results revealed that this condition was not able to exert any protective effects in this experimental design. This is important to stress that the single cell gel (comet) assay does not necessarily predict the mutagenic potential of chemical; moreover, the genotoxicity of EXC can be modulated in combination with other DNA-damaging agents that are present in the cell. This could explain our results found.
In summary, our results suggest that EXC could contribute to the protective effect against genotoxicity induced by DOX in heart cells of rats. However, this suggestions should be verified by further investigation.
3.3.9 Acknowledgements
This study was supported by CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico, Grant number: 561357/2008-0) and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). DAR is a recipient of fellowship from CNPq. RAM is a recipient of fellowship from CAPES.
3.3.10 Conflict of Interest
3.3.11 References
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4 ANEXOS
