PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS - PPGDITM
SILVANA TERESA LACERDA JALES
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROGEL CONTENDO Aloe vera (L.) Burman f.
ORIENTADOR: Prof. Dr. TULIO FLAVIO ACCIOLY DE LIMA MOURA COORIENTADORA: Prof.ª Dra. GIRLIANE REGINA DA SILVA
NATAL 2018
SILVANA TERESA LACERDA JALES
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROGEL CONTENDO Aloe vera (L.) Burman f.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Doutor.
Natal-RN 2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Jales, Silvana Teresa Lacerda
Desenvolvimento tecnológico e caracterização de hidrogel contendo Aloe vera (L). Burman f. / Silvana Tereza Lacerda Jales. – 2020.
90f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Tulio Flávio Accioly de Lima Moura. Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Girliane Regina da Silva.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Desenvolvimento e Inovação Tecnológica. Natal, RN, 2020.
1. Aloe – Tese. 2. Babosa – Tese. 3. Psoríase – Tese. 4. Acemanana – Tese. I. Moura, Tulio Flavio Accioly de Lima. II. Silva, Girliane Regina. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 582.573.41
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
Aos meus pais Benjamim Fernandes Jales (in memoriam) e Sonia Maria Lacerda, amores da minha vida.
A minha filha Maria Teresa, ser especial, presença diária de amor e motivação.
Ao Luiz, companheiro de todos os momentos, pela compreensão e carinho ao longo do período de elaboração deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me dado saúde e sabedoria para a execução deste trabalho e ao meu guia espiritual João.
Agradecimento muito especial ao Prof. Dr. Tulio Flavio Aciolly de Lima Moura, por ter acreditado no projeto que foi proposto, pelo acolhimento, ensinamentos e voto de confiança nessa difícil jornada. Acima de tudo, sou muito grata à amizade e aos conselhos dados.
À Professora Girliane, coorientadora, pelo acolhimento e construção desta tese.
À Professora Tânia Sarmento, pela atenção, disponibilidade e por ter proporcionado a execução de experimentos em seu laboratório de pesquisa.
À Professora Lyghia, pela “adoção” e incentivo nos momentos complicados. Foi enorme sua contribuição na construção desse trabalho.
À Professora Raquel, pela cooperação fundamental na elaboração da tese.
Ao Professor Fábio Souza, companheiro e amigo do Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPB, pela luz no fim do túnel.
Aos demais professores que contribuíram com a minha formação.
À Judite e Ednaldo, amigos do LDM e LEFI, que sempre me ajudaram com prontidão e boa vontade.
À Wellington de Lima Navarro, pela disponibilidade nos experimentos de espectrofotometria. Amigo de sempre e grande incentivador.
À Wilbur e Lyghia pelas prosas descontraídas no apartamento do Alto do Juruá.
À gloriosa Família Lacerda, em especial a vovó Teresa (in memoriam), vovô Justo, Salete, Sueli, Servulu, Stenio, Ana Teresa e Matheus, meus melhores momentos de vida foram com vocês.
Ao amigo Edmundo Barbosa, o grande incentivador da minha inserção no mundo dos fitoterápicos.
Às amigas Doralice e Ana Luiza, irmã e sobrinha que a vida me deu.
À minha mãe Sonia Lacerda e a minha filha Maria Teresa, pelo carinho, palavras de incentivo e porto seguro durante este tempo de muita batalha e persistência.
Agradecimento especial à Jose Luiz Andrade da Silva, pelo carinho, companheirismo, apoio e muita paciência! Não sei como você me aguenta, mas eu sou muito feliz ao seu lado!
“As pessoas educam para a competição e esse é o principio de qualquer guerra. Quando educarmos para cooperarmos e sermos solidários uns com os outros, nesse dia, estaremos a educar para a paz.”
RESUMO
A composição química e as propriedades terapêuticas da Aloe vera (L.) Burman f. (A. vera) explicam seu uso potencial nas aplicações cosméticas, nutricionais e farmacêuticas. O gel mucilaginoso de A. vera presente nas folhas é rico em vários compostos, principalmente polissacarídeos. Esses polissacarídeos, dos quais a maioria das atividades terapêuticas reportadas decorre, incluem glucomananas, sendo a acemanana o polissacarídeo predominante. As acemananas têm sido incorporadas em produtos cicatrizantes disponíveis comercialmente para aplicação em ferimentos. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver formulações na forma farmacêutica hidrogel para uso tópico contendo mucilagem de A. vera para ser utilizada em psoríase. Os hidrogéis foram preparados com 80 % p/p de mucilagem de A. vera, alternando dois tipos de polímero (aniônico e não iônico) carbômer 940 1% (FC1 e FC2) ou hidroxietilcelulose 2% (FH3 e FH4), além de conservantes, antioxidantes e sequestrantes. Frações polissacarídeas foram extraídas da mucilagem e empregadas como grupo de marcadores químicos e caracterizadas por difração de raio-X, espectroscopia de infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear (RMN). A quantificação desses marcadores, na matéria-prima (mucilagem) e no produto acabado (hidrogel), foi realizada por meio de técnicas espectrofotométricas na região UV-VIS. Foram obtidos quatro hidrogéis (FC1, FC2, FH3 e FH4) a partir da mucilagem de A. vera, e avaliados quanto às suas características organolépticas, reológicas, pH e teor de acemanana. Os hidrogéis FH3 e FH4 (hidroxietilcelulose) apresentaram teor de acemanana de 6,76 e 4,01 mg/g, respectivamente, FH4 apresentou pH 4,6 e FH3 demostrou comportamento reopético. As formulações com carbômer FC1 e FC2 apresentaram teor de acemanana de 8,69 mg/g e 9,17 mg/g, respectivamente, pH ideal para aplicação em psoríase, boa espalhabilidade, comportamento reológico do tipo pseudoplástico e tixotrópico, portanto, atendendo as características ideais para uma forma semi-sólida de aplicação tópica.
ABSTRACT
Chemical composition and therapeutic properties of Aloe vera (L.) Burman f. (A. vera) explain its potential use in cosmetic, nutritional and pharmaceutical applications. Mucilaginous gel present in the leaves of A. vera is rich in several compounds, mainly polysaccharides. Most of the reported therapeutic activities of these polysaccharides are indicated by the presence of glucomannan, with acemannan being the predominant polysaccharide. Acemannan has been incorporated into commercially available wound healing products for wound application. The objective of the present work has developed a hydrogel for topical use containing mucilage of A. vera to use in skin disease like psoriasis. The hydrogels were prepared with 80% (w / w) of A. vera mucilage, varying two types of polymer (anion and nonionic) carbomer 940 1% (FC1 and FC2) or hydroxyethylcellulose 2% (FH3 and FH4), as well as preservatives, antioxidants and sequestrants. Polysaccharide fractions were extracted from the mucilage. All of them were used as a group of chemical markers and characterized by X-ray diffraction, infrared (IR) spectroscopy and nuclear magnetic resonance (NMR). The quantification of these markers in the raw material, mucilage, and in the hydrogel was carried out using spectrophotometric techniques in the UV-VIS region. Four hydrogels (FC1, FC2, FH3 and FH4) were obtained from the mucilage of A. vera and evaluated for their organoleptic, rheological, pH and acemannan content. The hydrogels FH3 and FH4 (hydroxyethylcellulose) presented acemannan content of 6.76 and 4.01 mg / g, respectively, FH4 presented pH 4.6 and FH3 showed reoptic behaviour. The carbomer formulations FC1 and FC2 presented acemannan content of 8.69 mg / g and 9.17 mg / g, respectively, ideal pH for application in psoriasis, good spreadability, rheological behaviour of the pseudoplastic and thixotropic gels, therefore, taking into account the characteristics ideal for a semi-solid form of topical application.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aspecto geral da planta com a inflorescência (A), cultivo de Aloe vera no horto do IPERFARM/UFPB (B) e (C), destaque para as flores (D) e folhas (E), Corte
transversal da folha (F). Fonte: Autora. ... 21
Figura 2. Estrutura química da acemanana ... 22
Figura 3. Representação esquemática da formação de ligação O-glicosídica (condensação). O inverso da reação é a hidrolise. ... 24
Figura 4. Dispositivo para determinação da espalhabilidade. ... 42
Figura 5. Obtenção da curva de calibração... 52
Figura 6. Frações polissacarídicas de A. vera. ... 54
Figura 7. Espectros de FT-IR das frações polissacarídicas FP1, FP2 e FP3 de A. vera. 56 Figura 8. Espectro de RMN de 1H da fração polissacarídica (FP1) de A. vera. ... 59
Figura 9. Espectro de RMN de 1H da fração polissacarídica (FP2) de A. vera. ... 60
Figura 10. Espectro de RMN de 1H da fração polissacarídica (FP3) de A. vera. ... 60
Figura 11. Difratograma das frações polissacarídicas de A. vera. ... 61
Figura 12. Hidrogéis em processo de obtenção (A) com carbômer e (B) com hidroxietilcelulose ... 63
Figura 13. Imagens do teste de inversão de tudo para os hidrogéis de A. vera. ... 64
Figura 14. Valores de pH para os hidrogéis de A. vera (n=3) ... 65
Figura 15. Espalhabilidade das formulações A. vera em função do peso acumulado. ... 66
Figura 16. Representação gráfica da viscosidade dos hidrogéis e viscosidade da mucilagem de A. vera ... 68
Figura 17. Comportamento reológico (A) mucilagem (B) FC1 e FC2 (C) FH3 e FH4 . 70 Figura 18. Comportamento viscoelástico da mucilagem, FC1 e FC2 ... 71
Figura 19. Curva de calibração da fração polissacarídica (FP3) ... 73
Figura 20. Concentração de acemanana nas mucilagens de A. vera. ... 74
Figura 21. Concentração de acemanana nos hidrogéis de A. vera. ... 74
Figura 22. Varredura dos hidrogéis controle com carbômer e com hidroxietilcelulose, mucilagem 80% e solução de vermelho congo. ... 76
Figura 23. ATR-IR da mucilagem e dos hidrogéis de A. vera. ... 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Caracterizações da mucilagem de A. vera ... 27
Tabela 2. Métodos de caracterização química da mucilagem e seus derivados ... 30
Tabela 3. Insumos farmacêuticos utilizados na preparação dos hidrogéis ... 47
Tabela 4. Composição qualitativa e quantitativa dos hidrogéis de A. vera ... 48
Tabela 5. Rendimento da extração das frações polissacarídicas ... 54
Tabela 6. Bandas de absorção da mucilagem de A. vera e seus derivados. ... 57
Tabela 7. Sinais característicos do deslocamento químico e multiplicidade de pico dos espectros de RMN de 1H da mucilagem de A. vera... 58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABREVIATURAS
CG cromatografia gasosa
DRX difração de raios-x
FC formulação com carbômer
FH formulação com hidroxietilcelulose
FP fração polissacarídica
FT-IV infravermelho com transformada de Fourier
HPAE-PAD high performance aníon exchange pulsed amperometric detector
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
HPSEC cromatografia por exclusão de tamanho
IV infravermelho
MS espectrometria de massas
PC formulação controle com carbômer
PH formulação controle com hidroxietilcelulose
RMN ressonância magnética nuclear
TFA ácido trifluoroacético
UV ultravioleta
UV/VIS ultravioleta na região do visível
SIGLAS
FB5 Farmacopeia Brasileira 5
FDA Food And Drug Administration
IASC International Aloe Science Council
PNM Politica Nacional de Medicamentos
PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápico
RENAME Relação Nacional de Medicamentos
RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS
SUS Sistema Único de Saúde
SUMÁRIO
RESUMO ... vi
ABSTRACT ... vii
LISTA DE FIGURAS ... viii
LISTA DE TABELAS ... ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... x
SUMÁRIO ... xi 1. INTRODUÇÃO ... 14 2. OBJETIVOS ... 17 2.1 Geral ... 17 2.2 Objetivos específicos ... 17 3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 18 3.1 Fitoterápicos no Brasil ... 18 3.2 Aloe vera ... 20 3.2.1 Informações botânicas ... 20 3.2.2 Composição química ... 21 3.2.2.1 Polissacarídeos ... 23
3.2.3 Técnicas de obtenção da mucilagem e da fração polissacarídica ... 25
3.2.4 Metodologias analíticas aplicadas na caracterização de derivados de Aloe vera ... 26
3.2.4.1 Difração de Raios-X ... 32
3.2.4.2 Espectroscopia de Infravermelho (IV) ... 33
3.2.4.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)... 34
3.2.4.4 Espectrofotometria de UV-Visível (UV-VIS) ... 35
3.2.5 Atividade terapêutica... 36
3.2.6 Usos tecnológicos e biotecnológicos ... 38
3.3 Hidrogéis ... 39
3.3.1.1 Espalhabilidade ... 41 3.3.1.2 Viscosidade ... 42 3.3.1.3 Reologia ... 43 4. MATERIAIS E METODOS ... 44 4.1 Materiais ... 44 4.2 Métodos ... 44
4.2.1 Obtenção da matéria-prima vegetal... 44
4.2.2 Obtenção da mucilagem de A. vera ... 44
4.2.3 Extração da fração polissacarídica (marcador analítico)... 45
4.2.4 Caracterização das frações polissacarídicas (FP) ... 45
4.2.4.1 Rendimento ... 45
4.2.4.2 Identificação ... 46
4.2.5. Obtenção do hidrogel ... 47
4.2.5.1 Seleção dos excipientes da formulação ... 47
4.2.5.2 Preparação e acondicionamento das formulações ... 48
4.2.5.3 Formulações dos hidrogéis ... 48
4.2.6 Caracterizações dos hidrogéis ... 49
4.2.6.1 Avaliação das Características Organolépticas ... 49
4.2.6.2. Determinação do pH ... 50
4.2.6.3 Determinação da Espalhabilidade ... 50
4.2.6.4 Avaliação das propriedades reológicas... 50
4.2.7 Quantificação da acemanana ... 51
4.2.7.1 Construção da curva de calibração ... 51
4.2.7.2 Quantificação de acemanana nas mucilagens ... 52
4.2.7.3 Quantificação de acemanana nos hidrogéis ... 53
4.2.8 Espectroscopia de infravermelho – ATR –IR ... 53
4.2.9 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear ... 53
5. RESULTADOS ... 54
5.1 Caracterizações da fração polissacarídica ... 54
5.1.2 Rendimento ... 54
5.1.4 Espectroscopia de Infravermelho (IV) ... 55
5.1.5 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) ... 58 5.1.6 Difração de raios-X ... 61 5.2 Obtenção do hidrogel ... 62 5.2.1 Características organolépticas ... 63 5.2.2 Determinação do pH... 64 5.2.3 Determinação da Espalhabilidade ... 66
5.2.4 Avaliação das propriedades reológicas ... 67
5.3 Determinação do teor de acemanana ... 72
5.3.1 Curva de calibração ... 72
5.3.2 Quantificação de acemanana nas mucilagens (matéria-prima) ... 73
5.3.3 Quantificação de acemanana dos hidrogéis ... 74
5.3.4 Espectroscopia do infravermelho dos hidrogéis e mucilagem ... 76
5.3.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear ... 77
6. CONCLUSÕES ... 79
7. REFERÊNCIAS ... 80
APÊNDICES ... 88
APÊNDICE A - Valores de pH dos hidrogéis de A. vera (n=3) ... 88
APÊNDICE B - Valores da espalhabilidade (Ei) dos hidrogéis de A. vera (n=3) ... 88
APÊNDICE C - Valores da curva de calibração (n=3) ... 88
APÊNDICE D - Teor de acemanana nas mucilagens de A. vera (n=3) ... 89
1. INTRODUÇÃO
A Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (BRASIL, 2006a) aprovada por meio do Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, é um instrumento norteador para o desenvolvimento e fortalecimento da cadeia produtiva nacional de medicamentos fitoterápicos.
Neste contexto, a Relação Nacional de Medicamentos (RENAME) publicada pela Portaria MS/GM Nº 1.897, de 26 de julho de 2017 no âmbito de Sistema Único de Saúde (SUS), onde o Ministério da Saúde instituiu o elenco de fitoterápicos industrializados onde são listados 12 produtos, entre os quais se inclui a babosa (Aloe vera (L.) Burman f.) indicada para o tratamento tópico de queimaduras de 1° e 2° graus e como coadjuvante nos casos de psoríase vulgaris (BRASIL, 2017a).
Aloe vera (L.) Burman f. (Aloe barbadensis Miller) é uma planta medicinal pertencente à família Liliaceae, atualmente conhecida como Asphodelaceae, pelo sistema Angiosperm Phylogeny Group III System - APG III de 2009 (RAY; DUTTA GUPTA; GHOSH, 2013). Das mais de 300 espécies de Aloe, A. vera é a mais amplamente utilizada em medicamentos, cosméticos e em produtos alimentícios. Muitas atividades terapêuticas, incluindo antiviral, antibacteriana, cicatrizante, proteção contra radiação, antioxidante, anti-inflamatória, anticâncer, antidiabéticas, antialérgica, imunoestimulante e atividades de proteção UV têm sido atribuídas a essa planta, em particular, aos seus polissacarídeos (CHOI; CHUNG, 2003; CHUN-HUI et al., 2007; HAMMAN, 2008; NI et al., 2004; RAY; DUTTA GUPTA; GHOSH, 2013; REYNOLDS; DWECK, 1999; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011).
Os polissacarídeos encontrados na A. vera, aos quais a maioria das atividades biológicas é reportada, consistem em dois tipos: acemanana (polissacarídeo extraído a partir do gel interno das folhas) e outras variedades de polissacarídeos constituídos principalmente de substancias pécticas, celulose e também hemiceluloses (CHANG et al., 2006; FEMENIA et al., 1999).
Atualmente, as acemananas têm sido incorporadas em produtos cicatrizantes disponíveis comercialmente no mercado americano como Acemannan Hidrogel™, conhecido como CarrasynTM. Acemannan Hidrogel™ foi aprovado pelo FDA como um produto farmacêutico para aplicação em ferimentos e, mais recentemente, para tratamento de osteíte alveolar (NI et al., 2004; TALMADGE et al., 2004). Existe no
mercado também Acemannan immunostimulantTM, utilizado no tratamento de fibrosarcoma em cães e gatos (NI et al., 2004; TURNER et al., 2004).
Porém, nem a indústria alimentícia do Aloe nem pesquisadores de produtos naturais conseguiram desenvolver um método padrão para analisar e assegurar a quantidade de carboidratos com peso molecular superior a 10.000 Da presentes em produtos comerciais. O International Aloe Science Council (IASC) certifica processos e definições genéricas do material bruto final. Este processo fornece um passo importante e dá ao consumidor alguma confiança de que a indústria reconhece a necessidade de definições e padronização (TURNER et al., 2004).
IASC estabeleceu vários parâmetros qualitativos e quantitativos para avaliar a qualidade dos sucos das folhas de A. vera. O teor de polissacarídeos acetilados é considerado um marcador de qualidade com um padrão mínimo de 5% do peso seco para suco da folha de A. vera e matérias-primas do gel interno da folha, podendo ser analisados por métodos colorimétrico conforme descrito por Eberendu e colaboradores (2005), por ressonância magnética nuclear (RMN) e método do O-acetil descrito por Manna e Mcanalley (1993) (THE INTERNATIONAL ALOE SCIENCE COUNCIL, [s.d.]).
Um método colorimétrico quantitativo para mensurar a acemanana presente na A. vera sem separação previa ou degradação química do polímero foi desenvolvido e patenteado por Eberendu e Mcanalley (1996), onde a acemanana foi descrita como um polissacarídeo único tendo a capacidade de formar conjugado característico por reagir com corante vermelho congo em meio básico, e o aumento da absorção para 540 nm de comprimento de onda é estequiométrico em relação à concentração de acemanana (EBERENDU; MCANALLEY, 1996; RODRIGUEZ, E.R.; MARTIN; ROMERO, 2010).
O uso do gel de Aloe obtido a partir de material de baixa qualidade e técnicas de processamento não padronizadas gera produtos de A. vera de baixa qualidade, com pouca disponibilidade qualitativa e quantitativa dos compostos bioativos (RAY et al., 2015; RAY; ASWATHA, 2013).
Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo principal a obtenção de hidrogéis de A. vera a partir da mucilagem fresca extraída da parte interna das folhas na perspectiva de manter o máximo de suas características naturais bem como sua estabilidade, além de incrementar sua viscosidade. Para tanto, foram desenvolvidas formulações na forma farmacêutica hidrogel para uso tópico contendo 80 % p/p de
mucilagem de Aloe vera, polímeros gelificantes (carbômer 940 ou hidroxietilcelulose), além de conservantes, antioxidantes e sequestrantes. Todas as formulações foram avaliadas quanto as suas características organolépticas, reológicas e físico-químicas.
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Desenvolver e caracterizar uma forma farmacêutica tópica de hidrogel contendo mucilagem fresca extraída das folhas de Aloe vera (L.) Burman f. para aplicação em psoríase.
2.2 Objetivos específicos
Obter a matéria-prima (mucilagem) a partir da extração do gel interno das folhas;
Extrair e caracterizar as frações polissacarídicas (marcador) secas por liofilização, quanto às características morfológicas, espectroscopia de infravermelho e RMN, e rendimento do processo.
Analisar a mucilagem quanto ao teor de acemanana aplicando metodologia espectrofotométrica;
Preparar diferentes formulações de hidrogéis variando-se o tipo e a concentração dos agentes gelificantes;
Avaliar as formulações quanto a formação de hidrogéis;
Caracterizar os hidrogéis quanto as propriedades organolépticas, reológicas, e pH;
Analisar os hidrogéis quanto ao teor de acemanana aplicando metodologia espectrométrica de UV/VIS.
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Fitoterápicos no Brasil
A aprovação da Política Nacional de Medicamentos (PNM) no país, em 1998, iniciou uma série de ações importantes para aumentar a oferta de medicamentos eficazes, seguros e de qualidade, promovendo seu uso racional e ampliando o acesso da população a eles (BRASIL, 1998).
Em 2006 foi criada a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC), no Sistema Único de Saúde (SUS), com base em modelo de atenção humanizada e voltada para integralidade, fundamentos do SUS, com a finalidade de conhecer, apoiar, incorporar e realizar experiências que já vêm sendo desenvolvidas na rede pública de alguns municípios e estados, entre as quais se destacam o uso de medicamentos fitoterápicos (BRASIL, 2006b).
Posterior à PNPIC, no mesmo ano, com o intuito de estabelecer as diretrizes para atuação do governo na área de plantas medicinais e fitoterápicos, instituiu-se a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF). Uma das diretrizes destas políticas é garantir e promover a segurança, a eficácia e a qualidade no acesso aos fitoterápicos inseridos na Relação Nacional de Medicamentos (RENAME) (BRASIL, 2006a).
A Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), constituída de espécies vegetais com potencialidade para avançar nas etapas da cadeia produtiva e de gerar produtos de interesse ao SUS foi instituída em 2008, considerando-se as plantas já utilizadas nos considerando-serviços de saúde estaduais e municipais, o conhecimento tradicional e popular e os estudos químicos e farmacológicos disponíveis, fixando-se assim a RENISUS com 71 espécies, dentre elas a Aloe vera (L.) Burm. f. (BRASIL, 2009a).
Com a finalidade de criar incentivo para a garantia de acesso a plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos, a Portaria Nº 2.982 de 26 de novembro de 2009, aprova as normas de execução e de financiamento da assistência farmacêutica na atenção básica, estabeleceu financiamento tripartite (das esferas federal, estaduais e municipais) para os medicamentos fitoterápicos que contivessem Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek (espinheira-santa), Mikania glomerata Spreng. (guaco), Cynara scolymus L. (alcachofra), Glycine max (L.) Merr. (isoflavona-de-soja), Rhamnus
purshiana DC. (cáscara-sagrada), Uncaria tomentosa (Willd. ex Roem. & Schult.) (unha-de-gato), Harpagophythum procubens DC. ex Meissn. (garra-do-diabo), Schinus terebinthifolia Raddi (aroeira) (BRASIL, 2009b).
Atualmente, além dos medicamentos citados anteriormente, a Portaria Nº 1.897, de 26 de julho de 2017, estabeleceu a Relação Nacional de Medicamentos - RENAME 2017 no âmbito do SUS, onde foram incluídos Aloe vera (L.) Burm. F. (babosa), Salix alba L.(salgeuiro), Plantago ovata Forssk. (plantago) e Mentha x piperita L. (hortelã) (BRASIL, 2017a)
Aloe vera (L.) Burm. f. consta da lista de medicamentos do componente básico da assistência farmacêutica da RENAME 2017, na forma farmacêutica gel e creme com concentração/composição de 10 – 70% de gel fresco, com indicação para tratamento tópico de queimaduras de 1º e 2º graus e como coadjuvante nos casos de Psoríase vulgaris (BRASIL, 2017a).
Em 2014, foi publicada a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) N° 26/2014, que descreve o conceito de “Produto tradicional fitoterápico”, além dos requisitos necessários para sua regulamentação, diferenciando de medicamento fitoterápico. O principal objetivo dessa diferença está nos testes necessários para a verificação da eficácia farmacológica do produto fitoterápico tradicional, que pode ser feita com base no conhecimento entofarmacológico e na literatura e serão isentos de prescrição médica. Essa mudança facilitou o registro de fitoterápicos que ainda não tenham registro junto a Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e que já tenham comprovação de eficácia clinica através da literatura cientifica (ANVISA, 2014).
A mucilagem obtida a partir das folhas frescas de A. vera consta nas monografias da World Health Organization, do Memento Fitoterápico da Farmacopeia Brasileira e do Micromedex. com relatos de utilização em psoríase e queimaduras (BRASIL, 2016; MICROMEDEX 2.0® HEALTHCARE SERIES., [s.d.]; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1999), além de possuir literatura científica de comprovação de eficácia clínica. Fato que auxilia na solicitação de registro de medicamento fitoterápico contendo Aloe vera.
Esta espécie também está presente na Farmacopeia Brasileira (FBV) (2010) com monografia para quantificação de polissacarídeos totais, através da metodologia analítica da hidrolise ácida da mucilagem e quantificação baseada pelo teor de glicose.
3.2 Aloe vera
3.2.1 Informações botânicas
Aloe vera é uma planta arbustiva, dióica, apresenta folhas suculentas, lanceoladas, agudas, verde-glaucas, com manchas esbranquiçadas quando jovens, e caule rizomatoso curto. As folhas, dispostas em roseta, reúne até 20 unidades, com comprimento de 15 cm a 60 cm por 6 a 9 cm de largura e 3 cm de espessura na base. Os bordos foliares são dentado-espinhosos, apresentando acúleos esbranquiçados pequenos, perpendiculares à lâmina. A inflorescência é central, ereta e têm 1 a 1,50 m de altura (Figura 1) (BRASIL, 2010; SILVA JUNIOR, 2003).
A folha da Aloe vera pode ser dividida em duas frações principais, uma epiderme espessa nomeada de pele verde, incluindo os feixes vasculares, e um gel (polpa) interno incolor, denominada gel de Aloe. O exsudato amarelo e amargo presente nas células adjacentes aos feixes vasculares é rico em derivados de 1,8-diidroxiantraquinona e seus glicosídeos, enquanto que a polpa incolor contém proteínas, ligninas, aminoácidos, vitaminas, compostos inorgânicos, pequenos compostos orgânicos, além de diferentes carboidratos, incluindo polissacarídeos e açúcares livres (Figura 1F) (HAMMAN, 2008).
A área interna das folhas (polpa foliar) da A. vera contém células parenquimatosas que produzem um líquido mucilaginoso conhecido como polpa de Aloe, dentre outras terminologias como, gel interno, parênquima foliar, mucilagem e/ou simplesmente gel de Aloe (NI et al., 2004).Seu constituinte majoritário é a água, variando de 98,5 a 99,5% da planta fresca e aproximadamente 60% do remanescente sólido é formado por polissacarídeos (FEMENIA et al., 1999; MANNA; MCANALLEY, 1993). Propriedades físicas e bioquímicas da mucilagem de A. vera já foram bem caracterizadas (FEMENIA et al., 1999, 2003), e extensivamente investigadas (NI et al., 2004; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; SHARRIF MOGHADDASI; KUMAR VERMA, 2011).
Figura 1. Aspecto geral da planta com a inflorescência (A), cultivo de Aloe vera no horto do IPERFARM/UFPB (B) e (C), destaque para as flores (D) e folhas (E), Corte transversal da folha (F). Fonte: Autora.
3.2.2 Composição química
A composição química das plantas do gênero Aloe é em geral bastante semelhante, ocorrendo em algumas espécies compostos em maior concentração que outros, assim como alguma variação entre os compostos existentes. O gel mucilaginoso ou mucilagem consiste principalmente em água (>98%) e polissacarídeos (pectinas, celulose, hemicelulose, glucomanana, acemanana e derivados de manose), sendo a acemanana considerada o componente principal (BOZZI et al., 2007). A glicose consiste em mais de 95% dos açúcares solúveis presentes no referido gel (FEMENIA et al., 1999).
O remanescente sólido do parênquima de reserva é constituído por aproximadamente 60% de polissacarídeos e cerca de 15% constituído por proteínas. O teor de cinzas representa aproximadamente 10% desta fração e a percentagem de lignina não ultrapassa 3%, indicando a ausência de parede celular secundária no tecido de reserva da A. vera (FEMENIA et al., 2003). A composição de açúcares encontrados
nesses polissacarídeos revela a ocorrência de oito monossacarídeos, são eles: arabinose, galactose, manose, glicose, xilose, fucose, ramnose e ácido urônico (FEMENIA et al., 1999; NI; YATES; TIZARD, 2004).
Vários estudos identificam a acemanana como o maior polissacarídeo encontrado na mucilagem da A. vera. É composto por ligações (14) de unidades de manose (>60%) com C-2 ou C-3 acetilado, seguida de glicose (aproximadamente 20%) e, em menor quantidade, de galactose no C-6 (<10%), característica que corrobora a denominação acemanana (CHOI; CHUNG, 2003; DIEHL; TEICHMULLER, 1998; FEMENIA et al., 1999; NI et al., 2004; TAI-NIN CHOW et al., 2005; TALMADGE et al., 2004). Os grupos acetila são os únicos que não são grupos funcionais presentes em açúcares e parecem desempenhar um papel fundamental não apenas nas propriedades físico-químicas, mas também na atividade biológica da A. vera (Figura 2) (CAMPESTRINI et al., 2013; CHOKBORIBAL et al., 2015; NI et al., 2004).
O conhecimento sobre as características da A. vera é a base para uma melhor compreensão das alterações bioquímicas que ocorrem durante o cultivo da planta, o processamento e o armazenamento de seus produtos. Neste contexto, Ni e colaboradores (2004) identificaram e isolaram três componentes da polpa da A. vera, isto é, parede celular, micropartículas e gel líquido. O gel líquido foi considerado o componente estrutural devido a sua viscosidade e sua maior quantidade em peso e volume, e sua contribuição para a natureza suculenta da planta. A manana, presente no gel, é um polissacarídeo solúvel que confere ao gel as características viscoelásticas.
Ainda de acordo com Ni e colaboradores (2004), a mucilagem, ou simplesmente gel, não pode ser considerado uma entidade homogênea, pois apresenta três componentes estruturais diferentes e com composições químicas diferentes. Na parede celular detectou-se presença de ácido galacturônico, que sugere a presença de altos níveis de pectina ou substancias pécticas, as micropartículas ricas em galactose e o gel líquido, presença de manose. Sendo assim, o gel mucilaginoso contém todos esses monossacarídeos. A fração fibrosa do gel de Aloe estudada por Kiran & Rao (2016) reforça a presença de substâncias pécticas.
Chang e colaboradores (2011) realizaram analises da quantidade de carboidrato nas frações da pele, flores e gel de A. vera, concluindo que essas frações são significativamente diferentes. Enquanto que o gel apresentou um percentual de carboidrato de 58,3%, o extrato da pele apresentou um percentual de 37,3% e o extrato das flores apenas 23,4%.
No entanto, Bozzi e colaboradores (2007) verificaram que o gel fresco de A. vera contém principalmente frutose e glicose como açúcares livre (5,3 e 11,9 g/100g de matéria seca, respectivamente) numa razão de frutose:glicose de 1:2, contendo também pequenas quantidades de manose livre, que provavelmente originou-se da degradação do polissacarídeo acemanana.
As flutuações no conteúdo de polissacarídeos podem ser explicadas provavelmente por sofrerem influencias sazonal no cultivo e dos diferentes níveis de irrigação, pelo fato que os resíduos de manoses são oriundos do parênquima de reserva (FEMENIA et al., 1999). Sendo assim, é de grande importância o conhecimento de como as propriedades funcionais e de bioatividade flutuam com os estágios de crescimento, incluído a variação sazonal e a idade da planta (RAY et al., 2015; RAY; ASWATHA, 2013).
3.2.2.1 Polissacarídeos
As moléculas mais abundantes no reino vegetal são os carboidratos, existindo sob a forma de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e seus derivados (ROBYT, 2001).
Os polissacarídeos são polímeros de alto peso molecular resultantes da condensação de um grande número de moléculas de aldoses e cetoses. Cada molécula de açúcar é ligada a vizinha por intermédio de uma ligação osídica formada pela ligação
da hidroxila hemiacetálica em C-1 com qualquer das hidroxilas da outra molécula glicídica, com eliminação de uma molécula de água (Figura 3) (VON POSER, 2017).
Nas ultimas décadas, polissacarídeos de origem vegetal revelaram-se como uma importante fonte de produtos bioativos. Esses produtos têm uma ampla distribuição na natureza e são constituintes essenciais de todos os organismos vivos (VON POSER, 2017).
Os polissacarídeos são responsáveis pela maioria das atividades biológicas observadas a partir do uso da planta de A. vera (HAMMAN, 2008). Contudo, as atividades biológicas de A. vera resultam de uma ação sinérgica de uma variedade de compostos (RADHA; LAXMIPRIYA, 2015). Os polissacarídeos de Aloe consistem em cadeias lineares de moléculas de glicose e manose. Os principais polissacarídeos incluem celulose, hemicelulose, glucomananas, derivados de manose e compostos acetilados, acemanana e glucomanana consideradas os dois principais componentes funcionais da babosa. Acemanana é composta por uma longa cadeia de manose acetilada, isto é, ligado por β-(1,4) manose com pesos moleculares variando de 30 a 40 kDa ou maior (BOZZI et al., 2007; CHOKBORIBAL et al., 2015).
Figura 3. Representação esquemática da formação de ligação O-glicosídica (condensação). O inverso da reação é a hidrolise.
3.2.3 Técnicas de obtenção da mucilagem e da fração polissacarídica
Devido a alta atividade da água na mucilagem da Aloe e sua composição majoritária em carboidratos, o período de vida útil é de apenas 3-4 dias a temperatura ambiente, tornando necessário o uso de processos de estabilização para preservar a maioria dos ingredientes ativos e aumentar sua validade. Então, a estabilização é feita para diminuir a quantidade de água no gel, pela concentração e/ou secagem, sendo o processo de desidratação o mais utilizado (CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014; MINJARES-FUENTES et al., 2017).
O processo de obtenção da mucilagem de A. vera abrange praticamente um mesmo procedimento que inclui: coleta das folhas, lavagem, remoção da epiderme, eliminação da seiva amarela (exsudato), homogeneização (moagem ou prensagem), seguidos de filtração ou centrifugação para a retirada de material fibroso, e estabilização do gel.
A. vera sofre degradação rapidamente após a coleta, sendo assim, técnicas apropriadas são necessárias para serem aplicadas após a coleta no intuito de prolongar a meia vida do produto como a conservação e transporte das folhas em temperaturas baixas (RAY et al., 2015; RAY; ASWATHA, 2013). Resultados melhores são alcançados quando a planta é processada imediatamente após coleta, isto porque a decomposição gradativa do gel inicia-se por reações enzimáticas naturais, bem como por crescimento microbiano (RAMACHANDRA; SRINIVASA RAO, 2008).
O processo de filtração pode envolver filtros de carvão ativo, que é feita para descolorir o gel e remover antraquinonas, principalmente se o gel for para o uso interno, devido às propriedades laxativas dessas substancias (CHANG; CHEN; FENG, 2011; RAMACHANDRA; SRINIVASA RAO, 2008), seguidos de várias etapas de filtração que podem envolver filtros grosseiros (400-800µm) e até filtros mais finos (25-100µm) (MINJARES-FUENTES et al., 2017) para a retirada do material fibroso.
A mucilagem de A. vera quando exposta ao ar, pode sofrer oxidação, decomposição e perda das suas substancias ativas. Para evitar isso são utilizadas técnicas de estabilização, como secagem e pasteurização (ESHUN; HE, 2004; RAMACHANDRA; SRINIVASA RAO, 2008). Os produtos de A. vera são frequentemente estabilizados por desidratação, processo pelo qual pode provocar modificações irreversíveis nas características estruturais do polissacarídeo como: o grau de acetilação, peso molecular e remoção de cadeias laterais. Essas modificações podem
originar alterações nas atividades biológicas e no comportamento reológico desses polímeros (FEMENIA et al., 2003). Há várias técnicas que são empregadas para a desidratação da mucilagem como secagem por ar quente, spray drying, sendo a liofilização a mais utilizada (CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014; FEMENIA et al., 2003; MIRANDA et al., 2010).
É comum também para manter a estabilidade dos sucos das folhas de A. vera adicionar agentes estabilizantes e conservantes no processo de manufatura. Sulfito de sódio ou benzoato de sódio são utilizados para prevenir o crescimento microbiano e sorbato, citrato ou ascorbato são adicionados para evitar a oxidação. O ácido cítrico é comumente usado para ajustar o pH para valores inferiores a 4.6 (AMERICAN HERBAL PHARMACOPOEIA, 2012).
Para a separação e purificação de polissacarídeos comumente são utilizados métodos como precipitação por álcool, cromatografia de troca iônica (CHANG; CHEN; FENG, 2011; CHUN-HUI et al., 2007), cromatografia de permeação em gel (FEMENIA et al., 2003), diálises (MINJARES-FUENTES et al., 2017) e separação por membrana (XING; LI, 2009).
Frequentemente, a extração das frações polissacarídicas é feita com homogeneização da polpa, filtração ou centrifugação para retirada das fibras insolúveis e posterior precipitação por álcool ou fracionamento direto por cromatografia. Estas frações também podem ser obtidas pela imersão das amostras em etanol em ebulição (FEMENIA et al., 1999; MINJARES-FUENTES et al., 2017).
Femenia e colaboradores (2003) avaliaram os efeitos da temperatura de secagem a ar quente nas propriedades físico-químicas do polissacarídeo observaram modificações estruturais na acemanana quando as amostras foram desidratadas usando temperaturas entre 30 a 80 °C, principalmente entre 70-80 °C, comparando os resultados com uma amostra obtida por liofilização. Entre os diferentes processos de desidratação, a liofilização foi descrita como um método de desidratação mais eficiente, conservando as propriedades físico-químicas do gel de Aloe vera em comparação com outros métodos de secagem.
3.2.4 Metodologias analíticas aplicadas na caracterização de derivados de Aloe vera
Há diversas metodologias de caracterização química do gel de A. vera e seus derivados, dentre eles, determinação de carboidratos totais, quantificação da acemanana,
determinação de açúcares livres, determinação de polifenóis totais, vitamina C, vitamina E, ácido urônico, lignina, celulose e análises de metilação (Tabela 1), utilizando-se de técnicas analíticas espectroscópicas tais como: Ressonância Magnética Nuclear (RMN), infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e ultravioleta (UV); técnicas cromatográficas: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia por exclusão de tamanho (HPSEC) e por troca iônica, cromatografia gasosa (CG); e espectrometria de massas (MS) (Tabela 2).
Propriedades físico-químicas do gel de A. vera também são caracterizadas, por meio de ensaios como teste de solubilidade em água, medida de ângulo de contato, analise térmica, difração de raio-X, caracterização morfológica, determinação de firmeza, determinação da cor, teor de umidade, medidas reológicas e determinação de propriedades funcionais, como intumescimento, viscosidade, capacidade de retenção de água e capacidade de adsorção de gordura (Tabela 1).
Tabela 1. Caracterizações da mucilagem de A. vera
Caracterização Físico-Química Referências
Teor de acemanana
(DAVIS; GOUX, 2009; EBERENDU, A. R.; LUTA, G.; EDWARDS, J. A.; MCANALLEY, B. H.; DAVIS, B.; RODRIGUEZ, S.; HENRY, 2005; JIAO; JIA, 2010; KIRAN; RAO, 2016; LUCINI;
PELLIZZONI; MOLINARI, 2013; RAY;
ASWATHA, 2013; SRIARIYAKUL et al., 2016; TAI-NIN CHOW et al., 2005)
Teor de carboidratos totais
(BOZZI et al., 2007; BRASIL, 2010;
CAMPESTRINI et al., 2013; CHANG et al., 2006; CHANG; CHEN; FENG, 2011; CHOKBORIBAL et al., 2015; CHUN-HUI et al., 2007; DAVIS; GOUX, 2009; FEMENIA et al., 1999; FLORES-LÓPEZ et al., 2016; KIRAN; RAO, 2014, 2016; LEUNG et al., 2004; MINJARES-FUENTES et al., 2017; NI et al., 2004; RAY et al., 2015; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; SIMÕES et al., 2012; SRIARIYAKUL et al., 2016; TAI-NIN CHOW et al., 2005; TAN et al., 2012; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012a; XING; LI, 2009)
Teor de açúcares livres (BOZZI et al., 2007; FEMENIA et al., 1999; FLORES-LÓPEZ et al., 2016)
Teor de ácido urônico
(CAMPESTRINI et al., 2013; CHANG; CHEN; FENG, 2011; FEMENIA et al., 1999, 2003; FLORES-LÓPEZ et al., 2016; KIRAN; RAO, 2016;
MEDINA-TORRES et al., 2016; NI et al., 2004; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
Teor de ácidos orgânicos (BOZZI et al., 2007; FLORES-LÓPEZ et al., 2016; JIAO; JIA, 2010)
Teor de polifenóis totais
(BOZZI et al., 2007; CHANG et al., 2006;
FLORES-LÓPEZ et al., 2016; LUCINI;
PELLIZZONI; MOLINARI, 2013; MEDINA-TORRES et al., 2016; RAY et al., 2015; RAY; DUTTA GUPTA; GHOSH, 2013; SRIARIYAKUL et al., 2016; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012b)
Teor de celulose
(FEMENIA et al., 1999, 2003; MEDINA-TORRES et al., 2016; NI et al., 2004; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
Teor de proteínas
(CAMPESTRINI et al., 2013; FEMENIA et al., 1999, 2003; FLORES-LÓPEZ et al., 2016; KIRAN; RAO, 2016; LEUNG et al., 2004; TAN et al., 2012)
Teor de lipídeos (FEMENIA et al., 1999)
Teor de lignina (FEMENIA et al., 1999, 2003; RAY et al., 2015)
Teor de vitamina C (VEGA-GÁLVEZ et al., 2012a, 2012b)
Teor de vitamina E (VEGA-GÁLVEZ et al., 2012b)
Análises de metilação
(CAMPESTRINI et al., 2013; CHANG; CHEN; FENG, 2011; FEMENIA et al., 1999, 2003; KIRAN; RAO, 2016; MINJARES-FUENTES et al., 2017; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; SIMÕES et al., 2012; TAI-NIN CHOW et al., 2005) Análises elemental (FEMENIA et al., 1999; KIRAN; RAO, 2016;
RAY; ASWATHA, 2013) Determinação do peso
molecular
(CHOKBORIBAL et al., 2015; CHUN-HUI et al., 2007; MEDINA-TORRES et al., 2016)
Teste de solubilidade em água (CHOKBORIBAL et al., 2015; MINJARES-FUENTES et al., 2016)
Medida de ângulo de contato (CHOKBORIBAL et al., 2015)
Analise térmica (CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014; RAY et
al., 2015)
Higroscopia (MINJARES-FUENTES et al., 2016)
Difração de raio-X
(CHOKBORIBAL et al., 2015; MINJARES-FUENTES et al., 2017; RAY; ASWATHA, 2013)
Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
(CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014;
CHOKBORIBAL et al., 2015; KIRAN; RAO, 2014,
2016; MEDINA-TORRES et al., 2016;
MINJARES-FUENTES et al., 2017; RAY et al., 2015; RAY; ASWATHA, 2013;
RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
Determinação de firmeza (VEGA-GÁLVEZ et al., 2012a, 2012b)
Determinação da cor
(FEMENIA et al., 2003; MINJARES-FUENTES et
al., 2017; RAY; ASWATHA, 2013;
SRIARIYAKUL et al., 2016; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012a, 2012b)
Determinação da viscosidade (CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014)
Caracterização reológica
(CAMPESTRINI et al., 2013; CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014; KIRAN; RAO, 2014,
2016; MEDINA-TORRES et al., 2016;
MINJARES-FUENTES et al., 2016)
Condutividade eletrica (RAY; ASWATHA, 2013)
Teor de umidade
(CERVANTES-MARTÍNEZ et al., 2014; FLORES-LÓPEZ et al., 2016; MEDINA-TORRES et al., 2016)
pH (FLORES-LÓPEZ et al., 2016; MEDINA-TORRES
et al., 2016)
Teor de cinzas (FEMENIA et al., 1999, 2003; FLORES-LÓPEZ et
al., 2016)
Intumescimento
(FEMENIA et al., 2003; MINJARES-FUENTES et al., 2017; RAY et al., 2015; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
Capacidade de retenção de água
(FEMENIA et al., 2003; MINJARES-FUENTES et al., 2017; RAY et al., 2015; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012b)
Capacidade de adsorção de gordura
(FEMENIA et al., 2003; MINJARES-FUENTES et al., 2017; RAY et al., 2015; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
Análises da composição de carboidratos totais são muito utilizadas e contribuem como um método de monitoramento da qualidade dos produtos derivados do gel. Os carboidratos encontrados na composição do gel de Aloe incluem polissacarídeos, que são os constituintes majoritários da matéria seca, bem como monossacarídeos, açúcares livres e fibras.
O método mais comumente usado para a determinação dos monômeros presentes nas frações polissacarídea ou da acemanana purificada é o método da hidrólise ácida (Tabela 2). As hidrólises ácidas são na grande maioria realizadas com ácido sulfúrico a quente ou pelo método do ensaio fenol-ácido sulfúrico, ácido
sulfúrico-anthrone, além de hidrólises com ácido trifluoroacético (TFA) e ainda por hidrólises enzimáticas. Sendo posteriormente analisado em HPLC acoplado ao detector de Índice de Refração (CHOKBORIBAL et al., 2015; FLORES-LÓPEZ et al., 2016), UV-Visível (BRASIL, 2010; CHANG et al., 2006; KIRAN; RAO, 2014, 2016; LEUNG et al., 2004; RAY et al., 2015; SRIARIYAKUL et al., 2016; TAN et al., 2012; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012b), CG (CHANG; CHEN; FENG, 2011; FEMENIA et al., 1999, 2003; MINJARES-FUENTES et al., 2017; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011) e em HPAE-PAD (High Performance Aníon Exchange Pulsed Amperometric Detector) para análises dos açucares livres após hidrolise (BOZZI et al., 2007).
Tabela 2. Métodos de caracterização química da mucilagem e seus derivados
Analito Preparação da
amostra Técnicas Referências
Carboidratos totais
Hidrólise ácida
HPLC-IV (FLORES-LÓPEZ et al., 2016) HPAE-PAD (BOZZI et al., 2007)
HPLC-UV (TAN et al., 2012)
TLC (CHANG; CHEN; FENG, 2011)
CG (CHUN-HUI et al., 2007; FEMENIA et al., 1999, 2003; MEDINA-TORRES et al., 2016; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; XING; LI, 2009) CG-FID
(CHANG; CHEN; FENG, 2011; MEDINA-TORRES et al., 2016; SIMÕES et al., 2012)
CG/MS
(CAMPESTRINI et al., 2013; DAVIS; GOUX, 2009; LEUNG et al., 2004)
UV
(BRASIL, 2010; CHANG et al., 2006; KIRAN; RAO, 2016; LEUNG et al., 2004; RAY et al., 2015; SRIARIYAKUL et al., 2016; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012a, 2012b)
HPSEC-UV (DAVIS; GOUX, 2009) HPSEC-RI (CHUN-HUI et al., 2007) HPSEC-RI (TURNER et al., 2004)
HPSEC-MALLS (TURNER et al., 2004)
HPSEC-MALLS-RI (CAMPESTRINI et al., 2013)
FT-IR
(CHANG; CHEN; FENG, 2011; CHUN-HUI et al., 2007; KIRAN;
RAO, 2014, 2016;
MEDINA-TORRES et al., 2016;
RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
ATR-FTIR (RAY; ASWATHA, 2013)
1
H NMR
(BOZZI et al., 2007;
CAMPESTRINI et al., 2013; CHUN-HUI et al., 2007; DAVIS; GOUX, 2009; JIAO; JIA, 2010; LEUNG et al., 2004)
13
C NMR
(CAMPESTRINI et al., 2013; CHUN-HUI et al., 2007; LEUNG et al., 2004) Acemanana Hidrólise ácida UV (TAN et al., 2012) HPLC (CHOKBORIBAL et al., 2015) CG (FEMENIA et al., 2003; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011)
CG-FID (MINJARES-FUENTES et al.,
2017)
-
UV
(EBERENDU, A. R.; LUTA, G.; EDWARDS, J. A.; MCANALLEY, B. H.; DAVIS, B.; RODRIGUEZ, S.; HENRY, 2005; KIRAN; RAO,
2016; LUCINI; PELLIZZONI;
MOLINARI, 2013; RAY;
ASWATHA, 2013)
FT-IR (CHOKBORIBAL et al., 2015;
2011; SRIARIYAKUL et al., 2016) 1
H NMR (CHOKBORIBAL et al., 2015;
MINJARES-FUENTES et al., 2017) HPSEC-IR (CHOKBORIBAL et al., 2015)
Açúcares livres -
HPLC (FEMENIA et al., 1999)
HPLC-IR (FLORES-LÓPEZ et al., 2016) HPAE-PAD (BOZZI et al., 2007)
(-) amostras não submetidas à hidrólise
A quantificação do marcador analítico (acemanana) da A. vera vem sendo feita através de vários métodos, desde métodos espectrofotométricos até cromatografia líquida de alta eficiência, incluindo a cromatografia por exclusão de tamanho (Tabela 2). Embora a cromatografia por exclusão de tamanho seja bem mais precisa, seu alto custo em equipamento, colunas cromatográficas e padrões específicos acabam por constituir-se oneroso para sua reprodutibilidade em escala industrial. Essa dificuldade, a disponibilidade de metodologias já estabelecidas em artigos científicos, além do reconhecimento deste método pelo IASC, estimula a aplicação de método espectrofotométrico mais acessível em termos de custo e disponibilidade de equipamento (EBERENDU, A. R.; LUTA, G.; EDWARDS, J. A.; MCANALLEY, B. H.; DAVIS, B.; RODRIGUEZ, S.; HENRY, 2005; EBERENDU; MCANALLEY, 1996).
3.2.4.1 Difração de Raios-X
Os sólidos podem ser classificados como cristalinos ou amorfos. Os sólidos cristalinos são aqueles nos quais átomos, íons ou moléculas apresentam um arranjo periódico, ou seja, que se repete regularmente nas três dimensões. Os sólidos amorfos não contém ordenação espacial a longa distância. Tendem a ser mais energéticos do que os cristalinos, e por isso geralmente apresentam propriedades diferentes, como maiores solubilidade e taxa de dissolução (PRADO; ROCHA, 2015).
A difração de Raios-X consiste em medir ângulos de difração e intensidade característicos de um material policristalino, sendo um método de grande versatilidade e rapidez na aplicação de amostras. Podendo ser utilizado para a caracterização físico-química de materiais sólidos originários de novas descobertas como um requisito
essencial para assegurar a reprodutibilidade na fase de preparação e monitoramento durante o aumento de escala, processamento, fabricação, formulação e armazenamento (BRASIL, 2017b; CAIRA, 2014).
3.2.4.2 Espectroscopia de Infravermelho (IV)
A espectroscopia de absorção na região do infravermelho por transformada de Fourier (FT-IV) é um método rápido e não destrutivo da amostra, necessitando de mínima preparação do material e tem inúmeras aplicações, incluindo análises de fármacos. Considerado adequado para a determinação da presença ou ausência de uma grande variedade de grupos funcionais em uma molécula. Através de FT-IV são detectadas as vibrações das ligações químicas de uma molécula, fornecendo informações estruturais importantes como configuração e conformação química e forças interatômicas associadas às ligações de valência ou a interações intermoleculares (CRUZ, 2014).
A radiação infravermelha (IV) corresponde aproximadamente à região do espectro eletromagnético situada entre as regiões do visível e das microondas. Sendo que a janela espectral utilizada para realização de análises de compostos orgânicos situa-se entre 4000 e 400 cm-1 (SILVERSTEIN; WEBSTER, 1998).
Inúmeros trabalhos científicos têm caracterizado o gel de A. vera permitindo a analise estrutural das biomoléculas em função de suas características químicas, as quais constituem a impressão digital, que possibilita caracterizar as principais bandas de absorção da mucilagem e de seus derivados.
Os FT-IV de diferentes amostras de A. vera indicam a presença de grupos –OH (3420 cm-1), estiramento assimétrico de ligação -CH (2923 cm-1), estiramento de ligação C=O de grupamento acetil (1760- 1740 cm-1), C=O (1650- 1578 cm-1), estiramento assimétrico COO- (1598 cm-1), estiramento simétrico CH3 e COO- (1428 cm-1), estiramento de ligação C-O-C de grupos acetil (1248 cm-1), C-O-C éter em açúcar (1091-1030 cm-1), e bandas de glucan (1031 cm-1) (KIRAN; RAO, 2014; MINJARES-FUENTES et al., 2016).
Picos de intensidade ampla a 3420 cm-1 confirma a presença de grupos hidroxil, uma banda intensa na faixa de 1078-1036 cm-1 também indica a presença de açucares de polissacarídeos como manose, galactose e unidades de glucans (KIRAN; RAO, 2014; NEJATZADEH-BARANDOZI; ENFERADI, 2012).
Kiran & Rao (2014) e (2016) em suas pesquisas com a fração polissacarídica demonstraram a presença de picos em 3420, 1740, 1598 e 1248 cm-1 que indicam a presença de –OH, C=O, COO- e C-O-C estiramentos de grupos acetil, sugerindo que o pó da fração polissacarídica consiste em altos níveis de polissacarídeos de armazenamento, como a acemanana e outras glucomananas. Estes resultados são confirmados em outras observações do polissacarídeo acetilado bioativo (CHUN-HUI et al., 2007; RAY; ASWATHA, 2013; RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; YARON; COHEN; ARAD, 1992).
SRIARIYAKUL e colaboradores (2016) analisaram por espectroscopia FT-IV amostras desidratadas e observaram a presença de bandas de C=O de grupos acetil no comprimento de onda de 1740 cm-1. Houve um notável decréscimo dessas bandas que pode ser atribuído a desacetilação da acemanana durante o processo de secagem. Fato que corrobora com os achados de CHOKBORIBAL e colaboradores (2015) que reportam que a desacetilação completa da acemanana levou ao desaparecimento da absorção da carbonila a 1740 cm-1.
Os espectros de IV das frações obtidas da pele de Aloe e da fração da mucilagem foram similares, indicando que as estruturas macromoleculares são similares. Os sinais do grupo hidroxila e de éter (C-O-C) em unidades de açúcar foram absorvidos em forte intensidade em 3420 cm-1 e 1050 cm-1, respectivamente. Uma banda em 1066 cm-1 nos polissacarídeos da pele e da mucilagem surge devido a presença de componentes de manopiranose. Especificamente, picos nas regiões entre 1736-1740 cm-1 e 1246-1252 cm-1 determinam presença de O-acetil éster (CHANG; CHEN; FENG, 2011).
3.2.4.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)
RMN pode ser usado para a detecção direta e quantificação de componentes de interesse em produtos do suco da folha de A. vera e de matérias-primas para cumprir os requisitos exigidos para a certificação IASC, especificamente, para determinação do teor de polissacarídeos acetilados (acemanana), a presença de glicose e ácido málico e a presença e conteúdo de maltodextrina no caso de adulteração do produto (AMERICAN HERBAL PHARMACOPOEIA, 2012; JIAO; JIA, 2010).
De acordo com Ray e Aswatha (2013) os sinais correspondentes à acemanana e a glicose são claramente evidentes no espectro de RMN. Os sinais em 2,05 e 5,13 ppm, respectivamente sugerem a presença característica de acemanana e glicose.
Além disso, pode-se verificar a presença e conteúdo dos seguintes grupos de compostos: produtos de degradação (por exemplo, ácido lático, ácido succínico, ácido fumárico, ácido acético, ácido fórmico e etanol), conservantes (por exemplo, sorbato de potássio, benzoato de sódio e ácido cítrico/citrato), e outras impurezas atípicas, aditivos, ou adulterantes (por exemplo, metanol, glicina, glicerol, sacarose, maltodextrina, propilenoglicol, etanol) (AMERICAN HERBAL PHARMACOPOEIA, 2012; JIAO; JIA, 2010).
A acemanana pode ser convertida em ácido acético (2,08, 11,00 ppm), ácido láctico (1,34, 2,00, 4,27, 11,00 ppm) e ácido succínico (2,5, 11,00 ppm) por contaminação microbiana e posterior degradação. Portanto, a detecção desses ácidos orgânicos nos espectro de RMN implica em possibilidades de retrodegradação (RAY; ASWATHA, 2013).
3.2.4.4 Espectrofotometria de UV-Visível (UV-VIS)
Esta técnica fora desenvolvida tanto para análises quantitativas de glicose e manose utilizando comprimento de onda 490 nm, com os padrões apropriados para cada monômero (BRASIL, 2010; KIRAN; RAO, 2014, 2016; TAN et al., 2012; VEGA-GÁLVEZ et al., 2012b, 2012a), bem como para análises quantitativas da acemanana no comprimento de onda de 540 nm (EBERENDU, A. R.; LUTA, G.; EDWARDS, J. A.; MCANALLEY, B. H.; DAVIS, B.; RODRIGUEZ, S.; HENRY, 2005; KIRAN; RAO, 2016; LUCINI; PELLIZZONI; MOLINARI, 2013; RAY; ASWATHA, 2013).
Eberendu & McAnalley (1996) desenvolveram método colorimétrico quantitativo para mensurar a acemanana da A. vera sem separação previa ou degradação química do polímero. Vermelho congo (2,4'-difenil-2,2'-diazo-bis-1-nafta lamino-4-sulfonato de sódio) é um indicador usado para estimar ácidos minerais livres e também para a coloração de amostras biológicas.
O comprimento de onda máximo de absorção de luz do vermelho congo em solução aquosa a 1% (p/v) é de aproximadamente 488 nm e a absorção máxima de vermelho congo quando conjugado com acemanana desloca o comprimento de onda para 540 nm. A linearidade obtida pela plotagem das leituras de absorbâncias versus concentração (mg/L) de polissacarídeos apresentou um coeficiente de correlação de 0,999 entre as concentrações de 0,9 a 72,7 mg/L. O método de ensaio colorimétrico desenvolvido tem muitas vantagens em relação a qualquer método atualmente utilizado
para medir polissacarídeos de A. vera, e que o ensaio demonstra precisão na quantidade da verdadeira glucomanana, e que não sofre interferências com outros componentes (EBERENDU, A. R.; LUTA, G.; EDWARDS, J. A.; MCANALLEY, B. H.; DAVIS, B.; RODRIGUEZ, S.; HENRY, 2005).
A análise semi-quantitativa de acemanana por formação de cromógeno vermelho congo-acemanana foi documentada por limitado número de pesquisadores (PELLIZZONI et al., 2012). Acemanana foi descrito como um polissacarídeo único tendo a capacidade de formar conjugado característico por reagir com corante vermelho congo em meio básico, e o aumento da absorção para 540 nm de comprimento de onda é estequiométrico em relação à concentração de acemanana (RODRIGUEZ, E.R.; MARTIN; ROMERO, 2010).
Ray & Aswatha (2013) também utilizaram a técnica espectrofotométrica e observaram que a absorbância do conjugado vermelho congo – acemanana variou com a idade da planta, e com a estação do ano. Foi evidenciado que a planta com 03 anos de idade coletada no verão, produziu um gel mucilaginoso com quantidade maior de acemanana, visto que apresentou maior absorbância do cromóforo em relação à planta de 2 anos e foi superior as coletadas no inverno e período chuvoso.
Patel e colaboradores (2012) encontraram linearidade entre 9,09 µg/mL a 181,82 µg/mL, e coeficiente de correlação de 0,994, numa análise utilizando acemanana como marcador para produtos de A. vera. Os resultados mostram que interações eletrostáticas entre vermelho congo e acemanana contribuem para a reação do complexo cromogênico vermelho congo-acemanana, e possibilitaram quantificar os polissacarídeos bioativos de Aloe em absorbância máxima em 540 nm (PATEL et al., 2012).
3.2.5 Atividade terapêutica
Gel de A. vera é conhecido como agente de cura natural há muitos anos. Sabe-se que o gel de A. vera acelera a cicatrização de feridas (ALI et al., 2013; MAENTHAISONG et al., 2007; SOMBOONWONG; THANAMITTRAMANEE, 2000), protege e acalma os tecidos da pele (KORAC; KHAMBHOLJA, 2011). A glucomanana, um polissacarídeo solúvel em água de A. vera, afeta o fibroblasto, fator de crescimento e estimula a atividade e proliferação dessas células e, finalmente, melhora a produção de colágeno (HASHEMI; MADANI; ABEDIANKENARI, 2015). Mucilagem de A. vera também aumenta a quantidade de colágeno no local da ferida
com ligações transversais melhoradas (BOUDREAU; BELAND, 2006). A propriedade anti-inflamatória e o aumento da produção de colágeno promove o rearranjo dos tecidos epiteliais (HASHEMI; MADANI; ABEDIANKENARI, 2015).
Os benefícios para a saúde associados à A. vera foram atribuídos à sua composição heterogênea, contendo aminoácidos, enzimas, vitaminas, polissacarídeos (pectinas, celulose, hemicelulose, glucomanana, derivados de acemanana e manose) e outros derivados de baixo peso molecular (HAMMAN, 2008). Uma análise dos efeitos do A. vera sobre os requisitos para a cicatrização de feridas, como a manutenção de nutrientes, umidade, oxigenação, controle da inflamação, imunoatividade, epitelização e proliferação de fibroblastos indicaram que os produtos A. vera cumprem quase todas essas necessidades (BOATENG et al., 2008). Por exemplo, descobriu-se que um extrato inteiro do gel tem propriedades anti-inflamatórias no edema induzido por carragenina em patas de ratos (VAZQUEZ et al., 1996). Outros estudos mostraram que o A. vera aumenta o conteúdo de colágeno dentro da ferida, proporcionando cicatrização mais rápida (ZHANG; TIZARD, 1996).
O efeito anti-inflamatório de A. vera é um resultado de manose-6-fosfato e acemanana (REYNOLDS; DWECK, 1999). Foi comprovado que glucomanana e acemanana aceleraram a regeneração do tecido, ativam macrófagos, estimulam o sistema imunológico e têm efeitos antibacterianos e antivirais (BOZZI et al., 2007).
Syed e colaboradores (1996) compararam eficácia e tolerância de um creme hidrofílico de A. vera 0,5% na psoríase leve a moderada com placebo. Os pacientes foram avaliados durante quatro semanas e, seguidos por mais oito meses. A medida do desfecho principal utilizada foi o Índice de Área e de Severidade da Psoríase (do inglês, Psoriasis Area and Severity Index PASI). Ao final de quatro semanas de tratamento 45% (n=27) dos pacientes e 46,7% (n=762) das placas psoriáticas haviam sido curadas, significando uma diferença na pontuação PASI de 9,3 para 2,2. Na comparação entre os grupos, A. vera curou significativamente 83,3% (n=30) dos pacientes contra 6,6% (n=30) do placebo (p<0,001;). O grupo de A. vera também apresentou um número maior de placas crônicas curadas: 82,8% (n=396) contra 7,7% (n=366), respectivamente (p< 0,001) (DENG et al., 2013; MIRODDI et al., 2015; SYED et al., 1996).
Choonhakam e colaboradores (2010) compararam um creme contendo 70% de mucilagem de A. vera com o creme de acetonido de triancinolona 0,1% em pacientes com psoríase leve a moderada (n=40 por grupo). A pontuação PASI também foi a medida de desfecho neste estudo, comparando os dados obtidos antes e nas semanas
dois, quatro e oito do tratamento. Ocorreu perda de três pacientes no grupo de A. vera e dois no grupo controle, e nenhum paciente obteve a remissão completa das lesões após oito semanas de tratamento. Ao final do tratamento 16,2% (n=6) no grupo de A. vera e 10,5% (n=4) no grupo de acetonido de triancinolona tiveram uma diminuição de severidade das lesões superior a 75%. Uma diminuição 50-74% das lesões foi alcançada por 54,1% (n=20) dos tratados com A. vera e 65,8% (n=25) dos tratados com o medicamento controle. No grupo de A. vera, 27% obtiveram melhora inferior a 50% na escala do desfecho contra 23,7% do controle. A diferença média da pontuação PASI entre os grupos controle e tratado com A. vera após oito semanas de tratamento foi de 1,1, indicando que o creme de A. vera foi estatisticamente superior ao de acetonido de triancinolona 0,1% na remissão das lesões. (CHOONHAKARN et al., 2010; DENG et al., 2013; MIRODDI et al., 2015).
Baseado nas propriedades citadas anteriormente, as acemananas atualmente têm sido incorporadas em produtos cicatrizantes disponíveis comercialmente como Acemannan Hidrogel™, conhecido como CarrasynTM
. Acemannan Hidrogel™ foi aprovada pelo FDA como um insumo farmacêutico para aplicação em ferimentos e, mais recentemente, para tratamento de osteíte alveolar (NI et al., 2004; TALMADGE et al., 2004). Existe no mercado também Acemannan immunostimulantTM, utilizado no tratamento de fibrosarcoma em cães e gatos (NI et al., 2004; TURNER et al., 2004), Immuno-10 (DAVIS; GOUX, 2009; JIAO; JIA, 2010), Alcortin® (DAVIS; GOUX, 2009) e Mole-Cure® (SIMÕES et al., 2012).
3.2.6 Usos tecnológicos e biotecnológicos
A mucilagem de A. vera também é considerada uma potencial fonte de gomas e hidrocolóides, tendo inúmeras aplicações em alimentos e também em produtos com finalidades medicinais e cosméticas, devido à presença de moléculas bioativas, como polissacarídeos, proteínas e glicoproteínas (AHLAWAT; KHATKAR, 2011; ESHUN; HE, 2004). Contudo a manutenção da estabilidade estrutural e resistência mecânica da mucilagem ainda é um desafio para as indústrias devido à presença de alto teor de água, degradação enzimática e carga microbiana (KIRAN; RAO, 2016).
A. vera é uma boa fonte de polímeros naturais, sendo explorado extensivamente juntamente com outros biomateriais para aplicações na engenharia de tecidos. Polímeros de A. vera têm potencial para serem usados como biomateriais devido a vantagens como
