O efeito da injeção intracerebroventricular de neuropeptídeo S na expressão de Fos em núcleos dos circuitos de medo em camundongo Swiss

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL. FLADJANY EMANUELLY FAUSTINO DA SILVA. O EFEITO DA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE NEUROPEPTÍDEO S NA EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DOS CIRCUITOS DE MEDO EM CAMUNDONGO SWISS. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como pré-requisito para obtenção do título de mestre em Biologia Estrutural e Funcional. Natal-RN 2016.

(2) 2. FLADJANY EMANUELLY FAUSTINO DA SILVA. O EFEITO DA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE NEUROPEPTÍDEO S NA EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DOS CIRCUITOS DE MEDO EM CAMUNDONGO SWISS. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como pré-requisito para obtenção do título de mestre em Biologia Estrutural e Funcional Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante. Natal-RN 2016.

(3) 3. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB Silva, Fladjany Emanuelly Faustino da. O efeito da injeção intracerebroventricular de neuropeptídeo S na expressão de Fos em núcleos dos circuitos de medo em camundongo Swiss / Fladjany Emanuelly Faustino da Silva. Natal, 2016. 53 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional.. 1. Neuropeptídeo S - Dissertação. 2. Medo condicionado Dissertação. 3. Medo incondicionado - Dissertação. 4. Amígdala Dissertação. 5. Hipotálamo - Dissertação. I. Cavalcante, Judney Cley. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 612.822.

(4) 4. TÍTULO: O EFEITO DA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE NEUROPEPTÍDEO S NA EXPRESSÃO DE FOS EM NÚCLEOS DOS CIRCUITOS DE MEDO EM CAMUNDONGO SWISS. AUTOR: Fladjany Emanuelly Faustino Da Silva. DATA DA DEFESA: 05 / 08 / 2016. BANCA EXAMINADORA. Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante – Orientador Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Prof. Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.

(5) 5. Dedico ao meu esposo e amigo Aquiles Nunes e aos meus pais Francisco Faustino e Maria das Dores..

(6) 6. AGRADECIMENTOS Impossível seria tentar descrever a satisfação e alegria de ter vencido mais uma batalha. Ao longo dessa caminhada e processo de maturação intelectual, deparei-me com pessoas que de uma forma ou de outra me ajudaram na consolidação e construção desse trabalho. Assim, não poderia deixar de expressar minha eterna gratidão: A Deus, primeiramente pela sua imensa bondade em me prover a vida, por me proporcionar forças para continuar a caminhar quando já não as tinha. Ao meu esposo Aquiles Filgueira Nunes, que acompanhou essa trajetória desde o início e me incentivou e torceu incansavelmente para que tudo desse certo. Por todo seu amor, carinho e paciência quando mesmo ao seu lado estava ausente mergulhada em leitura de artigos e correções de textos. Obrigada meu eterno amor. Amo-te muito. Aos meus pais Francisco Faustino e Maria das Dores, pelo amor, paciência e dedicação ao longo de toda minha vida, pelas infindáveis orações e sobretudo pelo cuidado que têm comigo. A minha irmã Flávia Emanuelly, que tem sido meu anjo da guarda, que me escuta e me apóia nas minhas decisões. Ao meu professor/orientador Judney Cley Cavalcante, por toda paciência empregada em me ensinar todas as técnicas e experimentos laboratoriais utilizadas neste trabalho, por todo conhecimento passado e pela confiança em me aceitar como orientanda mesmo ainda sendo muito imatura no âmbito da ciência e pesquisa. Meu muito obrigada. Aos professores Expedito Junior, Ruthnaldo Lima, Fernando Ladd e Miriam Stela pelas inúmeras vezes que sanaram minhas dúvidas, bem como pelas dicas fornecidas e disponibilidade em me ajudar quando precisei. Aos meus colegas de laboratório Nayana pela enorme ajuda nos experimentos, Emanuella e Lucimário, Joacil, Brena, Mayara, Paloma e Nelyane pelos momentos de descontração e especialmente Melquisedec e Wylqui, por ter me acolhido, ajudado e me ensinado tantas e tantas vezes. Meu muito obrigada. A Regina, pelo preparo das soluções. Ao Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN pelo espaço físico e adequada execução desse trabalho..

(7) 7. A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao tamanho original. Albert Einstin.

(8) 8. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Imagem de campo escuro do tronco encefálico de camundongo de uma hibridização in situ marcada com Alexa Fluor 555 mostrando a expressão do RNAm de NPS............................................................................................................... 23. Figura 2 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos à Fos (Fos-ir) no núcleo medial da amígdala (MeA), núcleo hipotalâmico anterior (AHN), núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) e núcleo pré-mamilar dorsal (PMD) ........................................................................................................................................ 29. Figura 3 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir) no núcleo central da amígdala (CeA) e basolateral da amígdala (BLA) ........................................................................................................................................ 30. Figura 4. Expressão da proteína Fos em núcleos das vias de medo condicionado e não condicionado .......................................................................................................... 31 e 32.

(9) 9. LISTA DE TABELAS. Tabela 1 - Núcleos cujos neurônios Fos-ir foram contados e suas respectivas correspondências. de. áreas. de. contagem. ....................................................................................................................................... 26.

(10) 10. LISTA DE ABREVIATURAS AHN. Núcleo Hipotalâmico Anterior. BLA. Núcleo Basolateral Anterior da Amígdala. CeA. Núcleo Central da Amígdala. CHO. Células de Óvarios de Hamster Chinês. CRF. Fator Liberador de Corticotrofina. Fos-ir. Imunorreativo a Fos. GABA. Ácido Gama-aminobutírico. GPCR. Receptor acoplado à proteína G. icv. Intracerebroventricular. IEGs. Genes de Transcrição Imediata. KF. Kölliker-Fusi. LA. Núcleo Lateral da Amígdala. LC. Locus Coeruleus. LPB. Núcleo Parabraquial Lateral. MeA. Núcleo Medial da Amígdala. NMDA. N-Metil-D-Aspartato. NPS. Neuropeptídeo S. NPSR. Receptor do Neuropeptídeo S. PAG. Substância Cinzenta Periaquedutal. PMD. Núcleo Pré-mamilar Dorsal. Pr5. Núcleo Sensitivo Principal do Trigêmeo. RNAm. Ácido Ribonucléico mensageiro. RT-PCR. Proteína C Reativa em Tempo Real. TAG. Transtorno de Ansiedade Generalizada. VMH. Núcleo Ventromedial do Hipotálamo.

(11) 11. LISTA DE ANEXO. ANEXO 1 - Protocolo do Comissão de Ética no Uso de Animais ................................. 48.

(12) 12. SUMÁRIO. RESUMO ABSTRACT 1.. INTRODUÇÃO. 14. 1.1. O PAPEL DA AMÍGDALA NO DESENCADEAMENTO DO MEDO. 16. 1.2. O NEUROPEPTÍDEO S E O SEU RECEPTOR NPSR. 19. 2.. OBJETIVOS. 22. 2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 22. 3.. MATERIAL E MÉTODOS. 23. 3.1. SUJEITOS. 23. 3.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS. 23. 3.2.1. CIRURGIA ESTEREOTÁXICA. 23. 3.2.2. EXPERIMENTO 1: MAPEAMENTO DA EXPRESSÃO DE FOS EM. 23. RESPOSTA AO NPS 3.2.2.1. IMUNOISTOQUÍMICA. 24. 3.2.2.2. COLORAÇÃO DE NISSL. 25. 3.2.2.3. ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DOS DADOS. 25. 3.2.2.3.1. ANÁLISE. DO. TECIDO. E. CONTAGEM. DE. NEURÔNIOS 25. IMUNORREATIVOS A FOS 3.2.2.3.2. ANÁLISE DOS DADOS E ESTATÍSTICA. 27. 4.. RESULTADOS. 28. 5.. DISCUSSÃO. 33. 6.. CONCLUSÃO. 39. 7.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 40. 8.. ANEXO. 48.

(13) 13. RESUMO O medo e a ansiedade são emoções adaptativas caracterizadas por um conjunto de alterações fisiológicas e comportamentais que ocorrem quando os indivíduos se sentem ameaçados fisicamente e/ou psicologicamente. Apesar dos comportamentos de medo e ansiedade serem característicos, estudo das últimas duas décadas têm mostrado que diferentes fontes de medo podem ativar diferentes vias neurais e que há diferenças entre. medo. condicionado (aprendido) e medo incondicionado (inato). As vias do medo condicionado envolvem o córtex frontal medial e os núcleos central e basolateral da amígdala, enquanto o medo de predador (inato) envolve o núcleo medial da amígdala e núcleos da zona medial do hipotálamo. Sabe-se que as funções encefálicas são coordenadas por sistemas de neurotransmissores e seus receptores que são expressos nas mais diversas regiões do sistema nervoso, exercendo diferentes funções. O Neuropeptídeo S (NPS) é um neurotransmissor cujo estudos em roedores mostra sua importância como regulador de ansiedade e vigília, reduzindo a ansiedade, aumentando a vigília e o comportamento locomotor, sendo então um ansiolítico e estimulante, o que o torna um potencial alvo para estudos farmacológicos e clínicos. Neste trabalho realizamos a injeção intracerebroventricular (icv) de NPS em camundongos e mapeamento da expressão de Fos (proteína indicadora de atividade celular) em núcleos envolvidos nas vias de medo condicionado e incondicionado. A análise dos nossos resultados mostraram que a administração icv de NPS promoveu uma expressão de Fos diferenciada nos núcleos central e basolateral da amígdala, indicando um papel no medo condicionado.. Palavras-chave: Neuropeptídeo S; medo condicionado; medo incondicionado; amígdala; hipotálamo..

(14) 14. ABSTRACT Fear and anxiety are emotions featured by a group of physiological and behavioral changes that occur when subjects feel threatened physically and/or psychologically. For the last two decades many studies have showed that different sources of fear are able to activate different neural pathways, where conditioned (learned) and unconditioned (innate) fear run over different trails. The conditioned fear involves the frontal medial cortex and the central and basolateral nuclei of the amygdala, when the fear of predator (unconditioned) involves nuclei of the medial hypothalamus. It is known that the brain functions are coordinated by neurotransmitter's systems and its receptors that are expressed in many different places around the brain, having different functions. The Neuropeptide S (NPS) is a neurotransmitter whose studies have showed its important role as an anxiety and awake regulator. NPS decreases anxiety and increases awakeness and locomotor behavior, been thus an anxiolytic and stimulating neurotransmitter, what makes it a potential target for pharmacological and clinical studies. In the present work we injected NPS icv in mice and looked for the Fos-expressing neurons in the nuclei of the conditioned and unconditioned pathways. The analysis of our results showed that the icv NPS promoted the increase in Fos expression in the central and basolateral amygdala, what indicates its role in the conditioned fear.. Keywords: Neuropeptide S; fear conditioning; unconditioned fear; amygdala; hypothalamus.

(15) 15. 1. INTRODUÇÃO O conceito de transtorno, segundo o Manual de Diagnóstico e Estatística das Desordens Mentais (DSM-IV), é um estado de preocupação exacerbado que pode abarcar diversas atividades ou eventos da vida do indivíduo. De maneira mais ampla, considera-se um transtorno crônico quando este ocorre na maior parte dos dias em um período de pelo menos seis meses (American Psychiatric Association, 2002). Cerca de 450 milhões de pessoas sofrem de distúrbios mentais e do comportamento em todo o mundo, além disso, estima-se que uma em cada quatro pessoas desenvolverão uma ou mais destas perturbações durante a sua vida. De um modo geral, condições neuropsiquiátricas são responsáveis por 13% do total de anos de vida perdidos por incapacidade devido a todas as doenças e lesões no mundo e estima-se que aumente para 15% até o ano de 2020 (Who, 2004). Nos últimos anos tem-se observado que os Transtornos de Ansiedade tais como Fobia Social, Transtorno do Pânico, Transtorno Obsessivo-Compulsivo e Estresse Pós-Traumático, ganharam maior atenção em função ao seu aumento progressivo de forma veemente. Referindo-se especificamente ao Transtorno de Ansiedade Generalizada (TAG), este se evidencia por ser um tipo de transtorno de ansiedade que vem se apresentando cada vez mais como um importante problema de saúde pública, uma vez que ocupa a segunda posição dos transtornos mais prevalentes em locais de assistência a saúde pública, atingindo 11,5% dos atendimentos (Gonçalves e Kapczinski, 2008). É interessante perceber que, embora a analogia entre ataque do pânico em humanos e o medo e comportamentos de esquiva nos animais não é perfeita, os comportamentos de medo, fuga, esquiva e respostas semelhantes ao ataque do pânico ocorrem em toda a filogenia animal. Nesse sentido, o comportamento de um roedor que evita entrar em um compartimento onde foi anteriormente submetido a um estímulo adverso se assemelha ao de uma pessoa que se recusa a atravessar uma ponte sobre a qual já sofreu um ataque de pânico. Isto nos leva a crer que a execução de comportamentos, mesmo em diferentes espécies, possa apresentar-se de forma semelhante. De modo muito peculiar, analogamente, um animal apresenta elevação na frequência cardíaca, pressão arterial e liberação de glicocorticoides quando escuta um estímulo sonoro que foi anteriormente pareado com um estímulo adverso, demonstrando várias alterações autonômicas características de um ataque do pânico (Mezzasalma et al., 2004)..

(16) 16. Sabe-se que o medo e a ansiedade são emoções adaptativas caracterizada por um conjunto de alterações fisiológicas e comportamentais que ocorrem quando os indivíduos entram em contato com uma ameaça em seu ambiente (Gross e Hen, 2004) (Indovina et al., 2011). Frente ao ensejo, versamos ainda acerca da fobia social, uma vez que esta encontra-se entre as principais desordens mentais. Assim, a definição mais clara para a fobia social é a exibição de um medo intenso e duradouro de uma ou mais situações sociais e de desempenho em que o sujeito encontra-se exposto à observação dos outros e vivencia o medo de se comportar de maneira humilhante ou embaraçosa. Desse modo, pode-se perceber que a ansiedade sentida não é proporcional à ameaça real. As situações sociais e de desempenho são evitadas ou enfrentadas com grande mal-estar. Porém, é intrigante o fato de a perturbação de fobia social só conseguir ser diagnosticada quando a ansiedade se torna tão intensa e generalizada a ponto de ocasionar um sofrimento significativo ou prejudicar a capacidade de funcionamento do indivíduo (Garcia, 2013). Nas décadas de 70 e 80 alguns estudos realizados demonstraram a existência de um sistema denominado de Sistema Encefálico de Aversão, este por sua vez é acionado por estímulos de perigo e relacionado às respostas inatas de defesa. As estruturas que compõem tal sistema são o hipotálamo medial, o complexo amigdaloide e a substância cinzenta periaquedutal dorsal (Graeff, 1981). Para estudar os mecanismos neurais que medeiam respostas de medo, o medo condicionado é amplamente utilizado (Sah e Westbrook, 2008). Um estudo demonstrou a relação do medo condicionado com o medo incondicionado e inferiu que condicionamentos aversivos que geram respostas de medo condicionado como o comportamento de congelamento de um rato em um contexto onde anteriormente sofreu choques nas patas, levam a aprendizagens rápida, duradoura e de difícil extinção (Fendt e Fanselow, 1999). Frente a esse tipo de aprendizagem que ocorre a um condicionamento Pavloviano, um estímulo que inicialmente no contexto emocional apresenta-se como neutro para o organismo, através de associações sucessivas com um estímulo incondicionado aversivo, torna-se posteriormente um estímulo condicionado, o que possivelmente poderá desencadear mais tarde e apenas com sua apresentação respostas de medo condicionadas como o congelamento contextual (Fendt e Fanselow, 1999)..

(17) 17. 1.1 O PAPEL DA AMÍGDALA NO DESENCADEAMENTO DO MEDO Os primeiros passos para a descoberta da amígdala foi iniciado pelo fisiologista alemão Karl Friedrich Burdach, em 1819, sendo este um dos primeiros pesquisadores a observar e classificar o que denomina-se atualmente “Complexo Amigdalóide”. Cortes especiais do cérebro revelavam uma massa de matéria cinzenta em forma de amêndoa, localizada numa região subcortical. Burdach denominou tal massa de “Complexo Amigdalar” (Swanson e Petrovich, 1998). Sabemos que a amígdala é um complexo de núcleos que se encontra no lobo temporal anterior de seres humanos e de outros animais (Amaral et al., 1992), e para fins de classificação pode ser dividida em basicamente três grandes grupos: o basolateral, o centromedial e o cortical (Gale et al., 2004). Destes, o maior e mais bem diferenciado é o grupo basolateral, possuindo uma posição privilegiada no encéfalo, recebendo informações do neocórtex, tálamo e hipocampo, fazendo com que apresente uma excelente posição para integração sensorial. Tal grupo é composto pelos núcleos laterais e basais (Fanselow e Gale, 2003). Além do grupo basolateral, outro grupo fundamental na composição do complexo amigdalóide é o grupo centro-medial, composto pelos núcleos central e medial, no qual possuem conexões fundamentais com a estria terminal. As células da estria terminal são criticamente semelhantes às do grupo centro-medial, o que denominou que ela fosse chamada de “Amígdala Extendida”. O menor grupo de núcleos da amígdala é o grupo cortical, e é também conhecida como a “amígdala olfatória”. Estes núcleos recebem informações diretas do bulbo olfatório (Fanselow e Gale, 2003). Sabe-se que a principal via de entrada das informações sensoriais que chegam à amígdala é o seu núcleo lateral, sendo através deste que a amígdala recebe informações do mundo exterior, enquanto que a estrutura do complexo amigdalóide que funciona principalmente como a via de saída das informações codificadas na amígdala é seu núcleo central (Fanselow e Gale, 2003; Gale et al., 2004). Estudos neuroquímicos da amígdala permitiram revelar os neurotransmissores mais abundantes nas suas diversas subdivisões (Mcdonald e Augustine, 1993; Sun e Cassel, 1993). A partir de técnicas imunoistoquímicas para o neurotransmissor inibitório GABA e para proteínas que convertem o glutamato em GABA (a chamada GAD), observou-se a notável presença de uma densa população de neurônios GABAérgicos da amígdala que se estendem de forma ventral e ininterruptamente através do núcleo central e do núcleo medial desta.

(18) 18. estrutura. É interessante observar que tais núcleos terminam no limite ventromedial do hemisfério cerebral (Swanson e Petrovich, 1998). Em contraste às células do núcleo central e medial, robustamente GABAérgicas, em outras partes da amígdala neurônios GABAérgicos encontram-se apenas dispersos, provavelmente envolvidos na formação de circuitos locais. Neurônios encontrados em outras subdivisões da amígdala são provavelmente glutamatérgicos (utilizam o neurotransmissor excitatório glutamato). Tais evidências são fortes sugestões de que uma parte da amígdala (seus núcleos central e medial) é subcortical (estriatal), enquanto que suas outras partes são corticais (Mcdonald e Augustine, 1993; Sun e Cassel, 1993). O papel da amígdala no desencadeamento do medo foi mais bem estudado durante as décadas de 1970 e 1980, quando foi descrita a técnica de condicionamento pavloviano do medo. Essa técnica consistia em oferecer um estímulo emocionalmente neutro, como a emissão de um tom sonoro (estímulo condicionado), e associá-lo a um estímulo aversivo, como um choque elétrico (estímulo incondicionado). Depois da aplicação repetida desses estímulos associados, notou-se que o estímulo condicionado foi capaz de provocar respostas observadas, tipicamente, na presença de perigo, como comportamento de defesa (respostas de fuga ou luta), ativação do sistema nervoso autônomo (alterações no fluxo sangüíneo e freqüência cardíaca), respostas neuroendócrinas (liberação de hormônios hipofisários e suprarenais), entre outros (Ledoux, 2003). Desse modo, situação como exposição a sons fortes e súbitos, altura elevada e estímulos visuais grandes não identificados – que surgem na parte superior do campo visual de modo repentino – produzem o chamado medo incondicionado, presente em vários animais. Na espécie humana, o medo incondicionado pode ser produzido, por exemplo, pela escuridão. O medo condicionado, ou aprendido, e causado pela maioria dos estímulos, que se tornam “avisos” de que situações ameaçadoras podem acontecer novamente (Lent, 2005). Após essa descoberta, foi possível a associação desses comportamentos a amígdala, uma vez que lesões nessa estrutura interferiam na aquisição e na expressão do medo condicionado (Ledoux, 2003). Assim, a amígdala é uma estrutura encefálica fundamental para exercer ligação entre as áreas do córtex cerebral, recebendo informações de todos os sistemas sensoriais (Williams et al., 2006). Aferências sensoriais da amígdala são recebidas pelo núcleo lateral. As aferências auditivas provêm do tálamo auditivo e do córtex auditivo e chegam ao núcleo lateral da amígdala, estimulando-a nos processos de medo condicionado. Além do córtex e do tálamo auditivos, outras áreas são igualmente importantes, como as áreas ventrais do hipotálamo, que.

(19) 19. projetam-se para os núcleos basolateral e basomedial da amígdala, havendo, em casos de lesão dessas áreas, interferência na geração do condicionamento. (Ledoux, 2003). Ademais, o núcleo central da amígdala é responsável pela interface com o sistema motor, conseqüentemente lesões desse núcleo revelaram alterações na expressão das respostas ao medo condicionado (Ledoux, 2003). Falando-se especificamente do medo condicionado e sua extinção, três regiões do cérebro estão envolvidas, são elas a amígdala, o córtex pré-frontal e o hipocampo medial. A amígdala é a estrutura central envolvida tanto no condicionamento do medo quanto na extinção (Davis, 1992). Outra característica da amígdala é a sua participação em um circuito neural organizado, que permite-lhe interagir e coordenar as principais atividades sensoriomotoras atuando efetivamente nos estados emocionais (Misslin, 2003). Em ambas as situações de medo e ansiedade, por exemplo, o complexo amigdalóide é a estrutura alvo para os estímulos ameaçadores, além de ser o local onde o sistema hipocampal age para aumentar o valor emocional de tais estímulos levando assim a inibição comportamental (Mcnaughton e Corr, 2004). Para o aprendizado do condicionamento do medo, as vias que transmitem a informação do estímulo convergem no núcleo lateral da amígdala, de onde parte a informação para o núcleo central. Este, por sua vez, estabelece conexão com o hipotálamo e substância cinzenta periaquedutal no tronco encefálico, evocando, por fim, respostas motoras somáticas (Bear et al., 2002; Berridge, 2004). Ademais, após a descoberta do papel da amígdala, foi possível a associação desses comportamentos à amígdala, uma vez que lesões nessa estrutura interferiam na aquisição e na expressão do medo condicionado (Ledoux, 2003). Além do importante papel da amígdala na geração do medo, esse processo também parece ser dependente dos sistemas serotoninérgico, noradrenérgico e GABAérgico centrais, na medida em que se reconhece que o mecanismo de ação dos fármacos antidepressivos e ansiolíticos depende de interferências na condução habitual dessas vias, ao alterar a concentração de seus receptores (Lara e Akiskal, 2006). Como já mencionado anteriormente, pesquisas realizadas nas décadas de 1970 e 1980, apontaram a existência de um sistema encefálico de aversão acionado por estímulos de perigo e relacionado as respostas inatas de defesa, tal sistema foi denominado de Sistema Encefálico Aversivo, além deste, foi descoberto ainda outro sistema neural relacionado à estimulação aversiva, mas que está relacionada entretanto com as reações condicionadas de medo e com a aprendizagem contextual aversiva, tal sistema foi descrito como Sistema de Inibição.

(20) 20. Comportamental (Graeff, 1981; 1994; Gray e Mcnaughton, 2000). Estudos realizando a técnica de imunorreatividade à proteína Fos demonstraram que as estruturas do Sistema Encefálico Aversivo são marcadas após a exposição dos animais a uma estimulação ambiental aversiva, corroborando assim a hipótese de que tais estruturas compõem um sistema que é acionado por estímulos ameaçadores (Silveira et al., 2001). Desse modo, estas estruturas são responsáveis por avaliar as informações contextuais detectando conflitos entre informações já armazenadas e os estímulos provenientes do meio. Se uma incongruência é detectada, o hipocampo age aumentando a valência negativa da informação e tornando-a mais ameaçadora do que realmente é. Ocorre assim, uma supressão das respostas do organismo e uma inibição comportamental (Brandão et al., 2003). Nesse sentido, estudos tem mostrado que o complexo amigdalóide faz parte de um circuito neural que modula as respotas do medo inato (Blanchard e Blanchard, 1972) (Canteras et al., 2001). Foi proposto ainda um papel diferencial das sub-regiões central e basolateral da amígdala no medo inato (Moreira et al., 2007). Entretanto, ainda não está claro se o papel do complexo amigdalóide na organização da resposta inata é semelhante à participação dessa estrutura na aprendizagem de respostas relacionadas ao medo (Antoniadis e Mcdonald, 2001; Canteras et al., 2001; Muller e Fendt, 2006). Portanto, dependendo da natureza do evento estressor ou do estímulo incondicionado, o padrão de respostas defensivas orientadas e organizadas cede lugar a respostas motoras não coordenadas e incompletas. A amígdala e o hipotálamo medial podem funcionar como uma espécie de interface comutando os estímulos para os substratos neurais apropriados para elaboração das respostas defensivas condicionadas ou incondicionadas (Brandão et al., 2003). É importante citar que diferentes níveis de ameaça evocam distintos padrões de respostas defensivas, sendo que estímulos que sinalizam uma ameaça potencial, como um novo ambiente, levam a respostas de avaliação de risco, como uma exploração cautelosa do local. Assim, temos reações distintas a partir de estímulos que podem ser distais, como a percepção de um predador a determinada distância ou um contexto que foi previamente associado com um estímulo aversivo, como choque nas patas, evocando respostas de imobilidade com o aumento da tensão e tônus muscular, como a resposta de congelamento condicionado contextual, e estímulos proximais como o contato direto com o predador, que se traduz em respostas do tipo luta ou fuga (Blanchard e Blanchard, 1986). Assim, retomando as desordens que aflingem a mente e já citadas anteriormente, estas se instalam no indivíduo de forma grave ou se prolonga, tornando-se prejudicial de tal forma que poderá levar ao desencadeamento de doenças psicossomáticas a tais como a Hipertensão.

(21) 21. Arterial Sistêmica, Doença da Artéria Coronaria e por fim distúrbios mentais como depressão e insônia (Heravi et al., 2004). As funções encefálicas estão coordenadas por sistemas de neurotransmissores e seus receptores que são expressos nas mais diversas regiões do sistema nervoso, dependendo das funções a serem exercidas. Neurotransmissores clássicos como a noradrenalina, a acetilcolina, a serotonina, a dopamina, o glutamato e o ácido gama-aminobutírico (GABA) vêm sendo relacionados com diversas funções e o seu mal funcionamento gera as mais diversas patologias como as citadas acima (Bear et al., 2002; Lent, 2005). Neuropeptídeos e seus desbalanços tem sido muito estudados nas últimas décadas como agentes geradores de transtornos. Como exemplo, o sistema orexinérgico é responsável por regular as funções que estão afetadas em estados depressivos, como sono, sistema de recompensa, comportamento alimentar e resposta ao estresse (Nollet e Leman, 2013).. 1.2 O NEUROPEPTÍDEO S E O SEU RECEPTOR Dentre os neuropeptídeos com ação neurotransmissora mais recentemente descritos, o neuropeptídeo S (NPS) foi apontado como um importante regulador da ansiedade e da vigília, sendo portanto potencial alvo para estudos farmacológicos e clínicos nesta área (Sato et al., 2002; Xu et al., 2004; Guerrini et al., 2010). Sua descoberta ocorreu em 2002 utilizando a farmacologia reversa, onde receptores órfãos acoplados à proteína G (GPCR) foram usados como alvos para descoberta de novos mediadores (Sato et al., 2002). NPS é composto por 20 aminoácidos, dotado da seguinte sequência em humanos: SFRNGVGTGMKKTSFQRAKS; fragmentado a partir de um precursor polipeptídico. Funcionalmente, o NPS ativa o seu receptor que por meio da estimulação de uma proteína Gs apresenta efeito estimulatório na célula, bem como da proteína Gq, responsável por elevar a atividade da fosfolipase C que tem por função a degradação de fosfolipídios da membrana, o que leva comumente ao aumento da concentração citoplasmática de trifosfato de inositol, promovendo o aumento da concentração intracelular de cálcio (Xu et al., 2004; Vendelin et al., 2006). De acordo com Reinscheid e colaboradores (2005), pesquisas realizadas no GenBank, um banco de dados de sequências genômicas, revelaram que a estrutura primária de NPS é significativamente conservada entre humano, chimpanzé, macaco, bovino, cão, elefante, camundongo, rato, coelho, cobaia, galinha, sapo e gambá. Contudo, sugere-se que o gene parece estar ausente dos genomas atualmente disponíveis de peixe (zebrafish e fugu),.

(22) 22. sugerindo que o gene precursor de NPS apareceu tardiamente durante a evolução dos vertebrados. O NPS é clivado a partir de uma proteína precursora maior contendo um peptídeo de sinal hidrofóbico e locais de processamento proteolítico, tal qual é comprovado em outros neuropeptídeos (Xu et al., 2004). O receptor de NPS (NPSR) é um receptor acoplado a proteína G (GPCR) típico, constituído de sete domínios transmembrana. Tal receptor apresenta moderado aspecto homólogo com os outros membros da família GPCR, sendo os receptores de vasopressina os parentes mais próximos (Reinscheid e Xu, 2005; Valsalan e Manoj, 2014). Primariamente, o perfil farmacológico do NPS e do seu receptor foi traçado a partir da linhagem de células que expressam o receptor humano de NPS, tanto em células de ovário de hamster chinês (CHO) quanto em células embrionárias de rim humano 293 T células (HEK293 T) (Xu et al., 2004). O NPS em diferentes grupos como humano, rato e camundongo induz elevações progressivas de cálcio e dependentes da dose intracelular nas referidas linhagens celulares evidenciadas anteriormente (HEK293 T e CHO), sugerindo a relação estabelecida do NPSR acoplado a proteínas Gq (Xu et al., 2004). Estudos neuropsicofarmacológicos, com o objetivo de determinar as funções de NPS, mostram que a administração central de NPS produz alguns efeitos como o aumento indutivo da hiperlocomação e hiperatividade, aumento da vigília, supressão dos estágios do sono, redução da fome e efeito ansiolítico padrão em animais modelos para ansiedade (Rizzi et al., 2008; Fendt et al., 2010; Pape et al., 2010; Clark et al., 2011; Zhao et al., 2012). Em suma, o NPS produz um comportamento de propriedade única: efeito ansiolítico e estimulante (Koob e Greenwell, 2004). Sendo assim, os aspectos que abarcam os efeitos comportamentais produzidos através da administração intracerebroventricular de NPS, como excitação e vigília associado ainda aos efeitos ansiolíticos, parecem apresentar características singulares, visto que estimulantes, tais como anfetaminas e cocaína, induzem potencialmente a excitação ao mesmo passo que são ansiogênico (Roth et al., 2006). Outros estudos produziram evidências para um papel central da neurotransmissão do NPS na recompensa e abuso de drogas (Badia-Elder et al., 2008; Ruggeri. B. et al., 2010). Além desses papeis, o NPS também reduz efeitos de nocicepção em camundongos (Li et al., 2009). Utilizando a técnica de Proteína C Reativa em Tempo Real (RT-PCR), Xu e colaboradores (2004) mostraram que o Ácido Ribonucléico mensageiro (RNAm) de NPS e de seu receptor são expressos em vários tecidos dispersos por todo o corpo com níveis elevados.

(23) 23. no encéfalo, tireoide, glândulas salivares e mamárias de ratos. Apesar de evidenciada a elevada expressão do NPS na parte central do sistema nervoso, estudos com hibridização in situ mostraram que o RNAm de NPS está em neurônios localizados em áreas restritas do tronco encefálico. Em ratos uma moderada expressão foi vista no núcleo sensitivo principal do trigêmeo (Pr5) e no núcleo parabraquial lateral (LPB) e uma elevada expressão foi encontrada numa área entre o locus coeruleus (LC) e o núcleo de Barrington, denominada então de região peri-locus coeruleus (Xu et al., 2004; Xu et al., 2007). O complexo nuclear sensitivo do trigêmeo é uma estrutura pontina e originalmente descrita em 1950 (Olszewski, 1950), que o dividiu em 4 núcleos: principal, oral, interpolar e caudal. O Pr5 está dividido em uma porção ventral e dorsal, que são citoarquitetonicamente distintas e têm sido propostos servir as diferentes funções de retransmissão e processamento de sinais sensoriais da cabeça, como tato e propriocepção trigeminal (Luo e Li, 1991; Minnery e Simons, 2003). Tais funções podem ser suportadas pelos achados que esta estrutura recebe entrada primária direta de estruturas intra-orais e possui diversas fibras aferentes e eferentes que conectam-se com outras áreas do encéfalo (Smith, 1975; Shigenaga et al., 1986; Moritani et al., 1998). De acordo com Brodal (1984), o Pr5 recebe majoritariamente axônios de maior diâmetro incumbidos pela transmissão do tato discriminativo ou epicrítico e, em menor escala, pelo tato protopático e pressão (Brodal, 1984). O LPB é uma estrutura pontina localizada dorsolateralmente ao pedúnculo cerebelar superior (Menani et al., 2000). O LPB é um centro relé envolvido na transmissão de vários tipos de informação sensorial protopática (Nakamura, 2011). Além disso, também está envolvido com a regulação da temperatura corporal e situações relacionadas ao apetite e nocicepção (Hermanson e Blomqvist, 1996; Carter et al., 2013). Destes, o papel da sinalização nociceptiva em LPB tem sido descrita essencialmente em modelos de roedores (Sato et al., 2015). De acordo com um estudo recente realizado por Sato e colaboradores (2015), verificou-se que a inativação funcional do LPB prejudica significativamente a aprendizagem do medo sem afetar significativamente limiares de estímulos sensoriais aversivos e não aversivos, dessa forma, pode-se inferir que o LPB é necessário para expressão completa da aquisição da memória relacionada ao medo (Sato et al., 2015). O LC é um importante núcleo noradrenérgico pontino, que tem por função modular uma vasta gama de processos relacionados com estado de alerta, respostas induzidas pelo medo, movimentos rápidos dos olhos durante os estágios do sono, analgesia e excitação (Sabban et al., 2004; Freitas et al., 2005; Liddell et al., 2005). O LC é o local com o maior número de.

(24) 24. neurônios noradrenégicos na parte central do sistema nervoso, responsáveis por enviar extensas ramificações de axônios para muitas outras partes do encéfalo e da medula. Embora o LC contenha um número pequeno de neurônios (cerca de 10.000 nos humanos), seus axônios passam pelo feixe prosencefálico medial e fascículo tegmentar central e dorsal e dão origem a muitos milhões de terminais nervosos em todo o córtex, hipocampo e cerebelo (Rang e Dale, 2007; Standring, 2008). O núcleo de Barrington, também referido como o centro pontino da micção, representou a primeira porção do tronco encefálico em que por meio de modelos animais demonstrou-se a relação com a atividade de micção (Barrington, 1921). O produto da estimulação deste centro é o relaxamento do esfíncter uretral e contração detrusora, enquanto situações que provocam lesão neste, evoluem para abolição da micção e retenção urinária completa. De fato, o centro pontino da micção representa um ponto de convergência de estímulos pró e antimicção, sendo sua função primordial: o centro de comando para o início e harmonia do esvaziamento vesical (Juc et al., 2011). No entanto, como descrito anteriormente, neurônios que expressam o RNAm de NPS não estão nem no LC e nem no núcleo de Barrington, mas entre eles na região peri-locus coeruleus. O que fica evidenciado pelo fato de que neurônios NPS não expressam a tirosina hidroxilase, enzima precursora da noradrenalina, e nem o Fator Liberador de Corticotrofina (CRF), neurotransmissor expresso pela maioria dos neurônios do núcleo de Barrington (Xu et al., 2004; Xu et al., 2007). Ainda em rato, foi verificado que a maioria dos neurônios NPS na área peri-locus coeruleus são também glutamatérgicos e alguns são colinérgicos (Xu et al., 2007). Muitos neurônios NPS no Pr5 também são glutamatérgicos, enquanto no LPB eles coexpressam CRF (Xu et al., 2007). A distribuição de NPS no encéfalo de camundongo é um pouco diferente da de rato. Clark e colaboradores (2011), mostraram uma forte expressão de RNAm de NPS e de sua proteína em duas regiões do tronco encefálico de camundongo, sendo elas a região peri-locus coeruleus, semelhante a expressão em rato, e o núcleo Kölliker-Fusi (KF), uma divisão do núcleo parabraquial. Eles não detectaram neurônios NPS no Pr5, no LPB ou qualquer outra área do encéfalo de camundongo (Clark et al., 2011). A figura 1 é uma adaptação de Clarck e colaboradores (2011) e mostra a distribuição do NPS usando sonda para marcação. Além disso, forte marcação do precursor do NPS RNAm foi encontrada em apenas duas regiões do tronco encefálico de camundongo: o perilocus coeruleus e o núcleo KF. A expressão de NPS no perilocus coeruleus e núcleo KF foram confirmados por imunomarcação..

(25) 25. Figura 1 – Imagem de campo escuro do tronco encefálico de camundongo de uma hibridização in situ marcada com Alexa Fluor 555 mostrando a expressão do RNAm de Neuropeptídeo S (NPS).. A imagem em A mostra um grupo de células expressando o RNAm de NPS na região perilocus coeruleus. Em B está a marcação de neurônios expressando RNAm de NPS no núcleo Kölliker-Fusi (KF). Locus coeruleus (LC), quarto ventrículo (4V). Barra de escala = 500 µm. Fonte: Adaptada de Clark et al., 2011.. O KF está profundamente envolvidos no controle respiratório, referido muitas vezes como o “centro pneumotáxico” (Feldman, 1986). As projeções do KF caminham através do tracto tegmental central para a área hipotalâmica lateral, a área pré-óptica lateral e o núcleo central da amígdala (Saper e Loewy, 1980). Fibras descendentes do KF viajam principalmente através da formação reticular medular ventrolateral passando por regiões que dão origem a fibras pré-ganglionares parassimpáticas dos pares de nervos cranianos VII, IX e X e grupos de células de catecolaminas A1e A5 (Saper e Loewy, 1980). Todavia, ser o centro pneumotáxico não é a única função em que o núcleo KF está envolvido. Estudos apontam a relação íntima deste núcleo com áreas relacionadas com o controle do sistema cardiovascular e ainda na regulação da dor, como a medula vetrolateral rostral, núcleo cuneiforme, núcleo do trato solitário, núcleos da rafe, substância cinzenta periaquedutal e a coluna intermediolateral da medula espinal (Saper e Loewy, 1980; Shafei e Nasimi, 2011). Ao contrário da distribuição restrita de NPS, o RNAm de seu receptor é amplamente espalhado no encéfalo de ratos e camundongos (Xu et al., 2007; Clark et al., 2011). O NPSR está expresso sobretudo em áreas encefálicas que participam da modulação do medo e ansiedade, como o complexo amigdaloide e hipotálamo, do sono, como o tálamo, hipotálamo e núcleo pré-óptico, com a aprendizagem e memória, como regiões parahipocampais, córtex entorrinal, amígdala e subículo e ainda com a excitação e respostas ao estresse, como o núcleo.

(26) 26. paraventricular do tálamo (Xu et al., 2007; Clark et al., 2011). Estes núcleos quando estudados em conjunto são importantes indicadores dos efeitos moduladores do NPS. No entanto, apesar da distribuição do receptor ser ampla, a distribuição de fibras imunorreativas a NPS, observadas por técnica de imunoistoquímica em camundongo, é bem restrita (Clark et al., 2011), nos levando a considerar a existência de um outro ligante para tais receptores. Devido ao papel do NPS no medo e ansiedade e da distribuição de seu receptor na amígdala e hipotálamo em detrimento de sua limitada distribuição de fibras, é importante saber que estruturas podem estar respondendo a transmissão de NPS e se diferentes vias de controle de medo podem responder de forma diferenciada a injeção intracerebroventricular de NPS, desta forma melhorando as bases neuroanatômicas dos estudos farmacológicos deste neurotransmissor..

(27) 27. 2. OBJETIVOS Verificar se núcleos ligados as vias de medo condicionado e não condicionado se tornam ativos em resposta a injeção intracerebroventricular de NPS em camundongo.. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Mapear a expressão da proteína Fos nos núcleos medial da amígdala, hipotalâmico. anterior, ventromedial do hipotálamo e pré-mamilar dorsal, núcleos da via de medo inato de predador (não condicionado), em camundongo, em resposta a injeção intracerebroventricular de NPS. . Mapear a expressão da proteína Fos nos núcleos basolateral e central da amígdala,. núcleos da via de medo condicionado, em camundongo, em resposta a injeção intracerebroventricular de NPS..

(28) 28. 3. MATERIAIS E MÉTODOS. 3.1 SUJEITOS Para realização deste trabalho foram utilizados 20 camundongos Swiss, machos adultos, com peso médio de 36 gramas, entre 8 e 12 meses de idade. Estes animais foram mantidos em condições constantes de temperatura (22ºC), com água e ração ad libitum, sob ciclo claroescuro 12:12 com as luzes acesas às 6:00h. Os animais foram comprados da Anilab Animais de Laboratório (Paulínia - SP) e mantidos no biotério do Departamento de Morfologia antes do início dos procedimentos experimentais. Todos os procedimentos estão de acordo com as normas para uso de animais experimentais e pelo Comitê de Ética para Uso Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN), sendo aprovado pelo mesmo (protocolo 034/2012).. 3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS. 3.2.1 IMPLANTE DE CÂNULA A cirurgia de implante de cânula-guia foi feita com a ajuda de um aparelho estereotáxico com o objetivo de implantá-la no ventrículo lateral direito de camundongos para administração de NPS ou solução salina. As cânulas foram produzida a partir de agulhas que são utilizadas para administração de medicamentos, com diâmetro de 22 gauges e 8mm de comprimento. Para o procedimento cirúrgico, os camundongos foram levados à sala de cirurgia e foram anestesiados com ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg i.p. (intraperitonial), passaram por tricotomia do topo da cabeça e foram levados ao aparelho estereotáxico onde tiveram a cabeça fixadas pelos meatos acústicos externos e pelo focinho. Administramos solução salina nos olhos do camundongo para prevenção de possíveis úlceras córneas. Foi injetado 0,06 ml de um anestésico local (Mepiadre 100) subcutaneamente no topo da cabeça, seguido de uma antissepsia local utilizando iodoforo (agente antisséptico iodo-povidine) para que assim realizássemos a incisão cirúrgica. A pele da região craniana foi removida de forma a abrir um campo para visualização do bregma, trepanação e inserção do parafuso. Em seguida um parafuso de fixação foi colocado no osso parietal esquerdo. A cânula-guia foi implantada unilateralmente no ventrículo lateral direito de acordo com as seguintes.

(29) 29. coordenadas a partir do bregma: AP -0,6 mm; ML 1,1 mm; DV 1,0 mm. A cânula-guia foi fixada ao osso parietal e ao parafuso com cimento odontológico.. 3.2.2 INJEÇÃO Após 3 dias de recuperação da cirurgia, por 3 dias os animais foram levados no mesmo horário para uma sala onde cada um passou por uma manipulação com o objetivo de habituálos para a injeção. No quarto dia os animais foram novamente levados à mesma sala onde receberam a microinjeção intracerebroventricular (icv) de 2µl de NPS (1 nmol) ou 2µl de solução salina 9% durante 1 minuto. A microinjeção ocorreu através de uma agulha (cujo comprimento excede 1 mm a cânula-guia), que permitiu a administração da droga através da cânula-guia anteriormente implantada. A agulha estava ligada a um tubo de polietileno, que se encontrava conectado a uma seringa de Hamilton. Droga: NPS (gentilmente doada pelo Prof. Dr. Remo Guerrini da Universitá di Ferrara, Ferrara Itália e pela Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli da UFRN) foi diluído em solução salina, sendo o pH da solução verificado anteriormente à administração, com adequação aos níveis biológicos. 3.2.2 MAPEAMENTO DA EXPRESSÃO DE FOS EM RESPOSTA AO NPS Entre 90 a 120 minutos após a injeção, cada animal foi anestesiado como descrito anteriormente e sofreu perfusão transcardíaca, tendo o sistema circulatório limpo com solução salina 9% (50mL) e tendo formaldeído 4% (feito de paraformaldeído) como fixador (350mL). Em seguida os encéfalos foram removidos, pós-fixados no mesmo fixador por 2 horas e acondicionados em solução sacarose 30% até microtomia. Os encéfalos foram microtomizados por congelamento (30µm) em micrótomo de deslizamento e os cortes foram divididos em 4 séries de cortes alternados.. 3.2.2.1 IMUNOISTOQUÍMICA Uma das séries passou pelo procedimento de imunoistoquímica para marcar a proteína Fos. A técnica consistiu de uma imuperoxidase padrão pelo método ABC, onde, após lavagens em tampão fosfato 0,1M (PB), os cortes free floating foram submetidos a um prétratamento com uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% em tampão fosfato 0,1M com Triton X-100 (TXPB) durante 30 minutos em agitador orbital para inativação da peroxidase.

(30) 30. endógena, para então serem incubados em TXPB com anticorpo primário anti-Fos obtido em coelho (Jackson Laboratories; 1:10.000), acrescido de soro de jumento (1:1000; Jackson Laboratories) overnight. No dia seguinte, os cortes foram lavados em PB e incubados em anticorpo secundário anti-coelho feito em jumento (Jackson Laboratories; 1:1000) diluído em TXPB por 2 horas, novamente lavados em PB e incubados por 2 horas em solução de avidinabiotina-peroxidase (kit ABC, Vector, 1:333) diluídos em PB. Os cortes foram novamente lavados em PB antes de passarem por uma solução de PB contendo os cromógenos diaminobenzidina (DAB) 0,05% e sulfato de amônio e níquel (NAS) 0,05%, acrescidos de peróxido de hidrogênio 0,01% por aproximadamente 5 minutos. A reação foi parada com lavagens em PB em agitador orbital. Os cortes então foram montados em lâminas gelatinizadas, desidratados em uma sequência crescente de alcoóis, deslipidificados em xilol e cobertos com ERV-Mount e lamínula.. 3.2.2.2 COLORAÇÃO DE NISSL Uma outra série foi submetida a coloração de Nissl, para análise da citoarquitetura, usando tionina como corante. Neste procedimento, os cortes foram lavados em PB e montados em lâminas gelatinizadas. Após período de secagem do material as lâminas passaram por banhos de 3 minutos cada por uma bateria de alcoóis etílicos de concentrações crescentes (70%, 95% e 100%). Ao final da bateria, as lâminas foram mergulhadas em xilol, num primeiro banho de 3 minutos e sequencialmente imergidos num segundo banho de xilol por 30 minutos. Na sequência, os cortes foram reidratados em banhos em alcoóis etílicos de concentrações decrescentes (a mesma utilizada na primeira bateria, em sentido inverso), emergidos em água por 30 segundos e posteriormente imergidos em tionina por 40 segundos, para novamente serem desidratados e deslipidificados como descrito acima. Ao final, foram cobertos com lamínula como descrito anteriormente.. 3.3 ANÁLISE DOS DADOS. 3.3.1. ANÁLISE. DO. TECIDO. E. CONTAGEM. DE. NEURÔNIOS. IMUNORREATIVOS A FOS Todo o tecido foi analisado em microscópio óptico de campo claro. O local de injeção foi verificado pela presença de uma lesão cortical causada pela cânula-guia e pela micropipeta.

(31) 31. chegando próximo ou até o ventrículo lateral. As áreas encefálicas de interesse foram identificadas nas lâminas coradas pela tionina com o auxílio do Atlas Estereotáxico de Encéfalo de Camundongo (Paxinos e Franklin, 2008). Estas estruturas foram analisadas e tiveram suas áreas medidas bilateralmente em 1 ou 2 níveis utilizando o programa NIS (Nikkon). As áreas de cada núcleo de interesse foram então somadas resultando em uma área total que foi usada como uma forma de correção proporcional da contagem. A tabela 1 descreve as áreas de interesse e suas correnspondências aproximadas com o Atlas Estereotáxico de Encéfalo de Camundongo (Paxinos e Franklin, 2008). Na sequência, as mesmas áreas das lâminas imunocoradas para Fos foram analisadas e tiveram suas células imunorreativas para Fos contadas bilateralmente utilizando o programa NIS (Nikkon). Apenas os neurônios cuja marcação estivesse bem acima da coloração de fundo foram contados. Alguns núcleos foram contados em apenas 1 nível enquanto outros foram contados em 2, e o resultado está expresso em neurônios Fos por mm2, usando como base as áreas previamente medidas em colorações de Nissl.. Tabela 1 - Núcleos cujos neurônios Fos-ir foram contados e suas respectivas correspondências de áreas de contagem com Paxinos e Franklin (2008).. Núcleos. Nível 1. Nível 2. Núcleo Medial da Amígdala (MeA). Pranchas 43/44. Pranchas 45/46. Núcleo Hipotalâmico Anterior (AHN). Pranchas 37/38. Pranchas 39/40. Núcleo Ventromedial do Hipotálamo (VMH). Pranchas 43/44. Pranchas 45/46. Núcleo Pré-mamilar Dorsal (PMD). Prancha 52. -. Núcleo Central da Amígdala (CeA). Pranchas 39/40. Pranchas 43/44. Núcleo Basolateral Anterior da Amígdala (BLA). Pranchas 41/42. Pranchas 45/46. Fonte: Elaborada pelo autor.

(32) 32. 3.3.2 ESTATÍSTICA E FIGURAS Para análise estatística dos grupos NPS e Salina, utilizou-se o teste t de Student considerando a margem de erro de 5% (p<0,05%), executados no programa Sigma Plot 10, mesmo programa utilizado para construção de gráficos, forma na qual os dados são apresentados, com a Média Aritmética + Erro Padrão Médio (S.E.M.). As figuras foram montadas utilizando-se o Adobe Photoshop CS3 e tiveram apenas o brilho e o contraste alterados..

(33) 33. 4. RESULTADOS. Dos 20 animais que tiveram a cânula implantada no ventrículo lateral verificamos que em 12 deles a cânula-guia foi implantada com sucesso (n=6 para cada grupo), então apenas estes foram considerados na contagem de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir).. 4.1. EXPRESSÃO. DE. FOS. EM. NÚCLEOS. DA. VIA. DO. MEDO. INCONDICIONADO Foram 4 os núcleos analisados na via do medo incondicionado: núcleo medial da amígdala (MeA), núcleo hipotalâmico anterior (AHN), núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) e núcleo pré-mamilar dorsal (PMD). Nenhum deles apresentou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Fig. 2). AHN apresentou uma média de 113,1 ± 23,2 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina icv, enquanto os animais que receberam NPS 1nM icv apresentaram 136,5 ± 9,5 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,375; Fig. 4A-C). Os animais que receberam salina icv apresentaram no VMH 87,1 ± 28 neurônios Fos-ir/mm2, enquanto os animais que receberam NPS apresentaram 41,3 ± 10,4 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,157; Fig. 4D-F). PMD apresentou uma média de 171,1 ± 28,8 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina, enquanto os animais que receberam NPS apresentaram 275 ± 73,9 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,217; Fig. 4G-I). MeA apresentou uma média de 170 ± 51,1 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina icv contra 227 ± 48,9 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,430) nos animais que receberam NPS 1nM icv (Fig. 4J-L)..

(34) 34. Figura 2 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir) no núcleo medial da amígdala (MeA), núcleo hipotalâmico anterior (AHN), núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) e núcleo prémamilar dorsal (PMD).. Fonte: Elaborada pelo autor. 4.2. EXPRESSÃO. DE. FOS. EM. NÚCLEOS. DA. VIA. DE. MEDO. CONDICIONADO. Foram dois os núcleos analisados na via do medo condicionado: núcleo central da amígdala (CeA) e núcleo basolateral da amígdala (BLA). Em ambos os núcleos houve diferença estatisticamente significantes entre os grupos (Fig. 3). CeA apresentou uma média de 48,4 ± 11,8 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina icv contra 219 ± 42,6 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,005) nos animais que receberam NPS 1nM icv (Fig. 4J-L). BLA apresentou uma média de 29,4 ± 11,3 neurônios Fos-ir/mm2 nos animais que receberam salina icv, enquanto os animais que receberam NPS 1nM icv apresentaram 128,2 ± 19,5 neurônios Fos-ir/mm2 (p=0,002; Fig. 4J-L)..

(35) 35. Figura 3 - Gráfico mostrando expressão média de neurônios imunorreativos a Fos (Fos-ir) no núcleo central da amígdala (CeA) e basolateral da amígdala (BLA). * Diferença estaticamente significativa em relação ao animal com injeção icv de salina.. Fonte: Elaborada pelo autor.

(36) 36. Figura 4. Expressão da proteína Fos em núcleos das vias de medo condicionado e não condicionado.. Fonte: Elaborada pelo autor.

(37) 37. Figura 4. Continuação. A, D, G e J Fotomicrografias de campo claro de cortes do hipotálamo e amígdala corados com tionina (Nissl) mostrando a citoarquitetura do sistema nervoso de camundongo. B e C Fotografias de campo claro mostrando a expressão de Fos em neurônios do núcleo hipotalâmico anterior (AHN) em camundongos com injeção icv de salina (B) ou NPS 1nM (C). E e F Fotografias de campo claro mostrando a expressão de Fos em neurônios do núcleo ventromedial do hipotálamo (VMH) em camundongos com injeção icv de salina (E) ou NPS 1nM (F). H e I Fotografias de campo claro mostrando a expressão de Fos em neurônios do núcleo pré-mamilar dorsal (PMD) em camundongos com injeção icv de salina (H) ou NPS 1nM (I). K e L Fotografias de campo claro mostrando a expressão de Fos em neurônios da amígdala em camundongos com injeção icv de salina (K) ou NPS 1nM (L). Barra: 100m. Fonte: Elaborada pelo autor.

(38) 38. 5. DISCUSSÃO. Nossos resultados mostraram que a administração icv de NPS promoveu a expressão de Fos em diversas áreas do encéfalo de camundongo. Dentro das vias de medo, a injeção icv de NPS promoveu um aumento de Fos somente em núcleos da via de medo condicionado (CeA e BLA). Fos é uma ferramenta imunocitoquímica eficaz para mapeamento neuroanatômico dos neurônios encefálicos que sofrem ativação genômica em resposta a estímulos discretos fisiológicos ou farmacológicos (Morgan e Curran, 1991). Sabe-se que uma maneira de se estudar a ativação neuronal é utilizando alguns genes de transcrição imediata (IEGs), também chamados de protocongenes, que são expressos em resposta a atividade celular. A expressão da proteína ou do RNAm derivados destes genes são excelentes ferramentas neuroanatômicas indicadoras de atividade celular e vem sendo usadas em uma gama de estudos que incluem a administração de drogas, estímulos sensoriais e/ou comportamentos (Herrera e Robertson, 1996; Kovacs, 1998; Rajkumar et al., 2013). O c-fos e o c-jun são IEGs e codificam, respectivamente, as proteínas Fos e Jun (Curran e Morgan, 1987). Essas proteínas tendem a formar heterodímeros ou homodímeros e, dessa maneira, apresentam afinidade de ligação ao DNA, provocando a ativação de seus genes alvos (Angel et al., 1988; Ryzeck e Bravo, 1991). Após a formação do dímero, através de um zíper de leucina (Landshultz et al., 1988), o complexo se liga a uma seqüência gênica específica, o sítio AP-1, reconhecido como essencial para a transcrição basal ou ativada de vários genes (Curran e Franza, 1988). Simultaneamente, ao interagir com outros fatores de transcrição, o heterodímero das proteínas Fos e Jun forma uma ligação entre sistemas de segundos mensageiros independentes (Hai e Curran, 1991; Hagmeyer et al., 1993). Essas proteínas atuam, portanto como “terceiros mensageiros” nucleares, ligando eventos mediados pelos segundos mensageiros a alterações subseqüentes na expressão gênica (Morgan e Curran, 1988). A presença da proteína Fos no encéfalo de rato adulto foi descrita pela primeira vez por Dragunow e seus colaboradores (1987) que perceberam sua ativação após estimulação elétrica levando a inflamação (Dragunow e Robertson, 1987a). A partir daí muitos estudos passaram a utilizar a expressão de Fos ou seu RNAm como uma técnica que sinaliza a atividade neuronal. Fos tem vantagens em relação a outros IEGs, pois Fos apresenta uma baixa expressão basal, uma expressão rápida com pico do RNAm de 30 minutos e da proteína de 1 a 3 horas após o estímulo, e transitória, com queda da expressão da proteína por volta de 6 horas após o.

(39) 39. estímulo (Hunghes et al., 1992); (Sonnenberg et al., 1989; Chan et al., 1993; Kovacs e Sawchenko, 1996). Portanto, escolhemos Fos como ferramenta para o mapeamento de atividade neuronal em resposta a presença do NPS. Evidências a partir de modelos de roedores indicam que o sistema de NPS é criticamente envolvido na regulação de comportamentos condicionados e medo condicionado (Xu et al., 2004; Jüngling et al., 2008; Pañeda et al., 2009). As sensações de medo e raiva estão relacionadas com as conexões entre a amígdala, o hipotálamo e a PAG. A amígdala é responsável pela detecção, geração e manutenção das emoções relacionadas ao medo, bem como pelo reconhecimento de expressões faciais de medo e coordenação de respostas apropriadas à ameaça e ao perigo (Phan et al., 2002; De Gelder et al., 2004; Lee et al., 2006). A lesão da amígdala em humanos produz redução da emocionalidade e da capacidade de reconhecer o medo. Por outro lado, ao sofrer estímulo a amígdala pode levar o estado de vigilância ou atenção aumentada, além de ansiedade e medo (Graham et al., 2006; Lee et al., 2006). Segundo Carlson (2007), os neurônios individuais em vários núcleos da amígdala se tornam ativos quando estímulos emocionalmente relevantes são apresentados (Carlson, 2007). Dentro do medo condicionado 2 são os principais núcleos: a BLA, que recebe informações sensoriais sobre os estímulos condicionados e incondicionados; e o CeA, que recebe informação processada na BLA e outros núcleos da amígdala. Projeções neuronais do CeA para o hipotálamo e para a substância cinzenta periaquedutal (PAG) evocam as respostas comportamentais e fisiológicas que constituem o medo (Sah et al., 2003). Como descrito anteriormente, a aprendizagem de medo envolve o pareamento de um estímulo neutro (condicionado) a um estímulo aversivo (estímulo incondicionado), o que leva ao aumento da atividade neuronal que são induzidos pelo estímulo condicionado e mediadas por receptores de glutamato N-Metil-D-Aspartato (NMDA) (Sah e Westbrook, 2008). Esta plasticidade sináptica resultante do estímulo condicionado evocam um aumento da resposta em neurônios da BLA que projetam para o CeA e deste para a PAG levando a uma saída do circuito de medo condicionado (Sah e Westbrook, 2008). Lesões da CeA abolem tanto as respostas somato-motoras (congelamento) como vegetativas relacionadas à resposta condicionada (Ledoux, 2003). Um estudo realizado por Henry (2009) para examinar a conectividade dos neurônios do medo e neurônios de extinção, sugeriu que os neurônios do medo recebem entradas do hipocampo e projetam para o córtex pré-frontal medial. Neurônios de extinção, por outro lado, estão ligados ao córtex pré-frontal medial em ambas as direções (Henry et al., 2009)..

(40) 40. Assim, se o CeA está preservado, a apresentação isolada do estímulo neutro ou do contexto, previamente pareado ao estímulo aversivo, irá provocar uma reação comportamental muito característica de congelamento motor, bem como alterações autônomas diversas, no conjunto consideradas como sendo a resposta de medo condicionado (Ledoux, 2000). A extinção resulta de alterações na amígdala que bloqueiam os efeitos da potenciação a longo prazo, possivelmente por ativação de neurônios locais que secretam o neurotransmissor inibitório GABA. O córtex pré-frontal medial medeia a consolidação da extinção, bem como a subsequente ativação destes neurônios secretores de GABA pelo estímulo condicionado (Sah e Westbrook, 2008). Mas como a memória do medo condicionado é armazenada, como ela é extinta e como elas se traduzem em resultados comportamentais, são situações ainda mal compreendidas. Como mencionado anteriormente, lesões ou bloqueio farmacológico do CeA previnem a expressão do medo condicionado (Ledoux, 2000; Maren, 2001; Wilensky et al., 2006; Johansen et al., 2011), mas não interfere com medo incondicionado para um predador (Martinez et al., 2011). De modo contrário, lesões do MeA que bloqueariam respostas de medo de um predador não bloqueiam respostas condicionadas a choque nas patas (Blanchard et al., 2005). No entanto, as características inerentes ao medo condicionado não está restrita apenas ao núcleo CeA. O BLA também participa desse tipo de emoção adaptativa. Evidências sugerem que o BLA é um local crítico de plasticidade do medo condicionado e também é necessário para a aquisição e armazenamento da extinção da memória (Blair et al., 2001; Quirk e Mueller, 2008; Pape e Pare, 2010). Estudos de mapeamento de atividade e de lesão neuronal em roedores mostram que diferentes tipos de estímulos de ameaça ativam e dependem de diferentes partes da amígdala. Em roedores, pistas olfativas têm um papel crucial na sinalização da presença de um predador e estes sinais são transmitidos através de ligações diretas dos núcleos olfativos principal e acessório para o MeA. Assim, os ratos expostos a um predador natural ou seu odor mostram expressão diferenciada de Fos nesse núcleo (Dielenberg e Mcgregor, 2001). Diversos estudos das últimas 2 décadas tem demonstrado que o medo da dor, do predador e da agressão de membros da mesma espécie (medo social) são processadas em três vias neurais independentes que incluem os núcleos da amígdala, hipotálamo e PAG (Gross e Canteras, 2012). Predadores e membros da mesma espécie agressivos provocam respostas de medo inato (incondicionado) através da ativação de núcleos distintos da amígdala, que são, por sua vez ligado a regiões distintas do AHN, VMH, PMD e PAG para produzir comportamentos.