CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A utilização de Plasma Rico em Plaquetas na regeneração do tecido ósseo
alveolar e cortical. Estudos experimentais num modelo de defeito ósseo
periodontal em cão Beagle (Canis familiaris) e num modelo de defeito ósseo
cortical na ovelha (Ovies aries) #
The Platelet Rich Plasma utilization in regeneration of alveolar and
cortical bone tissue. Experimental studies in a periodontal bone defect
model in Beagle dog (Canis familiaris) and in a cortical bone defect model
in sheep (Ovies aries)
C. A. A. Viegas*1, M. I. R. Dias*1, J. M. T. de Azevedo2, A. J. Ferreira3, F. San Román4, A. M. S. Cabrita5
1Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal 2Departamento de Zootecnia - CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal
3Departamento de Morfologia e Clínica - CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, TULisbon,
Av. da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa, Portugal
4Departamento de Medicina e Cirurgia Animal, Faculdade de Veterinária, Universidade Complutense de Madrid,
Av. Puerta de Hierro, S/N, 28040 Madrid, Espanha
5Instituto de Patologia Experimental, Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, Rua Larga, 3004-504 Coimbra, Portugal Resumo: A primeira parte deste estudo teve como objectivo
avaliar o potencial de regeneração do osso alveolar em resposta ao implante cirúrgico de plasma enriquecido em plaquetas (PRP). O interesse do PRP reside no facto deste conter uma grande concentração em factores de crescimento angiogénicos e mitogénicos presentes nos grânulos a das plaquetas, e envolvi-dos na indução e/ou aceleração da cicatrização/regeneração de lesões dos tecidos moles e duros. Criaram-se defeitos cirúrgicos com 7 mm na tábua vestibular de PM4 e M1, em ambos os quadrantes mandibulares em cães Beagle. Em todos eles aplicou-se uma esponja de colagénio de origem equina associado ao PRP nos defeitos do quadrante direito, tendo o quadrante esquerdo funcionado como controlo. Os animais foram eutanasiados quatro meses após a cirurgia e o material processado para análises histológicas e histomorfométricas. No quadrante mandibular em que se utilizou o PRP observou-se uma frente celular rica contígua e a delinear toda a crista óssea com células mesenquimatosas e células blásticas, o que pressupôe grande actividade de síntese. A regeneração no lado controlo foi muito semelhante mas mais atrasada no tempo. O comprimento da regeneração óssea foi de 3,1±0,7 mm no grupo em que se havia aplicado o PRP relativamente aos 2,4±0,7 mm do lado controlo (p<0,05) e a área óssea foi de 3,4±1,0 mm2para o PRP
relativa-mente aos 1,5±1,0 mm2 do controlo (p<0,05). Os resultados
sugerem que nas condições desta experiência o tratamento de defeitos periodontais com PRP provou potencial na estimulação da regeneração óssea. A segunda parte deste trabalho visou o estudo da capacidade osteogénica, com recurso a análises
histológicas e de histomorfometria óssea, de um enxerto de osso esponjoso autólogo isolado e da sua associação ao PRP num modelo de defeito ósseo cortical circular (→ 6 mm) em ovelhas. Verificou-se que o volume ósseo foi significativamente afectado (p<0,0001) pelo tratamento e tempo. Concluiu-se que não existiu um aumento significativo na formação de tecido ósseo às 3ª e 6ª semanas pós-operatórias em defeitos não críticos a nível de tecido ósseo cortical preenchidos com a associação do enxerto ósseo ao PRP (50:50) relativamente ao uso isolado do primeiro (p>0,05). No entanto, verificou-se também que esta associação possibilitou a obtenção de resultados idênticos na formação de tecido ósseo aos dos defeitos ósseos preenchidos apenas com enxerto, reduzindo para metade a quantidade de enxerto ósseo requerido, o que implicaria menor morbilidade do local dador.
Palavras-chave: regeneração óssea, tecido ósseo alveolar,
tecido ósseo cortical, modelos experimentais, plasma rico em plaquetas
Summary: The purpose of the first study was to verify the
effect of the platelet rich plasma (PRP) in the reconstruction and healing of hard periodontal tissue after periodontal reconstruc-tive surgery. The interest in PRP hinges on the fact that it contains a large concentration of angiogenic and mitogenic growth factors present in the a granules of platelets involved in inducing and/or accelerating the healing of lesions of soft and hard tissues. The procedure was the following: approximately 7 mm large periodontal defects were created in the mandibular vestibular face at the 4thpremolar and the 1stmolar in Beagle
dogs. All the defects were filled up with collagen, but on the experimental side the collagen was saturated with PRP. The dogs were sacrificed 16 weeks postsurgery. We evaluated the bone regeneration histologicaly and the histometric recordings # Prémio Pfizer Ciências Veterinárias 2005
*Correspondência: cviegas@utad.pt Tel: +351 259350634; Fax: +351 259350480 idias@utad.pt
included height and area of alveolar bone regeneration. In the PRP group we could observe a nearly continuous layer of osteoblasts lined the newly formed bone, and there was a dense cellular "front" with mesenchymal stem cells and blastic cells at the coronal extent of the new bone. In the PRP experimental control group we could find the same regeneration standard but slowly developed. The regeneration of bone was 3.1±0.7 mm for the PRP against 2.4±0.7 mm on the control site (p<0.05). The bone area values are 3.4±1.0 mm2 for the PRP against
1.5±1.0 mm2on control (p<0.05). We couldn’t find collagenous
vehicles in both the experimental and the control groups. Our data suggest that PRP has a great potential for bone regenera-tion. The second work aimed at studying osteogenic capacity with recourse to histological and bone histomorphometry analysis of an isolated autologous spongy bone graft and its association to PRP in a model of small sized (→ 6 mm) circular cortical bone defect in sheep. The bone volume was significantly affected (p<0.0001) by the treatment and by time. The conclusion was reached that there was no significant increase in bone tissue f ormation on the 3rdand 6thpost-operative weeks on non-critical
defects at a level of cortical bone tissue filled with an associa-tion of autografting spongy bone with PRP (50:50) with respect to the isolated use of the first (p>0.05). Nevertheless, it was observed that this association enabled identical results to be achieved in bone tissue formation as in bone defects merely filled with grafting by decreasing the volume of autografting of required spongy bone down to half, which would imply lower morbidity at a local donor level.
Keywords: bone regeneration, alveolar bone tissue, cortical
bone tissue, experimental models, platelet rich plasma
Introdução
A engenharia de tecidos e a regeneração do tecido ósseo
A cicatrização/ regeneração do tecido ósseo é um processo complexo, no entanto, com capacidade de, em várias situações clínicas, reconstituir a estrutura do tecido ósseo original sem a formação de tecido cica-tricial conhecido como tal. Este facto é o responsável pela frequente utilização do termo regeneração na caracterização deste processo, ao invés do termo cicatrização, geralmente empregue nas feridas cutâneas ou com localização em outros sistemas orgânicos. Assim, o termo regeneração representa o denominado restitutio ad integrum com a reprodução e reconstrução dos tecido lesados de forma a que a estrutura anatómica e funções originais sejam comple-tamente restauradas e o termo cicatrização/reparação a reconstituição anatómica com a substituição do tecido original lesado ou perdido por tecido conjuntivo fibroso sem que exista a restauração íntegra da estru-tura ou da função do tecido original (Anitua e Andia, 2000). Vários investigadores pensam que o mecanismo que confere ao tecido ósseo a capacidade de regeneração, praticamente da sua exclusividade, uma vez que na grande maioria dos outros tecidos ou órgãos a reparação das lesões ocorre pelo processo característico de cicatrização, é o facto deste reconstituir vários dos fenómenos e funções celulares vitais que
ocorrem durante o desenvolvimento embrionário do sistema esquelético e ao nível da placa de crescimento epifisária (Vortkamp et al., 1998; Ferguson et al., 1999). A cicatrização/regeneração do tecido ósseo envolve um vasto número de fenótipos celulares responsáveis pela coordenação das funções de proliferação, migração, diferenciação e síntese da matriz extracelular (MEC) óssea, sendo que o seu sucesso depende do desenrolar destas funções, numa correcta sequência temporal, por várias linhas celulares presentes ou mobilizadas para o local da lesão em resposta a sinais ou estímulos específicos locais e/ou do meio ambiente. Assim, as vias e a velocidade de desenvolvimento do processo de regeneração do tecido ósseo podem ser influenciadas por numerosos factores locais e sistémicos sendo que, no entanto, na maioria das situações clínicas de lesão do tecido ósseo – este cicatriza após a instituição de terapêutica adequada e/ou intervenção cirúrgica.
No entanto, existem situações clínicas com perda de tecido ósseo, motivadas por diversos processos patológicos ou traumáticos, ou situações de fracturas em que desenvolvem graves complicações, como sejam, processos de atraso de união ou não união em prejuízo do estado geral de saúde e qualidade de vida do doente, que implicam a sujeição a tratamentos prolongados e com elevados custos. Assim, a forma de permitir um cada vez mais rápido pós-operatório ambulatório com qualidade de vida tem impulsionado a comunidade científica e os clínicos no sentido do desenvolvimento de novas terapêuticas com vista a promover ou acelerar o processo de cicatrização do tecido ósseo.
Os recentes avanços no conhecimento dos fenó-menos celulares e moleculares que ocorrem durante o processo de cicatrização das fracturas tem possibilitado o desenvolvimento de potenciais novas formas de abordagem terapêutica, nomeadamente a utilização de biomateriais biodegradáveis com propriedades osteo-condutoras e utilizados como veículos de transporte e libertação lenta de moléculas osteoindutoras, o recurso à terapia selectiva com células mesenquimatosas pluripotenciais (MSC) com origem na medula óssea e com capacidade de diferenciação nas linhas condro - e osteogénica, a utilização de factores de regulação do crescimento e diferenciação das células e da MEC do tecido ósseo em combinação com células osteoproge-nitoras ou isolados e, ainda, o recurso a várias formas de terapia genética, nomeadamente a transferência genética de genes de factores de crescimento para o local da lesão óssea (Goldstein et al., 1999; Scaduto e Lieberman, 1999; Bartold et al., 2000; Fleming et al., 2000; Khan et al., 2000; Niyibizi e Kim, 2000; Vacanti e Vacanti, 2000; Moore et al., 2001; Bucholtz, 2002). Assim, hoje em dia existe uma forte necessidade de melhorar a previsibilidade e a eficiência dos tratamentos regeneradores disponíveis, fazendo esta necessidade com que os investigadores redobrem os seus esforços no estudo da biologia da área da cicatrização, com a
identificação das células alvo mais adequadas, os agentes terapêuticos – os modificadores biológicos, como sejam, as MSC e os factores de crescimento entre outros, os sistemas de administração que permitem controlar a libertação dos mesmos a nível local e as respostas do hospedeiro (McCauley e Somerman, 1998). No que se refere em particular aos factores de crescimento, estes são peptídeos ou glicoproteínas que organizam e coordenam os processos de mitose, quimiotaxia, diferenciação e crescimento das MSC, assim como a produção da MEC pelas células (Forell e Straw, 1993). Os factores de crescimento exercem a sua acção pela ligação a receptores membranários específicos, promovendo uma sequência de fenó-menos intracelulares que influenciam a expressão de genes responsáveis pela codificação das funções metabólicas das células, iniciando-se a transmissão de sinalização intracelular ao ácido desoxirribonucléico (ADN), transcrição e síntese das proteínas necessárias à iniciação da divisão e/ou crescimento celular (Lind, 1998). Estes factores de crescimento, em associação com o micro-ambiente, influenciam a replicação, a diferenciação e as funções metabólicas das células do tecido ósseo aquando de lesão deste, assim como a transcrição genética para o tipo de matriz a produzir por estas células (Canalis et al., 1988a; Lynch et al., 1991b; The American Academy of Periodontology, 1996; Schliephake, 2002).
Actualmente dão-se os primeiros passos na utilização clínica de vários modificadores biológicos em áreas tão diversas como a cirurgia plástica para a regeneração cutânea nos doentes queimados, a cirurgia ortopédica na resolução de defeitos ósseos (Johnson et al., 1988, 1992; Riedel e Valentin-Opran, 1999; Boden et al., 2000; Kleeman et al., 2001; Bessho et al., 2002; Boden et al., 2002; Burkus et al., 2002; Poynton e Lane, 2002; Lanman e Hopkins, 2004a, 2004b) e a cirurgia maxilofacial que busca soluções para as lesões craniofaciais causadas por doenças infecciosas, neoplásicas, traumáticas ou outras destrutivas dos processos alveolares ou da própria estrutura da mandíbula e maxila com efeitos desfigurantes (Graves e Cochran, 1990; Langer e Vacanti, 1993; Boyne et al., 1997; Howell et al., 1997; Whitman et al., 1997; McCauley e Somerman, 1998; Groeneveld et al., 1999a; 1999b; Cochran et al., 2000; Garg, 2000; van den Bergh et al., 2000; Boyne, 2001; Jung et al., 2003; Warnke e Coren, 2003; Bianchi et al., 2004). Em particular na Medicina Dentária, a periodôncia, a endodôncia e a implantologia são áreas que se baseiam nestes conhecimentos com a finalidade de obtenção respectivamente da regeneração periodontal, formação de dentina reparadora ou terciária e uma quantidade suficiente de tecido ósseo de elevada densidade que permita a colocação de implantes passíveis de osteointegração, sobretudo em doentes edêntulos, com osteoporose ou atrofia grave da maxila (Urist, 1965; Graves e Cochran, 1990; Becker et al.,
1992; Langer e Vacanti, 1993; Rutherford et al., 1993; McCauley e Somerman, 1998; Garg, 2000; Kassolis et al., 2000; Meraw et al., 2000).
No entanto, uma das grandes limitações da utilização tópica de factores de crescimento como promotores da regeneração óssea é a sua limitada vida média no defeito ósseo, condicionada pela acção das enzimas proteolíticas, endocitose dos receptores, solubilidade dos veículos de distribuição controlada entre outros (McCauley e Somerman, 1998). Outro problema é o da sua difícil produção em larga escala e purificação, o que conduz aos elevados preços que inviabilizam no momento a sua utilização massiva na clínica (Obarrio et al., 2000). E muitas outras questões se põem com a utilização destes agentes, tais como: Qual o factor de crescimento ou a combinação mais adequada? Qual a dose mais adequada? Qual o melhor veículo biológico de libertação controlada para cada defeito ósseo? Quando se deve iniciar a libertação dos factores de crescimento na cascata do processo de regeneração óssea e em que sequência? Quais os possíveis efeitos colaterais locais e sistémicos durante a sua utilização? Poderão os seus efeitos limitar-se ao ambiente local (Vandersall, 1998; Rossa et al., 2000)?
O processo de cicatrização/regeneração do tecido ósseo
Abordando o processo de cicatrização dos tecidos orgânicos lesionados de uma forma geral, a reparação destes inicia-se logo após a agressão tecidular com-preendendo as fases inflamatória, de reparação e de remodelação.
A libertação de factores de crescimento, citocinas e outras substâncias bio-activas a partir das plaquetas, das células dos tecidos envolventes, da MEC agredidas e das células de reacção inflamatória (Rappolee et al., 1988) é parte crítica deste processo (Terranova et al., 1989). Depois de uma agressão tecidular aguda que afecte os tecidos sub-epiteliais, a ruptura dos vasos sanguíneos conduz à formação de um coágulo sanguí-neo, composto por uma rede de fibras de fibrina que retêm agregados de plaquetas, leucócitos, eritrócitos e proteínas plasmáticas, como sejam a fibronectina, a vitronectina e a trombospondina (Wikesjö et al., 1992; Aukhil, 2000). Entre as funções do coágulo sanguíneo salienta-se: o seu papel no aporte de factores de crescimento e citocinas libertados pelas plaquetas activadas e o facto de actuar como matriz condutora provisória para a migração celular (Aukhil, 2000). Nesta fase, o ambiente do coágulo de fibrina é a de um meio hipóxico (pO25-10 mm Hg) e acídico (pH 4-6), em relação ao tecido íntegro em termos fisiológicos (pO2 45-55 mm Hg, pH 7,42) (Knighton et al., 1981; Davis et al., 1988; Marx et al., 1996), contendo igualmente células estruturais, MSC e capilares seccionados com coágulos e células endoteliais expostas (Knighton et al., 1981). Desde os primeiros
momentos todos estes estímulos promovem o início da revascularização do coágulo, a migração de MSC, a sua activação na linha condro- e osteoblástica e a mitogénese das células osteo-precursoras no caso particular do tecido ósseo e dos fibroblastos presentes no local da lesão (Anitua e Andia, 2000).
As plaquetas activadas das margens da lesão sofrem desgranulação durante os primeiros cinco dias após a lesão, libertando vários factores de crescimento e citocinas cuja actividade termina ao fim de sete a dez dias (Marx et al., 1998). Entre estes encontram-se o factor de crescimento de transformação β1 e β2 (TGF-β1 e -β2), factor de crescimento fibroblástico (FGF) -2, factor de crescimento de origem plaquetária (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF), factor de crescimento das células endoteliais derivado das plaquetas (PDEGF), esfingosina 1-fosfato, peptido 2 activador dos neutrófilos (NAP-2), factor angiogénico derivado das plaquetas (PDAF), factor de crescimento dos hepatócitos (HGF), péptido III activador do tecido conjuntivo (CTAP-III), interleucina (IL) -1, substân-cias relacionadas como o factor 4 activador das plaquetas (PAF-4) e a β-tromboglobulina (Assoian et al., 1984; Miyazono e Takaku, 1989). Por outro lado, o exsudado plasmático aporta uma importante fonte de factor de crescimento tipo insulina (IGF) –I, sendo que poucas horas após a agressão são libertados no local da lesão pelas células adjacentes factores de crescimento como o IGF–I, PDGF, factor de cresci-mento de transformação a (TGF-α) e TGF-β (The American Academy of Periodontology, 1996; Gemmell e Park, 2000).
A fase inflamatória inicia-se cerca de uma hora após a agressão com o afluxo de polimorfonucleares neutrófilos que infiltram o coágulo a partir das margens da ferida. Posteriormente acodem os macrófagos atraídos pela acção do PDGF e pela existência de um gradiente de oxigénio superior a 20 mm Hg (Knighton et al., 1981, 1984; Wikesjö et al., 1992). Em cerca de seis horas a superfície da ferida é delineada por neutrófilos que eliminam os tecidos lesados, corpos estranhos e células bacterianas mediante fagocitose e pela libertação de enzimas e produtos tóxicos formados a partir do oxigénio (Aukhil, 2000). Os monócitos do sangue periférico continuam a ser recrutados para o local da ferida convertendo-se em macrófagos após activação (Aukhil, 2000). Os macrófagos, enquanto executam estas acções, libertam moléculas biologicamente activas, como sejam, o PDGF, factor estimulante da formação de colónias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante da formação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulante da formação de colónias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), FGF-2, IGF-I, TGF-α, TGF-β1 e citocinas como o IL-1 que, por sua vez, recrutam outras células inflamatórias, para além de fibroblastos e células endoteliais
(Rappolee et al., 1988). Assim os macrófagos repre-sentam um papel muito importante na transição da fase inflamatória para a fase de formação de tecido de granulação (Rappolee et al., 1988; Wikesjö et al., 1992). À medida que a influência do PDGF de origem plaquetária diminui, incrementa-se a acção dos factores de crescimento derivados dos macrófagos, dos factores angiogénicos e do TGF-β produzido pelas MSC pré-existentes ou recrutadas dos tecidos envol-ventes à lesão (Knighton et al., 1981, 1984).
Dois a quatro dias após a agressão, enquanto se mantém a diferença de pH do coágulo de fibrina organizada em relação ao tecido são, inicia-se a fase de formação de tecido de granulação paralelamente a uma redução gradual da infiltração pelos neutrófilos, permanecendo o fluxo de macrófagos e de fibroblastos que, mediante fagocitose, vão destruindo os neutrófilos e os eritrócitos in loco (Aukhil, 2000). Os fibroblastos, sob a influência de factores de crescimento sintetizados pelos macrófagos ou por eles próprios, sintetizam tecido conjuntivo laxo responsável pela união das margens da lesão, e que actua como suporte a outras células e à neovascularização necessária ao forneci-mento dos nutrientes e da oxigenação vitais à manutenção das funções celulares (Wikesjö et al., 1992; Anitua e Andia, 2000; Aukhil, 2000).
Quando no coágulo organizado se equilibra, o gradiente da pressão de O2 e se equilibra o pH, diminui a actividade dos macrófagos, o processo de angiogénese reduz-se e os fibroblastos migram e proliferam na rede de fibrina, depositando MEC. Entre os sete a dez dias após o início da cicatrização, alguns fibroblastos transformam-se em miofibroblastos e expressam a actina de músculo liso que lhes permite gerar fortes forças contrácteis responsáveis pela con-tracção da ferida (Wikesjö et al., 1992; Aukhil, 2000). Gradualmente passa-se da fase de reparação à última fase ou fase de remodelação que se prolonga durante meses ou anos, na qual o tecido neoformado, rico em células sofre um processo de maturação e de remodelação em resposta às suas necessidades funcionais (Wikesjö et al., 1992).
No tecido ósseo, a cicatrização óssea por 1ª intenção ou directa, inicialmente descrita por Danis (1949), caracteriza-se pela ausência de formação de um calo ósseo externo e pelo desaparecimento gradual da linha de fractura através da regeneração directa por tecido ósseo formado por sistemas de Havers secundários, sem a formação intermédia de tecido fibroso, carti-lagíneo ou mesmo tecido ósseo trabecular (Bagby e Janes, 1958; Prieur e Sumner-Smith, 1984; Kaderly, 1991). A cicatrização óssea por 1ª intenção, ou seja, a verdadeira regeneração com restitutio ad integrum do tecido original ocorre apenas nas fracturas estáveis e sem deslocamento dos fragmentos ósseos ou naquela em que é possível uma redução anatómica perfeita, após sujeição a técnica cirúrgica que permita a fixação rígida do foco de fractura e em que é possível a
manutenção de um adequado suprimento sanguíneo desde a fase inicial do processo de regeneração óssea (Ashhurst, 1986; Schenk, 1987).
O processo de cicatrização óssea por 2ª intenção ou indirecto desenvolve-se devido à existência de uma separação superior a 150 a 200 mm e/ou micromovi-mentos entre os fragmicromovi-mentos ósseos no foco de fractura, denominando-se desta forma pelo facto de, numa primeira fase, ocorrer a formação de tecido conjuntivo intermediário ou fibrocartilagíneo, substituído poste-riormente por tecido ósseo (Schenk, 1987). O processo de cicatrização óssea por 2ª intenção é muito mais frequente que o processo por 1ª intenção, caracteri-zando-se por uma combinação de ossificação endo-condral e intramembranosa, sendo que o estímulo que induz a condrogénese ao invés da ossificação intramembranosa não se encontra ainda completa-mente esclarecido pensando-se, no entanto, que esteja relacionado com factores mecânicos e/ou vasculares.
Os processos biológicos e as várias fases fisiológicas do processo de cicatrização óssea por 2ª intenção foram estudados por numerosos autores, de entre eles: McKibbin (1978, 1989a, 1989b), Perren (1979), Pauwels (1980), Frost (1983, 1989a, 1989b), Mayer e Wolf (1983), Ashhurst (1986), Reddi et al. (1987), Owen e Friedenstein (1988), Aro et al. (1990) e Einhorn (1991, 1998), tendo sido subdivididos segundo uma sequência temporal e/ou eventos com localiza-ções específicas ao nível do foco de fractura em seis fases: impacção, indução, inflamação, formação do calo ósseo mole, formação do calo ósseo duro e remodelação (McKibbin, 1978; Heppenstall, 1980). Estas fases ocorrem sucessivamente encontrando-se, no entanto, interrelacionadas e temporariamente sobrepostas, podendo existir áreas no foco de fractura que progridem mais rapidamente do que outras, sabendo-se actualmente que este processo é composto por uma continuidade de fases interactivas de formação, reabsorção e substituição de tecidos até à reposição do tecido ósseo lamelar no foco de fractura. Hoje sabe-se que, no caso particular do processo da regeneração óssea, desde a fase da lesão até à remode-lação final, ocorrem igualmente uma série de fenó-menos – migração, diferenciação, proliferação celular e síntese de MEC óssea, fenómenos estes controlados e coordenados pela expressão de genes específicos, esta, por sua vez, induzida nomeadamente por factores de crescimento e citocinas. Vários estudos têm com-provado a expressão espacial e temporal no calo ósseo, ao longo do processo de cicatrização da fractura, de vários factores de crescimento, como sejam, o TGF-β, as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), o FGF, o IGF e o PDGF (Joyce et al., 1990; Andrew et al., 1993a, 1993b; Bourque et al., 1993; Sandberg et al., 1993; Nakase et al., 1994; Andrew et al., 1995; Bostrom et al., 1995; Onishi et al., 1998; Fujii et al., 1999), assim como algumas citocinas, principalmente a IL-1 e -6 (Einhorn, 1995), e proteínas
da MEC óssea, tais como, os colagénio tipos I, II, IX e X, a fostatase alcalina (ALP), a osteocalcina (OC) e a osteonectina (OCN) (Jingushi et al., 1992; Hiltunen et al., 1993; Sandberg et al., 1993; Stafford et al., 1994; Hughes et al., 1995).
O Plasma Enriquecido em Plaquetas (PRP) como modificador biológico e as razões fundamentais para o seu uso nos tratamentos que visam a regeneração óssea
Tendo como base os trabalhos desenvolvidos por Martas desde 1972 (Martas, 1982), Tayapongsak et al. introduziram em 1994 o conceito de adesivo autólogo de fibrina (AFA). Ao adicionar o adesivo autólogo de fibrina a enxertos de osso esponjoso observaram uma consolidação óssea precoce dos enxertos, o que atribuíram às propriedades adesivas do AFA e à rede de fibrina nele desenvolvida que facilitaria a osteocondução às células osteocompetentes do enxerto ósseo. Para além do referido o AFA apresenta propriedades hemostáticas, é um bom substrato para a migração de MSC e fibroblastos, facilita a revascula-rização, estimula a proliferação de fibroblastos e osteoblastos e retarda a multiplicação de microrganis-mos (Tayapongsak et al., 1994). Depois dos trabalhos pioneiros em cirurgia oral e maxilofacial de Whitman et al. (1997) e de Marx et al. (1998, 2000), reconhece-se actualmente o papel central dos factores de cresci-mento encontrados no AFA no êxito clínico dos enxertos ósseos aplicados ao nível da maxila e mandíbula (Miyazono et al., 1994).
Relativamente ao PRP, este consiste no sequestro e concentração de trombócitos no plasma mediante cen-trifugação por gradientes de densidade, aumentando assim em cerca de 900% (Marx, 1999) a concentração das plaquetas e dos factores de crescimento (relação linear) (Landesberg et al., 2000) nelas contidos relati-vamente à contagem normal de plaquetas no sangue, o que o torna muito útil na promoção da cicatrização de feridas (Roberts e Sporn, 1993). Marx et al. (1998) demonstraram a presença de vários factores de cresci-mento no PRP, nomeadamente do PDGF, TGF-β1 e -β2 e IGF-I identificados nos grânulos a das plaquetas (Linder et al., 1979; Harrison e Cramer 1993; Reeder et al., 1993; Roberts e Sporn, 1993; Miyazono et al., 1994; Greenlagh, 1996), VEGF, PDEGF, IL-1, FGF-2 e PAF-4 (Jones et al., 1992; Harrison e Cramer 1993; Miyadera et al., 1995; Mohle et al., 1997).
Relativamente aos principais factores de crescimen-to concentrados no PRP refere-se que o TGF-β tem como principais acções o efeito mitogénico sobre os fibroblastos, condroblastos e osteoblastos, a quimio-taxia, a síntese de colagénio e a indução da função osteoblástica, a activação da síntese de outros factores de crescimento e a indução da diferenciação de MSC (Bonewald, 2002). O IGF-I estimula a síntese de colagénio, a proliferação fibroblástica, a síntese de
proteoglicanos sulfatados, a função osteoblástica, exerce efeito mitogénico sobre as células diferencia-das, incluindo os osteoblastos e inibe a colagenase (Conover e Rosen, 2002). O PDGF promove a quimio-taxia dos macrófagos e fibroblastos, a proliferação dos fibroblastos, o metabolismo do colagénio, a angiogé-nese e o efeito mitogénico sobre as MSC, fibroblastos e osteoblastos (Canalis e Rydziel, 2002).
Na continuação dos seus trabalhos Marx et al. (1998) também demonstraram, aquando da utilização conjunta de PRP com enxerto de osso esponjoso autólogo, a existência de receptores celulares para os factores de crescimento PDGF e TGF-β nas MSC localizadas essencialmente a nível perivascular endosteal (Owen, 1985; Caplan, 1987) e para o IGF-I localizados nos osteoblastos endosteais, transplantados com o enxerto ósseo e medula, e que constituirão os prováveis alvos de actuação do PRP, para além de estreitamente relacionados com o processo de regene-ração do tecido ósseo (Marx, 1999).
A aplicação do gel autólogo rico em plaquetas (APG) desenvolvido por Marx et al. (1998), como um subproduto do PRP, promove uma regeneração óssea mais rápida e eficiente, pois proporciona um signi-ficativo aporte de moléculas de fibrina e fibronectina, com propriedades hemostáticas, osteoconductoras e estabilizadoras do coágulo sanguíneo, associado ao facto de possuir uma alta concentração de leucócitos capazes de actuar como um "antibiótico autólogo", reduzindo os riscos de infecção e amplificando a influência dos factores de crescimento formados nas plaquetas e que são libertados aquando da sua desgranulação (Marx et al., 1998; Anitua, 1999; Anitua e Andia, 2000; Garg, 2000; Garg et al., 2000; Camargo et al., 2002). O facto do APG ser uma preparação autóloga evita o perigo de transmissão de doenças infecto-contagiosas e de reacções imunitárias, para além de ser um produto acessível em termos económicos relativamente à utilização dos factores de crescimento obtidos por engenharia genética (Marx et al., 1998; Obarrio et al., 2000; Marx, 2000).
No entanto, e apesar do PRP ter vindo a ser utilizado nos últimos anos de forma isolada ou como um potencial adjunto ao autoenxerto de osso esponjoso ou a materiais substitutos ósseos na cirurgia reconstrutiva do tecido ósseo a nível oral e maxilofacial em Medicina Humana (Marx et al., 1998; Sanchez et al., 2003; Hanna et al., 2004; Zhang et al., 2004; Camargo et al., 2005; Sammartino et al., 2005), os estudos experimentais pré-clínicos referentes à utilização do PRP a nível oral ou maxilofacial (Fennis et al., 2002; Velich et al., 2004; Grageda et al., 2005; Swennen et al., 2005) ou do crânio (Aghaloo et al., 2002, 2004, 2005; Schlegel et al., 2003, 2004; Wiltfang et al., 2004) são limitados, sendo a litera-tura científica relativa à sua aplicação na reconstrução do tecido ósseo cortical e/ou trabecular ao nível do esque-leto apendicular em modelos animais (Zhang et al., 2003; Fujimori, 2005) muito escassa.
Assim, naturalmente torna-se necessário a realização de outros estudos experimentais em modelos animais que elucidem acerca da potencial utilização do PRP ao nível do tecido ósseo alveolar e cortical. Este trabalho teve assim como objectivos o estudo e caracterização das potenciais propriedades osteoindutoras do PRP isolado num modelo experimental de defeito no tecido ósseo alveolar/periodontal no cão Beagle ou da sua associação a um enxerto de osso esponjoso autólogo num modelo de defeito ósseo cortical de pequenas dimensões na ovelha, com recurso a análises de histologia e histomorfometria óssea.
Material e métodos
Os protocolos anestésico e cirúrgico e a manutenção dos animais foram avaliados e aprovados pela Comissão Consultiva do Bem Estar Animal e de Protecção dos Animais Utilizados Para Fins Experimentais e/ou Outros Científicos, da Direcção Geral de Veterinária, respeitaram a Portaria nº 1005/92 de 23 de Outubro, e os regulamentos da Legislação da Comunidade Europeia para o Bem Estar e Experimentação Animal.
Modelo experimental de defeito no tecido ósseo alveolar/periodontal
Protocolos anestésico e cirúrgico. Os animais foram
sujeitos a medicação pré-anestésica com acepromazina (Calmivet®, Vetóquinol), 5 mg EV. A indução da anestesia realizou-se com pentotal sódico (Pentothal® Sódico, Abbott) a 2,5%, 20-25 mg/kg EV, e a manutenção com anestesia por inalação utilizando halotano (Fluothane, Zeneca Produtos Biociência, Lda.) 1-1,5% veiculado numa associação de oxigénio e protóxido de azoto.
O trabalho realizou-se em cinco cães adultos machos de raça Beagle. Em cada quadrante da mandíbula foram realizados dois defeitos experimentais correspondendo ao 4º pré-molar (PM4) e ao primeiro molar (M1), cada um deles com duas raízes. Nos defeitos criados nas peças situadas no quadrante mandibular direito realizou-se o trabalho experimental enquanto que nos defeitos criados no quadrante mandibular esquerdo se desenrolaram os trabalhos correspondentes ao grupo controlo.
Após a amputação da coroa (aproximadamente 2 mm acima da união cimento – esmalte) e a realização das endodôncias, elevou-se um "flap" mucoperiosteal de ambos os lados vestibular e lingual desde a face mesial de PM4até à face distal do M1. Retirou-se de seguida, com recurso a uma broca redonda em micro-motor a 430 rpm, a tábua vestibular do osso alveolar realizando-se um defeito final de 7 mm em cada peça dentária, desde a união cimento – esmalte até ao fundo do defeito sobre as raízes mesial e distal (Figura 1).
Após se terem criado os defeitos, aplicou-se no quadrante direito uma esponja reabsorvível de colagénio de origem equina (Emovet®) embebida em PRP, cujo protocolo de obtenção se descreve no Quadro 1. No lado contra lateral esquerdo apenas se aplicou a esponja de colagénio. Os "flaps" foram sutu-rados sem tensão, com fio reabsorvível Vicryl® 3-0, com pontos de sutura interdentais ajustando-se a sutura à zona da união cimento-esmalte, tendo o defeito permanecido assim até à eutanásia dos animais quatro meses mais tarde (Figura 2).
Os cuidados pós-operatórios incluíram a administração de uma associação antibiótica de amoxicilina/ácido clavulânico (Synulox®, Pfizer), 8,75 mg/kg p.v. IM de 24 em 24 horas, desde o dia anterior à intervenção cirúrgica até aos dez dias posteriores à referida cirurgia. Durante as duas semanas posteriores à cirurgia os animais foram alimentados com ração humedecida, para minimizar a possibilidade de trauma da zona intervencionada durante as refeições, sendo que passado este período se passou a fornecer uma ração normal.
Exames radiográficos. Realizaram-se radiografias
apicais com parâmetros idênticos (45 kV, 100 mA/0,05 segundos, 6 mAs) num aparelho de radiologia oral (Trophy®) e um estudo radiovisiográfico após as inter-venções e antes da eutanásia.
Histologia e histomorfometria óssea. As amostras
foram fixadas numa solução de formaldeído e proces-sadas utilizando técnicas de inclusão em metacrilato (Figura 3) e seccionadas e polidas com recurso ao equipamento EXAKT "Cutting and Grinding
System"® (EXAKT Technologies), desenvolvidos por
Donath (1995), até à obtenção de uma espessura média de 5 µm. Realizamos dois cortes por cada dente, um por cada raiz e na porção central das mesmas. As lâminas obtidas foram coradas com a coloração de (Lévai e Laczkó, 1975) e analisadas num microscópio óptico Leitz®DM-RBE (Leica, Wetzlar), com objectivas de ampliação ×10, ×40, ×100 para avaliação da regeneração do osso alveolar.
Cada lâmina, contendo uma secção de uma raiz e do tecido periodontal envolvente, foi avaliada pelo mesmo avaliador num estudo cego. As análises histo-morfométricas assistidas por computador realizaram-se em imagens capturadas por vídeo câmara Olympus (modelo DP-10) a partir das imagens das secções histológicas obtidas ao microscópio. As imagens foram analisadas com o programa versão Micro Image para a Europa 4,0® (Olympus Optical CO) para Windows® 95/NT/98© num computador IBM (PC compatível). O software foi calibrado para a medição dos parâmetros analisados em milímetros. As medições realizadas para a avaliação da regeneração óssea foram o comprimento (distância entre a extensão apical do defeito e a extensão coronal da regeneração óssea ao longo da raiz) e a área (medida da área em corte seccional representada pela regeneração óssea ao longo da raiz).
Análise estatística. Os resultados quantitativos são
apresentados na forma de médias ± desvio padrão (SD) e foram calculados por raiz, dente (duas raízes por dente) e indivíduo. A análise dos dados incluiu o cálculo das diferenças significativas entre locais com e sem utilização de PRP, sendo que as diferenças entre
Figura 1 - Aspecto final dos defeitos periodontais criados Figura 2 - Aplicação do PRP na esponja de colagénio
Figura 3 - Lâmina realizada segundo o método de Donath (1995) e
grupos foram analisadas com o teste paramétrico de t-student com n=5, visto que apesar de amostra ser pequena existir normalidade dos dados. Os dados foram analisados com o programa de software de estatística (Versão 8,2, 1989-2003, SAS Institute, Inc.®, NC, USA). As diferenças foram consideradas significativas para uma probabilidade superior a 95% (p<0,05).
Modelo experimental de defeito ósseo de pequenas dimensões no tecido ósseo cortical
Protocolos anestésico e cirúrgico. Utilizou-se a
técnica de defeito ósseo de pequenas dimensões descrita por Schenk e Willenegger (1977) para o estudo da formação do tecido ósseo e posteriormente utilizada por Hallfeldt et al. (1995) e Stützle et al. (1998) para estudos de avaliação das propriedades osteogénicas da matriz óssea desmineralizada após diferentes técnicas de esterilização e de incorporação de cerâmicas.
O protocolo anestésico foi idêntico ao anteriormente referido. Após a indução da anestesia geral, os animais foram posicionados em decúbito lateral esquerdo de forma a proceder-se ao acesso cirúrgico à face medial da tíbia esquerda. Procedeu-se à preparação do campo cirúr-gico por meio da desinfecção e colocação dos panos de campo esterilizados. Realizou-se uma incisão cutânea longitudinal de cerca de 18 cm na face média do mem-bro posterior esquerdo para acesso à diáfise da tíbia, afastou-se anteriormente os músculos tibial cranial e ter-ceiro peroneal e posteriormente o músculo flexor lateral
dos dedos e incidiu-se longitudinalmente o periósteo que se elevou numa extensão de cerca de 12 cm. Os orifícios transcorticais com 6 mm de diâmetro foram realizados ao nível da face antero-medial da diáfise da tíbia (Figura 4), com recurso a uma broca de 6 mm da Synthes®, tendo permanecido vazios, sido preenchidos por autoenxerto de osso esponjoso da epífise proximal do úmero, por uma associação (50:50) de enxerto de osso esponjoso autólogo e PRP ou apenas por PRP (Quadro 1). O periósteo que cobria a zona do defeito ósseo e em cerca de 2 mm ao seu redor foi removido. O endósteo foi igual-mente removido ao redor da zona interna do defeito ósseo por curetagem, assim como a medula óssea visível, e após a realização do defeito ósseo. A ferida cirúrgica foi suturada, fáscias musculares e tecido subcutâneo com um fio de sutura reabsorvível e a pele com seda.
Quadro 1 - Técnica de obtenção do plasma enriquecido em plaquetas e da associação deste ao enxerto de osso esponjoso autólogo
para aplicação cirúrgica (Marx et al., 1998)
Protocolo de obtenção do plasma rico em plaquetas
1. Obtenção de 5 ml de sangue venoso da veia jugular em tubos de colheita de amostras sanguínea com 1 ml de fosfato citrato dextrose sódio (anticoagulante).
2. Centrifugação da amostra sanguínea (5600 rpm, 10 minutos).
3. Separação, segundo os diferentes gradientes de densidade, da série vermelha, que se deposita no fundo do tubo, e do plasma que corresponde ao sobrenadante. Este, por sua vez, pode subdividir-se no plasma rico em plaquetas (PRP) e no plasma pobre em plaquetas (PPP), sendo que o PRP representa a fracção mais próxima da série vermelha.
4. Pipetagem dos 2 ml mais superficiais de sobrenadante, correspondentes ao PPP, que se desprezam. 5. Segunda centrifugação da amostra sanguínea (2400 rpm, 15 minutos).
6. Obtenção de 1 a 2 ml de PRP juntamente com a zona mais superficial da série vermelha pois as plaquetas de síntese mais recente e de maior actividade possuem maiores dimensões e misturam-se com o 1 mm3mais
superficial da camada dos eritrócitos, pelo que se devem incluir juntamente com a camada de PRP, e sendo que este facto confere à referida camada uma tonalidade avermelhada (Reeder et al., 1993).
Protocolo de associação do PRP ao enxerto de osso esponjoso autólogo para aplicação cirúrgica
1. Mistura de 10 ml de cloreto de cálcio a 10% com 10.000 unidades de trombina tópica de origem bovina (Gen Trac®,
BioPharma) necessários para o início do processo de coagulação (desgranulação das plaquetas).
2. Associação de 2 ml de PRP com 0,5 ml da mistura de cloreto de cálcio/trombina e 0,5 ml de ar, actuando as bolhas como meio de mistura, numa seringa de 10 ml.
3. Agitar a seringa durante 6 a 10 segundos para se iniciar o processo de coagulação.
4. O PRP, agora sob a forma de um gel, pode ser utilizado em cirurgia podendo-se moldar com a forma necessária à sua aplicação cirúrgica.
Realizaram-se trinta e dois orifícios transcorticais ao nível da face antero-medial da tíbia em oito ovelhas, com idades compreendidas entre os 2 e os 6 anos e um peso médio de 45 kg, subdivididas em qua-tro grupos experimentais (n=8): o grupo conqua-trolo (grupo 1) em que o defeito ósseo permaneceu vazio e os grupos em que os defeitos ósseos foram preenchidos com autoenxerto de osso esponjoso (grupo 2), os preenchidos por uma associação de enxerto de osso esponjoso autólogo e PRP (grupo 3) e os preenchidos apenas com PRP (grupo 4). Por sua vez, cada grupo foi subdividido em dois períodos pós-operatórios – 3ª e 6ª semanas, pelo que para cada tratamento e período pós-operatório se obtiveram quatro defeitos ósseos.
Procedeu-se a analgesia pós-operatória pela admi-nistração de flunixina meglumina (Finadyne P.A.®, Schering-Plough II), 1 mg/kg IM de 24 em 24 horas, durante as primeiras 48 horas, a antibioterapia com amoxicilina (Clamoxyl®LA, Pfizer), 15 mg/kg p.v. IM de 48 em 48 horas, e à renovação, todas as 48 horas, dos pensos compressivos e de protecção da sutura cutânea durante os primeiros 8 dias de pós-operatório. Os pontos da sutura cutânea foram retirados por volta do 10º dia pós-operatório.
Histologia e histomorfometria óssea. As peças ósseas,
contendo a área do defeito ósseo, foram fixadas numa solução de formaldeído, sujeitas a processo de inclusão em metilmetacrilato (Difford, 1974; Page et al., 1996), seccionadas ao longo do eixo longitudinal da tíbia e polidas até à obtenção de secções com uma espessura média de 25 µm com o equipamento EXAKT acima referido, tendo-se reali-zado duas secções por cada uma das peças ósseas. No que se refere aos métodos de colo-ração, por cada peça óssea submeteu-se uma secção a coloração pelo método do Azul de Toluidina (Schenk et al., 1984) e outra pelo método do Tricrómico de Goldner (Goldner, 1937; Page et al., 1996; Stevens e Wilson,
1996). A avaliação histológica foi realizada com objec-tivas de ampliação ×2, ×4, ×10, ×20 e ×40.
A análise histomorfométrica foi realizada pela quantificação do volume ósseo à 3ª e 6ª semanas do período pós-operatório nos grupos 1 a 4, com objectiva de ampliação ×4, por técnica de leitura manual e automática com recurso ao programa de software de análise de imagem SigmaScan® (SPSS Science). O volume ósseo corresponde à área trabecular/área total medida, em que a área corresponde a X*D2 (X=número de impactos da quadrícula sobre as trabéculas ósseas, D=medida do lado da quadrícula em micrómetros) (Kimmel e Jee, 1983; Parfitt, 1983; Parfitt et al., 1987).
Análise estatística. Todos os dados são apresentados
na forma de média ± SD. Procedeu-se a análise de variância para o estudo da influência do tratamento e do tempo na variação do volume ósseo à 3ª e 6ª semanas do período pós-operatório entre os diferentes tratamentos. A análise estatística foi realizada pelo programa de software de estatística JMP (JMP Versão 5, 1989-2003, SAS Institute, Inc.®, NC, USA). As diferenças foram consideradas significativas para uma probabilidade superior a 95% (p<0,05).
Resultados
Modelo experimental de defeito no tecido ósseo alveolar/periodontal
Exames radiográficos. Nesta experiência a
regenera-ção óssea foi mais evidente nas amostras em que se aplicou o PRP relativamente às do grupo controlo (Figuras 5 e 6), facto comprovado também pela correspondente representação da percentagem de regene-ração do tecido ósseo alveolar (Gráficos 1 e 2) e pelas imagens histológicas (Figuras 7 e 8).
Figura 5 - Regeneração óssea no quadrante
controlo
Gráfico 1 - Neoformação de tecido
ósseo no grupo controlo
Gráfico 2 - Neoformação de tecido
ósseo no grupo experimental
Figura 6 - Regeneração óssea no quadrante
com PRP
Figura 8 - Crescimento expressivo do osso
no grupo experimental (Lévai Laczkó, 4×)
Figura 7 - Crescimento limitado do osso
Análise histológica. Nas análises histológica das
amostras em que se juntou o PRP, o tecido conjuntivo que rodeou a porção mais coronal do tecido ósseo neoformado apresentou uma frente celular de grande densidade com a presença de numerosos vasos sanguíneos, células mesenquimatosas indiferenciadas e células de tipo blástico delineando as margens das trabéculas, existindo também nas margens do endósteo, indiciando síntese activa de osteóide (Figuras 9 e 10). Nos canais de Havers foi possível observar pequenos capilares, células mesenquimatosas, células blásticas e osteóide não completamente mineralizado (Figuras 11 à 13). Também se pôde observar tecido ósseo neofor-mado nas superfícies periosteais do tecido ósseo original, este último mais maduro e delineado por células de tipo blástico em continuidade.
Na análise histológica das amostras do grupo controlo, o periodonto apresentava características típicas de um processo normal de reparação. Em geral as amostras controlo demonstravam uma sequência semelhante de regeneração do tecido ósseo alveolar apesar de mais atrasado no tempo. Observou-se um
extenso epitélio de união adjacente à superfície radicu-lar e sobre o tecido conjuntivo, tendo havido menor número de osteoblastos, assim como da quantidade de osso regenerado.
Figura 9 - Frente celular rica em células mesenquimatosas
indiferen-ciadas, células blásticas e neovascularização na porção coronal da crista óssea (Lévai Laczkó)
Figura 10 - Osso delineado por um envólucro de osteoblastos.
Observa-se também a formação de fibras de Sharpey na sua união ao osso (Lévai Laczkó)
Figura 11 - Deposição de células blásticas (osteoblastos) no interior de
um canal de Havers (Lévai Laczkó)
Figura 12 - Observar-se a presença de osteoblastos no interior de um
canal de Havers e a síntese de osteóide não completamente mineraliza-do (Lévai Laczkó)
Figura 13 - Aspecto interior de um canal de Havers delineado por
endotélio, células blásticas, células mesenquimatosas indiferenciadas e osteóide (Lévai Laczkó)
Figura 14 - Fotografia histológica de grupo controlo à 6ª semana
pós-operatória evidenciando a neoformação de tecido ósseo a partir do local receptor (Tricrómico de Goldner, ×70)
Figura 15 - Fotografia histológica de grupo que recebeu PRP à 6ª
semana do período pós-operatório (Tricrómico de Goldner, ×70)
Análise de histomorfometria óssea. A regeneração
óssea (comprimento) foi de 2,4±0,7 mm no grupo controlo e de 3,1±0,7 mm no grupo onde se juntou o PRP. Observaram-se, assim, diferenças significativas (p=0,04) entre os dois grupos, correspondendo a aproximadamente 36% no grupo controlo e 48% no grupo experimental relativamente à totalidade do defeito ósseo em causa.
A área de regeneração óssea foi de 1,5±1,0 mm2no grupo controlo e de 3,4±1,0 mm2 no grupo onde se aplicou o PRP, tendo-se observando-se diferenças significativas (p=0,01) entre os dois grupos.
Modelo experimental de defeito ósseo de pequenas dimensões no tecido ósseo cortical
Análise histológica. Todos os grupos demonstraram
um aumento da formação de tecido ósseo ao longo do tempo, sendo que a maior formação se observou nos grupos que receberam o autoenxerto de osso espon-joso isolado (grupo 2) ou a sua associação ao PRP (grupo 3) relativamente ao grupo controlo (grupo 1) ou ao que recebeu apenas o PRP (grupo 4).
No grupo 1 controlo, a neoformação de tecido ósseo originou-se a partir das margens dos defeitos não se observando, no entanto, o total preenchimento do defeito ósseo à 6ª semana do período pós-operatório (Figura 14). O aspecto observado no grupo 4, que havia recebido o PRP isolado, foi semelhante ao do grupo 1 (Figura 15).
Nos grupos 2 e 3, em que se aplicou o autoenxerto de osso esponjoso isolado ou associado ao PRP, e à 3ª semana, não se verificou a presença de zonas de hematoma, absorvido provavelmente ao longo das 1ª e 2ª semanas durante a fase de revascularização do enxerto. Em alguns casos observou-se a ocorrência de neoformação de tecido fibroso promovendo a união entre o enxerto e as margens do defeito ósseo. Às 3ª e 6ª semanas observou-se uma extensa neoformação do tecido ósseo sobre a maioria das trabéculas ósseas por todo o enxerto, em simultâneo com uma actividade de reabsorção osteoclástica e remodelação simultânea do enxerto com a deposição de tecido ósseo lamelar ao nível dos núcleos das trabéculas em necrose (Figuras 16 à 21). À 6ª semana, igualmente nos grupos 2 e 3, verificou-se a ocorrência da cicatrização do tecido ósseo ao nível do defeito ósseo pela incorporação do enxerto e pela neoformação de tecido ósseo mediada pelo próprio enxerto, verificando-se a ocorrência na grande maioria das situações de uma união entre o local receptor e o enxerto através de tecido ósseo (Figura 22).
Análise de histomorfometria óssea. No que se refere
à avaliação histomorfométrica, o Quadro 2 apresenta os valores comprovativos da progressão do volume ósseo em função do tempo para os vários grupos em estudo. A análise de variância do volume ósseo
demonstra que este foi significativamente afectada pelo tratamento (p<0,0001) e pelo tempo (p<0,0001). No que se refere aos contrastes entre grupos e tempos verificou-se que nos grupos 2 e 3, às 3ª e 6ª semanas, houveram aumentos significativos (p<0,0001) do volume ósseo relativamente aos grupos 1 e 4. De notar que o grupo 4, em que se utilizou o PRP isolado, demonstrou uma tendência para apresentar menor formação de tecido ósseo relativamente ao grupo 1, Figura 16 - Fotografia microscópica do grupo que havia recebido
enx-erto de osso esponjoso autólogo à 3ª semana pós-operatória onde se pode observar a deposição de osteóide sobre as trabéculas ósseas enx-ertadas (Tricrómico de Goldner, ×35)
Figura 17 - Pormenor da Figura 16 onde se pode observar a presença
de vasos sanguíneos entre as trabéculas enxertadas (Tricrómico de Goldner, ×375)
Figura 18 - Pormenor da Figura 16 evidenciando o osteóide localizado
entre as trabéculas ósseas enxertadas e a camada de osteoblastos responsáveis pela sua síntese (Tricrómico de Goldner, ×375)
Figura 19 - Fotografia histológica de grupo que havia recebido
enxer-to de osso esponjoso autólogo à 3ª semana pós-operatória evidenciando trabéculas ósseas transplantadas rodeadas por osteoblastos activos (Azul de Toluidina, ×375)
Figura 20 - Fotografia histológica de grupo que havia recebido
enxer-to de osso esponjoso autólogo à 6ª semana pós-operatória onde se observa a presença de trabéculas ósseas transplantadas em processo de reabsorção, concomitante a neoformação de tecido ósseo sobre as mes-mas trabéculas (Azul de Toluidina, ×70)
Figura 21 - Pormenor da Figura 20 evidenciando a deposição de tecido
ósseo recém formado sobre as trabéculas ósseas enxertadas (Azul de Toluidina, ×180)
Figura 22 - Fotografia histológica de grupo que havia recebido
enxer-to de osso esponjoso autólogo à 6ª semana pós-operatória evidenciando a incorporação do enxerto ósseo e o início da união entre este e o local receptor e simultaneamente a sua conversão em tecido ósseo lamelar (Azul de Toluidina, ×70)
controlo, em ambos os tempos em estudo, apesar de esta diferença não ter sido estatisticamente significativa quando comparada com o grupo controlo (p>0,05). No grupo 3, em que se utilizou a associação de autoenxerto de osso esponjoso ao PRP, verificou-se uma ligeira tendência de aumento do volume ósseo à 6ª semana quando comparado com o grupo 2, em que se aplicou apenas o enxerto ósseo, apesar de esta diferença também não ter sido significativa (p>0,05).
Discussão
O PRP tem sido utilizado em cirurgia oral e maxilo-facial com vista à obtenção da regeneração do tecido ósseo com maior rapidez e qualidade, uma vez que os factores de crescimento nele contidos exercem funções de indução e/ou aceleração da cicatrização das lesões dos tecidos moles e duros (Okuda et al., 2003). Tal como anteriormente referido, as plaquetas contêm reservas fisiológicas de factores de cresci-mento angiogénicos e mitogénicos nos seus grânulos a (Banks et al., 1998; Maloney et al., 1998), com possi-bilidade de libertação quando activadas, segregadas ou agregadas pelo colagénio ou adrenalina (Banks et al., 1998). Entre eles referem-se o VEGF, com propriedades de estimulação de crescimento do endotélio vascular, o TGF-β1 e -β2 capazes de promover a diminuição da reabsorção óssea e da formação e actividade dos osteoclastos, assim como estimularem a maturação do colagénio nas feridas (Bonewald e Mundy, 1990; Steenfos, 1994; Banks et al., 1998). Ao referido, acresce o facto de, por acção do PDGF, poderem aumentar o número das células envolvidas na cicatrização de feridas e recrutar outros factores de crescimento angiogénicos para o local da lesão (Steenfos, 1994) existindo, assim, a possibili-dade de que o aumento da concentração das plaquetas no local da lesão aumente e melhore a cicatrização dos tecidos em causa.
As diversas vantagens da utilização clínica do PRP baseiam-se no facto de constituir uma técnica simples, rápida e económica, com recurso a um separador de células que promove a sua repartição segundo o seu gradiente de densidade, quando são necessários grandes volumes de PRP, ou apenas a uma centrífuga, quando são necessários reduzidos volumes de PRP. A obtenção do PRP pode realizar-se em simultâneo com a obtenção do enxerto de osso esponjoso autólogo ou
com outro procedimento cirúrgico necessário, reduzindo-se a quantidade de enxerto necessária ao preenchimento de determinado defeito ósseo e incre-mentando a regeneração do tecido ósseo a esse nível. O facto do PRP constituir uma preparação autóloga, realizada no momento da intervenção cirúrgica, elimina preocupações referentes à transmissão de possíveis doenças infecto-contagiosas e de reacções imunológicas e possibilita a recuperação dos eritrócitos e do plasma pobre em plaquetas (PPP), após a obtenção do PRP, que podem ser administrados ao doente a partir dos sacos de recolha sanguínea através de acesso a uma veia central ou periférica.
No que se refere ao estudo da utilização do PRP associado a uma esponja de colagénio no modelo experimental ao nível do tecido ósseo alveolar no cão Beagle este fundamentou-se na teoria da indução bio-química da regeneração periodontal sugerida por Terranova e Wikesjö (1987) que se baseia na hipótese de que pela estimulação de células competentes nos tecidos viáveis que rodeiam a lesão com modifi-cadores da resposta biológica, como os factores de crescimento de origem polipeptídica, podemos induzir as células apropriadas a migrar para a lesão, a sua multiplicação e diferenciação e a síntese de MEC, desencadeando a complexa sequência de aconteci-mentos que conduzem à regeneração do tecido ósseo. Até hoje desenvolveram-se vários estudos pré-clínicos com o objectivo de avaliar a acção dos factores de crescimento na regeneração do periodonto. Apesar de não existir nenhum trabalho que utilize apenas PRP e das diferenças nas metodologias utilizadas pelos autores, iremos tentar comparar os nossos resultados com os resultados obtidos noutros trabalhos.
Devido à natureza complexa dos tecidos conjuntivos envolvidos no processo regenerativo é pouco provável que um factor de crescimento isolado seja suficiente para obter a regeneração do periodonto (Terranova e Wikesjö, 1987). Tatakis et al. (2000) referiram que o tratamento de defeitos periodontais apenas com o TGF-β1 não tem utilidade prática, pois não conduziu à regeneração do tecido ósseo nem do cimento.
No entanto muitos estudos realizados in vitro e in vivo demonstraram a capacidade individual e em asso-ciação de vários factores de crescimento na indução da regeneração do tecido ósseo. Estudos in vitro utilizando factores de crescimento como o PDGF (Canalis et al., 1988b; Piché e Graves, 1989; Hughes et al., 1992; Hock e Canalis, 1994; Strayhorn et al.,
Quadro 2 - Avaliação histomorfométrica da neoformação de tecido ósseo nos vários grupos em estudo
Volume ósseo (%)
Tratamento Grupo nº 3ª semana 6ª semana
Controlo 1 28,2±6,1 43,2±3,5
Autoenxerto osso esponjoso 2 59,5±8,5 80,0±4,4
Osso esponjoso autólogo + PRP 3 53,7±6,1 82,5±2,9
1999) ou IGF-I (Hock et al., 1988) em osteoblastos, TGF-β em células progenitoras dos osteoblastos (Rosen, 1994; McCauley et al., 1995; Strayhorn et al., 1999), IGF-I em células progenitoras dos osteoclastos (Panagakos, 1993) e em osteoclastos (Mochizuki et al., 1992), BMP-2 em combinação com PDGF, IGF-I e TGF-β na abóbada craniana do rato (Pfeilschifter et
al., 1990) ou IGF-I, EGF, PDGF e TGF-β em células
progenitoras dos osteoblastos (Piché e Graves, 1989) promoveram a regeneração do osso alveolar.
Estudos pré-clínicos em que se promoveu um aporte de factores de crescimento de modo isolado como seja o rhBMP-2 no cão (Sigurdsson et al., 1995; Wikesjö et al., 1999), FGF-2 no cão (Murakami et al., 1999) e em macaco (Takayama et al., 2001), PDGF em macaco (Giannobile et al., 1994) ou TGF-b1 em ovelhas (Mohammed et al., 1998), ou de uma combinação de factores de crescimento, como seja, de PDGF-BB e IGF-I em estudos experimentais no cão (Lynch et al., 1989, 1991a, 1991b), em macaco (Rutherford et al., 1992a; Giannobile et al., 1994, 1996) ou no Homem (Howell et al., 1997) demonstraram a regeneração periodontal. Nestes últimos estudos provou-se a sinergia entre o PDGF e o IGF na indução da proliferação de células ósseas, na deposição de MEC óssea e colagénica e na aderência conjuntiva por proliferação de fibroblastos do ligamento periodontal em comparação com o obtido na sua utilização individual.
Na nossa experiência a aplicação cirúrgica de PRP numa esponja de colagénio resulta em evidência radiográfica, histológica e histomorfométrica da existência de uma aceleração da regeneração óssea no grupo experimental em que se utilizou o PRP relativa-mente ao grupo controlo. No que respeita ao cresci-mento do osso obtivemos valores superiores no lado em que aplicou o PRP, com diferenças significativas (p=0,04) entre os dois grupos, o que correspondeu a aproximadamente 48% de regeneração no grupo em que se aplicou o PRP e 36% no grupo controlo em percentagem do defeito induzido. A mesma tendência segue-se no caso da área de tecido ósseo regenerada com diferenças muito significativas entre os dois grupos em estudo (p=0,01).
Lynch et al. (1989) foram os primeiros a demonstrar a regeneração periodontal, em termos de tecido ósseo e cimento, utilizando uma combinação de PDGF-BB e IGF-I em dentes de cão Beagle afectados por perio-dontite. Os nossos resultados histológicos vão de acordo aos encontrados com este estudo, onde podemos observar uma camada contínua de osteoblastos delineando o tecido ósseo neoformado e uma densa frente celular na porção mais coronal da crista óssea quando se adiciona PRP ao defeito. Lynch et al. (1991b), num modelo de periodontite de surgimento natural em cão Beagle, demonstraram uma breve exposição dos tecidos periodontais a uma combinação de rhPDGF-B e IGF-I, num veículo de gel de carboxi-metilcelulose, exercia um efeito terapêutico prolongado
constituindo um estímulo inicial ao processo da cica-trização das feridas conducentes à sua regeneração. Lynch et al. (1991a) e Becker et al. (1992) referiram a indução da regeneração óssea pela combinação de PDGF-BB e IGF-I ao redor de implantes de titânio e nos alvéolos que permanecem após extracção dentária. Rutherford et al. (1992a) alcançam regeneração perio-dontal com a combinação PDGF-BB e IGF-I num modelo de periodontite induzida com ligaduras elásticas em macaco. Giannobile et al. (1996) estudaram os efeitos regeneradores da combinação de IGF-I e PDGF-BB no macaco (Macaca fascicularis) com resultados positivos às doze semanas com 42,5% de regeneração óssea contra os 48% obtidos na nossa experiência às dezasseis semanas do defeito induzido. Selvig et al. (1994) estudaram no cão a aplicação de uma combinação de IGF-II, FGF-2 e TGF-β1 com o objectivo de obter regeneração periodontal, mas sem resultados positivos.
Howell et al. (1995) avaliaram pela primeira vez no Homem com êxito os efeitos de uma combinação de PDGF-BB e IGF-I num veículo de metilcelulose. Dois anos depois, Howell et al. (1997) avaliaram os efeitos de uma combinação rhPDGF-BB e rhIGF-I no Homem com resultados prometedores na promoção da regeneração do tecido ósseo e do cimento.
Sigurdsson et al. (1995) verificaram que com a utilização de rhBMP-2, aplicado em partículas sintéticas absorvíveis se promoveu um aumento significativo da deposição de tecido ósseo e cimento no cão, mas com evidência de fenómenos de anquilose das raízes. Choi et al. (2002), num estudo com rhBMP-2 em esponja absorvível de colagénio, obtiveram regeneração do tecido ósseo em 65% do defeito induzido às oito semanas e de 68% às vinte e quatro semanas. Também se desenvolveram estudos com BMP em osteointe-gração de implantes como os levados a cabo por Rutherford et al. (1992b), nos quais se utilizou OP-1 em humanos e o de Wang et al. (1993), com BMP de origem bovina no cão, e nos quais se obtiveram incre-mentos na deposição de tecido ósseo. Wikesjö et al. (1999) obtiveram num modelo de defeito ósseo periodontal no cão, com a utilização de rhBMP-2, incremento na regeneração do tecido ósseo alveolar e aderência do periodonto.
A realização de um estudo sobre a utilização de PRP isolado ou em associação com um enxerto de osso esponjoso autólogo, num modelo de defeito ósseo de pequenas dimensões ao nível do tecido ósseo cortical na ovelha, fundamentou-se no facto de existirem inúmeros estudos experimentais em modelos animais publicados comprovando a acção dos factores de crescimento no processo de regeneração óssea em ossos longos (compilados e revistos por Bonewald, 2002; Canalis e Rydziel, 2002; Conover e Rosen, 2002; Hurley et al., 2002; Rosen e Wozney, 2002).
Pela ausência de estudos experimentais com a utilização da associação de autoenxerto de osso
esponjoso ao PRP ao nível do tecido ósseo cortical, em ossos longos com ossificação endocondral, realizaremos a comparação dos resultados obtidos no nosso estudo com trabalhos em que se utilizou esta associação ao nível de tecido ósseo dos ossos planos do crânio ou mandíbula, de ossificação intramembranosa. Na análise histológica dos defeitos em que se utili-zou o enxerto ósseo isolado ou associado ao PRP pode-se observar o padrão cíclico de reabsorção, revascularização e subsequente formação de tecido ósseo que está descrita para a caracterização da incor-poração do enxerto de osso esponjoso (Hanson e Markel, 1992). Esta é frequentemente definida como "creeping substitution" – processo regenerativo de reconstrução dinâmica após o transplante de tecido ósseo, em que o tecido viável com origem no local receptor substitui a estrutura de tecido transplantado em necrose (Burchardt, 1987) – apesar da incorpo-ração do enxerto de osso esponjoso não corresponder ao processo clássico de "creeping substitution", asso-ciado à utilização de aloenxertos corticais, pelo facto de com o enxerto de osso esponjoso a neoformação de tecido ósseo ocorrer directamente sobre as trabéculas ósseas em necrose, com a subsequente reabsorção destas após a deposição de tecido ósseo recém formado (Albrektsson, 1980).
A análise histomorfométrica demonstrou a existência de um aumento significativo no volume ósseo às 3ª e 6ª semanas no grupo onde se havia aplicado o enxerto ósseo isolado, e no grupo em que se utilizou a associa-ção do enxerto ósseo ao PRP, relativamente ao grupo controlo e ao grupo em que se aplicou apenas o PRP. Ocorreu uma tendência para uma menor formação de tecido ósseo no grupo que recebeu apenas o PRP relativamente ao grupo controlo e um leve aumento do volume ósseo à 6ª semana no grupo que recebeu o enxerto ósseo associado ao PRP relativamente ao grupo do enxerto ósseo isolado, no entanto, não signi-ficativo estatisticamente. Este último facto não coin-cide com os resultados obtidos no estudo clínico de Marx et al. (1998) que demonstraram um aumento da área e densidade de tecido ósseo trabecular quando se utilizou a associação de autoenxerto de osso espon-joso ao PRP (74,0±11,0%, p=0,005) e relativamente ao recurso ao enxerto ósseo isolado (55,1±8,0%, p=0,005). No entanto, de referir que este estudo foi realizado no Homem em defeitos ósseos de descon-tinuidade da mandíbula e, por conseguinte, em tecido ósseo com origem embrionária distinta dos ossos do esqueleto apendicular e formado por processo de ossi-ficação intramembranosa, também ele diferente do processo de ossificação endocondral pelo qual se formam os ossos do esqueleto apendicular. De referir que, no geral, os resultados obtidos estão de acordo com os apresentados no estudo pré-clínico de Aghaloo et al. (2002) realizado no crânio do coelho, tanto no que concerne à maior neoformação de tecido ósseo nos grupos em que se aplicou o enxerto ósseo isolado
ou associado ao PRP relativamente aos grupos controlo e em que se aplicou apenas o PRP, como na ligeira tendência para uma maior formação de tecido ósseo no grupo que recebeu a associação de enxerto ósseo e PRP no final do período pós-operatório de 4 meses permitido neste estudo.
Uma possível explicação para que o volume ósseo no grupo em que se aplicou apenas o PRP, às 3ª e 6ª semanas do período pós-operatório, ter sido idêntico ao do grupo controlo no estudo experimental ao nível do tecido ósseo cortical poderá ser justificado pelo facto dos principais factores de crescimento presentes no PRP actuarem essencialmente nos receptores das MSC presentes na medula óssea e nos pré-osteoblastos e osteoblastos existentes no tecido ósseo trabecular, e consequentemente também no enxerto de osso espon-joso mas não, ou em percentagem muito inferior, apenas no local receptor do tecido ósseo cortical.
Apesar de não se ter verificado a existência de diferenças significativas entre o grupo em que se utilizou a associação do enxerto ósseo ao PRP e o grupo em que se aplicou o enxerto ósseo isolado, o número de defeitos ósseos de pequenas dimensões ao nível do tecido ósseo cortical realizados para cada tratamento e tempo pós-operatório foi pequeno, o que pode ter contribuído para a falta de significado estatís-tico nas diferenças observadas entre os vários grupos em estudo. Outro aspecto que pode ter influenciado os resultados obtidos é o facto de grande parte dos fenó-menos da cicatrização óssea ocorrerem nas fases iniciais, após a indução da lesão no tecido ósseo, pelo que possíveis diferenças significativas entre os grupos em estudo podem ter ocorrido antes da 3ª semana pela acção dos factores de crescimento veiculados pelo PRP.
Em conclusão:
1. No modelo de defeito do tecido ósseo alveo-lar/periodontal verificou-se que o comprimento e área óssea foram significativamente afectadas, com valores superiores no lado em que aplicou o PRP relativa-mente ao controlo, o que ratifica que o PRP apresenta um forte potencial na estimulação da rege-neração do tecido ósseo alveolar.
2. Apesar de se ter verificado que a associação de enxerto de osso esponjoso autólogo ao PRP (50:50) não promovia um efeito osteogénico superior à da uti-lização isolada do autoenxerto de osso esponjoso em defeitos não críticos a nível de tecido ósseo cortical conclui-se que esta associação induzia uma formação de tecido ósseo equivalente à obtida pela aplicação isolada do enxerto, permitindo assim a redução da quantidade necessária do referido enxerto ósseo o que diminui a morbalidade ao nível do seu local de obtenção.
