UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
NADIA GRANDI BOMBONATO
INVESTIGAÇÃO DE BRUCELOSE EM PEQUENOS RUMINANTES
DOUTORADO
NADIA GRANDI BOMBONATO
INVESTIGAÇÃO DE BRUCELOSE EM PEQUENOS RUMINANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Federal de Uberlândia, como exigência parcial para obtenção do título de Doutora em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Saúde Animal
Orientador: Profa. Dra. Anna Monteiro Correia Lima
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil.
B695i 2017
Bombonato, Nadia Grandi, 1957
Investigação de brucelose em pequenos ruminantes / Nadia Grandi Bombonato. - 2017.
92 f. : il.
Orientadora: Anna Monteiro Correia Lima.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.
Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.te.2018.52 Inclui bibliografia.
1. Veterinária - Teses. 2. Caprino - Doenças - Teses. 3. Ovino - Doenças - Teses. 4. Brucelose - Teses. I. Lima, Anna Monteiro Correia. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. III. Título.
INVESTIGAÇÃO DE BRUCELOSE EM PEQUENOS RUMINANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias, da Faculdade de
Medicina Veterinária, da Universidade Federal de
Uberlândia, como exigência parcial para obtenção
do título de Doutora em Ciências Veterinárias.
Uberlândia, 04 de agosto de 2017.
__________________________________________________
Profa. Dra. Anna Monteiro Correia Lima (Orientadora) – FAMEV/UFU
__________________________________________________
Profa. Dra. Viviane de Souza – EMBRAPA/Sobral - CE
__________________________________________________
Prof. Dra. Karine Cristine de Almeida - UNIPAM
_________________________________________________
Prof. Dra. Camila Raineri – FAMEV/UFU
__________________________________________________
À minha família, pelo apoio,
AGRADECIMENTOS
À Deus por tudo que tenho e tudo que sou.
À Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia.
À minha orientadora Profa. Dra. Anna Monteiro Correia Lima, exemplo de ser
humano, de pesquisadora e professora, grande amiga e incentivadora, agradeço pelo carinho
e compreensão.
Aos membros da banca examinadora, pelas sugestões e enriquecimento do
trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias e seus professores.
Ao Centro Universitário de Patos de Minas – UNIPAM, pelo incetivo e apoio
durante todo o período da pós-graduação.
Aos colegas do Laboratório de Doenças Infecciosas da Universidade Federal de
Uberlândia, pelo apoio, carinho e amizade.
À minha amiga Mariana Assunção, pela ajuda nos momentos difíceis, pelo
incentivo em continuar minha pesquisa e pela amizade incondicional.
Ao amigo Luis Oliveira Lopes, pelo companheirismo e amizade.
A todos os colegas de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias da UFU.
A todos os proprietários das fazendas que me receberam e confiaram no trabalho
realizado.
Às minhas alunas e estagiárias Glaucia e Lorena, do Laboratório de Doenças
Infecciosas do Centro Universitários de Patos de Minas - UNIPAM, pelo constante auxílio
durante as coletas nas fazendas e processamento das amostras.
A todos da minha família que me incentivaram e torceram por mim, em especial à
minha mãe, pelo orgulho que tem ao falar de mim e de minha profissão.
A todos os outros colegas e amigos que direta e indiretamente contribuíram para
RESUMO
Bombonato, Nadia Grandi, 2017. Investigação de brucelose em pequenos ruminantes. Tese de
doutorado em Ciências Veterinárias. UFU. Uberlândia, MG. 92p.
Ao longo das últimas décadas a criação de ovinos e caprinos têm sofrido transformações técnicas nos diversos elos de suas cadeias produtivas. É uma atividade explorada em todos os continentes, sendo exercida em distintos ecossistemas com os mais diferentes tipos de clima, solo, topografia e vegetação. Devido a importância que representam essas criações, cuidados com a sanidade dos rebanhos devem ser tomados, não só pela perda e danos na produção como também pelo controle de enfermidades que podem acometer o ser humano. Dentre essas temos a brucelose, enfermidade infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero Brucella. Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar a ocorrência da brucelose em duas propriedades de caprinos leiteiros e três propriedades de ovinos de corte na região do Alto Paranaíba, MG. Foram coletadas 48 amostras de sangue e leite de cabras em lactação para o diagnóstico da B. abortus, pelo teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e Teste do Anel em Leite (TAL). Foi também utilizada a PCR em tempo real para diagnóstico da B. abortus e B. melitensis no leite desses animais. De 30 ovinos de três propriedades da região foram coletadas amostras de sangue para diagnóstico da B. ovis, pelo teste de Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA) e pela PCR em tempo real. Vinte amostras de sêmen ovino de duas Centrais de Produção e Comercialização de Semen foram analisadas pela PCR em tempo real para também verificar a presença de B. ovis. Para o teste do TAL no leite caprino, todas as 48 amostras foram negativas, já para o teste do AAT, uma fêmea caprina foi positiva, mostrando que a B. abortus pode ocorrer também em caprinos. No diagnóstico pela PCR em tempo real todas as amostras de leite mostraram resultado negativo para B. abortus e B. melitensis. Das 30 amostras de sangue ovino para o teste do IDGA, 3(10%) foram positivas e confirmadas pela PCR em tempo real. Apesar da baixa ocorrência da B. abortus, e a não ocorrência da B. melitensis nos caprinos investigados, deve sempre haver um monitoramento dos rebanhos visto a importância zoonótica dos agentes. Quanto a B. ovis, devido aos problemas graves que causa na reprodução dos ovinos, os exames devem ser feitos rotineiramente.
ABSTRACT
Bombonato, Nadia Grandi, 2017. Investigation of brucellosis in small ruminants. Doctoral
thesis in Veterinary Sciences. UFU. Uberlândia, MG. 92p.
Over the last decades, sheep and goat farming has undergone technical transformations in the various links of its productive chains. It is an activity explored in all the continents, being exerted in distinct ecosystems with the most different types of climate, soil, topography and vegetation. Due to the importance of this animal’s productions, care for the health of herds must be taken, not only for the loss and damages in the production, but also for the control of diseases that can affect the human being. Among these we have brucellosis, an infectious contagious disease, caused by bacteria of the genus Brucella. Thus, the objective of this research was to investigate the occurrence of brucellosis in two properties of dairy goats and three properties of sheep for meat production in the Alto Paranaíba, MG region. Forty-eight blood samples and lactating goats' milk were collected for the diagnosis of B. abortus, by the Acidified Buffered Antigen (ABT) and Milk Ring Test (MRT). Real-time PCR was also
used for the diagnosis of B. abortus and B. melitensis in the milk of these animals. Blood
samples were also collected from 30 sheep of three properties in the region, for
diagnosis of B. ovis by the IDGA test and real-time PCR. Twenty samples of sheep semen
from two Semen Production and Marketing Centers were analyzed by real-time PCR to
also verify the presence of B. ovis. For the Ring Test in goat milk, all 48 samples were
negative, whereas for the ABT test, a caprine female was positive, showing that B. abortus can also occur in goats. In the diagnosis by real-time PCR, all the milk samples showed negative results for B. abortus and B. melitensis. From 30 sheep blood samples for the IDGA Test, 3 (10%) were positive and confirmed by real-time PCR. Despite the low occurrence of B. abortus, and the non-occurrence of B. melitensis in the goats investigated, there should always be a monitoring of the herds, considering the zoonotic importance of the agents. As for B. ovis, due to the serious problems it causes in sheep breeding, examinations should be done routinely.
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
abortus...………..42
Tabela 2. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
melitensis...43
CAPÍTULO 3
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
ovis……….……..55
CAPÍTULO 4
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
ovis……….……..65
Tabela 2.Frequência de ovinos reagentes (valores relativos e absolutos) na pesquisa
SUMÁRIO
Capítulo 1 – Considerações Gerais.……….10
1. Introdução...11 2. Objetivo.………...13 2.1 Objetivos gerais.………...13
2.2 Objetivos específicos.………...13
3. Revisão de Literatura………....14
3.1A importância da produção de ovinos e caprinos .………...14
3.2 Brucelose….………16
3.2.1 Brucella abortus ... 717 3.2.2 Brucella melitensis . ... 19
3.2.3 Brucella ovis.………..21
3.3 Diagnóstico………...23
Referências. ... 26
Capítulo 2 – Detecção de Brucella abortus e Brucella melitensis em leite caprino pela PCR em tempo real ... 37
Capítulo 3 – Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo real em sêmen ovino comercial….………50
Capítulo 4 – Investigação da ocorrência de infecção por Brucela ovis em rebanhos ovinos………..59
Capítulo 5 – Considerações finais...73
Anexo II – Normas da Revista Ciência Rural para submissão do artigo: Investigação da ocorrência de infecção por Brucella abortus e Brucella melitensis em rebanhos
caprinos ... 75
Anexo III – Normas da Revista Semina: Ciências Agrárias para submissão do artigo: Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo real em sêmen ovino comercial... 80
Anexo IV – Normas da Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira para submissão do artigo: Investigação da ocorrência de infecção por Brucela ovis em rebanhos
11
1. Introdução
O crescimento significativo da exploração de pequenos ruminantes está transformando
o cenário dos sistemas produtivos no mundo. Ao longo das últimas décadas a criação de
ovinos e caprinos têm sofrido transformações técnicas nos diversos elos de suas cadeias
produtivas. É uma atividade explorada em todos os continentes, sendo exercida em distintos
ecossistemas com os mais diferentes tipos de clima, solo, topografia e vegetação. Porém,
apenas em alguns países a atividade possui expressão econômica e assim como no Brasil é
desenvolvida de forma empírica com baixos níveis tecnológicos (CORREIA, 2016).
De acordo com dados do IBGE, o rebanho nacional de caprinos atingiu 9,78 milhões
de cabeças em 2016 apresentando uma variação positiva de em relação a 2015. O Nordeste
detém o maior efetivo de caprinos, sendo responsável por 92,7% do total da espécie no País.
O efetivo de ovinos foi de 18,45 milhões em 2016, com pouca variação em relação a 2015. A
Região Nordeste se destaca na criação de ovinos e concentrou 60,6% do rebanho nacional no
último ano. A Região Sul figura em seguida, representando 26,5% do efetivo da espécie,
acompanhada pelas Regiões Centro-Oeste (5,6%), Sudeste (3,8%) e Norte (3,6%) (IBGE,
2016).
Os produtos originados da ovinocaprinocultura, carne, leite e pele, têm crescente
procura e aceitação no mercado interno e externo, e para atender à demanda de mercado,
começam a ser observadas mudanças nos segmentos de produção e comercialização, com o
surgimento de criadores cada vez mais especializados na caprinocultura de corte ou leite e na
ovinocultura de corte. O abastecimento dos mercados urbanos de carne, leite e seus derivados
constitui o foco principal da atividade, onde a carne assume uma posição de destaque ao ser
comercializada em ambientes especializados a preços compensadores. Porém, verifica-se que
no mercado interno ainda não há a fiscalização adequada para que os produtos
comercializados sejam idôneos.
Devido a importância que representam essas criações, cuidados com a sanidade dos
rebanhos devem ser tomados, não só pela perda e danos na produção como também pelo
controle de enfermidades que podem acometer o ser humano.
Dentre as enfermidades que acometem pequenos ruminantes temos a brucelose com
caráter zoonótico e uma das mais difundidas no mundo. É causada pelo gênero Brucella onde cada uma das espécies possui seus hospedeiros preferenciais entre os animais domésticos. A
Brucella abortus em bovinos, B. melitentis em caprinos e ovinos, B. ovis em ovinos e B. canis
considerada endêmica em várias regiões no mundo e em alguns países da América Latina,
porém ainda não encontrada no Brasil.
A infecção por bactérias do gênero Brucella spp. é uma das causas mais importantes de
problemas reprodutivos em animais domésticos, e as perdas econômicas geradas pela brucelose
vão além dos problemas reprodutivos, como barreiras internacionais ao comércio de produtos de
origem animal (carne, leite e derivados) e perdas para as indústrias devido a condenação dos
mesmos, além de gastos com programas de controle, erradicação e pesquisas (JARDIM et al.,
2006).
Considerando o número reduzido de rebanhos de pequenos ruminantes na região do
Alto Paranaíba em Minas Gerais, um levantamento sobre ocorrência das espécies de Brucella
que acometem esses hospedeiros é muito importante, não só para o conhecimento do estado
sanitário dos animais e controle da enfermidade, como também na minimização da doença
13
2. Objetivo
2.1 Objetivo Geral
Investigar a ocorrência da brucelose em caprinos e ovinos em propriedades na região
do Alto Paranaíba, MG.
2.2 Objetivos Específicos
• Identificar a ocorrência de anticorpos anti Brucella abortus em rebanhos
caprinos leiteiros utilizando o teste do Antigeno Acidificado Tamponado (AAT).
• Identificar a ocorrência de anticorpos anti Brucella abortus em amostras individuais de leite caprino pelo Teste do Anel do Leite (TAL).
• Investigar a presença do DNA de Brucella abortus e Brucella melitensis em leite caprino com o uso de marcadores moleculares padronizados para identificação dos agentes
por meio da PCR em Tempo Real.
• Investigar a presença do DNA de Brucella ovis em sêmen ovino comercial com o uso de marcadores moleculares padronizados para identificação do agente por meio da PCR
em tempo real.
3. Revisão de literatura
3.1. A importância da produção de ovinos e caprinos
Os caprinos foram os primeiros animais domesticados pelo homem, há cerca de dez
mil anos, a produzirem alimentos. Vêm acompanhando a história da humanidade com
registro em relatos históricos, porém apesar disso teve poucas vezes seu valor reconhecido.
Produzem leite, carne, couro e esterco, além de ter utilidade como animal de tração e ainda
hoje os caprinos tem um papel fundamental como fornecedores de alimentos em países ou
regiões em desenvolvimento (RIBEIRO, 1997).
A caprinocultura leiteira encontra-se bastante avançada em países como França,
Canadá, Espanha, Suíça, Inglaterra e Itália, e especialmente na França, Espanha, Suíça,
Inglaterra e Itália, que apresentam um consumo de 6,5 litros de leite por habitante ano,
porém 75% do total produzido destina-se a produção de queijos. Nos países como Canadá e
África do Sul concentra-se a produção de leite em pó. Esse fato proporciona aos governos a
adoção de políticas públicas que visem o desenvolvimento do mercado interno dos produtos
de origem caprina e ovina que apresenta um grande potencial (CARVALHO, 2014).
No Brasil, a produção de leite de cabra não ocorre somente na região Nordeste,
havendo outras bacias leiteiras já sedimentadas nas regiões Sudeste e Sul do país. O
desenvolvimento da caprinocultura leiteira no contexto brasileiro ocorre de acordo com o
sistema de produção utilizado (SILVA et al., 2012). Mais da metade do rebanho nacional
(52,61%) é composta por animais leiteiros, porém, sua produção é pouca expressiva, estando
em 21ª lugar (0,93%) na produção mundial. Apesar disso, dados sobre a produção leiteira
revelam que o Brasil se configura como maior produtor de leite de cabra da América do Sul,
com 150.000 t/ano (FAO, 2014).
Apesar da cidade de São Paulo se tratar de um grande e potencial centro
consumidor, o consumo tanto de derivados quanto de leite de cabra é restrito, devido
principalmente ao desconhecimento e à falta de costume da população. Porém, os
consumidores ressaltam que há potencial de elevação no consumo de ambos, desde que haja
maior disponibilidade, informação sobre o produto, além de um preço mais acessível para o
consumidor final (LIMA et al., 2015).
As primeiras espécies domesticadas pelo homem foram os ovinos e sua criação
possibilitava produção de alimento, principalmente carne e leite e ainda proteção pelo uso de
15
continentes, isto devido principalmente ao seu poder de adaptação a diferentes climas,
relevos e vegetações. Esta criação está destinada à exploração econômica e também à
subsistência de famílias em zonas rurais. Na Europa a criação de ovinos ocorre de forma
intensiva com rebanhos produtores de carne e leite, destinados à fabricação de queijos
especiais, e na América do Sul as criações ocorrem em sistemas de confinamento e
pastagens naturais com rebanhos de raças mistas que produzem lã e carne de qualidade para
o mercado internacional (VIANA, 2008).
A criação de ovinos e caprinos no Brasil ainda tem um longo período a percorrer
para conquistar seu próprio mercado nas diversas regiões onde é praticada e se credenciar a
uma maior participação no mercado nacional e, até mesmo, no internacional. No entanto,
terá que satisfazer os pré-requisitos de aumento de produtividade e da melhoria da qualidade
de seus produtos. São objetivos difíceis, mas possíveis de atingir, desde que trabalhados
simultaneamente com a melhoria nos padrões de gerenciamento das unidades produtivas e
maior articulação entre os diversos componentes da cadeia produtiva (GUIMARÃES
FILHO; ATAÍDE JUNIOR, 2009).
Destacam-se como fatores limitantes para o desenvolvimento desse comércio a
irregularidade no fornecimento dos produtos de origem caprina e ovina, visto que a
exigência do mercado se dá principalmente no fornecimento fixo desses produtos durante
todo o ano sem períodos de sazonalidade. Tem-se ainda o abate clandestino desses animais
que agem competitivamente com frigoríficos industriais e também os elevados preços
comerciais praticados no mercado que reduz a competitividade de outros produtos
concorrentes (CARVALHO, 2014).
A oferta de carnes de ovinos e caprinos oriundos de frigoríficos certificados por
serviços de inspeção federal ou estadual é uma vantagem que conota para o crescimento da
demanda, haja vista que esses órgãos regulamentam e certificam o elevado padrão de
qualidade sanitária do produto com consequente aumento da confiabilidade do mercado em
consumir esse alimento (SEBRAE/RN, 2001).
No Brasil o número efetivo de ovinos teve um aumento de 3,4% em 2010
comparativamente a 2009 (IBGE, 2010). Dentro deste cenário a ovinocultura destaca-se no
cenário nacional por apresentar grande potencial de crescimento chegando a um rebanho com
mais de 18 milhões de cabeças (BRASIL, 2015).
Diferentemente dos maiores países criadores de ovinos e caprinos, o Brasil possui
condições edafoclimáticas altamente favoráveis nesse segmento, porém, essa atividade no
Nordeste ainda não se enquadrou como cadeia produtiva dentro do enfoque do agronegócio,
criadores dos outros países orgulham-se e lucram com os produtos e subprodutos advindos
dessa atividade (NETO, et al. 2007).
3.2. Brucelose
A brucelose é uma enfermidade infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero
Brucella. Em muitos países, apresenta-se na forma endêmica resultando em prejuízos econômicos significativos aos sistemas de produção e sérias implicações em saúde animal e
pública, visto seu caráter zoonótico (BRASIL, 2006). Pode ser veiculada ao homem pela
ingestão de produtos de origem animal contaminados, principalmente leite e derivados que
não passaram por processamento térmico, e transmitida pelo contato direto ou indireto com
animais infectados, fetos abortados ou anexos fetais, além da própria manipulação de
carcaças e vísceras no abate sanitário. As principais manifestações clínicas são as febres
recorrentes, fraquezas, dores musculares, distúrbios nervosos e sudorese, podendo levar à
incapacidade parcial ou total ao trabalho (PAULIN; FERREIRA NETO, 2008).
De acordo com a Organização Internacional de Epizootias (OIE) a brucelose é
classificada como doença da lista B, onde estão incluídas as enfermidades que têm
importância socioeconômica e/ou para saúde pública e consequências significativas no
comércio internacional de animais e seus produtos (OIE, 2002).
O agente etiológico da brucelose é uma bactéria intracelular facultativa e Gram
negativa, cocobacilos curtos e pequenos que medem 0,6 a 1,5µm por 0,5 a 0,7µm de
dimensão, aeróbia, imóvel, não produz cápsula, flagelos ou esporos, pertencem ao gênero
Brucella da classe Proteobacteria (PROBERT et al., 2004). São microrganismos aeróbios, porém uma atmosfera com tensão de 5 a 10% de CO2 favorece o isolamento de algumas
espécies. Apresentam temperatura de multiplicação na faixa de 20 a 40°C, sendo 37°C a
temperatura ideal, e um pH ótimo de 6.6 a 7.4 (OIE, 2009).
Cada espécie ou biovar de Brucella tem seu hospedeiro preferencial: Brucella abortus (bovinos e bubalinos), B. melitensis (caprinos e ovinos), B. ovis (ovinos), B. canis (cães), B. neotomae (ratos do deserto) (BANAI; CORBEL, 2010; BRASIL, 2006), as quais são subdivididas em sete biovares para Brucella abortus (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 9) três para
B. melitensis (1, 2 e 3) e cinco para B. suis (1, 2, 3, 4 e 5), B. neotomae, B. ovis, B. canis, B. ceti, B. pinnipedialis, B. microti e B. inopinata, onde os membros do gênero possuem potencial zoonótico, embora a patogenicidade seja bastante variável para o ser humano
17 2010).
As bactérias do gênero Brucella podem ser divididas em dois grupos antigenicamente distintos, denominadas lisas, que possuem em sua parede celular externa
lipopolissacarídeo liso (LPS) ou rugosas, que contêm em sua superfície externa o
lipopolissacarídeo rugoso (LPR) e antígenos proteicos (NIELSEN et al.,2004; CARDOSO et
al., 2006; POESTER et al., 2010).
As espécies B. melitensis, B. abortus, B. suis e B. neotomae normalmente apresentam morfologia de colônia lisa e quando sofrem mutações para formas rugosas ou
mucóides, deixam de ser patogênicas. Já as espécies B. canis e B. ovis apresentam morfologia de colônia predominantemente do tipo rugosa (ALTON et al., 1988; PAULIN;
FERREIRA NETO, 2003; MINHARRO, 2009; POESTER et al., 2010).
A capacidade de penetração do agente pela pele íntegra ou lesada e pelas
membranas mucosas, além da formação de aerossóis, predispõe os tratadores, veterinários,
laboratoristas, trabalhadores de matadouros, frigoríficos e entrepostos de leite ao risco de
infecção (LAGE et al., 2008).
A transmissão entre pessoas, apesar de possível, é considerada insignificante sob o
ponto de vista epidemiológico, apesar de relatos de casos de transmissão por meio de
transfusão de sangue, transplante de medula e relação sexual (GODFROID et al., 2005;
MINHARRO, 2009).
3.2.1 Brucella abortus
A Brucella abortus é o agente etiológico da brucelose em bovinos e responsável por uma importante causa econômica de abortos em rebanhos (OSLEN; TATUM, 2010). O
agente também pode acometer outras espécies como búfalos, bisões e alces representando
um risco importante na manutenção do agente na população animal com especial
importância em áreas onde animais selvagens e rebanhos bovinos vivem juntos
(GODFROID, 2002). Equídeos, suínos, ovinos, caprinos e cães também podem ser
infectados pela B. abortus. Geralmente não é transmitida aos suínos, porém quando ocorre se apresenta como infecção transitória, podendo servir de fonte de infecção para bovinos.
Em ovinos e caprinos a infecção ocorre ocasionalmente, sendo os ovinos mais resistentes
que caprinos. Nos ovinos pode causar epididimite e nos caprinos aborto (CARTER, 1991).
Infecções em animais selvagens podem dificultar a erradicação em rebanhos bovinos. Além
Dentre outras brucelas a B. abortus é a de maior prevalência nos casos de brucelose no Brasil, seguido pela B. suis em suínos. Já a Brucella melitensis e B. neotoma ainda não foram isoladas no país (POESTER et al., 2002).
A infecção causada pela B. abortus ocorre pelo contato do agente com qualquer mucosa do animal susceptível, principalmente a mucosa oral (THOEN et al., 1993). Depois
da penetração no organismo, há um curto período de bacteremia, e as bactérias vão se alojar
em vários órgãos, principalmente do sistema linfático (EAGLESOME; GARCIA, 1992;
THOEN et al., 1993).
A permanência e a disseminação da B. abortus no organismo se dá devido a capacidade da mesma sobreviver dentro de macrófagos (GORVEL; MORENO, 2002). O
curso da doença depende do estágio fisiológico do animal. Os animais jovens, antes da
puberdade, parecem ser mais resistentes à infecção. Caso o animal não esteja gestante, a B. abortus geralmente infecta linfonodos e glândula mamária (CRAWFORD et al., 1990). Estando o animal gestante, as bactérias atingem o útero, local pelo qual possuem grande
tropismo, provocando assim o aborto (SAMARTINO; ENRIGHT, 1993).
Geralmente na primeira gestação após a infecção, ocorre o aborto, porém o mesmo
é muito menos frequente na segunda gestação após infecção e raro a partir da terceira
gestação (THOEN et al., 1993; CORBEL et al., 2006). De acordo com Thoen et al., (1993)
isso ocorre devido ao desenvolvimento de uma resposta imune, principalmente celular, pelos
animais, que diminui a área e a intensidade das lesões. Dessa forma a manifestação clínica
passa a ser a presença de natimortos ou o nascimento de bezerros fracos.
Após a infecção, a principal manifestação clínica é o aborto (terço final da
gestação), onde nos rebanhos com infecção crônica, quase sempre acontece nas fêmeas
primíparas e nos animais sadios recentemente introduzidos (BRASIL, 2006).
Nas fêmeas causa placentite necrótica, retenção de placenta, corrimentos vaginais,
endometrites, mastites (PACHECO, 2007). Os machos apresentam aumento de volume
testicular, uni ou bilateral além das ampolas e vesículas seminais. Pode haver atrofia do
órgão afetado devido à reação inflamatória do tipo necrosante, levando a quadros de
subfertilidade, infertilidade ou esterilidade (GORVEL; MORENO, 2002; PAULIN;
FERREIRA NETO, 2003; LAGE et al., 2008).
No aparelho locomotor, podem ser observadas infecções articulares, bursites,
espondilites em vértebras torácicas e lombares, podendo atingir medula óssea e tendões
(GUIDO; GRASSO, 2005). Não há nenhuma lesão patognomônica da brucelose no feto
19
FERREIRA NETO, 2003; BRASIL, 2006). Os inchaços nas articulações dos joelhos e
jarretes, conhecidos como higromas, também apresentam evidência de brucelose
(RADOSTITIS et al., 2007; LAGES et al., 2008).
No começo da década de 1990, o Estado de Minas Gerais iniciou uma campanha de
vacinação obrigatória de bezerras com a vacina B19 em todo o estado. Além de Minas
Gerais, o único estado que possuía um programa de vacinação, apesar de haver diminuído os
índices de cobertura vacinal nos últimos anos, era o Estado do Rio Grande do Sul (PAULIN;
FERREIRA NETO, 2003).
Em 2016, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)
estabeleceu por meio da IN nº 19, 10/10/2016 o Regulamento Técnico do Programa
Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal - PNCEBT e a
Classificação das Unidades da Federação de acordo com o grau de risco para as doenças
brucelose e tuberculose, assim como a definição de procedimentos de defesa sanitária
animal a serem adotados de acordo com a classificação, na forma desta Instrução Normativa
(MAPA, 2016).
Alguns Estados, como o Mato Grosso, apresentaram aumento da prevalência
quando comparado aos dados do último diagnóstico de situação em nível nacional, realizado
em 1975. É relevante a diminuição significativa da prevalência da doença em alguns estados
como Minas Gerais, proporcionada pela campanha de vacinação das fêmeas bovinas e
bubalinas com vacina B19 iniciada em 1993 (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003).
3.2.2 Brucella melitensis
O principal agente etiológico da brucelose em caprinos e ovinos é a Brucella melitensis e também o principal agente responsável pela brucelose humana, conhecida como febre de Malta. Aborto e infertilidade são os sinais clínicos predominantes em pequenos
ruminantes. Embora haja escassez de estudos específicos, ela é reconhecida como fonte de
perdas econômicas em ambas as espécies. A sua incidência é muito alta em países do sul e
leste da União Européia e em vários outros com baixa renda. Isto afeta países que possuem
mais do que 70% de propriedades pecuárias suscetíveis, tornando a brucelose de importância
internacional (FAO, 2006).
A infecção por B. melitensis em pequenos ruminantes tem sido tradicionalmente negligenciada, pois a produção de ovinos e caprinos representa geralmente uma atividade de
desenvolvimento mundial. Devido a esses sistemas de produção serem usualmente nômades,
o controle e erradicação desta infecção são extremamente difíceis. A distribuição da doença
é praticamente mundial e vários países estão sofrendo uma reemergência desta doença em
caprinos e ovinos e consequentemente também em humanos (WHO, 2005). A brucelose em
caprinos e ovinos é considerada uma doença de menor importância no Brasil, pois a B. melitensis ainda não foi diagnosticada no país (SELEEM et al., 2010; POESTER et al., 2002).
Em caprinos a infecção por Brucella melitensis é similar à infecção causada por B. abortus em bovinos (MEGID et al., 2016). Nos pequenos ruminantes, a infecção por B. melitensis causa doença apenas em animais sexualmente maduros e animais jovens podem ser infectados, porém não mostram nenhum sinal clínico, e a resposta sorológica é fraca e
transitória (ALTON, 1990). A B. melitensis (biovar 1, 2 ou 3), principal agente causador brucelose em ovinos e caprinos, infecta caprinos causando uma infecção generalizada que
pode persistir por anos. Nas cabras prenhes a bactéria se multiplica no útero e glândula
mamária (RODOLAKIS, 2014).
O aborto no terço final da gestação é o sinal mais evidente, na infecção por
Brucella melitensis, mas pode haver um surto de abortos, seguido por um período de resistência do rebanho, no qual eles não ocorrem. Em infecções experimentais ocorrem
sintomas caracterizados por febre, depressão, perda de peso e às vezes diarréia. Estes sinais
podem ocorrer também em surtos agudos e naturais e serem acompanhados por mastite,
claudicação, higroma e orquite, placentite e queda na produção de leite em cabras e ovelhas.
Muitas vezes, a infecção por B. melitensis acomete um grupo de animais, sem apresentar sinais evidentes (BLOOD, 1991; OIE, 2004; MEGID et al., 2016).
Apesar da Brucella melitensis ser transmitida congenitamente via útero, cabritos e cordeiros se infectam principamente pelo leite e colostro. A orquite e epididimite em ovinos
e caprinos podem ocorrer, mas não são comuns (MEGID et al., 2016).
Nos países do Sudeste da Europa e do Mediterrâneo a incidência da brucelose
causada pela B. melitensis em caprinos e ovinos é alta, e segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a brucelose é considerada uma das sete doenças negligenciadas e
subnotificadas (DONEV, 2010). A doença é reemergente em locais anteriormente
controlados, como Malta e Omã. Também ocorre no Oriente Médio, Ásia Central, ao redor
do Golfo Pérsico e alguns países da América Central (MEGID et al., 2016).
A incidência global da brucelose em humanos não é bem conhecida devido à
21
geográficas, mesmo dentro de um mesmo país. Assim, devido à deficiência nos Serviços de
Saúde de vários países onde a brucelose é endêmica, não há dados reais no estado global da
doença em humanos. A razão desta alta prevalência ocorre devido a fatores socioculturais,
agravada pela falta de medidas de controle a serem aplicadas em sistemas de produção de
pequenos ruminantes. O contato com animais e exposição ocupacional, assim como os
hábitos alimentares, e falta de medidas de higiene, representam os fatores de risco para a
infecção de humanos por B. melitensis (PAPPAS, 2006).
3.2.3 Brucella ovis
A brucelose ovina é uma doença infecto-contagiosa de distribuição mundial
causada pela Brucella ovis. É um micro-organismo não zoonótico, intracelular facultativo que coloniza células do sistema macrocítico linfocitário, provocando doença crônica em
ovinos, conhecida como Epididimite Contagiosa dos Carneiros ou Epididimite Ovina.
(BURGUESS, 1982; QUISPE et al., 2002).
Apesar de considerada de menor relevância quando comparada às outras bactérias
do mesmo gênero, devido ao fato de não ser zoonótica, a B. ovis tem sua importância relacionada aos prejuízos econômicos que causa principalmente para produtores em que a
criação de ovinos é principal fonte de renda. Entre inúmeros agentes, é a principal causadora
da epididimite contagiosa ovina. Reduz os índices reprodutivos, aumenta anualmente o
número de carneiros não aptos à atividade reprodutiva, gera diminuição da vida reprodutiva
dos machos, abortamentos, mortalidade perinatal e a consequente diminuição nos
rendimentos de carne e lã (ROBLES, 2008).
A bactéria se multiplica nos órgãos afetados e é eliminada à medida que as células
infectadas são destruídas (MEGID et al., 2016). A eliminação de B. ovis ocorre principalmente por meio do sêmen do animal infectado, de forma intermitente e por
períodos prolongados (WORTHINGTON et al., 1985; PAOLICCHI et al., 1991).
Ao final do segundo mês de infecção ocorre a bacteremia e o micro-organismo se
localiza no trato genital, baço, rins, fígado, pulmão e outros gânglios linfáticos e
multiplica-se nesmultiplica-ses órgãos (GIL TURNES, 1998; MEGID et al., 2016).
A cauda do epidídimo é o local em que se observa maior alteração, geralmente
unilateral, inicialmente com edema palpável, seguido de hiperplasia e fibrose, que passa a
apresentar consistência firme à palpação. A inflamação do epidídimo causa degeneração
espermatozóides, causando assim queda na fertilidade. O aumento da cauda desse órgão
caracteriza cronicidade da doença (FOSTER et al., 1989; BLASCO, 1990; WEST et al.,
1993; RIDLER; WEST, 2011; MEGID et al., 2016).
A infecção pode ocorrer em animais que ainda não tiveram contato sexual,
principalmente em períodos de estabulação prolongada, quando estes animais têm contato
com a urina de outros já infectados. Nessas condições, a bactéria penetra no organismo pela
mucosa nasal, oral, conjuntival e pela via percutânea, quando há feridas ou escoriações
(ALTON et al., 1988; BULGIN, 1990). Além disso a B. ovis não impede a concepção e eventualmente verificam-se infertilidade, morte embrionária e abortamentos ou, ainda
nascimento de cordeiros fracos. As fêmeas que abortam têm infecção persistente e o agente
é isolado da placenta, descargas vaginais e leite. Cordeiros nascidos de fêmeas infectadas
raramente desenvolvem a infecção (MEGID et al., 2016).
Nas criações de ovinos em sistema extensivo, o contágio se dá em duas épocas.
Primeiramente na fase de pré-serviço quando os machos começam a ter um aumento da
libido e ter um comportamento homossexual de montar, cheirar e lamber outros machos e
posteriormente com contágio indireto durante o serviço, quando uma fêmea saudável atua de
forma passiva como agente intermediário entre dois machos infectados. Isto não quer dizer que a
fêmea adoeça, pois para que ela desenvolva a enfermidade ela deverá estar prenhe (ROBLES,
2008).
A espécie ovina se infecta de forma natural pela B. ovis, embora já tenha havido confirmação da transmissão da bactéria de carneiros infectados para cervos criados no
mesmo pasto, e entre cervos infectados (RIDLER; WEST, 2011). Os caprinos podem ser
infectados de forma experimental, porém são menos suscetíveis quando comparados aos
ovinos, e a infecção nessa espécie é de caráter leve e de curta duração (BURGESS et al.,
1985).
Ao contrário do que ocorre na brucelose bovina, a manutenção da infecção por B. ovis em um rebanho ocorre principalmente por meio do macho infectado, e este também é o principal responsável pela transmissão da infecção entres os animais. Por esta razão, o
diagnóstico da brucelose ovina causada por B. ovis deve ser realizado fundamentalmente nos machos da propriedade a ser investigada (ROBLES, 2008).
Para que haja o controle da brucelose ovina é necessário o estabelecimento de
medidas que tenham como alicerce a identificação e eliminação de animais infectados,
23
rebanho. Desta forma, é fundamental a existência de métodos diagnósticos eficientes,
rápidos e viáveis em sua execução (COSTA, 2010).
3.3 Diagnóstico
O diagnóstico da brucelose pode ser feito pela identificação do agente por métodos
diretos, ou pela detecção de anticorpos contra B. abortus por métodos indiretos (BRASIL, 2006).
Os métodos indiretos ou sorológicos utilizados no diagnóstico da brucelose são
importantes recursos utilizados nas campanhas de controle e erradicação da doença em
bovinos e bubalinos (OLIVEIRA, 2003). Os mesmos identificam os anticorpos específicos
presentes no soro sanguíneo dos animais infectados, baseando-se em antígenos de superfície
bacteriana, compostos por lipopolissacarídeos (LPS) e proteínas de membrana externa
(ALTON et al., 1988; RAJASHEKARA et al., 2005; MINHARRO, 2009).
O diagnóstico sorológico é a base do combate à brucelose em rebanhos, permitindo
o monitoramento tanto de propriedades como de regiões inteiras, além de monitorar zonas
onde a doença já foi erradicada. Os testes devem ser utilizados respeitando-se as normas
técnicas estabelecidas pelos organismos internacionais, com antígenos padronizados e
específicos para cada prova (ALTON, 1988). Os principais testes para brucelose, são os que
buscam detectar anticorpos no soro e leite como também em muco vaginal e sêmen
(PAULIN, 2003; BRASIL 2006).
O Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose
Animal (PNCEBT) preconiza o Teste do Antígeno Acidificado Tamponado (TAAT) e o
Teste de Anel em Leite (TAL) como provas de triagem e como provas confirmatórias o
Teste do Mercaptoetanol (2-ME) e o Teste de Polarização Fluorescente (BRASIL, 2016).
Como os testes sorológicos não apresentam sensibilidade absoluta, há necessidade de
associação entre várias técnicas em busca de melhores resultados na detecção de animais
positivos, principalmente na fase inicial da infecção e em infecções crônicas. Essa estratégia
tem como base a escolha de um teste de triagem de fácil execução, pouco honeroso e com
boa sensibilidade, seguido de um teste confirmatório apenas nos soros positivos no teste
anterior, mais elaborados, e com melhor especificidade (COSTA, 2001; OLIVEIRA, 2003;
BRASIL, 2006).
Como teste de triagem temos o de soroaglutinação com Antígeno Acidificado
Tamponado (AAT), que é preparado com o antígeno acidificado na concentração de 8%,
rápida, prática e de boa sensibilidade. Foi desenvolvido a partir da observação de que a IgG
é menos ativa em pH7, mudando de comportamento com a acidificação do meio. Como
podem ocorrer alguns poucos casos de reações falso-positivas em decorrência da utilização
da vacina B19 em bovinos, sugere-se a confirmação por meio de testes de maior
especificidade para se evitar o sacrifício de animais não infectados (OMS, 1986; WRIGHT;
NIELSEN, 1990; BRASIL, 2006).
O teste do anel em leite (TAL) foi idealizado para ser aplicado em misturas de leite
de vários animais, uma vez que a baixa concentração celular do antígeno (4%) o torna
bastante sensível. A prova revela anticorpos preferencialmente da classe IgA, presentes no
leite e aderidos às moléculas de gordura pela sua fração Fc. São empregados mais
comumente antígenos corados com hematoxilina, que dá a cor azul característica à reação
positiva. Se existirem anticorpos no leite, eles se combinarão com a B. abortus do antígeno,
formando uma malha de complexo antígeno-anticorpo que, por sua vez, será arrastada pelos
glóbulos de gordura, fazendo com que se forme um anel de cor azulada na camada de
gordura do leite caracterizando reação positiva (OMS, 1986; BRASIL, 2006).
Dentre os testes sorológicos confirmatórios temos o do Mercaptoetanol (2-ME), o
de Soroaglutinação em Tubos (SAT) e a Reação de Fixação de Complemento (RFC).
O teste do Mercaptoetanol é uma prova quantitativa seletiva que detecta somente apresença
de IgG no soro, que é a imunoglobulina indicativa de infecção crônica. Deve ser executada
sempre em paralelo com a prova lenta em tubos (SAT) (BRASIL, 2006). Tem sua
especificidade aumentada por inibição da atividade aglutinante da IgM mediante processo
químico que consiste no tratamento do soro com a droga 2-mercaptoetanol (TYMONEY et
al., 1988). A interpretação dos resultados é dada pela diferença entre os títulos dos soros sem
tratamento (prova lenta), frente ao soro tratado com 2-ME. Desta forma, resultados positivos
em ambas as provas indicam a presençade IgG, que são as aglutininas relacionadas com
infecção, devendo os animais ser considerados infectados (BRASIL, 2006).
Como teste confirmatório temos ainda o Teste de Soroaglutinação em Tubos (SAT)
chamada de prova lenta (leitura dos resultados é feita em 48 horas). É a prova sorológica
mais antiga e ainda hoje bastante empregada. É utilizada em associação como teste do
2-Mercaptoetanol para confirmar resultados positivos em provas de rotina (BRASIL, 2006). É
executada num pH neutro, e demonstra uma boa sensibilidade analítica na detecção dos
isotipos bovinos com uma exceção importante, a IgG1 (WRIGHT E NIELSEN, 1990).
A Reação de Fixação de Complemento (RFC) é considerada a melhor prova para a
25
isolamentos em animais natural ou experimentalmente infectados (NIELSEN, 1995). É o
teste de referência recomendado pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o
trânsito internacional de animais. Na brucelose bovina, apesar da FC detectar tanto IgG1
como IgM, o isotipo IgG1 é muito mais efetivo como fixador do complemento (BRASIL,
2006). Trata-se de uma prova mais laboriosa e mais cara que as de aglutinação, sendo
recomendado seu uso como confirmatória para os soros positivos à triagem (CHAPPEL,
1989).
Os testes imunoenzimáticos que têm apresentado melhores resultados para
brucelose são os ELISA indiretos e competitivos (COLLING, 1998). O teste ELISA Indireto
(I ELISA) possui alta sensibilidade, entretanto, sua especificidade assemelha-se àquela do
AAT. Emprega-se como antígeno o lipopolissacarídeo de B. abortus imobilizado em placas de 96 poços. Como conjugado, utiliza-se um anticorpo monoclonal anti-IgG1 bovina
conjugado com a peroxidase. Agentes quelantes (EDTA/EGTA) são utilizados para
minimizar reações não específicas (BRASIL, 2006). No teste ELISA Competitivo (C Elisa)
utiliza-se também como antígeno imobilizado na fase sólida o lipopolissacarídeo (LPS) de
B. abortus. No momento da prova, o soro a se testar é misturado com um anticorpo monoclonal específico contra a cadeia “O” de B. abortus. Apresenta como vantagens altas especificidade e sensibilidade e apesar de seu alto custo, é recomendado pela Organização
Mundial de Saúde Animal (OIE) como teste confirmatório para o diagnóstico de brucelose
(NIELSEN, 1995; BRASIL, 2006).
O Teste de Polarização de Fluorescência (FPA) se fundamenta na comparação de
velocidades dos movimentos aleatórios das moléculas em solução. O tamanho molecular é o
principal fator que influencia a velocidade de rotação de uma molécula, sendo inversamente
proporcional a ela (BRASIL, 2006). Se o anticorpo estiver presente no soro, irá ligar-se ao
antígeno, e a taxa rotacional desse antígeno conjugado será alterada, e esta mudança poderá
ser determinada pelo analisador de polarização fluorescente, baseado nas diferenças
rotacionais entre a LPS e o complexo antígeno-anticorpo. O FPA é uma prova de simples
execução, onde apenas o antígeno, com um indicador, é adicionado nas amostras diluídas
(SAMARTINO, 1999). Este teste foi validado para o sorodiagnóstico da brucelose em
bovinos, suínos, ovinos, caprinos, bisões e cervídeos, já que a reação cruzada com epítopos
comuns à Brucella abortus, B. melitensis e B. suis encontrados na cadeia O, permite o uso de um só antígeno por serem estas espécies de brucelas lisas (NIELSEN, 2001).
Nos métodos diretos de diagnóstico temos o isolamento e a identificação do agente,
cadeia da polimerase (PCR). O isolamento e a identificação da B. abortus a partir de material de aborto ou de secreções apresentam resultados muito bons quando a colheita
transporte do material é bem feita (BRASIL, 2006).
A aplicação da análise de DNA tem se intensificado bastante nos últimos anos, e o
desenvolvimento do método de reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction
- PCR) tem sido largamente empregado nas áreas biológicas, em especial na medicina
veterinária, pois muitas doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro
(OLIVEIRA, 2003).
Outro método molecular é PCR em tempo real (qPCR), baseada na PCR
tradicional, que, além de amplificar, simultaneamente, ela determina medidas quantitativas
ao longo dos ciclos da PCR, tornando-se uma ferramenta mais rápida, específica e sensível,
dando a capacidade de quantificar o DNA durante as reações (SCHMITTGEN, 2000).
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