Capítulo 3. Materiais e Métodos
Sumário
Neste capítulo descrevem-se os materiais e métodos utilizados durante a dissertação. Inclui-se no capítulo a caracterização da área de estudo, a construção da base de dados para registar a informação sobre a micoflora das uvas, e o processo de análise de dados.
1. Área de estudo... 122
2. Plano de amostragem ... 144
3. Enumeração de fungos filamentosos... 145
4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de Aspergillus... 159
5. Construção duma base de dados para documentação da micoflora das uvas ... 161
6. Determinação da OTA em uvas ... 170
7. Avaliação da influência da composição química do estado de maturação e variedade de uva na produção de OTA ... 175
1. Área de estudo
Das 32 regiões demarcadas Portuguesas, seleccionaram-se 4 para recolher uvas e conduzir o estudo durante 3 anos (2001-2003): 2 no norte do país, Vinhos Verdes e Douro, e 2 no sul: Alentejo e Ribatejo (V. Capítulo 2, Figura 2.4). O critério de selecção baseou-se na diversidade de climas e distribuição geográfica. Em 2003, foram adicionalmente estudadas amostras da região Demarcada do Dão e da Ilha da Madeira, e mais um local na região do Douro.
Nesta secção apresenta-se uma caracterização sucinta das regiões estudadas e do tipo de vinhos nela produzidos. Para informações adicionais podem ser consultados os seguintes sítios da WWW1: IVV, para informações gerais e legislação sobre todas as regiões; Comissão Vitivinícola Regional dos Vinhos Verdes (CVRVV) para informações sobre a região dos Vinhos Verdes; Instituto do Vinho do Porto (IVP), para informações sobre o vinho do Douro e Porto; Comissão Vitivinícola Regional do Alentejo (CVRA), para informações sobre vinhos do Alentejo.
1.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes
A região dos Vinhos Verdes localiza-se no noroeste de Portugal (V. Capítulo 2, figura 2.4), na zona tradicionalmente conhecida como Entre-Douro-e-Minho. Tem como limites a norte o rio Minho (fronteira com a Galiza), a nascente e a sul zonas montanhosas que constituem a separação natural entre o Entre-Douro-e-Minho Atlântico e as zonas do país mais interiores de características mais mediterrânicas, e por último o Oceano Atlântico que constitui o seu limite a poente.
Orograficamente, a região apresenta-se como “um vasto anfiteatro que, da orla
marítima, se eleva gradualmente para o interior” (Amorim Girão, citado no sítio da
1 URLs: IVV: http://www.ivv.min-agricultura.pt/; CVRVV: http://www.cvrvv.pt/; IVP:
CVRVV2), expondo toda a zona à influência do oceano Atlântico, fenómeno reforçado pela orientação dos vales dos principais rios, que correndo de nascente para poente facilitam a penetração dos ventos marítimos. Como tal, a região apresenta temperaturas e amplitudes térmicas moderadas, pluviosidade elevada e insolação baixa.
Durante a vindima, é frequente a ocorrência de chuva, que cria condições frequentes para o aparecimento de podridão, em particular de Botrytis cinerea, que pode conduzir à antecipação das vindimas.
É a maior região demarcada nacional, representando 15% da área vitícola nacional. Os Vinhos Verdes regra geral têm baixo teor alcoólico e são derivados de mostos medianamente ricos em açúcar, mas ricos em ácido, de pH baixo, com suficientes teor de azoto. Nestes vinhos as fermentações são totais. O tempo de fermentação alcoólica de um mosto pode ser prolongado até três a quatro semanas. Os vinhos tintos são encorajados a fazer a fermentação maloláctica, que consiste na transformação do ácido málico em ácido láctico.
A Região Demarcada Vinhos Verdes está dividida em 9 sub-regiões: Amarante, Ave, Baião, Basto, Cávado, Lima, Monção, Paiva e Sousa representadas no mapa geográfico da Figura 3.1.
Quanto à classificação das Zonas Vitícolas Europeias, a região está inserida na zona CIa (Regulamento (CE) nº 1493/1999, de 17 de Maio de 1999).
Figura 3.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes (retirado do sítio da CVRVV. URL: http://www.vinhoverde.pt/pt/vinhoverde/mapaRDVV.htm)
1.2. Região Demarcada do Douro
O Douro é das regiões mais antigas do país. Localiza-se no nordeste de Portugal (V. Capítulo 2, figura 2.4), na bacia hidrográfica do Douro, rodeada de montanhas que lhe dão características climáticas particulares. A região estende-se por área total de cerca de 250 000 ha, estando dividida em três sub-regiões naturalmente distintas, por factores climáticos e sócio – económicos: Baixo Corgo, Cima Corgo e Douro superior (Figura 3.2).
Figura 3.2. Localização das 3 sub-regiões do Douro (retirado do sítio do IVP. URL: http://www.ivp.pt/pt/Regiao/, acedido a 12/02/05)
O clima da região do Douro é muito distinto da região dos Vinhos Verdes. A individualidade do Douro deve-se à sua localização, sendo grande a influência que exercem as serras do Marão e de Montemuro, servindo como barreira à penetração dos ventos húmidos de oeste. Situada em vales profundos, protegidos por montanhas, a região caracteriza-se por ter invernos muito frios e verões muito quentes e secos.
O Douro pertence à Zona Vitícola Europeia CIIIb (Regulamento (CE) nº 1493/1999, de 17 de Maio de 1999). Nesta região produz-se vinho do Douro e o vinho do Porto, que é produzido por paragem da fermentação com adição de aguardente vínica a 77%. O vinho do Porto é um vinho licoroso, e a doçura do vinho advém de açúcares
naturais nas uvas não fermentados, sem qualquer concentração prévia. O tempo de fermentação e maceração é muito curto comparado com os outros vinhos (dois a 3 dias)3.
1.3. Região Alentejo
O Alentejo localiza-se no sul de Portugal (V. capítulo 2, Figura 2.4). É a maior província do país, é limitado a Norte pelo Rio Tejo, a Noroeste pela Estremadura, a Oeste pelo Oceano Atlântico, a Este pela fronteira com Espanha e a Sul pelo Algarve. A hidrografia é constituída fundamentalmente pelas bacias do Guadiana e do Sado. Esta província tem em média 19,9 habitantes por Km2, a mais baixa densidade populacional de Portugal e uma das mais baixas da Europa. A cultura da vinha tem um papel social muito importante, o que se evidencia pelo facto dos concelhos com maior área de vinha serem também aqueles em que a densidade populacional é superior à média da região. A área de vinha no Alentejo ronda os 13.500 ha, o que corresponde apenas a cerca de 5% da área dedicada à cultura em todo o país. Encontra-se nos solos mais pobres da região, sendo uma cultura basicamente estreme, com excepção de algumas vinhas velhas e encontra-se instalada em terrenos com declives suaves (excepto a zona de Portalegre, onde predomina a vinha em encosta), cuja exposição dominante é a Sul. Esta província encontra-se subdividida em quatro unidades, designadas por Alto Alentejo, Alentejo Central, Baixo Alentejo e Alentejo Litoral. Existe no Alentejo uma Denominação de Origem Controlada - DOC Alentejo, com oito sub-regiões vitivinícolas: Borba, Évora, Granja/Amareleja, Moura, Portalegre, Redondo, Reguengos e Vidigueira (Figura 3.3). Em termos vitícolas, o Alentejo Central é a unidade mais importante uma vez que aqui se inserem as zonas vitícolas de Borba, Évora, Redondo, Reguengos e parte de Granja/Amareleja.
3 Para descrição detalhada do processo de vinificação do vinho do Porto, consultar o sítio do IVP. URL:
Figura 3.3. Delimitação geográfica das subregiões vitícolas do Alentejo. (retirado do sítio de clubvintage.com. URL: http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?id=35, acedido a 12/02/05)
As zonas vitivinícolas do Alentejo situam-se na faixa Ibero-Mediterrânea, com características climáticas mediterrânicas aliadas a uma acentuada continentalidade. O clima da região é caracterizado por Primaveras e Verões excessivamente quentes e secos. Os valores relativos à insolação são muito elevados, particularmente no trimestre que antecede as vindimas, contribuindo para a perfeita maturação das uvas e qualidade dos vinhos. São de facto condições marcadamente favoráveis à síntese e acumulação dos açúcares e à concentração de matérias corantes na película dos bagos. A insolação anual é de aproximadamente 3000 horas. Desde há alguns anos que a grande maioria das vinhas alentejanas está sujeita a uma prática de protecção integrada, o que reduz significativamente a utilização de pesticidas, seleccionando os menos tóxicos e racionalizando ainda a sua aplicação. Em virtude das condições climatéricas existentes na vindima, a podridão é rara e as principais doenças causadas por fungos são doenças do lenho, como a esca, escoriose e eutipiose.
Na região produzem-se essencialmente vinhos brancos e tintos. As condições alentejanas são favoráveis para a sobrematuração dos cachos e, como tal, coloca-se muito ênfase na determinação correcta da data da vindima.
1.4. Região Ribatejo
A região do Ribatejo situa-se acima do rio Tejo (V. Capítulo 2, Figura 2.4), a norte de Lisboa. O clima do Ribatejo é sul-mediterrânico temperado, menos quente que o Alentejo, influenciado pelo rio que a percorre. No Ribatejo, há três regiões de características diferenciadas: são designadas por lezíria (“campo” ou “borda-d'água”), bairro e charneca. A lezíria corresponde à planície, inundável pelo rio Tejo. O bairro, na margem direita do Tejo, adjacente à planície aluvial, surge com um relevo pouco acentuado, de formações areníticas, calcárias e argilosas que apresentam tonalidades variadas. A charneca, estende-se da margem esquerda do Tejo até ao Alentejo. É uma área de solos pobres, condicionando-a a um amplo revestimento florestal de sobreiros, eucaliptos e pinheiros. O grau alcoométrico volúmico do vinho produzido nesta região toma valores mais elevados devido ao aquecimento dos bagos pela reflexão do sol nas areias brancas em que a vinha é implantada. Estão definidas 6 sub-Regiões no Ribatejo: Almeirim, Cartaxo, Chamusca, Coruche, Santarém e Tomar (Figura 3.4). Todas as sub-regiões compreendem vinhas na lezíria e/ou bairro, mas apenas as sub-sub-regiões Almeirim, Chamusca e Coruche têm vinhas na charneca.
Figura 3.4. Localização geográfica das sub-regiões do Ribatejo (retirado de clubvintage.com. URL: http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?tipo=2, acedido a 12/02/05)
1.5. Região Dão
A área geográfica correspondente à Denominação de Origem Dão (V. Capítulo 2, figura 2.4) fica enquadrada pelas Serras da Estrela, Buçaco, Caramulo, Nave, Lousã e Açor. As serras dominam a paisagem e formam um verdadeiro anel à volta da Região Demarcada do Dão. A região do Dão possui um clima bastante chuvoso no Inverno. No Verão o tempo é quente e seco. Existem também vários microclimas, dependentes da altitude e da inclinação das zonas. Existem 7 sub-regiões: Alva, Besteiros, Castendo, Serra da Estrela, Silgueiros, Terras de Azurara e Terras de Senhorim. A região tem vocação para a produção de espumantes naturais.
1.6. Região Madeira
A ilha da Madeira possui um clima muito seco, com pouca precipitação, e temperaturas amenas. No entanto, a humidade do ar é elevada. A área geográfica correspondente à Denominação de Origem "Madeira" abrange toda a ilha. Nesta região microclimática, de terrenos saibrosos, de solos vulcânicos e basálticos, a vinha cultiva-se em socalcos, nas encostas soalheiras, principalmente na zona sul da Ilha da Madeira. É aqui que se produz o vinho da Madeira, um vinho licoroso de fabrico semelhante ao vinho do Porto, mas com um processo de envelhecimento muito mais complexo, que envolve o aquecimento do vinho por “estufagem” até aproximadamente 45 a 50 ºC. O Vinho da Madeira aquando das descobertas marítimas portuguesas tomou os nomes de Vinho da Volta, Vinho da Roda da Índia, Vinho da Roda e ainda Vinho da Torna Viagem. O vinho era exportado para outros continentes de barco. Verificou-se ao regresso do barco que o vinho que não foi vendido tinha qualidade superior à de quando foi enviado. Quando passava pelas regiões quentes e com os balanços dos navios, o vinho sofria um envelhecimento prematuro e vantajoso. Desta forma conseguia-se envelhecer um vinho em poucos meses, o que em situações normais levaria muitos anos a envelhecer. O processo de estufagem deriva desta descoberta.
1.7. Locais estudados
Em cada região, seleccionaram-se 1 a 3 quintas para estudo. Em 2003, incluíram-se quintas de 2 regiões adicionais: Madeira e Dão, exclusivamente na vindima. No Douro superior, foi incluído um local extra, com condições climatéricas diversas. No total, foram estudados 12 locais (Tabela 3.1).
Tabela 3.1. Locais donde foram recolhidas amostras de uvas em cada região e sub-região
Região Sub-região Locais estudados
Localidade mais próxima Latitude (GMS)
Longitude (GMS) Alentejo Évora Évora 38° 33' 38" N 7° 54' 30" W
Reguengos Reguengos de Monsaraz 38° 25' 27" N 7° 32' 04" W Dão Silgueiros Viseu 40° 39' 39" N 7° 54' 34" W Douro Baixo Corgo Régua 41° 09' 30" N 7° 47' 02" W Cima Corgo Pinhão 41° 11' 35" N 7° 32' 51" W Douro superior Sra. da Ribeira 41° 09' 30" N 7° 14' 51" W Madeira Câmara de Lobos 32° 38' N 16° 56' W Ribatejo Almeirim Almeirim 39° 12' 34" N 8° 37' 46" W Vinhos Verdes Monção Melgaço 42° 06' 49" N 8° 15' 36" W Lima Arcos de Valdevez 41° 50' 50" N 8° 25' 14" W
1.8. Caracterização climática e bioclimática dos locais de
estudo
No modelo bioclimático de Rivas-Martinez, os principais parâmetros bioclimáticos que condicionam a distribuição das espécies são a temperatura e a precipitação. Os dados climatológicos usados para caracterização climática dos locais foram os das estações meteorológicas mais próximas (Tabela 3.2), com base nas normais climatológicas de 1951-1980 do Instituto de Meteorologia para todos os locais à excepção da Madeira, em que as normais a que tivemos acesso foram as de 1931-1960. As normais climatológicas
correspondem aos dados de 30 anos de estudos climáticos. No sítio do Instituto de Metereologia, foi possível conseguir cartas com a representação gráfica da distribuição geográfica da temperatura e precipitação com base nas normais de 1961-1990.
Tabela 3.2. Estações meteorológicas donde se obtiveram os dados climatológicos para caracterização dos locais onde foram recolhidas uvas
Código Estação Período Localização
Latitude Longitude A Funchal 1931-1960 32º 38´N 16º 55´W B Régua 1951-1980 41º 10´N 7º 48´W C Pinhão/S. Bárbara 1951-1980 41º 10´N 7º 33´W D Viseu 1951-1980 40º 40´N 7º 54´W E Monção/Valinha 1967-1980 42º 04´N 8º 23´W F Braga/Posto agrário 1951-1980 41º 33´N 8º 24´W G Santarém/Escola Agrícola 1951-1980 39º 15´N 8º 42´W H Évora 1951-1980 38º 34´N 7º 54´W I Évora/Mitra 1951-1980 38º 32´N 8º 01´W J Évora/Currais 1951-1980 38º 31´N 7º 47´W
1.9. Regime de temperaturas
As principais características do regime termoclimático da área de estudo estão indicadas na Figura 3.5 e na Tabela 3.3.
Da Figura 3.5 e da Tabela 3.3 observa-se que nos locais estudados as temperaturas no Verão podem ir até próximo dos 40 ºC. O mês mais quente do ano é normalmente Julho e mais raramente Agosto. O mês mais frio no Continente é invariavelmente Janeiro, e na Madeira é Fevereiro. O local mais quente é o Pinhão, seguido de Évora e Régua. Viseu e Braga são relativamente frescos no Verão, com as temperaturas a rondar os 20 ºC. Monção no Verão é mais quente que Braga. Viseu é o local em que as temperaturas são mais frias no Inverno. Em geral, o Inverno é pouco rigoroso, mas ocasionalmente atingem-se temperaturas negativas. O local com menor amplitude térmica é o Funchal, na ilha da Madeira. No território continental, os locais
mais interiores têm maiores amplitudes térmicas que os mais litorais. A amplitude térmica mais elevada foi registada no Pinhão.
E B-C F G D H-J E B-C F G D H-J E B-C F G D H-J
Figura 3.5. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios da temperatura do ar em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas 1961-90: esquerda- temperatura mínima anual; centro- temperatura média anual; direita- temperatura máxima anual. As letras representam a localização aproximada das estações meteorológicas respectivas utilizadas neste estudo
Tabela 3.3. Dados termoclimáticos principais relativos às estações meteorológicas estudadas. T=temperatura média anual; MQ=mês mais quente do ano; Tmax=temperatura média de MQ; Max=temperatura máxima absoluta; MF=mês mais frio do ano; Tmin=temperatura média de MF; M=temperatura média das máximas de MF; m=temperatura média das mínimas de MF; Min=temperatura mínima absoluta; AT=amplitude térmica anual; Min<0=valores médios de n.º de dias/ano com temperaturas negativas; Max>25=valores médios de n.º de dias/ano com temperaturas superiores a 25 ºC
Estação T MQ Tmax Max MF Tmin M m Min AT Min<0 Max> 25 A 18,7 Agosto 22,1 37,4 Fevereiro 15,3 18,5 13,1 4,4 6,7 0 29 B 17,7 Julho 23,0 42 Janeiro 8,1 12,5 3,6 -6,5 14,9 17,9 125,6 C 15,6 Julho 24,4 42,1 Janeiro 7,9 12,5 3,5 -5 16,5 16,1 129,6 D 13 Julho 20,5 38,5 Janeiro 6,6 11,1 2,1 -8,5 13,9 32,8 87,5 E 14,4 Julho 21,4 39 Janeiro 8,6 12,5 4,7 -5 12,8 4,6 82,3 F 14 Julho 20,2 38,9 Janeiro 8,7 12,8 4,5 -4,1 11,5 11,9 81,3 G 16 Agosto 22,8 42,2 Janeiro 9,9 14,4 5,5 -4,5 12,9 5,2 123,0 H 15,6 Agosto 23 40,6 Janeiro 9,3 12,5 6,1 -5 13,7 1,8 105,8 I 15,4 Agosto 23,1 41,6 Janeiro 8,6 13,4 3,8 -7,1 14,5 11,0 118,7 J 15,6 Julho 23,4 42,3 Janeiro 8,8 13,6 4 -5,6 14,6 13,4 135,0
1.10.
Regime de precipitações
As principais características do regime termoclimático da área de estudo estão indicadas na Figura 3.6 e na Tabela 3.4.
Os únicos locais com precipitações elevadas são Viseu, Braga e Monção. Estes locais estão incluídos na região do Dão e Vinhos Verdes, que são muito chuvosas. Dos locais estudados, o mais seco é o Funchal, na Ilha da Madeira. Os meses mais secos no Verão são Julho e Agosto.
E B-C F G D H-J E B-C F G D H-J E B-C F G D H-J
Figura 3.6. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios anuais da precipitação em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas 1961-90: esquerda- quantidade de precipitação anual (mm); centro- nº de dias com precipitação superior a 1 mm; direita- nº de dias com precipitação superior a 10 mm. As letras representam a localização aproximada das estações metereológicas respectivas utilizadas neste estudo
Tabela 3.4. Dados ombroclimáticos principais relativos às estações climatológicas analisadas. P=precipitação total anual; MCh=mês mais chuvoso do ano; Pmax=precipitação total de MCh; MS=mês mais seco do ano; Pmin=precipitação total de MS; Max=precipitação diária máxima; P0,1=número de dias/ano com precipitação (P>0,1mm); P10=número de dias/ano com precipitação abundante (P>10mm).
Estação P Mch Pmax MS Pmin Max P0,1 P10 A 513,7 Novembro 81,0 Julho 1,4 107,0 65 16 B 950 Fevereiro 136,3 Julho 11,4 83,8 110,7 33,2 C 671,7 Fevereiro 91,7 Agosto 10,8 63,7 95,2 23,9 D 1229,3 Fevereiro 176,7 Julho 13,9 112,0 116,0 44,1 E 1235,4 Janeiro 209,8 Agosto 17,9 76,7 137,7 43,9 F 1514,8 Janeiro 217,1 Julho 20,9 114,0 130,4 52,3 G 736,9 Janeiro 109,4 Julho 3,6 104,5 97,6 25,2 H 642,6 Janeiro 94,4 Agosto 3,0 86,4 100,6 21,6 I 664,6 Janeiro 97,7 Julho/Agosto 3,1 93,3 85,1 23,0 J 567,4 Janeiro 80,7 Agosto 2,4 49,0 97,4 18,7
1.11.
Insolação
O número de horas de luz (tempo de sol descoberto) é importante para a cultura da vinha e maturação das uvas. Os valores de insolação estão indicados na Tabela 3.5.
Da Tabela 3.5 observa-se que os locais Santarém e Évora no sul de Portugal são as que registam níveis de insolação mais elevados.
Tabela 3.5. Dados relativos à insolação das estações climatológicas analisadas. It=insolação total anual; MImax=mês com maior insolação do ano; I%=percentagem registada de insolação face a insolação máxima possível calculada com base em tábuas astronómicas; - dados não obtidos
Estação It MImax I% A 2431,5 Agosto 61 B 2294,6 Julho 74 C 2332,6 Julho 70 D 2532,6 Julho 74 E - - - F - - - G 2701,6 Julho 81 H 2869,5 Julho 85 I - - - J - - -
1.12.
Temperatura e precipitação em Setembro
Setembro é regra geral o mês das vindimas, momento em que as uvas estão maduras, e mais susceptíveis ao ataque de fungos. Por isso, interessa conhecer as condições climáticas nesta altura do ano. A temperatura e precipitação registadas no mês de Setembro nas estações climatológicas consideradas estão indicadas na Tabela 3.6.
As temperaturas registadas no mês de Setembro são relativamente elevadas, rondando os 20 ºC. Os valores de precipitação mais elevados foram observados em Braga, na região dos Vinhos Verdes. Estas condições favorecem a podridão por fungos, em particular por B. cinerea. No Funchal e em Évora, registaram-se os níveis de precipitação mais baixos.
Tabela 3.6. Temperaturas médias (T), média das temperaturas máximas (Max) e mínimas (Min), e precipitação total (P) do mês de Setembro registadas nas estações climatológicas consideradas
Estação T Max Min P
A 22,0 24,7 19,4 24,0 B 20,6 28,3 12,8 40,9 C 21,4 28,9 13,9 36,2 D 18,0 25,1 10,8 56,8 E 19,2 25,4 13,1 55,4 F 18,4 24,9 11,8 77,7 G 21,2 28,3 14,1 33,4 H 21,1 26,9 15,3 25,0 I 20,9 28,2 13,6 27,7 J 21,2 29,0 13,4 19,3
1.13.
Caracterização bioclimática dos locais estudados
A caracterização bioclimática foi feita de acordo com os índices e critérios de Rivas-Martinez seleccionados por Honrado (2003), indicados no anexo I. Na Tabela 3.7 encontra-se descrita a diagnose climática dos locais das estações meteorológicas.
Da diagnose bioclimática resultante temos que as estações metereológicas pertencem todos ao mesmo bioclima, Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico, com a excepção de Braga, que é de macrobioclima temperado na sua variante Submediterrânica. Existe uma diversidade considerável de climas onde se localizam as estações metereológicas, quanto às amplitudes térmicas, temperatura e precipitação. Regra geral, as estações localizadas mais no interior do país têm uma continentalidade mais acentuada. A maior parte dos locais pertence ao termotipo Mesomediterrânico inferior, mas o Funchal e Santarém registaram valores de temperatura totais mais elevados, pertencendo ao termótipo Termomediterrânico. Os locais mais húmidos são Viseu, Monção e Braga. No Douro, o Pinhão é mais seco que a Régua, e no Sul, Santarém mais húmido que Évora.
Tabela 3.7. Diagnose bioclimática dos locais das estações meteorológicas
Estação Bioclima Continentalidade Termotipo Ombrótipo A Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Eu-hiperoceânico Termomediterrânico inferior Seco inferior B Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Euoceânico Mesomediterrânico inferior Sub-húmido inferior C Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Euoceânico Mesomediterrânico inferior Seco superior D Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Euoceânico Mesomediterrânico superior Húmido inferior E Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Semi-hiperoceânico Mesomediterrânico inferior Húmido inferior F Submediterrâneo Oceânico Semi-hiperoceânico Mesomediterrânico
inferior Húmido superior G Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Semi-hiperoceânico Termomediterrânico superior Sub-húmido inferior H Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Euoceânico Mesomediterrânico inferior Seco superior I Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Euoceânico Mesomediterrânico inferior Seco superior J Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico Euoceânico Mesomediterrânico inferior Seco superior
1.14.
Castas
Para este estudo, foram seleccionadas castas brancas e tintas recomendadas para as regiões. Ao todo, foram analisadas 13 castas nacionais, 10 tintas e 3 brancas (Tabela 3.8). As únicas castas brancas analisadas foram Alvarinho e Loureiro na região dos Vinhos Verdes e Boal na Ilha da Madeira. Para fins comparativos, incluiu-se no estudo
Cabernet Sauvignon, uma casta autorizada em muitas regiões portuguesas, neste caso
proveniente do Ribatejo e Dão. A designação das castas foi a recomendada pelo livro da sinonímia das castas do IVV.
1.15.
Vinhas amostradas
No total, foram estudadas 17 vinhas. A localização e casta estão indicadas na Tabela 3.8.
Tabela 3.8. Vinhas e castas estudadas entre 2001 e 2003
Código da vinha Região Local Código da Quinta Casta 1 Vinhos Verdes Melgaço V1 Alvarinho 2 Vinhos Verdes Arcos de Valdevez V2 Loureiro 3 Vinhos Verdes Arcos de Valdevez V2 Vinhão
4 Douro Régua Do1 Tinta Barroca
5 Douro Pinhão Do2 Touriga Franca
6 Douro Sra. da Ribeira Do3 Tinta Barroca
7 Ribatejo Almeirim R1 Periquita
8 Ribatejo Almeirim R2 Tinta Miúda
9 Ribatejo Almeirim R2 Cabernet Sauvignon
10 Alentejo Reguengos A1 Aragonês
11 Alentejo Évora A2 Periquita
12 Douro Cedovim Do4 Mistura
13 Dão Viseu Da1 Cabernet Sauvignon
14 Dão Viseu Da2 Touriga Nacional
15 Alentejo Évora A1 Trincadeira
16 Madeira Câmara de Lobos M1 Boal
17 Madeira Câmara de Lobos M1 Tinta Negra Mole
1.16.
Caracterização climática dos anos de estudo
A caracterização geral anual será feita de acordo com as indicações fornecidas pelo Instituto de Metereologia4, nos períodos entre Setembro a Agosto do ano seguinte.
4 URL do sítio: http://www.meteo.pt; URL da página consultada:
Fornecem-se adicionalmente as informações específicas para o mês de Setembro de cada ano.
1.16.1. Setembro de 2000 a Agosto de 2001
A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) foi superior aos valores das normais 1961-90 em todo o território continental, com excepção da região de Faro onde foi um pouco inferior ao valor normal. Os meses que mais contribuíram para a quantidade de precipitação anual foram Dezembro, Janeiro e Março. Registaram-se valores da temperatura do ar superiores aos valores das normais climatológicas em todo o território continental, excepto na região de Vila Real, onde a temperatura máxima foi ligeiramente inferior.
1.16.2. Setembro de 2001 a Agosto de 2002
Em Portugal Continental o mês de Setembro caracterizou-se por temperaturas médias superiores aos valores médios em todas as regiões estudadas. A quantidade de precipitação esteve acima dos valores normais na região de Lisboa e nas regiões a sul do rio Tejo, com excepção das regiões de Alvalade e Portalegre. Nas restantes regiões do território a quantidade de precipitação foi igual ou inferior aos valores médios.
A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) esteve abaixo dos valores médios das normais 1961-90. No ano anterior (2000/01) verificou-se a situação contrária.
Registaram-se valores da temperatura média do ar ligeiramente inferiores aos valores das normais climatológicas no interior da região norte e superiores no restante território, com os maiores desvios positivos na região de Portalegre.
1.16.3. Setembro de 2002 a Setembro de 2003
Em Portugal Continental o mês de Setembro caracterizou-se por temperaturas máximas e médias muito inferiores aos valores médios em quase todo o território. Os valores da quantidade de precipitação foram muito superiores aos valores médios. Excederam-se, nalguns locais, os totais mensais e os máximos diários de precipitação até agora registados em Setembro. A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) esteve acima dos valores médios das normais 1961-90 em todo o território, com excepção das regiões de Elvas e Beja, onde esteve acima do valor das normais climatológicas. Registaram-se valores da temperatura média do ar superiores aos valores das normais climatológicas em todo o território. Registaram-se também, no mês de Agosto, alguns máximos absolutos da temperatura máxima diária.
O mês de Setembro de 2003 caracterizou-se por temperaturas superiores aos valores médios em todo o território.
Os valores da quantidade de precipitação foram inferiores aos valores médios em todas as regiões continentais estudadas.
1.17.
Estados de maturação estudados
Durante o período de maturação do bago, entre Junho e Outubro, foram colhidas amostras em 3 estados de maturação: bago ervilha, pintor e vindima. Os estados de maturação foram-nos indicados pelos viticultores.
1.18.
Total de amostras de uvas analisadas
Na Tabela 3.9 estão indicadas as datas de colheita de todas as amostras usadas para este estudo.
Tabela 3.9. Data de colheita de amostras de uvas em todos os estados de maturação e vinhas
Vinha Bago ervilha Pintor Vindima
2001 2002 2003 2001 2002 2003 2001 2002 2003 1 27-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 18-09 12-09 12-09 2 25-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 14-09 - 12-09 3 25-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 27-09 18-09 24-09 4 13-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 17-09 16-09 07-09 5 06-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 26-09 24-09 27-09 6 06-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 17-09 11-09 07-09 7 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 21-09 13-09 10-09 8 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 13-09 13-09 10-09 9 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 13-09 13-09 10-09 10 29-06 - - 01-08 06-08 31-07 28-09 13-09 - 11 29-06 - - 01-08 06-08 31-07 28-09 13-09 20-08 12 - - - 06-10 13 - - - 07-10 14 - - - 07-10 15 - - - 20-08 16 - - - 08-09 17 - - - 08-09
Salientam-se as seguintes observações quanto à data de recolha das amostras: • o estado de bago ervilha atingiu-se mais cedo no ano de 2001 comparativamente
aos outros anos. Em 2002 e 2003 não foi possível obter amostras do Alentejo, situação que se solucionou na recolha de amostras subsequentes;
• O pintor atingiu-se muito tardiamente em 2002 na região dos Vinhos Verdes, quase com 1 mês de diferença face aos outros anos no mesmo local;
• A vindima da vinha 5 no Douro faz-se aproximadamente 10 dias mais tarde que as vinhas 4 e 6;
• A casta Vinhão matura mais tardiamente que o Loureiro, e é colhida duas semanas mais tarde. Em 2002, não foi possível obter amostra de Loureiro devido a chuvas súbitas que aumentaram o risco de podridão, e as vindimas foram antecipadas sem aviso;
• A data da vindima no Alentejo variou consideravelmente, sendo a vindima mais tardia feita no ano de 2001.
Na Tabela 3.10 está indicado o número de amostras totais em cada ano, região e estado de maturação.
Tabela 3.10. Número de amostras analisadas em cada ano, região e estado de maturação
Região Amostras recolhidas
Bago ervilha Pintor Vindima
To tal 01 02 03 To tal 01 02 03 To tal 01 02 03 To tal Alentejo 2 0 0 2 2 2 2 6 2 2 2 6 14 Douro 3 3 3 9 3 3 3 9 3 3 4 10 28 Ribatejo 3 3 3 9 3 3 3 9 3 3 3 9 27 V.Verdes 3 3 3 9 3 3 3 9 3 2 3 8 26 Dão 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 Madeira 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 Total 11 9 9 29 11 11 11 33 11 10 16 37 99
1.19.
Análise de mostos
Em 2001, foram recolhidas amostras de mostos de uva destinados ao fabrico de vinho em 3 fases distintas: i) antes da adição comercial de sulfuroso; ii) após adição comercial de sulfuroso; iii) após início de fermentação. As amostras foram cedidas por adegas nas regiões de: Vinhos Verdes, na sub-região de Monção e de Arcos de Valdevez; Douro, no Cima Corgo; Ribatejo, em Almeirim. As amostras foram retiradas de preferência imediatamente antes do transporte. Quando não foi possível, as amostras foram refrigeradas até transporte e transportadas para o laboratório nas mesmas condições que as uvas.
Tabela 3.11. Amostras de mosto analisadas em 2001
Sub-região Mosto
Antes SO2 Depois SO2 Depois fermentação Arcos de Valdevez - 1 tinto
1 branco
1 tinto 1 branco
Almeirim 1 tinto 1 tinto -
Cima Corgo 1 tinto 1 tinto -
Monção 1 branco 1 branco -
2. Plano de amostragem
As amostras são constituídas por 10 cachos de uva colhidos ao longo de dois transeptos diagonais previamente traçados na vinha, consoante indicado na Figura 3.7.
Figura 3.7. Esquema do plano de recolha de 10 cachos na vinha ao longo de 2 transectos diagonais
A escolha dos locais de amostragem na vinha foi definida à priori. A escolha do cacho na planta não obedeceu a nenhum critério particular de localização. Foram colhidos cachos para análise sem podridão aparente, representativos dos estados
observados na vinha. Quando foram detectados cachos com podridão, estes foram colhidos e analisados à parte.
2.1. Colheita dos cachos
Sempre que possível os cachos foram colhidos com tesouras de poda usadas nas vinhas, tocando o mínimo possível nos cachos. O cacho, ainda preso à vinha, era colocado num envelope de papel A4 de fole com abertura lateral aberto pela primeira vez no momento da colheita e com a tesoura de poda cortou-se o engaço. O envelope foi imediatamente fechado após o acto de colheita.
2.2. Transporte para o laboratório
Os envelopes fechados foram colocados numa arca refrigeradora com termoacumuladores e transportados de carro até ao laboratório. O tempo que decorreu entre a colheita dos cachos e a chegada ao laboratório foi entre 1 a 6 horas. As amostras colhidas na ilha da Madeira foram colocadas em caixas rígidas e transportadas de avião, num intervalo de 3 a 4 horas entre a colheita e a chegada ao laboratório.
3. Enumeração de fungos filamentosos
Para detecção de fungos nas uvas, usaram-se métodos de plaqueamento. Usaram-se placas de Petri de plástico, triplamente ventiladas para permitir aerificação, de 94 mm de diâmetro e 16 mm de altura, estéreis, da Greiner (referência 633180). Usaram-se dois procedimentos: plaqueamento directo das uvas sem desinfecção superficial e com desinfecção superficial, que se descrevem de seguida:
Plaqueamento directo sem desinfecção superficial. De cada cacho, foram seleccionados aleatoriamente 5 bagos, cortaram-se ao meio e colocaram-se assepticamente em placas de Petri com meio de cultura (Figura 3.8). O processo decorreu à chama, com bisturi e pinça flamejados.
Plaqueamento directo com esterilização superficial. De cada cacho, foram seleccionadas aleatoriamente 5 bagos, colocados num matraz de 250 ml. Adicionou-se uma solução de lixívia comercial com 4% de cloro diluída 10 vezes até perfazer 250 ml, mexendo com uma pinça durante alguns segundos. Cobriu-se com um vidro de relógio e deixou-se estar durante 2 minutos, agitando algumas vezes. No fim deste tempo, decantou-se a solução e plaquearam-se as uvas imediatamente, conforme recomendado por Pitt e Hocking (1997).
Meio de cultura. O meio de cultura para isolamento usado foi DRBC, Dichloran Rose
Bengal Chloramphenicol agar (Oxoid CM727). O DRBC é um meio de cultura adequado
à análise de fungos filamentosos em alimentos frescos com elevada actividade de água como frutos (Pitt & Hocking, ob. cit.). Este meio contém rosa de bengal e diclorano, que restringem o crescimento dos fungos sem afectar a germinação. A combinação destes inibidores restringe o crescimento de espécies fúngicas de crescimento galopante, como
Rhizopus e Mucor, que tem um crescimento muito rápido reduzindo o tempo de vida da
placa de isolamento. No entanto, com a presença de uvas no meio de cultura, nem sempre foi possível controlar o crescimento destes fungos (Figura 3.9). A presença de cloranfenicol previne o crescimento de bactérias. Este meio é fototóxico (Chilvers et al., 1999) e foram tomadas precauções no sentido de minimizar a sua exposição à luz.
Condições de incubação. As placas foram incubadas no escuro numa estufa a 25 ºC, aproximadamente 7 dias, voltadas para cima, não seladas.
Detecção e registo de fungos filamentosos observados. A partir do 2º dia de incubação, as placas foram monitorizadas diariamente ou de dois em dois dias ao estereomicroscópio para a presença de fungos filamentosos. Sempre que possível, a identificação até ao
género era feita ao estereomicroscópio, com base na presença de estruturas de reprodução especializadas, e o género presente registado na placa, conforme indicado na Figura 3.8.
Figura 3.8. Placa de isolamento com 5 dias de incubação onde se observam fungos do género Penicillium a crescer em uvas
Figura 3.9. Placa de isolamento ao fim de 5 dias de incubação invadida por Rhizopus sp.
Sempre que se detectou micélio estéril, as placas foram colocadas debaixo de luz negra para induzir a esporulação, numa dispositivo desenhado para o efeito. A presença de micélio estéril não foi registada, visto que nenhuma informação pode ser inferida acerca da presença destes fungos. A informação dos géneros detectados em cada bago é
possível através duma referência na tampa da placa e base da placa, que se faz coincidir. Desta forma, no final do tempo de incubação, o número de partículas em que foi detectada a presença de cada espécie é registado. No caso de placas contaminadas com fungos de crescimento rápido como Mucorales, quando não foi possível avaliar o número de bagos colonizados, considerou-se por defeito 1 bago colonizado com a espécie invasiva.
3.1. Isolamento de fungos das uvas
Exemplares representativos de cada género, géneros não identificados, e todos os exemplares de Aspergillus e Penicillium foram isolados com agulha, à chama. Nalguns casos o processo realizou-se ao estereomicroscópio. O inóculo foi transferido com uma agulha esterilizada à chama duma área jovem da colónia para meios de malte (MEA), aveia (OA), agar de Czapek (CZ), agar de Czapek com extracto de levedura (CYA) ou água da torneira (TWA) com papel de filtro, conforme o grupo taxinómico, como indicado na Tabela 3.12. A pureza da colónia obtida foi verificada por inspecção visual cuidada ao estereomicroscópio.
Tabela 3.12. Meios de cultura em que foram isolados os fungos dos diferentes grupos taxonómicos detectados
Grupo taxonómico Meio de cultura
Ascomycetes (Neurospora, Chaetomium) OA, TWA com papel de filtro
Aspergillus CZ, CYA
Coelomycetes OA Dematiáceos OA
Eurotium CYA20S, M40Y
Fusarium TWA com papel de filtro
Penicillium MEA
3.2. Meios de cultura usados no isolamento de estirpes
A formulação dos meios de cultura MEA, CZ, CYA, CYA20S será apresentada na secção 3.5 do presente capítulo. A formulação dos meios OA e TWA com papel de filtro encontra-se descrita no livro de Santos et al. (1998). A formulação de M40Y é indicada no catálogo da colecção de culturas alemã DSMZ na lista de meios de cultura (M40Y: meio nº 187) que pode ser acedido electronicamente5. Esterilizaram-se os meios de
cultura a 121 ºC, 15 minutos na autoclave. • OA:meio de agar com aveia
30 g de flocos de aveia 15 g de agar Nº3 (Oxoid L13) Água destilada
Cozer os flocos de aveia em lume brando durante cerca de 2 horas. Filtrar por um pano de algodão fino. Medir e completar o volume com água até perfazer um litro. Acrescentar o agar e esterilizar.
• M40Y: meio para fungos osmofílicos
400 g de sacarose (extra pura, Merck) 20 g de extracto de malte (Oxoid, L39) 5 g de extracto de levedura (Difco 212750) 20 g de agar Nº3 (Oxoid L13)
1l de água destilada
• TWA com papel de filtro: meio de agar com água da torneira com papel de filtro
15 g de agar Nº 3 (Oxoid L13) papel de filtro
1l de água da torneira
Autoclavar a água com o agar. À parte, cortar e esterilizar rectângulos de papel de filtro. Após o meio vertido nas placas solidificar, adicionar um rectângulo de papel de filtro.
3.3. Conservação das estirpes isoladas
Estirpes representativas dos géneros encontrados, das espécies de Penicillium identificadas e todas as estirpes de Aspergillus isoladas foram conservadas, para construção duma colecção de fungos isolados de uvas portuguesas para documentação e futuros estudos. A conservação de estirpes dos grupos encontrados não apresenta dificuldades de maior visto que produzem abundantemente esporos. Inicialmente, as estirpes isoladas foram conservadas em gel de sílica ou em tubo com meio de cultura a 4 ºC, conforme descrito por Santos (2004). Mas rapidamente se verificou que para o número de estirpes isoladas, estes métodos eram muito dispendiosos em termos de espaço. Como tal, adoptou-se por conservar as estirpes a – 80 º C.
3.3.1. Conservação a –80 ºC
Material:
Glicerol (p.a., aproximadamente 87%, Merck) Frascos universais de vidro de 30 ml
Pipetas Pasteur de vidro estéreis Criovials de 2 ml (Nalgene) Canetas de frio
Missangas
Cryo Freezing Container (Nalgene) 2- propanol (p.a., Merck)
Criovials com missangas. As missangas foram adquiridas em casas comerciais. Lavaram-se abundantemente com água corrente e deixaram-se numa solução de ácido clorídrico a 2% durante a noite. No dia seguinte, foram novamente lavadas com água corrente, mergulhadas em água destilada, e de seguida foram secas numa estufa. Depois de completamente secas, foram autoclavadas em frascos de vidro
transparente a 121 ºC, 15 minutos. Os crivials foram enchidos até ¼ da sua capacidade com as missangas numa câmara de fluxo laminar, e fechados.
Frascos com glicerol. Autoclavaram-se alíquotas de 10 ml duma solução de glicerol 10% em frascos de vidro de 30 ml.
Procedimento:
Duma cultura pura em placa, de aspecto saudável e bem esporulada, faz-se uma suspensão de esporos em glicerol a 10% previamente esterilizado a 121 ºC, 15 minutos, da seguinte forma: com uma pipeta Pasteur estéril, coloca-se aproximadamente 1 ml da solução de glicerol numa área da colónia. A solução fica em forma de gota, devido à hidrofobicidade dos esporos, e com a pipeta Pasteur, soltam-se os esporos dessa área raspando a ponta da pipeta na colónia, e aspira-se de seguida a suspensão. Coloca-se a suspensão em criovials de 2 ml contendo missangas previamente lavadas e esterilizadas até ¼ do frasco, a cobrir as missangas. Colocam-se os frascos no Cryo Freezing Container, um recipiente com 2-propanol que permite o arrefecimento dos criovials a uma taxa controlada de 1 grau por minuto na arca a -80 ºC. Para obter a estirpe no estado activo, retira-se os criovials da arca, mantêm-se no recipiente gelado até manuseamento, aquece-se a porção superior das missangas com o calor das mãos e, com ajuda duma agulha esterilizada, retira-se uma missanga para uma placa com meio de cultura voltando a congelar o frasco. Desta forma, um criovial permite vários rejuvescenimentos (Figura 3.10). A técnica mostrou-se eficaz, visto que todas as estirpes rejuvenescidas estavam viáveis. Por cada estirpe, foram guardados dois criovials, para fazerem parte do banco de células de trabalho (BT) e banco de células de colecção (BC). No caso de culturas que não esporulam abundantemente, cortou-se o meio de cultura com fungo crescido e colocam-se porções no criovial com a solução. Neste caso, um criovial serve para um rejuvescenimento, e foram guardados 6 criovials, 3 em cada banco.
Figura 3.10. Cultura de Aspergillus rejuvenescida a partir da missanga (centro da colónia) dum criovial a -80 ºC
3.3.2. Conservação em gel de sílica (Santos, 2004)
Material:
Frascos universais de 30 ml Silica gel
Leite desnatado em pó (Oxoid, L31) Pipetas Pasteur de vidro
Procedimento:
Prepara-se uma solução de leite desnatado a 5% e autoclava-se a 121 ºC durante 5 minutos. Enchem-se os frascos com silica gel até ¼ e esterilizam-se por calor seco a 180 ºC, durante 3 horas. No dia antes da conservação, colocam-se os frascos no congelador a -20 ºC. As culturas e leite desnatado colocam-se no frigorífico a 4 ºC.
A partir dum tubo com uma cultura esporulada, prepara-se uma suspensão de esporos e adiciona-se a um frasco arrefecido com sílica seco e esterilizado. Deixa-se secar na estufa com tampa ligeiramente desarrolhada a 25 ºC, durante 10 a 15 dias. Quando bem seco, fecha-se e guarda-se num ambiente seco com indicador de humidade.
3.3.3. Conservação a 4 ºC (Santos, 2004)
Material:
Tubos de 12 ml (Greiner, 164161) Meio de cultura
Procedimento
Crescem-se culturas em tubo e após esporuladas, colocaram-se a 4 ºC.
3.4. Segurança e higiene no laboratório de micologia
As recomendações sobre regras de higiene e cuidados a ter no laboratório de micologia de Santos et al. (1998) foram seguidas. Especial atenção foi tomada aos ácaros,
pequenos aracnídeos que podem estar presentes em materiais vegetais. Após plaqueamento das uvas, todas as placas são inspeccionadas ao estereomicroscópio, e o restante material vegetal processado ou descartado, e as bancadas do laboratório cuidadosamente limpas com álcool a 70% e pulverizadas com lixívia comercial diluída 10 vezes. Se ao fim de 2 dias for detectada a presença de ácaros em alguma placa, esta e as placas vizinhas ficam de quarentena, numa tina com água, para prevenir a contaminação de outras placas, até ao fim do tempo de incubação.
No final do tempo de incubação, as placas de isolamento e culturas foram autoclavadas a 121 ºC, 20 minutos.
3.5. Identificação e caracterização dos fungos
A identificação dos fungos baseou-se na microscopia óptica das estruturas reprodutoras especializadas, sexuais e assexuais, e na morfologia da colónia. No entanto, para a caracterização de estirpes de Aspergillus secção Nigri, usou-se SEM. Na caracterização de algumas estirpes de Penicillium, usou-se o perfil de metabolitos secundários em TLC.
3.5.1. Observação da morfologia das culturas
As culturas foram observadas ao estereomicroscópio (Leica MZ125, com sistema
de iluminação Leica CLS 150X). Para registar as cores da colónia, usou-se o código de cores do livro de cor Methuen (Kornerup & Wanscher, 1978).
3.5.2. Condições de cultivo para identificação até ao género
Os fungos foram identificados até ao género tipicamente ao fim de 7 dias, ou até que surjam estruturas reprodutoras. As placas foram incubadas na estufa a 25 ºC no
escuro, voltadas para cima, não seladas. Em alguns casos, para induzir a esporulação, as placas foram colocadas debaixo de luz negra, em ciclos de 12 horas.
3.5.3. Condições de cultivo para a identificação de Aspergillus e
Penicillium até à espécie
A identificação de Aspergillus até à espécie foi conduzida em CZ, ao fim de pelo menos 10 dias. Os teleomorfos de Aspergillus foram identificados em CY20S, ao fim de 15 dias. A identificação de Penicillium foi conduzida em CZ e MEA, ao fim de 7 a 9 dias. A formulação de MEA, CYA e CYA20S pode ser encontrada no manual de identificação de Aspergillus de Klich e Pitt (1988). Autoclavou-se os meios de cultura a 121 ºC, 15 minutos.
• MEA: meio de agar com extracto de malte
20 g de extracto de malte (Oxoid L39) 1 g de peptona (Oxoid )
22 g de glucose monohidratada (para fins bioquímicos, Merck) 20 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)
1 l de água destilada
• CYA: agar de Czapek com extracto de levedura
30 g de sacarose (extra pura, Merck) 5 g de extracto de levedura (Difco 212750) 1 g de K2HPO4
10 ml de concentrado de Czapek 15 g de agar Nº 3 (Oxoid L13) 1 l de água destilada
Concentrado de Czapek (com metais vestigiais)
5 g de KCl (p.a., Merck)
5 g de MgSO4.7H2O (grau para biologia molecular, Calbiochem)
0,1 g de FeSO4.7H2O (p.a., Merck)
0,1 g de ZnSO4.7H2O (extra puro, Merck)
0,05 g de CuSO4.5H2O
100 ml de água destilada
• CYA20S: agar de Czapek com extracto de levedura e sacarose a 20%
1 g de K2HPO4
10 ml de concentrado de Czapek
5 g de extracto de levedura (Difco 212750) 200 g de sacarose (extra pura, Merck) 14 g de agar Nº 3 (Oxoid L13) 1 l de água destilada
3.5.4. Preparação das estruturas para observação ao microscópio óptico
Após observar as culturas ao estereomicroscópio e verificar a sua pureza, as estruturas reprodutoras foram localizadas e com uma agulha esterilizada à chama, retirou-se material duma área em esporulação activa. O líquido de montagem mais frequentemente usado nas preparações microscópicas foi o azul de algodão, mas ocasionalmente foram usados a lactofucsina e o azul de lactofenol. Ao fazer preparações microscópicas de culturas muito esporuladas (v.g., Aspergillus e Penicillium), lavou-se previamente o material a observar com álcool a 96%, para remoção dos esporos. Quando foi necessário observar ao microscópio as estruturas reprodutoras imobilizadas, usou-se a técnica da fita-cola, que consiste em pressionar a superfície adesiva de fita-cola contra a colónia, colocá-la numa lâmina voltada para cima, aplicar uma gota de solução corante e cobrir com uma lamela.
O microscópio usado foi um Leica DMR, que permite observação tanto de campo claro como de contraste diferencial de interferência (também conhecido como microscópio de Nomarski).
3.6. Manuais de identificação
Os manuais de referência para cada grupo de fungos estão indicados na Tabela 3.13. Os fungos foram identificados com base em manuais especializados em micologia alimentar e do solo, visto que o solo é o reservatório de quase todos os fungos.
Tabela 3.13 Manuais de identificação usados para identificação dos Ascomycota e Zygomycota detectados Manuais de identificação Grupo de fungos
Pitt & Hocking, 1997 Geral para fungos em alimentos Domsch et al. (1993) Fungos do solo
Barron (1968) Fungos do solo Ellis (1971) Dematiáceos Raper & Fennell, 1965; Pitt &
Hocking, 1988
Aspergillus e teleomorfos
Pitt (1979; 1988) Penicillium e teleomorfos
von Arx (1980) Géneros que esporulam em cultura pura
3.7. Preparação de Aspergillus para observação ao SEM
Foram usados dois procedimentos para preparação de amostras para observação ao SEM. Inicialmente, fixaram-se as amostras com tetróxido de ósmio, lavaram-se e desidrataram-se através duma série progressiva de soluções de álcool a 25%, 50%, 75%, 95% e 100%. Secaram-se as amostras num excicador, montaram-se nos suportes, cobriram-se com ouro, e foram observadas de imediato ao SEM. Exemplos de imagens obtidas por este processo são as fotografias de SEM do capítulo 2 (V. capítulo 2, Figura 2.7, p. 107). Mais tarde, confirmou-se que, tal como mencionado por Kozakiewicz (1989), que estes passos são desnecessários visto que os esporos são estruturas naturalmente desidratadas. Como tal, esfregaram-se os suportes com fita de carbono em áreas esporuladas de culturas de CZ com um mês de idade, cobriram-se de ouro e observaram-se imediatamente. As imagens de SEM apresentadas no capítulo 3
(Resultados) foram todas obtidas pelo último processo mencionado. O SEM usado foi um Leica Cambridge S360.
3.8. Confirmação da identificação de Aspergillus secção Nigri
Estirpes representativas de Aspergillus negros foram enviadas para confirmação pela perita Dra. Zofia Kozakiewicz (representante do Reino Unido da ICPAS) e para análise molecular (grupo do Dr. Javier Cabañes). Os resultados foram consistentes no que diz respeito à distinção das espécies unisseriadas, agregado A. niger e A. carbonarius.
3.9. Diferenciação de Penicillium
Visto que a identificação de Penicillium não foi feita com recurso a técnicas moleculares, o nome da espécie (v.g., P. miczinskii, P. simplicissimum) diz respeito ao sentido lato.
A distinção entre P. glabrum e P. spinulosum não foi feita, visto que tal como descrito, se verificou que as duas espécies formam uma interface (Pitt, 1988). Algumas estirpes foram facilmente identificadas como P. glabrum ou P. spinulosum, mas outras não puderam ser atribuídas a uma das espécies com segurança. Como tal, optou-se por se apresentar os dados respeitantes ao grupo P. glabrum/P. spinulosum, tendo em consideração que a distinção entre estas duas espécies não se considera relevante até ao momento da escrita desta dissertação no que diz respeito à produção de micotoxinas, e que as duas espécies são muito próximas e partilham requisitos ecofisiológicos semelhantes (Pitt et al., 1990).
3.10.
Perfis de metabolitos secundários de estirpes de
Penicillium
As culturas foram crescidas em YES durante 7 dias, e analisadas de acordo descrito por Paterson e Bridge (1994) e Abrunhosa (2001): foram retiradas 3 cilindros de agar com um fura-rolhas de 4 mm de diâmetro, e aplicados numa placa de TLC (sílica gel 60 em folhas de alumínio, Merck, Lisboa, Portugal). A fase móvel foi tolueno/acetato de etilo/ácido fórmico (5:4:1, v/v/v). Os solventes usados são de grau para HPLC e foram adquiridos da Merck. A formulação do meio YES é descrita de seguida:
• YES: meio de agar com extracto de levedura com sacarose
20 g de extracto de levedura (Difco 212750) 150 g de sacarose (extra pura, Merck) 20 g de agar Nº 3 (Oxoid L13) 1 l de água destilada
Esterilizar a 121 ºC, 15 minutos.
O extracto de levedura foi adquirido preferencialmente da Difco com base nos trabalhos de Filtenborg e colaboradores (1990), que verificaram que esta marca de extracto de levedura era mais adequada à análise de metabolitos secundários.
3.11.
Fotografias dos espécimens identificados
As fotografias dos espécimens foram tiradas com um máquina digital de 3,3 Megapíxeis (JVC GC-X3). Quando necessário, foi feito tratamento de imagem no Corel Photo Paint para correção de luminosidade e cor.
4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de
Aspergillus
Para avaliar o potencial ocratoxigénico das estirpes de espécies de Aspergillus descritas como produtoras de OTA, usou-se o meio CYA. Para verificar se a capacidade produtora se mantinha em uva, fez-se um rastreio a um número representativo de estirpes produtoras e não produtoras de OTA em CYA em meio com extracto de uva (GJ50).
4.1. Estirpes analisadas
A lista de estirpes analisadas, com código, espécie, data de isolamento e amostra de uvas donde foi isolada (origem) encontra-se no anexo II. O número de estirpes analisadas de cada espécie entre 2001 e 2003 por plaqueamento directo está indicado na tabela 4.2 do capítulo 4 (p. 202).
4.2. Reagentes químicos e materiais
Os solventes usados foram de grau HPLC e foram fornecidos pela Merck (Lisboa, Portugal). Os filtros de seringa usados têm 0,45 µm de poro (Acrodisc). Os frascos para conter as amostras são de cor de âmbar de 4 ml com tampas de teflon (Supelco). Antes da injecção no cromatógrafo, as amostras foram transferidas para frascos brancos de 2 ml (Chromacol). Na formulação dos meios de cultura, foram usados os mesmos reagentes indicados na secção anterior.
4.3. Rastreio de produção de OTA pelas estirpes
As estirpes de Aspergillus foram isoladas em CYA, e a produção de OTA foi testada no mesmo meio, preferencialmente na placa de isolamento, após verificação
cuidada da pureza da cultura ao estereomicroscópio. A capacidade das estirpes produzirem OTA num meio à base de extracto de uva (GJ50) também foi testada. A formulação do meio GJ50 descreve-se de seguida:
• GJ50: meio de agar com extracto de uva a 50%
500 ml de extracto de uva 20 g de agar N º 3 (Oxoid L13) 500 ml água destilada
Preparação do extracto de uva: 1-2 kg de uvas
Homogeneizar as uvas na misturadora cerca de 1 minuto. Centrifugar o homogeneizado a 8500 r.p.m. durante 5 minutos. Decantar o sobrenadante. Colocar o sobrenadante a 4 ºC durante a noite para estabilizar. Filtrar por filtros de microfibra de vidro de 1,5 µm de poro e de 110 mm de diâmetro (Whatman). Medir 500 ml. Autoclavar a 90 ºC, 30 minutos.
Autoclavar a água e o agar a 121 ºC, 15 minutos. Adicionar os 500 ml de extracto de uva e autoclavar novamente a mistura a 102 ºC, 5 minutos.
O método usado para rastreio da capacidade de produção de OTA pelas estirpes foi o de Bragulat et al. (2001), e consiste no seguinte: as estirpes foram inoculadas em CYA e incubadas a 25 ºC, no escuro, durante 7 dias. Ao fim do tempo de incubação, retiraram-se com um fura-rolhas 3 cilindros de agar de 3 áreas da colónia distintas: próximo do centro, meio da colónia e próximo da periferia. Os cilindros de agar foram colocados em frascos com 500 µl de metanol. Ao fim de 1 hora, o metanol foi filtrado e evaporado a ca de 50 ºC com corrente de azoto. O resíduo foi ressuspendido em fase móvel e injectado no HPLC. A OTA nas amostras foi determinada e confirmada conforme descrito nas secções 7.7 e 7.8, respectivamente. O limite de detecção deste método foi de 0,1 µg OTA por kg de cilindros de agar (peso fresco).
4.4. Ensaio interlaboratorial
Foram fornecidas a 6 laboratórios (incluindo o nosso) 4 estirpes, sem informações sobre a espécie, para que o teor de OTA nas culturas fosse determinado. O resultado da identificação coincidiu com a identidade das estirpes determinada pela Dra. Z. Kozakiewicz, e o resultado quanto à determinação de OTA obtido no nosso laboratório (P4) foi concordante com o de 3 dos laboratórios (Tabela 3.14).
Tabela 3.14. Resultado do ensaio interlaboratorial quanto à detecção da OTA produzida por 4 estirpes (P4: resultados obtidos no nosso laboratório)
Nº Espécie Teor de OTA
P1 P2 P4 P7 P8 P10
1 Agregado A. niger Muito baixo OTA- OTA- OTA- OTA- OTA- OTA+ 2 A. carbonarius Elevado OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ 3 A. aculeatus Baixo OTA- OTA- OTA- OTA- OTA- OTA+ 4 Agregado A. niger Negativo OTA- OTA- OTA- OTA+ OTA- OTA+
O laboratório P10 usou um método de HPLC diferente dos restantes laboratórios e não efectuou a confirmação por derivatização com BF3 conforme descrito na secção 7.8,
o que pode justificar a ocorrência de falsos positivos.
5. Construção duma base de dados para documentação da
micoflora das uvas
À medida que as amostras de uvas foram analisadas quanto à sua micoflora e as estirpes isoladas e avaliadas quanto à produção de OTA, tornou-se necessário um sistema de informação que permitisse registar os dados resultantes da análise micológica das uvas, bem como facilitar o acesso à informação nele depositada. No entanto, criar um sistema de registo de informação apresenta uma dificuldade inata: seleccionar a informação a registar. Dados não registados implicam perda de conhecimento, mas
registar tudo é impraticável. Nesta secção, explana-se o processo de conceptualização da base de dados, os modelos e ferramentas usados, e a aplicação desenvolvida. A base de dados é um repositório de informação sobre a micoflora das uvas, que permite posteriormente a realização de análises estatísticas ou exploração informática aos dados nela registados, descritos no capítulo seguinte.
5.1. Software
A base de dados foi elaborada recorrendo ao Microsoft Access XP, e os formulários de interacção foram elaborados com recurso a uma aplicação desenvolvida no Microsoft Visual Basic versão 6.
5.2. Modelo da base de dados
A base de dados foi desenvolvida com base no modelo entidade-relação (E-R) (Teorey, 1999). Neste modelo, a informação encontra-se estruturada em entidades, que correspondem a um dado tema ou assunto (v.g., proveniência das uvas). As entidades associam-se através do estabelecimento de relações. Cada entidade tem várias características, designadas de atributos (v.g., nome da quinta, casta de uvas). A informação respeitante a uma entidade é registada numa tabela. Os atributos são os campos da tabela. Os campos duma tabela podem ter vários valores, ou seja: o atributo “casta de uvas” pode ser ter o valor Loureiro, Vinhão, Tinta Barroca, etc. Os atributos numa tabela são de dois tipos: identificadores e descritivos. Os campos identificadores ou chaves (campos id) permitem a identificação única duma instância da entidade. O atributo identificador da tabela chama-se chave primária. Através das chaves, as tabelas podem ser relacionadas, bem como os registos respeitantes a uma dada instância. Os atributos descritivos especificam características que não são únicas duma dada instância (v.g., nome da quinta, casta de uvas). As relações entre as tabelas podem ser de um para um, um para muitos ou muitos para muitos. Para mais informações sobre a
conceptualização, implementação e gestão de bases de dados, dever-se-á consultar (Connolly et al., 1998).
Figura 3.11. Exemplo de duas entidades relacionadas num modelo E-R. A entidade região de origem das uvas (designada por “Regioes”) é uma tabela com 3 atributos: 1 identificativo (id_regiao) e dois descritivos: o nome da região (cujo valor pode ser Alentejo, Dão, Douro, Madeira, Ribatejo ou Vinhos Verdes) e observações (v.g., sul de Portugal). A entidade “Locais” liga-se à entidade “Regioes” com uma relação de 1 para muitos, pois uma região pode ter vários locais. A entidade “Locais” possui dois atributos chave: um atributo identificativo (id_local) e um atributo identificativo da tabela regiões, que permite fazer a ligação entre os dados das duas tabelas. Possui dois atributos descritivos: o nome do local (v.g., EVAG) e observações (v.g. em Arcos de Valdevez)
5.3. Estrutura da base de dados
A base de dados foi feita para responder a questões como:
• Quais os fungos encontrados numa dada região no bago ervilha no ano de 2002?
• Qual o local, região ou ano em que foram encontrados mais espécies de
Aspergillus?
• Qual a origem das estirpes isoladas?
• Quantas estirpes foram isoladas da quinta A? • Quantos produtores de OTA foram encontrados?
Com base nas perguntas a que se queria dar resposta, seleccionaram-se os temas e atributos a registar. Os principais temas considerados são: i) origem das uvas; ii) a placa
de isolamento; iii) as espécies detectadas e iv) as estirpes isoladas. A estrutura da base de dados é apresentada de seguida centrada em cada um destes temas.
As relações entre as tabelas podem ser observadas na Figura 3.12. Todas as tabelas têm campos de observações, que permitem registar informações relevantes não indexadas noutros campos.
5.3.1. Origem das uvas
Para a amostra ser identificada, necessita de informação sobre a sua origem, estado de maturação e data de colheita. O estado de maturação e a data da colheita estão ligados à placa de isolamento (secção seguinte). A tabela que contém informações sobre a origem das uvas, designada por proveniência das uvas (Figura 3.12), está relacionada com as tabelas que contêm informação sobre o local (quinta) e casta das uvas. Como um local pode ter várias castas, e a mesma casta ser estudada em vários locais, a relação entre as duas tabelas é de muitos para muitos, e faz-se com recurso a uma tabela de ligação (castas por quintas). A tabela local relaciona-se com a tabela regiões (Figura 3.11). Além dos atributos identificativos, a tabela proveniência das uvas têm mais dois atributos: UvaRaquis, um campo binário que especificava se a amostra provinha de bagos de uva ou de ráquis (os resultados apresentados dizem respeito a dados de bagos de uva), e amostra, que indica qual o ponto de amostragem onde foi colhido o cacho.
5.3.2. Placa de isolamento
A placa de isolamento cruza informações sobre a origem das uvas, estado de maturação das uvas e data de colheita, e os fungos detectados nas amostras. A cada placa de isolamento foi dado um código. O código reflecte a data de isolamento, região, local e ponto de amostragem, consoante indicado na Figura 3.13.
Quando existe mais que uma casta por local, a casta faz parte do código (v.g., para uma amostra da região dos Vinhos Verdes, da EVAG, casta Loureiro, ponto de amostragem 6, o código é: 25/6VVEVAL6).
As informações que se obtêm da placa de isolamento estão estruturadas na tabela “Amostragens”. Esta tabela possui campos identificativos que lhe permitem relacionar-se com a proveniência das uvas e com o meio de cultura (campo “meios”) e procedimento usado para detecção de fungos filamentosos (campo “metodos”). Possui um campo identificativo próprio (id_amostragens) e o código atribuído manualmente. No campo data, é introduzida a data da amostragem (dia/mês/ano). Relaciona-se com a tabela maturação, onde estão indicados os estados de maturação analisados.
5.3.3. Espécies
A informação que se considerou relevante quanto às espécies foi o nome, micotoxinas produzidas, propriedades e habitats. As espécies detectadas em cada placa de isolamento estão ligadas à tabela “amostragens” pela tabela de ligação “EspeciesPorAmostragem”, onde o nº de bagos colonizados por cada espécie fica registado.
5.3.4. Estirpes isoladas
As estirpes isoladas estão ligadas à placa de isolamento e, portanto, partilham de todas as informações sobre a origem e processo de isolamento. Estão relacionadas com a espécie, e tem campos de informação adicional sobre: i) data de isolamento; ii) produção de OTA; iii) confirmação da identificação; iv) código. O código é constituído pelos dois últimos dígitos do ano de isolamento, por um U, que indica que a estirpe derivou de uvas, seguido de iniciais do género e de um número de ordem sequencial (Figura 3.14)
Figura 3.12. Modelo conceptual da base de dados. As entidades estão representadas em tabelas (caixas azuis). O nome da tabela está indicado a branco com
fundo azul no topo da caixa. Os atributos estão listados nos espaços brancos. O atributo identificativo (chave primária) está a negrito. As relações entre as tabelas estão representadas por uma linha negra. O 1 e ∞ indicam que a relação é de um para muitos
6/6 DC2 Data de colheita Ponto de amostragem Local Região 6/6 DC2 Data de colheita Ponto de amostragem Local Região 6/6 DC2 Data de colheita Ponto de amostragem Local Região
Figura 3.13. Código de uma amostra de uvas de bago ervilha (colhida em 6 de Junho) proveniente do Douro, local Do2 (C é a sigla da Quinta), que corresponde ao ponto de amostragem 2
01UAs363 Ano 2001 Uvas rgillus Número de estirpe Aspe 01UAs363 Ano 2001 Uvas rgillus Número de estirpe Aspe
Figura 3.14. Código duma estirpe de Aspergillus isolada de uvas em 2001. O código de estirpe é constituído pelo ano de isolamento, inicial do material de onde foi isolado, siglas do género de fungo, e código sequencial para a estirpe
Formulários
Para introduzir informação na base de dados, foi criada uma aplicação em Visual Basic disponibilizando vários formulários. Um formulário serve para criar registos numa tabela. A sequência de preenchimento dos formulários acompanha o processo de análise das uvas: após ter sido criado o registo dos métodos, meios e origem das uvas, preenche-se o formulário respeitante à amostragem (Figura 3.15). Em preenche-seguida, cria-preenche-se o registo para as espécies, e adicionam-se à lista de espécies detectadas, juntamente com o número de bagos colonizados. Depois destes registos estarem criados, preenche-se os registos respeitantes ao isolamento de estirpes, quando existem.
Figura 3.15. Formulários usados para inserir registos sobre a placa de isolamento (formulário amostragens, lado esquerdo), que através do botão isolamentos, dá acesso ao formulário isolamentos, que tem informação sobre as estirpes
5.4. Questionários
Os questionários foram construídos seleccionando as tabelas e campos de que se deseja obter informação. Um exemplo da construção dum questionário para saber o número de bagos colonizados com as espécies de Aspergillus negros Aspergillus niger e
Aspergillus carbonarius nas regiões em 2003 nos estados de maturação analisados está
indicado na Figura 3.16. O resultado do questionário está indicado na Figura 3.17.
A informação obtida dos questionários pode ser exportada directamente para outras aplicações, como Word, Excel ou SPSS.
