AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS PROTEÔMICOS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS GENETICAMENTE SELECIONADOS PARA ALTO
E BAIXO CONGELAMENTO.
Aluno: Yana Ferreira Ribas Orientador: J. Landeira-Fernandez Co-orientadora: Rachel Ann Hauser-Davis
1. Introdução
Recently we have reported our novel rat breeding line known as Cariocas High and Low Conditioned Freezing (CHF and CLF) as a genetic model to study fear and anxiety1. Oxidative stress has been linked with pathological manifestations of many neurological disorders. Several reports indicate that depression, anxiety and other psychiatric disorders are in part related to oxidative damage.
Metalotioneínas (MTs) são uma classe de proteínas citosólicas de baixo peso molecular, e sua estrutura é composta de uma única cadeia de aminoácidos, dos quais 20 são cisteínas, que representam em torno de 30% do total de aminoácidos. A abundância dos resíduos de cisteína presentes na estrutura da MT confere a proteína uma alta afinidade por íons metálicos livres, o que faz das MTs proteínas de grande interesse sob o ponto de vista bioquímico.2 Sua função biológica está relacionada à regulação de metais essenciais e a detoxificação de metais tóxicos. A gama de metais capazes de se ligarem a MT é ampla; a maior parte dos íons metálicos das famílias I-B e II-B da tabela periódica são conhecidos por se ligarem aos grupos cisteína, principalmente Zn, Cu, Cd e Hg.3,4
A associação de metais com diferentes ligantes celulares pode influenciar sua biodisponibilidade dentro da célula. Por exemplo, metais sequestrados por proteínas citosólicas, como MTs, ou estocados nos lisossomos são considerados detoxificados, e não mais biodisponíveis a alvos celulares.5,6 O papel das MTs está, portanto, relacionado com a função da proteína de redução da toxicidade de metais, sendo necessário que a síntese de MT seja induzida, provocada pelo simples aumento nos níveis de metais no organismo.7
Metalotioneínas presentes no sistema nervoso central, especificamente a isoforma MT-3, apresentam atividade de eliminação de radicais livres, sendo um dos principais sistemas antioxidantes no corpo e no cérebro, e estão envolvidos no controle
regulador do metabolismo do cobre e do zinco no cérebro, protecção dos neurônios contra os metais tóxicos e a prevenção de diversas metais tóxicos de ultrapassar a barreira hematoencefálica 8.
A glutationa (GSH, c-glutamil-cisteinil-glicina) também é uma proteína antioxidante e uma das primeiras barreiras contra o estresse oxidativo, como a produção de radicais livres, causados por diversos contaminantes ambientais. A GSH está envolvida em dois mecanismos que de combate ao estresse causado por metais combate: (i) aliviando os efeitos do estresse oxidativo causado por metais , através da formação de glutationa oxidada (GSSG), e (ii) através da formação de complexos de metal9. Os níveis de GSH flutuam em resposta a estímulos que produzem o estresse oxidativo e esta proteína tem sido utilizada como biomarcadora de estresse oxidativo em diversos organismos.
2. Objetivos
Este trabalho teve como objetivo principal a análise da expressão de proteínas indicativas de estresse oxidativo em cérebros de ratos geneticamente selecionados para alto e baixo congelamento, como a metalotioneína (MT), incluindo a isoforma MT-3, presente apenas no sistema nervoso central, e a glutationa reduzida (GSH).
3. Metodologia 3.1. Animais
Ratos Wistar adultos foram mantidos a 22º C num foto período de 12 horas na luz e 12 horas no escuro. Os animais foram permitidos ao acesso ilimitado à água e a uma dieta padrão de laboratório.
3.2. Coleta das amostras de cérebro
Sete ratos adultos de linhagem CHF e sete ratos adultos de linhagem CLF, machos e fêmeas, totalizando 28 animais, foram sacrificados, o crânio foi cuidadosamente separado com tesouras e bisturis e cérebros inteiros foram removidos, cuidadosamente lavados com água ultra pura e armazenados a -80º C em tubos estéreis de polipropileno. Cérebros inteiros foram liofilizados por pelo menos 48 horas e, em seguida, cuidadosamente moídos a um pó fino com o auxílio de grau e pistillo.
3.3. Caracterização dos níveis GSH, MT e MT3.
Para caracterização de GSH, MT e MT-3 foram utilizados animais da 14ª geração de cruzamentos seletivos. Estes animais foram previamente selecionados como os criadores para continuar o processo de reprodução seletiva. CHF (Cariocas de alto congelamento, do inglês Carioca High Freezing) (machos n = 7, n = 7 fêmeas) e CLF Cariocas de baixo congelamento, do inglês Carioca Low Freezing) (machos n = 7, n = 7 fêmeas) foram sacrificados, os cérebros inteiros foram removidos, lavados com água ultra pura e imediatamente armazenados a -80°C até a análise.
A extração de GSH foi conduzida por homogeneização de amostras de cérebro de uma proporção de 1:4 em tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0, contendo sacarose 0,25 M, seguida de centrifugação a 13.500 rpm. O teor total de glutationa foi determinado pelo método10 de Ellman, e expressa como peso úmido de m-mol g-1. A absorvância das amostras foram avaliada a 412 nm. As concentrações foram calculadas utilizando a GSH como padrão externo.
A extração de MT foi conduzida pelo tratamento térmico 11. Resumidamente, as amostras de cérebro foram descongeladas e homogeneizadas em uma proporção de 3:1 em eppendorfs estéreis em uma solução contendo Tris-HCl 20 mM pH 8,6, PMSF 0,5 mM, como agente anti-proteolítico e B-mercaptoetanol a 0,01%, como agente redutor. As amostras foram então centrifugadas a 20.000 x g durante 1 hora a 4°C. Os compostos da superfície foram separados das pelotas, transferidos para novos estéreis eppendorfs e, em seguida, aquecidos a 70ºC durante 10 min. Outra centrifugação, nas mesmas condições, foi conduzida durante 30 minutos e os compostos superficiais finais contendo o MT foram separados e congelados a -80°C até a análise. A absorvância da amostra foi avaliada a 412 nm. As concentrações foram calculadas utilizando GSH como padrão externo. O teor de TA foi então estimado assumindo a relação de 1 mol TA = 18,8 moles de GSH, como descrito para os mamíferos.
A quantificação de MT-3 foi realizada por ELISA, utilizando uma microplaca específica TA-3 de rato MT3 (Cusabio, China). Resumidamente, 50 mg de cérebro liofilizado de rato foram homogeneizados em 1 x tampão de fosfato de sódio e sonicado durante 5 minutos para romper as membranas celulares. As amostras foram então centrifugadas durante 5000 x g por 5 minutos a 4°C, o composto da superfície separado e analisado imediatamente. 100 μL de cada amostra foram adicionadas à microplaca de 96 poços e incubadas durante 2 horas a 37º C. O líquido de cada poço foi então removido, 100μL de anticorpo biotina foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada
por 2 horas a 37º C. Os poços foram então aspirados e lavados três vezes com tampão de lavagem, 100 μL de conjugado de avidina-peroxidase de rábano, e foram adicionados ao longo de outra hora de incubação realizada a 37° C. Os poços foram então aspirados e lavados três vezes e 90 μL de substrato TMB foram adicionadas. A placa foi então incubada durante 30 minutos a 37º C no escuro e, finalmente, 50 μL de uma solução de paragem foi adicionada a cada poço. A absorção de cada poço foi então analisada a 450 nm, dentro de 5 minutos após a adição da solução de finalização da reação.
4. Resultados e discussão
A análise ANOVA de duas vias da MT-3 mostrou uma ausência de uma interação de duas vias (F1, 24 = 0,63, p = 0,43), e sem efeitos principais para cada linha (F1, 24 = 0,0033, p = 0,95) e sexo (F1, 24 = 0,95, p = 0,33). A análise de variância de duas vias da resposta MT mostrou uma significativa interação nos dois sentidos (F1, 23 = 11,32 p <0,05), e os efeitos principais para a linhagem (F1, 23 = 4,436, p <0,05) e para o sexo (F1, 23 = 29,667, p <0,05). O teste post-hoc de fisher mostrou diferenças significativas entre CHF e CLF entre machos. Para a expressão GSH, os resultados mostraram uma significativa interação nos dois sentidos (F1, 23 = 11,15, p = 0 <0,05), e os efeitos principais para o sexo (F1, 23 = 7,88, p <0,05), mas não para a linhagem (F1, 23 = 2.11, p = 0.1).
Com relação MT-3, podemos observar que na linhagem CHF, as fêmeas e os machos possuem a mesma quantidade dessa proteína, 14 pg mL-1, enquanto na linhagem CLF, os machos possuem maior quantidade, 15 pg mL-1, do que as fêmeas, 13 pg mL-1, e as linhagens CHF e CLF possuem quantidades próximas entre si. No caso da proteína MT, a quantidade de proteína em machos e fêmeas da linhagem CHF também é a mesma, cerca de 80 ug mL-1, na linhagem CLF, a quantidade de proteína chega a 100 ug mL-1em machos e cerca de 75 ug mL-1em fêmeas, os machos de cada linhagem tem uma diferença maior da quantidade dessa proteína do que as fêmeas. Finalmente, se tratando de GSH, podemos notar na linhagem CHF, que aparece uma diferença entre machos, cerca de 2,5 umol g-1 presente, e fêmeas, 4 umol g-1, e na linhagem CLF, já não há tanta diferença assim, machos possuem cerca de 3,75 umol g-1 e fêmeas cerca de 3,7 umol g-1, podemos notar também uma grande diferença entre machos das 2 linhagens e uma diferença um pouco menor, mas considerável, nas fêmeas de cada linhagem da quantidade dessa proteína presente no cérebro.
Figura 1: Resultados proteômicos para linhagens CHF e CLF, animais machos e fêmeas.
Traços de íons metálicos nos organismos vivos desempenham um papel importante na homeostase do organismo e processos metabólicos necessários. Vários elementos essenciais são conhecidos por ligarem ou serem componentes integrantes de proteínas (isto é, selenoproteínas, e proteínas ligadas ao ferro, como a ferritina e transferrina). A deficiência ou o excesso desses elementos em organismos mamíferos tem sido descritos como responsável por interromper potencialmente a homeostase metabólica, o que por sua vez pode levar ao estresse oxidativo e à toxicidade que podem, finalmente, causar doenças e até mesmo a morte 12,13. A mera presença de metais tóxicos, por outro lado, pode ter efeitos adversos sobre bioquímica intracelular, mesmo em concentrações muito baixas14. Os resultados indicam que animais CHF e CLF podem demonstrar alterações na homeoastase do organismo, com diferenças entre os sexos. Níveis mais baixos de MT e GSH verificados, que são proteínas relacionadas ao combate ao estresse oxidativo, estão presentes de forma proeminente, demostrando e o envolvimento do sistema redox em ratos CHF.
MT-3 Males Females 0 5 10 15 20 CHF CLF Sex p g / m L -1 MT Males Females 0 50 100 150 CHF CLF * Sex u g /m g M T GSH Males Females 0 1 2 3 4 5 CHF CLF Sex u m o l/ g GS H
5. Conclusões
Foram encontradas divergências entre as linhagens em vários aspectos relacionados com o estresse oxidativo, tais como diferenças de metalotioneína no cérebro. Também verificou-se diferenças entre os sexos. Os resultados obtidos no presente estudo corroboram a presença proeminente e o envolvimento do sistema redox em ratos CHF, e sugerem que estes animais podem não conseguir lidar adequadamente com o estresse oxidativo, já que eles apresentam níveis mais baixos de MT e GSH. Isto pode desempenhar um paper importante em iniciare ou exacerbar as desordens de ansiedade ou desordens similares.
6. Referências
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