INTRODUÇÃO FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 2

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FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 2

INTRODUÇÃO

Este trabalho foi realizado nas aulas de Farmacologia I, em que se fez experiências para estudar o comportamento do canal deferente do ratinho, relativamente a agonistas e antagonistas de transmissão colinérgica periférica.

Usou-se os fármacos:

Acetilcolina e Carbacol – agonistas totais de acção directa Fisostigmina ( ou eserina ) – colinomimético de acção indirecta Atropina – antagonista.

O objectivo foi de estudarmos as curvas dose-resposta, de modo a podermos comparar o efeito da Fisostigmina (ou eserina) sobre as curvas à acetilcolina e ao

carbacol.

Para caracterizar um determinado fármaco, é necessário: medir a sua afinidade (capacidade do fármaco se ligar ao receptor); a sua actividade intrínseca (capacidade de, uma vez ligado ao receptor, desencadear uma resposta) que é dada pela amplitude da curva dose-efeito; a potência é dada pela posição da curva no eixo das abcissas, para calcular a potência é usual determinar o EC50, concentração do fármaco necessária para

causar 50% da resposta máxima. Para comparar a potência dos agonistas é mais prático achar o logaritmo negativo da dose que produz 50% do efeito máximo ( - log [ EC50

] ) que se denomina por pD2.

Para caracterizarmos a capacidade bloqueadora dos antagonistas competitivos é necessário calcular o pA2. Segundo Schild, o pAx é o logaritmo, na base de 10, da

concentração molar de um antagonista que reduz o efeito de uma dose múltipla de um agonista ao efeito de uma dose unitária. De acordo com esta definição, o pA2 será o

logaritmo negativo da concentração molar de um antagonista necessária para reduzir o efeito produzido por um dose dupla ( 2x ) de um agonista ao efeito produzido por uma dose unitária. Um antagonista competitivo compete com o

fármaco para o mesmo local, podendo ser deslocado pelo antagonista, se a ligação não for irreversível, enquanto que o antagonista não competitivo compete para um local diferente do agonista, sendo impossível deslocar por aumento da concentração. É possível distinguir o tipo de antagonismo através do declive da Regressão de Schild, se for igual a um o antagonista é competitivo, à desvios proporcionais à concentração, se o declive da recta for diferente de um o antagonista pode ser competitivo ou não.

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Os receptores colinérgicos são classificados farmacologicamente em nicotínicos e muscarínicos, mas só os segundos é que são do interesse para o nosso estudo.

Os receptores muscarínicos são classificados em quatro subtipos, designados por M1, M2, M3, M4, tendo sido postulado com base em clonagem molecular um

subtipo M5, com semelhanças ao M1.

• M1 e M4 – predominam nos tecidos neuronais ( M1 nos gânglios vegetativos

autónomos, córtex cerebral e hipocampo; M4 no estriado ) e em glândulas;

• M2 e M3 – predominam nas áreas cerebrais inferiores e nos órgãos efectores

periféricos, como o coração ( M2 ), músculo liso ( do intestino, dos vasos, da

íris, das vias urinárias, etc. ) e glândulas ( M3 ).

A caracterização farmacológica dos diferentes subtipos tem sido efectuada sobretudo pela utilização de antagonistas específicos, uma vez que não são ainda conhecidos agonistas dotados de uma selectividade elevada para cada subtipo.

É sobretudo sobre os receptores muscarínicos do subtipo M3 é que se debruça

o nosso estudo.

Os efeitos da acetilcolina como mediador químico das terminações nervosas pós ganglionares parassimpáticas são assim todos mediados por receptores do tipo muscarínico. Os efeitos evocados nos vários órgãos são diferentes. De um modo geral, observa-se uma estimulação das células, traduzida, por exemplo, por uma contracção

de quase todos os tipos de músculo liso (intestino, brônquios, vias urinárias, músculo

circular da íris ) e por um aumento de secreção das glândulas exócrinas ( salivares, gástricas, entérias, sudoríparas, lacrimais, brônquicas, etc. ).

O carbacol, como colinomimético, é capaz de provocar efeitos análogos aos dos compostos do parassimpático, pode actuar a nível pré-sinaptico, aumentando a libertação da acetilcolina, ou activar directamente os receptores muscarínicos, levando à contracção da musculatura lisa em questão (contracção do canal deferente do ratinho).

A Fisostigmina (ou eserina) é um colinomimético de acção indirecta, isto é, um inibidor das colinesterases (enzimas que degradam a acetilcolina na fenda sináptica) bloqueando-as, permitindo, deste modo, a acumulação da acetilcolina em maior quantidade e durante mais tempo junto dos receptores, causando uma potenciação dos seus efeitos.

A Atropina é capaz de bloquear os receptores muscarínicos da acetilcolina, diminuindo a capacidade funcional da célula efectora. Por exemplo, ao nível da

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musculatura lisa das vias brônquicas, biliares, intestinais e urinárias verifica-se um relaxamento.

Este estudo só pode ser feito graças ao estudo da acção dos fármacos em sistemas biológicos muito simples, como células ou tecidos isolados (canal deferente do ratinho) mantendo-os em condições fisiológicas normais, não sendo portanto necessário utilizar um animal inteiro, o que representa uma vantagem.

Materiais e métodos

Órgão utilizado: canal deferente de rato; íleo de rato

- Líquido nutritivo : Solução de Krebs

. Sistema de registo das contracções : transdutor isométrico + polígrafo . Carga : 1g

. Oxigenação: Carbogenio ( CO2 + O2 )

. Temperatura : 37º C

. Volume dos Banhos /alíquotas: 20ml / 100 µl ;

.

Protocolo

:

o Quando se usou os agonistas : carbacol e acetilcolina (curva dose resposta única) 1. Lavar o órgão com solução de Krebs;

2. Adicionar a alíquota do fármaco em estudo ; 3. Registar as contracções ;

4. Lavar o órgão .

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5. Repetir o procedimento anterior do agonista utilizando eserina (10 µM)

6. Lavar o órgão ;

o Quando se usou o antagonista (curvas cumulativas)

1. Adicionar concentrações crescentes de agonista 2. Registar as contracções

3. Lavar o órgão

1. Adicionar alíquota do antagonista utilizado (atropina) 2. Esperar 10 minutos ;

3. Adicionar concentrações crescentes do agonista; 4. Registar a contracção ;

5. Lavar o órgão ;

Repetiu-se este procedimento para diferentes concentrações de antagonista (atropina)

o

Soluções

:

Cloreto de acetilcolina: C7H16ClNO2. PM=181,7 12 diluições de 1: 3 a partir

de uma solução 2,0 mg/ml;

Sulfato de atropina: (C17H23NO3)2 .H2SO4.PM=676,8 Soluções de 3x10-8,

1x10-7, 3x10-7;

Cloreto de carbacol: C6H15ClN2O2. PM=182,6 12 diluições de 1 : 3 a partir

de uma solução 40 mg/ ml;

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Resultados:

Colinomiméticos de acção directa

No canal deferente Carbacol Acetilcolina 3,7 3,5 log nM cm mN % Log nM cm mN % 1,845098 70 0,0 0 0 1,845098 70 0,0 0 0 2,845098 700 0,3 0,794595 9,090909 2,845098 700 0,0 0 0 3,845098 7000 1,5 3,972973 45,45455 3,845098 7000 0,4 1,12 17,3913 4,30103 20000 2,8 7,416216 84,84848 4,30103 20000 1,0 2,8 43,47826 4,845098 70000 3,3 8,740541 100 4,845098 70000 1,5 4,2 65,21739 5,30103 200000 2,9 7,681081 87,87879 5,30103 200000 2,3 6,44 100 5,845098 700000 1,9 5,32 82,6087 EC50 (Cch) = 7,9432 x 10-6 M pD2 (Cch) = - log (7,9432 x 10-6) = 5,1 EC50 (Ach) = 2,3988 x 10-5 M pD2 (Ach) = - log (2,3988 x 10-5) = 4,62

Agonistas no intestino

Carbacol Acetilcolina 2,0 2,0 log nM cm mN % log NM Cm mN % 1 10 0,2 0,49 3,225806 1 10 0,1 0,392 1,190476 1,48 30 0,5 1,225 5,747126 1,48 30 0,5 1,96 5,952381 2 100 1,4 3,43 16,09195 2 100 1,4 5,488 16,66667 2,48 300 7,0 17,15 80,45977 2,48 300 3,0 11,76 35,71429 3 1000 8,4 20,58 96,55172 3 1000 5,7 22,344 67,85714 3,48 3000 8,7 21,315 100 3,48 3000 6,7 26,264 79,7619 4 10000 7,5 29,4 89,28571 4,48 30000 7,7 30,184 91,66667 5 100000 8,1 31,752 96,42857 5,48 300000 8,4 32,928 100 6 1E+06 8,2 32,144 97,61905

Curva dose resposta de agonistas no canal deferente

0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 Log [agonista] % de contracção máxima individual Cch Ach Gráfico 1

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EC50 (Cch) = 1,6218 x 10-7 M

pD2 (Cch) = - log (1,6218 x 10-7) = 6,79

EC50 (Ach) = 6,166 x 10-7 M

pD2 (Ach) = - log (6,166 x 10-7) = 6,21

Colinomiméticos de acção indirecta

Carbacol + eserina 10 µM Acetilcolina + eserina 10 µM

3,7 3,5 log nM cm mN % Log nM cm mN % 1,845098 70 0,0 0 0 1,845098 70 0,5 1,4 10,41667 2,845098 700 0,7 1,854054 20 2,845098 700 2,4 6,72 50 3,845098 7000 1,7 4,502703 48,57143 3,845098 7000 4,8 13,4 100 4,30103 20000 2,3 5,959459 64,28571 4,30103 20000 4,0 11,2 83,33333 4,845098 70000 3,5 9,27027 100 4,845098 70000 3,3 9,24 68,75 5,30103 200000 3,0 7,945946 85,71429

Efeito da eserina na resposta do carbacol

0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 log [Cch]] % de resposta máxima individual Cch Cch + Es

Curva dose resposta de agonistas no intestino

0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 log [agonista] % de resposta máxima individual Cch Ach Gráfico 2 Gráfico 3

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EC50 (Cch+Es) = 7,9432 x 10-6 M

pD2 (Cch+Es) = - log (7,9432 x 10-6) = 5,1

EC50 (Ach+Es) = 7,244 x 10-7 M

pD2 (Ach+Es) = - log (7,244 x 10-7) = 6,14

Contracção provocada pela eserina no intestino:

cm %

Acetilcolina 4 100

Eserina 10 µΜ 3,3 82,5

Efeito da eserina na resposta à acetilcolina

0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 log [Ach] % de resposta máxima individual Ach Ach + Es

Contracção provocada pela eserina no intestino 100 82,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Acetilcolina Eserina 10 mM

% de resposta em relação à Ach

Gráfico 4

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FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO 9 Estudo de antagonistas

Carbacol Cch+atrop 3E-8M Cch+atrop 1E-7M Cch+atrop 3E-7M

4,0 4,0 4,0 4,0 log nM Cm mN % cm mN % cm mN % cm MN % 1 10 0,5 1,225 8,333 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 1,4771 30 0,7 1,715 11,67 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 2 100 1,8 4,41 30 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 2,4771 300 3,5 8,575 58,33 0,3 0,74 4,839 0,1 0,25 1,79 0,0 0 0 3 1000 5,5 13,48 91,67 1,5 3,68 24,19 0,5 1,23 8,93 0,0 0 0 3,4771 3000 6,0 14,7 100 3,3 8,09 53,23 1,9 4,66 33,9 0,1 0,25 1,587 4 10000 6,0 14,7 96,77 4,5 11 80,4 0,3 0,74 4,762 4,4771 30000 6,2 15,2 100 5,5 13,5 98,2 2,2 5,39 34,92 5 100000 5,6 13,7 100 5,4 13,2 85,71 5,4771 300000 6,3 15,4 100

[antag.] Log [] EC50 DR log (DR-1)

Carbacol 2,51E-07

Cch+Atrop 3,E-08 -7,52 2,51E-06 10,00 1,00

Cch+Atrop 1,E-07 -7,00 5,01E-06 19,95 1,30

Cch+Atrop 3,E-07 -6,52 4,07E-05 162,18 2,21

pA2 = -(intersecção da recta com o eixo das abcissas)

pA2 = 8,27 C a rb a c o l + a tro p in a 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 1 2 3 4 5 6 lo g [a g o n is ta ] % resposta C ch +a tro p [3 E -8 ] C ch +a tro p [1 E -7 ] C ch +a tro p [3 E -7 ] C ch Gráfico 6 Gráfico 7 P lo t d e S c h ild (a tr o p in a ) y = 1 ,1 9 8 6 x + 9 ,9 1 2 1 R2_{= 0 ,9 7 0 4} -0 ,5 0 0 ,5 1 1 ,5 2 2 ,5 -9 ,0 0 -7 ,0 0 -5 ,0 0 -3 ,0 0 -1 ,0 0 1 ,0 0

log [a nta gonis ta ]

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Acetilcolina Ach+atrop 3E--8M Ach+atrop 1E-7M Ach+atrop 3E-7M

2,5 2,5 2,5 2,5 Log nM cm mN % cm mN % cm mN % cm MN % 1 10 0,3 1,176 7,317 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 1,47712 30 0,8 3,136 19,51 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 2 100 2,3 9,016 56,09 0,1 0,39 2,1277 0,0 0 0 0,0 0 0 2,47712 300 3,1 12,15 75,60 0,3 1,18 6,383 0,0 0 0 0,0 0 0 3 1000 3,8 14,89 92,68 1,2 4,7 25,532 0,4 1,568 8,51 0,1 0,39 2,08 3,47712 3000 4,1 16,07 100 2,2 8,62 46,809 1,0 3,92 21,3 0,3 1,18 6,25 4 10000 3,8 14,89 92,68 4,2 16,5 89,362 2,9 11,36 61,7 1,2 4,7 25 4,47712 30000 4,7 18,4 100 4,2 16,46 89,4 2,7 10,6 56,3 5 100000 4,3 16,9 91,489 4,7 18,42 100 4,3 16,9 89,6 5,47712 300000 4,5 17,64 95,7 4,8 18,8 100 6 1000000 4,6 18 95,8

[antag.] Log [] EC50 DR log (DR-1)

Acetilcolina 7,94E-08

Ach+Atrop 3,E-08 -7,52 2,45E-06 30,90 1,49

Ach+Atrop 1,E-07 -7,00 6,31E-06 79,44 1,90

Ach+Atrop 3,E-07 -6,52 2,51E-05 316,25 2,50

pA2 = 8,96 Gráfico 8 Acetilcolina+atropina 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 log [agonista] % respost a Ach+atrp[3x10^-8] Ach+atp[10^-7] Ach+atp[3x10-7^] Ach Gráfico 9

Plot de Schild (atropina) y = 1,0078x + 9,0826 R2_{= 0,9841} 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 -9,50 -7,50 -5,50 -3,50 -1,50 0,50 log [antagonista] log (DR-1 )

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Discussão dos resultados / Conclusões

Podemos concluir a partir da experiência realizada e dos cálculos efectuados que o carbacol é mais potente que a acetilcolina, pois o pD2 (carbacol) = 5,1 é superior ao pD2

(acetilcolina )= 4,6 e quanto maior o pD2 mais potente é o fármaco . Aliás uma menor

concentração de carbacol (EC50=7,9x 10 M ) em relação à acetilcolina ( EC50 =

2,4x10M ) foi capaz , como demonstrado nos resultados de desencadear 50% da resposta máxima .

Segundo a bibliografia ambos os fármacos são agonistas totais com capacidade de atingir uma resposta de 100% , logo têm actividade intrínseca semelhante . Não podemos é comparar a sua actividade neste caso , por não termos utilizado a mesma fracção de canal deferente na experimentação de ambos os fármacos.

As curvas dos respectivos agonistas têm uma inclinação semelhante, o que nos permite concluir que provavelmente actuam no mesmo tipo de receptores .

Outro fármaco testado , a eserina , como colinomimética de acção indirecta potência a acção da acetilcolina havendo um deslocamento da curva para a esquerda (ver gráfico 4). Na resposta ao carbacol a eserina não teve qualquer efeito (ver gráfico 3), este agonista é resistente à degradação pelas colineterases, daí não ser potenciada a sua acção pela eserina.

O pD2 (acetilcolina + eserina) = 6,14 é superior ao pD2 ( carbacol + eserina )= 5,10,

pelo que a potência da acetilcolina é superior à do carbacol quando as colinesterases estão inibidas.

No intestino quando aplicada isoladamente a eserina verificou-se , ao contrário do que seria de esperar, uma resposta contráctil de cerca de 82,5% . A situação é devida à inibição exercida pela eserina sobre as colinesterases impedindo deste modo a degradação da acetilcolina e aumentando a sua concentração na fenda sináptica . A acetilcolina actua então sobre os receptores provocando a contracção observada (ver gráfico 5) . Tudo isto vem demonstrar a presença deste agonista endógeno e das colinesterases no intestino que degradam a acetilcolina impedindo a contracção do músculo. Ao compararmos a acetilcolina e o carbacol no canal deferente e no intestino, verificamos que o pD2 aumenta no intestino, isto é, a potência do agonista aumenta.

Este facto deve-se provavelmente ao elevado tónus parassinpático existente no intestino relativamente ao canal deferente, havendo sempre uma determinada quantidade de

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acetilcolina libertada. Quando se adiciona uma determinada concentração de agonista, já se encontra presente na fenda sináptica uma elevada quantidade de agonista endógeno, deste modo a concentração efectiva de agonista na fenda sináptica é superior, registando-se contracções com concentrações mais baixas do agonista.

A atropina bloqueia preferencialmente os receptores muscarínicos, como na presença de uma concentração crescente de atropina (antagonista), concentrações progressivamente maiores de agonista causam resposta progressivamente maiores, apesar de estas respostas serem significativamente menos intensas que as verificadas na ausência do antagonista. Assim na presença de atropina a curva dose/resposta sofre um deslocamento para a direita, mantendo-se paralela, em relação à curva dose/resposta quando o único fármaco presente é o agonista, podemos concluir que o carbacol e acetilcolina actuam nos receptores muscarínicos do intestino. A presença de antagonista aumenta a concentração de agonista necessária para um certo grau de resposta.

Como os valores de declive obtido, quando traçada a regressão de Schild, ambos próximos de 1, podemos concluir que o antagonista testado (atropina) é competitivo. Os valores de pA2 obtidos para a atropina com o carbacol e a acetilcolina são aproximados,

pois esse valor é característico de um antagonista, devendo-se manter constante apesar de utilizarmos agonistas diferentes.

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BIBLIOGRAFIA

♦ S.P.H. Alexander; J.ª Peters, Pharmacological Sciences 2001 Receptor & Ion Channel Nomenclature Suplement, Twelfth Edition, London ( pag 6 ) ♦ H.P. Rang; J.M. Ritter;M.M. Dale, Farmacologia, 3ª edição, Editora

Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995. ( Capítulo 6 )

♦ Walter Osswald; Serafim Guimarães, Terapêutica Medicamentosa e suas Bases Farmacológicas, 4ª edição, Porto Editora, Porto, Jun/2001. ( Capítulo 22).

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao Dr. Jorge Oliveira, pelo tempo e atenção dispensados.

Queríamos também agradecer aos colegas das outras turmas laboratoriais por nos terem cedido os seus registos, sem os quais não poderíamos ter efectuado o nosso trabalho.

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