Pré-processamento e Normalização de Microarrays

(1)

Ivan G. Costa Filho

igcf@cin.ufpe.br

Centro de Informática

Universidade Federal de Pernambuco

Pré-processamento e

(2)

Tópicos

• Microarrays e Ruídos

• Aquisição dos dados de microarray

– análise da imagem

– medição da expressão

• Pré-processamento e normalização

– normalização dos dados

(3)

Aquisição e Processamento

de Dados

• Extração dos valores de

expressão

– identificação do spot

– calcular intensidade

do sinal

– normalizar valores

entre arrays

– detecção de ruídos

Cond A

Cond B

Cond C

Gene 1

-1,1

0,1

1,5

Gene 2

3,1

3,4

2,1

Gene 3

-2,2

-1,9

-3

...

B

C

B

C

A

(4)

Fontes de Variabilidade (1)

• Sistemáticos

– quantidade total de RNA

– transcriptase reversa

– etiquetagem (label)

– processo de escaneamento da imagem

• Efeitos similares em muitos dados

(5)

Fontes de Variabilidade (2)

• Estocásticos

– defeito em sondas

– deficiência do processo de detecção de

spots

– cross-hibridização ou hibridização não

específica

• Efeitos específico de cada sonda

– requerer modelos ruído

(6)

(7)

Conceitos Basicos

R

uid

o

P

ou

co

R

uid

o

(8)

Processamento de

Imagem

(9)

Processamento de

Imagem

• Arquivo GAL identifica o

posicionamento das sondas

– especifico da plataforma

• Processamento

(10)

Processamento de

Imagem

• Arquivo GAL identifica o

posicionamento das sondas

– especifico da plataforma

• Processamento

(11)

Processamento de

Imagem

• Arquivo GAL identifica o

posicionamento das sondas

– especifico da plataforma

• Processamento

– Posicionamento dos grids

– Identificação dos spots

(12)

Identificação Spots

• Identificar bordas

• Custoso, boa detecção

• Centralizar círculos

• Simples, baixa

(13)

(14)

Valor do Spot

Saturação

• Calibragem do scanner pode levar

muitos pixels a ter valores máximos

– 16bits – 65,535

• Mediana resolve com poucos pontos

saturados

(15)

verde

(cy5)

vermelho

(cy3)

cDNA Leitura - Exemplo

• Imagem é dividida em 2

canais (verde e vermelho)

• Mediana da intensidade de

cada circulo

• Expressão final é dada por

– cy3

_mediana

/cy5

_mediana

200

50

(16)

Detecção de Background

• Problemas:

– falha na lavagem do

array, luminosidade,

hibridização não

específica

• Uso de intensidade local

como sinal de

(17)

verde

(cy5)

vermelho

(cy3)

cDNA Leitura - Exemplo

• Imagem é dividida em 2

canais (verde e vermelho)

• Inclusão de background na

medida

• Expressão final é dada por

– (cy3

sinal

_-cy3

background

_)/

(cy5

sinal

_-cy5

background

₎

200

50

(18)

Leitura Affymetrix

Exemplo

• Grid quadrado é

usado para marcar

sondas

• Expressão absoluta

do gene

PM

MM

PM

₁

= 300

PM

₁

= 0

PM

₂

= 2000

PM

₂

= 100

(19)

Leitura Affymetrix

Exemplo

• Expressão absoluta

do gene

• Formula original

pode gerar valores

negativos

PM

MM

PM

₁

= 300

PM

₁

= 0

PM

₂

= 2000

PM

₂

= 100

Avg. diff =

∑

j∈ A

w

_j



PM

_j

−

MM

_j



∣

A∣

∑

j∈ A

w

_j

1if PM

−

MM



0

(20)

Qualidade de Leitura

• u

• Fontes de ruído

– Defeito de fabricação, distribuição, erro no

processo de identificação do spot, bolha de

ar, poeira, cabelo, buracos negros

• Qualidade do spot:

– Luminosidade: razão do sinal/background

– Uniformidade: variação da intensidade do

pixel

(21)

Qualidade de Leitura

• u

• Ações:

– Definir valores como NA (missing values)

•i.e.

(cy3

sinal

-cy3

background

) < c

– normalização locais para reduzir problemas

como poeira

– usar indicadores de qualidade em estágios

posteriores da análise.

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

Normalização

e

x

p

re

ss

ã

o

(27)

Normalização

• Problemas

– Intensidade dos canais, calibragem do

scanner, ...

• Princípios básicos

– a maioria dos genes medidos mantem

mesma expressão

– a quantidade total de RNA

apresentado é igual

(28)

Normalização

• _{Localização}

–

_{Corrigir viés}

espacial

• _Escala

–

_igualar

variabilidade

• _{Os microarrays devem}

{

(29)

Normalização

Escalonamento

• _{Rescalonamento}

Mediana é usada por

ser mais robusto

• _{Todos arrays tem a}

mesma localização

(30)

Normalização

Escalonamento (2)

• _{Como medir o fator de escalonamento?}

–

_{todos os genes}

–

_{genes house-keeping}

–

_{controles spike-in}

• _{Correção do Background}

–

_{global - Usar 5% percentile}

–

_{Local - ???}

(31)

Controle de Qualidade

• _{Swirl data}

log(red)/log(gre

en)

(32)

(33)

(34)

(35)

Escalonamento

Problemas

Scatter Plot MA Plot

(36)

Normalização Loess

• _{Existe um viés}

dependente da

intensidade

Viés = f(x)

• e

_med

= f(x) + e

_real

• _{Encontra f e}

calcular e

_med

-f

• _{Calcular f com}

(37)

Normalização Loess

Exemplo

(38)

Normalizacao

Metodo de Quantil

• _{Todos os histogramas devem ser}

(39)

Normalizacao

Metodo de Quantil

Normalizacao

(40)

Normalizacao

Metodo de Quantil

Normalizacao

(41)

Normalizacao

Metodo de Quantil

Normalizacao

(42)

Normalizacao

Metodo de Quantil

Normalizacao

(43)

Normalizacao

Estabilizacao de

Variancia

• Usa transformacao arcsin ao invez

do log

• Usa metodos de maxima

verossimilhanca para calcular

valores de escalonamento e

normalizacao

• Ussume um erro aditivo e

multiplicativo

(44)

Normalizacao

Estabilizacao de

Variancia

(45)

Normalizacao

Estabilizacao de

Variancia

(46)

Normalizacoes

• A principio todas as normalizacoes

retornam bom resultados

– Escalonamento local

– Loess

– Quantil

(47)

(48)

(49)

Filtros

• _{Alguns genes nao hidridizam com}

suas sondas

• _{Problemas de confeccao da sonda}

• _Solucoes

–

_{Usar sondas multiplas}

–

_{Filtrar genes com baixa expressao}

(50)

Conclusoes

• Pre-processamento

– Obtenco dos dados

– Requer varios niveis de checagem de

qualidade

• Sonda, array, gene

– Exercicio importante na analise de

dados!

(51)

Software

• _Bioconductor

–

_{Implementa maioria dos metodos:}

vsn, limma, affy, …

• _{Affymetrix, Agilent}

–

_{tem software proprio implementando}

(52)

Agradecimentos

Slides foram retirados de

apresentacoes de Christine

Steinhof e Tim Beissbarth