CARACTERIZAÇÃO DO GENE xynb2 QUE CODIFICA UMA β-xilosidase EM Caulobacter crescentus

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CARACTERIZAÇÃO DO GENE xynB2 QUE CODIFICA UMA β-XILOSIDASE EM Caulobacter crescentus

Moara R. Mingori1_{(PIBIC/CNPq/UNIOESTE), Juliana M. Corrêa}2

(PGEAGRI/PTI), Rinaldo F. Gandra3_{(PQ), Clarice A. Osaku}1_{(PQ), Marina K.} Kadowaki1_{(PQ) e Rita de Cássia G. Simão}1_{(ORIENTADORA),}

e-mail: ritabioq@yahoo.com.br

Universidade Estadual do Oeste do Paraná / 1_{Centro de Ciências Médicas e} Farmacêuticas, 2_{Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas,}3_Hospital

Universitário do Oeste do Paraná, PR. Área: Ciências da Saúde - 4.00.00.00

Sub-área: Farmácia - 4.03.00.00

Palavras-chave: resíduos lignocelulósicos, bactéria aquática, Biotecnologia. Resumo:

Caulobacter crescentus é uma bactéria aquática, membro da subdivisão α de Proteobacteria que se divide assimetricamente originando uma célula móvel e uma célula talo. Bactérias do gênero Caulobacter são hábeis a sobreviverem em ambientes oligotróficos e apresentam enzimas envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulósicos, mostrando um grande potencial para a degradação de resíduos agroindustriais. O xilano é o principal componente das hemiceluloses e sua completa degradação envolve um conjunto de enzimas das quais as Xilanases e Beta-Xilosidases são as principais. Neste estudo o gene xynB2 que codifica a β-Xilosidase II de C. crescentus foi clonado no vetor JET 1.2 blunt. Este recombinante foi caracterizado por análise em gel de eletroforese de DNA seguido de sequenciamento automatizado de nucleotídeos. A análise da seqüência obtida mostrou que o gene xynB2 de C. crescentus foi de fato clonado e apresenta 79% de similaridade com o gene que codifica para uma Beta-Xilosidase de Xanthomonas axonopodis.

Introdução

C. crescentus é uma bactéria geneticamente manipulável, vive em ambientes aquáticos oligotróficos, é não-patogênica e forma biofilmes com eficiência (Poindexter, 1981). A análise do genoma de C. crescentus confirmou que a bactéria apresenta genes envolvidos com a degradação de materiais lignocelulósicos derivados da parede celular das plantas como a celulose, o xilano e a lignina, além dos sistemas de transporte para importar os açúcares resultantes da degradação destes (Nierman et al., 2001) e portanto pode ser potencialmente utilizável em processos biotecnológicos que objetivam produção de enzimas a partir do aproveitamento de resíduos agroindustriais. Beta-D-Xilosidases (EC 3.2.1.37) são glicosídeo hidrolases que catalizam a liberação de unidades de xilose a partir de xilooligossacarídeos derivados da degradação do xilano. A completa

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degradação deste abundante heteropolissacarídeo é um passo chave do ciclo do carbono na natureza.

Materiais e métodos

Clonagem e outras técnicas de Biologia Molecular

Reações em cadeia da polimerase (PCR), ligações, transformação, isolamento de DNA plasmidial, digestão, recuperação de fragmento por papel Whatman DE81, sequenciamento de DNA e outras técnicas básicas de Biologia Molecular foram realizadas de acordo com metodologias padronizadas e descritas em manual de referência (Sambrook et al., 1989). Ferramentas de Bioinformática

As seqüências das proteínas preditas a partir do gene xynB2 foram obtidas partir do sequenciamento do gene xynB2 clonado e de pesquisa do genoma de C. crescentus em banco de dados público (NCBI: National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). A análise de similaridade de seqüências entre a β-Xilosidase (CCNA 02442) de C. crescentus com outros organismos foi realizada usando-se o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) na página do NCBI e o programa blastX.

Resultados e Discussão

O isolamento do gene xynB2 foi realizado através da amplificação do fragmento de DNA de 1,5 kb por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos com sítios de restrição EcoRI/XbaI e DNA genômico de C. crescentus. O fragmento amplificado foi recuperado através de eletroforese preparativa, para posterior ligação ao vetor de clonagem pJET 1.2 blunt em um sítio de restrição não coesivo (Figura 1). A identidade do gene xynB2 de C. crescentus foi confirmada por análise da seqüência nucleotídica após sequenciamento automatizado de DNA com o kit Big Dye Terminator versão 3.1 (Applied Biosystems). As seqüências nucleotídicas foram produzidas em termocilcador no laboratório de Bioquímica da UNIOESTE segundo as especificações do fabricante e posteriormente foram enviadas para análise em sequenciador automático no Instituto de Química da USP – São Paulo.

A proteína predita (Figura 2) a partir da seqüência gênica obtida foi comparada com β-Xilosidases de outros organismos com o auxílio do programa blastX e foi verificado que a proteína é mais similar a enzimas do grupo das γ-Proteobacteria, como é o caso de Xanthomonas axonopodis e

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Figura 1 – Gene xynB2 em pJet1.2/blunt (Fermentas®) (linha 2), digerido com enzimas de

restrição EcoRI/XbaI. (linha 1) Marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder.

MANAGPGARVIDLDLRRAAGPVDRFFDLSIGSDYPGTLIREDSQAQLKTTVDELGFR YIRFHAIFHDVLGTVKVQDGKIVYDWTKIDQLYDALLAKGIKPFIELGFTPEAMKTS DQTIFYWKGNTSHPKLGPWRDLIDAFVHHLRARYGVEEVRTWFFEVWNEPNLDGFWE KADQAAYFELYDVTARAIKAIDPSLRVGGPATAGAAWVPEFLAHVKKSGSAVDFVTT HTYGVDGGFLDEKGVQDTKLSPSPDAVVGDVRRVREQIEASAFPGLPLYFTEWSTSY TPRDSVHDSYVSAAYIVEKLRRVKGLVQAMSYWTYSDLFEEPGPPTAPFQGGFGLMN PQGIRKPSWFAYKYLNALKGRELVCADDQVFAARDGDRVAIVAYAWRQPDQKVSNRP FYTKLHPASDVEPLKVRLTSLKPGRYKLRVRRVGYRRNDAYSAYIDMGSPTTLTESQ LQSLQALTEDRPEIEKALKVSGETVVDLPMRANDVVLIELEPLA

Figura 2 – Seqüência de aminoácidos da β-Xilosidase II de Caulobacter crescentus. A

seqüência de aminoácidos especificada acima foi predita a partir da seqüência nucleotídica obtida usando vetor pJET 1.2 blunt contendo o gene xynB2 como molde e os oligonucleotídeos direto e reverso do vetor.

pJET1.2/blunt ≅2,9 kb Gene xynB2 ≅1,5 kb 1 2 0,5 kb 1,6 kb 2,0 kb 3,0 kb 4,0 kb

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Tabela 1. Comparação da β-Xilosidases II de C. crescentus com β-Xilosidases de outros

microrganismos.

Conclusões

O presente estudo possibilitou a clonagem e caracterização do gene xynB2 de C. crescentus que está sendo subclonado em outros vetores em nosso laboratório. Estas clonagens adicionais permitirão o estudo da proteína na própria bactéria C. crescentus por indução da expressão da mesma, pela depleção da β-Xilosidase II a partir da construção de um mutante nulo, além da superexpressão do gene em E. coli que perimitirá a purificação da β- Xilosidase II seguido de caracterização bioquímica.

Agradecimentos

Ao CNPq pela bolsa de iniciação científica da estudante Moara R. Mingori e a Fundação Parque Tecnológico Itaipu (PTI) pela bolsa de mestrado (PGEAGRI – Pós Graduação em Engenharia Agrícola) de Juliana M. Corrêa.

Referências

Nierman, W. C.; Feldblyum, T V; Laub, M T; Paulsen, I T; Nelson, K E; Eisen, J; Heidelberg, J F; Alley, M R K; Ohta, N; Maddock, J R; Potocka, I; Nelson, W C; Newton, A; Stephens, C; Phadke, N D; Ely, B; DeBoy, R T; Dodson, R J; Durkin, A S; Gwinn, M L; Haft, D H; Kolonay, J F; Smit, J; Craven, M B; Khouri, H; Shetty, J; Berry, K; Utterback, T; Tran, K; Wolf, A; Vamathevan, J; Ermolaeva, M; White, O; Salzberg, S L; Craig Venter, J; Shapiro, L & Fraser, C M. Complete genome sequence of Caulobacter

XynB2

Microrganismo Identidade Similaridade

Xanthomonas axonopodis 68% 79%

Xanthomonas campestris 66% 78%

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Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.