Determinação da viabilidade de Bacillus Thuringiensis apos processos de secagem

FACULDADE DE ENGENHARIA AGRiCOLA

DETERMINA(,:AO DA VIABILIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS APOS PROCESSOS DE SECAGEM

POR

REGINA DE OLIVEIRA MORAES

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Orientador:

Prof. Dr. KIL JIN ,PARK

~~~

Dissertayiio apresentada e:U

cumprinl~<l;s-requisitos

para obten<;:iio do titulo de Mestre em Engenharia Agricola: Area de C~ncentra<;:iio: Pre-Processamento de Produtos

Agropecuarios,

-Campinas-SP novembro-1993

e ao Renato, com muito carinho

Ao Prof. Dr. Kil Ji1 Park pelas sugest6es, estimulos, amizade e respeito com que sempre me tratou.

A

Dra. Deise Maria Fontana Capalbo pelo companherismo e acompanhamento efetivo no desenvolvimento deste trabalho.

A

minha mae, Prof. Dra. Iracema de Oliveira Moraes pelo estimulo, contribui96es, for9a e sua inabalavel confian9a neste trabalho.

Ao meu pai, Edezio, pela dedica9iio, apoio e ideias fundamentais para a otimiza9iio da fase experimental da tese.

A

Rosana e seu violiio, Manila e Rodrigo pela ajuda e companhia nas longas noites de experimento, tomando-as ate gostosas!

A

Faculdade de Engenharia Agricola atraves de seus docentes e funcioniirios pela oportunidade de realiza9iio desta pesquisa.

apoio financeiro.

Ao pessoal do LABIN e da P6s-graduac;ao pela amizade, e pelo ambiente gostoso de trabalho.

Aos tecnicos Dagoberto Favoretto Junior e Carla Mazom Soares pela colaboras:ao efetiva na fase experimental.

Ao Fernando Brod e Denis Lozano pela colabora<;iio na construs:ao do equipamento. Ao Ednaldo Carvalho Guimaraes pela ajuda na analise estatistica.

A

Vania Sant'ana Furlam, Rosangela Gomes e Ana Paula Montagner pelo suporte administrative, e demais pessoas que direta ou incliretamente contribuiram para a realizac;ao deste trabalho.

Bacillus thuringiensis (Bt), uma bacteria utilizada em controle biologico de lepidopteros,

e

produzida atraves de fermenta9iio submersa ou semi-salida . Ap6s a fermenta9iio urn dos maiores problemas encontrados

e

a recupera9iio desse material. Neste trabalho foi estudada a secagem do material fermentado apos centrifuga9ao. A pasta foi pre-formulada usando 97% de argila como inerte e 3% de principia ativo (Bt). A secagem foi feita usando diferentes tipos de secadores, nos quais se estabeleceram os parametros de interesse. A compara9iio entre os processos foi feita atraves da avalia9iio da manuten9iio da atividade microbiana de Bacillus thuringiensis A secagem realizada em secador convencional a 90 oc apresentou urn valor D de 5,86 h. A secagem realizada em atomizador a 120, 150 e 180 oc apresentou respectivamente 9,49 s, 5,88 s e 3,43 s de valor D, e valor z de 135,16°C. A viabilidade relativa foi mantida a 5ooc e 70°C e sofreu redu9iio a 90 oc em secador convencional. No atornizador a viabilidade relativa decresceu com eleva9iio da temperatura de 120 oc a 180°C.

Bacillus thuringiensis (Bt), a bacteria used in biological control of insect pests is produced by submerged or semi solid fermentation. Downstrean problems are very important after fermentation is finished. In this work it was studied the drying of fermented broth, after centrifugation. Three per cent of Bt was mixed with 97% clay, and used as a pre formulated material to be dried. Drying was realized both in conventional and spray dryers. Conventional dryer at 90

oc

presented D value of 5.86 hand spray dryer presented D values of 9.49 s; 5.88 s; 3.43 s, at 120 °C 150 °C e 180 °C respectively. The z value in spray dryer was 135.16

oc.

Microbial relative viability was maintained at 50 °C and 70

oc

but was reduced at 90

oc

in conventional dryer. In spray dryer the microbial relative viability decreased when the temperature increase from 120 °C to 180 °C.

Pagina

PAGINA DE ROSTO

SUMARIO . . . ii

LISTA DE FIGURAS . . . VII LISTA DE TABELAS . . . 1x NOMENCLATURA . . . XI RESUMO . . . . . . . xiii l. INTRODU<;AO . . . . . . . . . . . 1 2. OBJETIVOS . . . . . . . 3 2.1. Objetivo Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.2. Objetivos Especificos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

3.1. Bacillus thuringiensis . . . '. . . . . . . . . . . . . 5

3.1.1. Hist6rico . . . . . . . . . . . . . . . 5

3.1.2. Importiincia . . . . . . . . . . . . . . 6

3.1.3. Produ<;ao Industrial . . . , . . . 7

3.2. Recupera<;iio do Produto . . . . . . . . . . . . 8

3.3. Secagem de Material Biol6gico . . . . . . . . . 9

3.4. Resistencia Termica de Bacterias . . . 11

3.4.1. Fatores que Influenciam a Resistencia Termica das Bacterias . . . 12

3.4.2. Resistencia Tem1ica de Bacillus e em especial B. thuringiensis . . . 12

3.5. Iipos de Secadores . . . 14

3.5.1. Secador de leito estatico . . . 15

3.5.2. Atomizador . . . 16 3.5.3. Liofilizador . . . 16 3.6. Penetra<;ao de calor . . . 17 3. 7. Difusividade termica . . . 18 4. MATERIAL E METODOS . . . 19 4.1. Material . . . . . . . . 19 4.1.1. Microrganismo . . . . 19 4.1.2. Equipamentos . . . . 19 iii

4.1.2.2. Secagem convencional . . . 20 4.1.2.3. Liofilizador . . . 22 4.1.3. Inerte . . . 22 4.1.4. Outros equipamentos . . . 22 4.1.5. Reagentes . . . • . . . 24 4.2 Metodos . . . 25

4.2.1. Produc;iio de Bacillus thuringiensis . . . 25

4.2.1.1. Pre-fermentac;iio . . . 25

4.2.1.2. Fennentac;iio . . . 26

4.2.2.Centrifugac;ao . . . 27

4.2.3. Preparo da material . . . 28

4.2.3.1. Preparo do material para secagem em atomizador . . . 28

4.2.3.2. Preparo do material para secagem convencional . . . 29

4.2.3.3. Preparo do material para liofiliza<;iio . . . 30

4.2.4. Secagem . . . 30

4.2.4.1. Secagem em atomizador . . . 30

4.2.4.2. Secagem convencional . . . 31

4.2.4.3. Secagem por liofiliza<;iio . . . 33

4.2.4. Analise de via bilidade . . . . . . . 33

5. RESULTADOS E DISCUSSOES . . . • . . • . 35

5.1. Atomizador . . . • . . . • . . . 35

5.1.2. Analise estatistica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

5.1.3. Analises tennobacteriologicas . . . 37

5.1.3.1. Calculo de D . . . 37

5.1.3.2. Calculo de z . . . 39

5.2. Secagem convencional . . . 40

5.2.1. Resultados das secagens . . . 40

5.2.2. Analise estatistica . . . 42 5.2.3. Analises termobacteriologicas . . . 46 5.2.3.1. Calculo de D . . . 46 5.2.3.1.1. Cilculo de D a 50 "C . . . 46 5.2.3.1.2. Oilculo de D a 70 "C . . . 48 5.2.3.1.3. C::ilculo de D a 90

oc ...

48 5.2.3.2. Calculo de z . . . 49 5.2.4. Curvas de secagem . . . 49 5.2.4.1. Calculo de h . . . 50 5.2.4.2. Oilculo de j e f ... 53

5.2.5. Penetra9ao de calor e viabilidade de esporos durante a secagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

5.2.6. calculo da difusividade efetiva . . . 57

5.3. Liofilizador . . . 60

5.4. Coment!irios adicionais . . . 61

7. ANEXOS . . . . . . . . . . . 64 7.1. Anexo 1. Resultados da secagem em atomizador . . . 64 7.2. Anexo 2. Resultados da secagem convencional . . . 70 7.3. Anexo 3. Curvas de f*a{r2

versus N8 , • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 88 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS . . . 89 9. ABSTRACT . . . 93 10. AGRADECIMENTOS . . . 94

Figura 1. Esquema do atomizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Figura 2. Esquema do secador convencional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Figura 3. Amostrador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Figura 4. Sistema de alimenta<;:iio do atomizador . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Figura 5. Viabilidade comparativa, em secador do tipo atomizador . . . . . . . . 38

Figura 6. Curva de sobreviventes, ap6s secagem em atomizador

a

temperatura de 120 °C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

Figura 7. Curva de sobreviventes, ap6s secagem em atomizador

a

temperatura de 150

oc . . .

40

Figura 8. Curva de sobreviventes, ap6s secagem em atomizador

a

temperatura de 180

oc . . .

41

Figura 9. Curva fantasma de morte termica, para secagem em atomizador,

Figura 11. Curva de sobreviventes a 50 °C em secador convencional . . . 47 Figura 12. Curva de sobreviventes a 70 °C em secador convencional . . . 47

Figura 13. Curva de sobreviventes

a

90

oc

em secador convencional . . . 48

Figura 14. Curva de umidade do produto durante secagem convencional

a 50 °C. . . . . . . . . . . 49

Figura 15. Curva de umidade do produto durante secagem convencional

a 70 "C. . . 50

Figura 16. Curva de umidade do produto durante secagem convencional

a 90 "C. . . 50

Figura 17. Curvas de penetraqiio de calor em secagem convencional as temperaturas de

50, 70 e 90 "C . . . 57

Figura 18. Penetraqao de calor e log do numero de col6nias de esporos viaveis durante

secagem a 50 "C . . . . . . . . 58

Figura 19. Penetra<;ao de calor e log do numero de col6nias de esporos viaveis durante

secagem a 70

•c . . .

59

Figura 20. Penetraqao de calor e log do numero de col6nias de esporos viaveis durante

secagem a 90

oc . . .

60

Tabela I. Resistencia termica do Bacillus cereus . . . . . 14 Tabela 2. Resultados da secagem por atomizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Tabela 3. Teste de Tukey para medias de temperaturas em atomizador . . . . . 37 Tabela 4. Valores medios de· D para atomizador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Tabela 5. Resultados da secagem convencional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Tabela 6. Analise de variiincia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Tabela 7. Teste de Tukey para medias de tempo

a

temperatura de

50

oc . . .

44

Tabela 8. Teste de Tukey para medias de tempo

a

temperatura de

70

oc . . .

44

Tabela 9. Teste de Tukey para medias de tempo

a

temperatura de

90

oc . . .

45

Tabela 10. Propriedades do ar seco (a pressiio de 1 atm), nas temperaturas de 50, 70 e ·

Tabela 12. Propriedades da agua e da argila em diferentes

temperaturas. . . . . . . 53

Tabela 13. Valores de j e f, em cada tempo de secagem

a

temperaturas de

50 "C . . . . . . . . . . 54

Tabela 14. Vaiores de j e f, em cada tempo de secagem

a

temperaturas de

70 "C . . . 54

Tabela 15. Valores de j e f, em cada tempo de secagem

a

temperaturas de

90 "C . . . . . . . . 55

Tabela 16. Perfil de temperaturas em secagem convencional . . . 56

Cp calor especffico (Kcal/Kg*"C) D indice de reduqao decimal (s)

f tempo requerido para que a temperatura seja alterada em 90% (s) g acelern,iio cia gravidade (m/s2)

h coeficiente de transferencia de calor (Kcalfh*m2*T)

j fator de atraso (s)

k condutividade termica (Kcalfm*h*oC) L parametro geometrico (m)

t temperatura ("C)

N numero de co16nias de esporos viaveis

No numero inicial de col6nias de esporos vhiveis N8 ; numero de Biot (h*L/k)

X adimensional

z indice de temperatura ou coeficiente termico (0

C)

a difusividade termica (m2

/s)

13

coeficiente de expansiio tennica(0

C)

e

tempo (s)

iJ viscosidade (Kg/m *s) p densidade (Kg/m3)

Bacillus tlwringiensis Berliner,

e

atualmente um dos inseticidas biologicos ma1s utilizados e difundidos em diversos paises como Estados Unidos, Russia, China e paises europeus.

A importancia do desenvolvimento dessa bacteria deveu-se ao fato desta apresentar caracteristicas ideais como:

a. Especificidade, virulencia e potencia contra insetos-praga.

b. Inocuidade ao ser humane e outros vertebrados e insetos benefices. c. ReproduS'iio "in vitro" atraves de processo fermentative, o que lorna sua produS'iio viavel comercialmente.

Os estudos de fermenta9iio para produS'iio do inseticida biol6gico de Bacillus thuringiensis (Bt), vem sendo desenvolvidos ha um bom tempo e levaram em consideraS'iio a variedade do microrganismo, os substrates a serem usados como fontes de carbone e nitrogenio e as condiS'6es operacionais da fermentaS'iio.

Entretanto, essa area

e

bastante carente de literatura, aplicada especialmente aos processes de secagem de microrganismo. No caso da recupera9ao do Bacillus thuringiensis, a manuten9i\o da viabilidade e o fator mais importante e estii associado

a

resistencia termica do microrganismo, sendo que esta depende fundamentalmente da combina9ao temperatura e tempo.

Para que o Bacillus thuringiensis chegue a fase de campo hii necessidade de estudos e desenvolvimento de processes na area de recupera9ao do produto para que entao seja fonnulado e aplicado.

2.1. OBJETIVO GERAL

1. Estudo de secagem de produtos de Bacillus thuringiensis, visando a manutenS'iio da atividade microbiana.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Estudo de panimetros envolvidos na secagem de Bacillus thuringiensis.

2. Detem1inaqao da viabilidade microbiana dos produtos secas.

3. Estudo termobacteriologico visando a determinaqao dos valores de D e z.

3.!. Bacillus thuringiensis.

3.!.!. Historico.

Patogenos de insetos, utilizados como agentes de controle biologico, tern sido usados em escala cada vez maior no com bate a pragas da agricultura e vetores de doen~as.

Muitos resultados promissores obtidos com a bacteria entomopatogenica Bacillus rhuringiensis (Bt) tern levado a pesquisa a concentrar esfor~os para elucidar uma serie de fen6menos que acompanham o controle de insetos por ela exercido.

CAPALBO (1989) relata que o primeiro isolado de Bt, posteriormente denominado Bacillus thuringiensis var. sorto, foi obtido por Ishiwata, no Japiio, em 1902, de uma lagarta do bicho da seda, Bombix mori. Em 1915, na Alemanha, Berliner isolou uma bacteria de Anagasta kuhniela, tra~a das farinhas,

a

qual denominou Bacillus thuringiensis.

Entretanto, apenas em 1953 foi demonstrada a presen~a do corpo paraesporal na celula esporulada desta bacteria, o qual foi associado

a

sua atividade inseticida. Esse corpo paraesporal (tambem denominado crista!, crista! proteico, endotoxina, deltaendotoxina ou protoxina), de natureza proteica, e formado durante 0 processo de esporula~ao do microrganismo.

3.1.2. Importimcia.

Confonne MORAES, CAPALBO (1986) o Bacillus thuringiensis

e

uma bacteria mesotila, aerobica ou anaerobica facultativa, gram-positiva, e que produz 0 crista! proteico durante a fennenta<;iio. Diversos pesquisadores reestudaram detalhadamente o efeito deste crista! proteico, tambem chamado delta-endotoxina, sabre as larvas de lepidopteros e pode-se dizer que esta toxina e hidrolisada par enzimas do processo digestive e pelo pH alcalino caracteristico do trato digestive da larva. As sub-unidades do crista! atacam o tuba digestive e causam entiio a paralisia. 0 esporo tambem atua no centrale dos insetos quando penetra a parede do tubo digestive destes, e pode se reproduzir em seu interior. Neste caso o inseto morrer.\ com caracteristicas de septicemia e nao de toxemia, como no caso de morte pelo crista!.

MORAES (1981) cita que outras toxinas sao igualmente produzidas por diferentes variedades de Bt na fase vegetativa, e tem sido demonstrada sua atividade contra diferentes insetos. A ampla gama de insetos suscetiveis, a inocuidade

a

fauna e a flora, bem

como aos vertebrados e a possibilidade de prodw;iio "in vitro", foram aspectos positivos para a industria se interessar pela prodw;:ao deste inseticida em grande escala.

3.1.3. Produ~ao Industrial.

0 interesse comercial no desenvolvimento de produtos para controle microbiano de insetos iniciou-se em tomo de 1950, quando se percebeu a pcssibilidade de manipular microrganismos para causar epizootias em insetos suscetiveis, a ve]ocidndes proximas aquelas dos produtos quimicos, sem contudo causar danos as especies beneficas. Primeiramente, foram as empresas com instala<;oes para fennenta9iio que, na procura de novos mercados, se Janqaram no estudo da prodw;:ao do Bt, que se apresentava viavel para crescimento in vitro. A seguir, as industrias de produtos quimicos, ja estabelecidas na produ<;iio e venda de inseticidas, demonstraram interesse devido a potencialidade que o inseticida bacteriano representava na facilidade de produ<;ii.o, viabilidade e eficiicia para o controle de insetos, MORAES, CAPALBO (1986).

Para a produ<;iio comercial de microrganismos, ou de produtos microbianos, hii necessidade de uma linhagem bern adaptada ao processo fennentativo e varias:oes sao necessarias a fim de maximizar a produ<;iio e realizar o crescimento sob condi<;6es de fennenta<;iio economica. No caso de Bt

e

a aplica<;ii.o de bioensaios com o produto obtido que determina a melhor linhagem. Isto envolve grande consumo de tempo, o que nao

e

pratico nem economico, pcrem indispensavel, MORAES (1976).

3.2. Recuperaqao do Produto.

A recuperaqao de produtos microbianos pode ser mais dificil e mais cara que o processo fermentativo. Como exemplo, sabe-se que para uma planta de produqao de antibic\tico, o investimento realizado com as instala96es de recupera9ao representam cerca de quatro vezes o custo das instalaqoes de fermentaqiio (fermentador e equipamentos auxiliares). Cerca de 60 % do custo fixo de plantas de fermentaqao para acidos organicos ou amino-acidos siio atribuidos

a

seqiio de recuperaqiio, BUNGAY et al (1984).

Segundo DIETZ (1981), dentre os processos utilizados para recuperaqiio de microrganismos, podem ser considerados v:irios metodos, os quais sao usados para conserva<;iio de culturas microbianas. 0 metoda de Jiofilizaqao

e

o mais conveniente para a mai01ia das bacterias incluindo actinomicetos e alguns fungos e leveduras, alem de ser born para culturas que seriio comercializadas. Apresenta algumas desvantagens tais como de que a viabilidade usualmente

e

boa mas esse rigoroso processo pode ocasionar mutantes indesejaveis e

e

insatisfatc\rio para alguns microrganismos higrc\filos e fungos altamente esporulados. Outro metodo e o da conservaqao a Ultra Baixa Temperatura ou sobre nitrogenio liquido ( -196 "C), cujas vantagens sao que ha uma interrupqao do metabolismo e permite Iongo periodo de armazenamento. Como desvantagens temos o custo de investimento inicial muito alto, a necessidade de condi<;6es economicamente estaveis para evitar perdas por deficiencia no suprimento de nitrogenio liquido, e e urn processo caro e deve-se ter muito cuidado no caso de uso de ampolas Jacradas. 0 !acre improprio pode

permitir que haja entrada do nitrogenio no material e quando exposto ao ar pode ocorrer explosiio.

3.3. Recuperac;ao de Material Biol6gico.

Usa-se amplamente a secagem na recuperar;ao dos produtos de fermentar;iio, ligado principalmente as operar;oes de acabamento, BORZANI et al (1975).

0 processo de secagem de urn produto biol6gico envolve a remor;ao de agua ate o ponto em que o produto possa ser armazenado com seguranr;a. A condir;ao necessaria para que ocorra o processo de secagem

e

que o teor de umidade do produto esteja acima do seu teor de umidade de equihbrio, para condic;oes pre-estabelecidas de umidade relativa

e temperatura do ar de secagem, FORTES, OKOS (1980).

Dentre os fatores que detem1inam a taxa de evapora<;iio da agua na superffcie de um corpo ou um material poroso completamente timido, consideram-se: temperatura; umidade, pressiio de vapor e velocidade do ar; tamanho e forma da superficie urnida; direr;ao do movimento do ar em relac;iio a superficie tirnida, LOPES FILHO (1983).

Segundo SOLOMONS (1969) uma das mais dificeis operac;6es de recuperac;iio de material biol6gico 6 a secagem. Materiais termo-h\beis niio apresentam apenas problemas de inatividade causados por altas temperaturas, mas muitas vezes paradoxalmente, precisa-se de certa quantidade de calor para evitar uma aut6lise enzimatica . Como exemplo bastante tipico para esse tipo de problema, pode-se comparar a secagem de rnicrorganismos como a de um conjunto de celulas. Temperaturas elevadas causam,

obviamente, severos danos em proteinas, mas a secagem a vacuo a 40 "C tambem

e

muitas vezes igualmente desastrosa porque uma severa degrada9iio pode ocorrer e o material obtido ficar com colora9iio escura e apresentar odor de am6rua. Como em muitas opera9aes, deve-se observar que o processo para secagem de 10 mg de amostra laboratorial apresenta um grau de complexidade positivamente diferente do manuseio de 50 kg do mesmo material.

BLACHERE et al (1973), secando meio de Beamwia tenella, em leito fixe com temperatura de entrada do ar a 25 "C por 48 h, obteve queda de viabilidade do material para 5,3%, com as causas identificadas como: tempo Iongo de secagem, ma circula96o do ar, celulas muito compactadas e as:ao nociva do oxigenio do ar. Os autores fonnulando e secando meio de Beau;·eria rene/fa com silica

a

temperatura de 30 "C per 4-5 h obtiveram uma viabilidade final de 4,9% .

Beauveria brongniartii e Beauveria bassi ana fom1uladas e secas emleito fixe com temperatura de ar de entrada a 150 "C e de saida a 70 "C, tiveram uma viabilidade final entre 50-70% . 0 inerte usado foi a bentoruta, FARGUES et al (1979).

Reed e Ponte apud MORRIS (1990) afinnam que geralmente leveduras sao secas em correntes de ar, mantendo a temperatura da levedura abaixo de 40 "C.

MORRIS (1990) secando leveduras em secador de Ieite de Jorro

a

temperaturas de 100, 120 e 140 "C, obteve uma viabilidade entre 13,8 e 39% ap6s 30 minutos de secagem.

DULMAGE et al (1990) formularam uma pasta obtida por centrifugas:ao de Bacillus thuringiensis com agente umectante, dispersante e inerte tendo 4% de principia

ativo. 0 material foi seco em atomizador com temperatura de entrada entre 125 e 150 °C e temperatura de saida a 75 e 100 °C.

3.4. Resistencia Termica de Bacterias.

STUMBO (1973), apresenta os metodos mais comuns usados para medida da resistencia termica das bacterias: Tempo de morte tennica (TDT)-metodo de tubo, Tempo de morte termica (TDT)-metodo latas, Metodo do Tanque, Metodo de Frasco, Tem1oresistor, Metodo TDT com tubo aberto, Metodo do tubo capilar, que sao comumente empregados para detenninaqiio do tratamento termico, representado pelo valor D. Dependendo de como os dados foram obtidos, o valor D pode ser tomado diretamente atraves da constrw;iio da curva de sobreviventes plotando o logaritimo do numero de sobreviventes versus tempo (temperatura constante), ou ainda atraves da suposi<;iio da ordem de logaritimo de rnorte, a partir do numero inicial de sobreviventes ap6s um intervale de tempo de aquecimento, a cada temperatura estudada.

0 valor D, tempo de redw;:ao decimal, e definido como o tempo para que a linha do gnifico do logaritimo do numero de sobreviventes versus tempo, atravesse um ciclo Jogaritimico, ou, tempo para que o numero de sobreviventes seja alterado em urn fator de 10, ou ainda, tempo para que a popula<;ao de sobreviventes seja reduzida em 90%, PFLUG (1990).

0 valor z, coeficiente de temperatura de destrui<;ao microbiana, e definido como o numero de graus de temperatura necessarios para causar uma redu<;ao de fator 10

no valor D, ou para que o mesmo seja reduzido em 90% .

E.

calculado atraves da declividade da reta quando plota-se logaritimo de D versus temperatura.

3.4.1. Fatores que influenciam a resistencia termica das bacterias.

Podem ser classificados os seguintes fatores, STUMBO (1973): a. Resistencia inerente (genetico ).

b. Intluencias ambientais ativadas durante o crescimento e fonnac;iio de celulas e esparos: idade, temperatura de crescimento, natureza do meio onde o esporo foi produzido, efeito do meio de recupera9iio do esparo.

c. Intluencias ambientais ativadas durante o tempo de aquecimento das celulas au esparos. BASSEN eta! (1989) estudando a resistencia tennica do B. cereus expressa como o valor D, observou um aumento deste de 3,1 para 3,7 minutos com a varia9ao do pH do produto (Ieite em p6, sora de Ieite em p6 e agua) de 6,2 para 7,2.

3.4.2. Resistencia termica de Bacillus e em especial B. thuringiensis.

As esp6cies de Bt siio muito parecidas as esp6cies de Bacillus cereus quanta

as

caracteristicas culturais e bioquimicas. A priori, se forem ignorados os cristais e a palencia entomopatogenica, grupos das duas especies niio podem ser distinguidos par testes bacteriologicos de rotina, DE BARJAC (1981).

Segundo DULMAGE, AlZA W A (1982), o termo Bt e, muitas vezes, mal empregado, descrevendo urn grupo de organismos similarmente proximos em tamanho e na forma ao B. cereus.

A resistencia termica do Bacillus cereus e apresentada na Tab 1, a partir de dades obtidos por varies autores:

EL-GHANNAM et al (1988) trabalhando com culturas de B. thuringiensis e B. subrilis obteve redu9iio de 20-25% da viabilidade quando o tratamento termico foi de 60 "C por 10 a 30 minutes; a 70 "C pelo mesmo tempo a viabilidade foi reduzida em 64-76 % e em banho-maria em agua fervente (aproximadmnente IOO "C) reduziu-se a 14,6 e 9,5 % para B. thuringiensis e 21,4 e 16,7 %para B. subtilis. 0 B. subtilis e mais resistente ao calor.

PENDURKAR, KULKARNI (1989) estudando a resistencia termica de esporos de Bacillus em agua destilada e Ieite pasteurizado, encontrou para 100 "C o valor D de 19, 26,5, 20,2, 30,2 e 54 minutes para B. cereus, B. pumilis, B. subtilis, B. coagulans e B. licheniformi. 0 experimento constou de aquecimento a 50-100 "C por 10-100 minutes.

Tabela 1. Resistencia termica do Bacillus cereus. temperatura

oc

82 85 90 92 95 98 100 D min 232,84 110,87 13,50 6,72 30,00 2,34 19 Fonte FAJARDO NOGUEIRA et a! (1992) ' FAJARDO NOGUEIRA eta! (1992) 1 FAJARDO NOGUEIRA eta! (1992) 1 FAJARDO NOGUEIRA eta! (1992) ' FAJARDO NOGUEIRA eta! (1992) 1 FAJARDO NOGUEIRA eta! (1992) ' PENDURKAR, KULKARNI (1989) 2

110 1,00 PFLUG (1990) 2

1

para valores de z 7,8

"C

2

para valor de z niio definido.

3.5. Tipos de secadores.

Dos tipos de secadores tem-se dois grandes grupos: secadores diretos e indiretos.

Nos secadores diretos o calor se transfere pelo contato entre o solido Umido e um gas aquecido. 0 liquido vaporizado e carregado atraves do meio de secagem, ou seja, o gas aquecido. Os secadores diretos podem tambem ser chamados de secadores de convecc;ao. Como exemplo desse secador tem-se o secadorde leito estatico ou convencional, secador de tune!, de leito fluidizado e atomizadores. Nos secadores indiretos, o calor para secagem e transferido para 0 solido timido atraves de urna "parede" (suporte). 0 liquido

vaporizado

e

removido independentemente do meio de secagem. A velocidade de secagem depende do contato do material umido com a superffcie quente. Secadores indiretos tambem sao conhecidos como secadores de conduc;iio ou de contato, como exemplo tem-se os liofilizadores, PORTER (1984).

COUCH, ROSS (1980) baseando-se em patentes internacionais de produtos comerciais de Bt informam que a pasta de celulas pede ser seca em Ieite fixo com ar forc;ado a 40-50

oc,

em secador a vacuo, por atomiza<;iio ou liofilizac;iio.

3.5.1. Secador de leito estatico.

No secador de Ieite estatico, o material e aquecido principalmente por convecc;iio pelo ar circulante, a temperatura

e

controlada para o material niio se aquec;a acima da temperatura especificada. Esta temperatura pode ser fixada ligeiramente acima da temperatura de bulbo-umido, que raramente excede 70

oc.

Em geral sao secadores mais baratos. Este tipo de secador apresenta algumas desvantagens, KEEY (1975):

a. 0 ar exaurido e ainda quente o que causa uma baixa eficiencia termica.

b. Se o umidificante for urn solvente valioso, sua recuperac;iio no gas ventilado

e

dificil e cara.

c. 0 produto pede reagir com o oxigenio e outros gases em contato.

d. Com materiais pulverulentos, o ar circulante pede carregar as particulas finas, e em consequencia

e

perdida parte do material.

3.5.2. Atornizador ou "Spray dryer".

Quando usado para materiais biol6gicos, os atornizadores ou "spray dryers", na maioria das vezes operam com temperatura do gas de entrada em 250

oc

e o gas de sa!da com 100 "C. A secagem geralmente

e

instantanea e embora a temperatura do ar seja alta, o material seco nunca alcanqa essa temperatura. 0 processo

e

tao nipido que a desnaturaqiio

e

men or do que primeiramente se suporia, mas ha muitas vezes uma sensivel diferenqa entre a temperatura do ar que entra e sm bem como na raziio de alimentaqiio assim, urn bom ntimero de experimentos e necessaria para se alcanqar resultados confiaveis, SOLOMONS (1969).

3.5.3 Liofilizador

A liofilizaqao

e

uma das tecnicas mais comumente usadas para secagem de materiais termolabeis em laborat6rio. Muitos liofilizadores de laborat6rio tanto podem ser usados para produqiio de material em ampolas ou para secar maiores volumes dependendo da capacidade do equipamento, SOLOMONS (1969).

Segundo REY ( 1975), a liofilizaqiio

e

uma operaqiio multipla na qual o material para ser estabilizado necessita de :

a. congelamento a baixas temperaturas.

c. estocagem sob condi<;Oes controladas, livre de oxigenio, vapor d'figua, usualmente em embalagens opacas e a vacuo.

Entre os parametres envolvidos estao: temperatura maxima para a solidificac;ao completa, velocidade 6tima de resfriamento, ocorrencia de estabilidade do produto e temperatura minima do inicio do descongelamento.

3.6. Penetrac;ao de Calor.

HAY AKAW A (1970) cementa que exist em muitas f6nnulas na literatura para obten<;ao da temperatura num processo transiente. Estas f6nnulas sao classificadas em dois grupos: um baseado em f6mmlas te6ricas de transferencia de calor (Ballet al, 1957; Cham1, 1963; Cewell et al, 1961; Evans, 1958, Evans et al. 1954; Gillespy. 1953; Hayakawa et al, 1968, 1969 e Hieks, 1951) e outre baseado no uso de parametres experimentais como f e

j (Ball, 1923).

SPAGNOL et al (1989), apresentam numa revisao os significados dos fatores

f e j. 0 fator f quando obtido graficamente plotando tempo de secagem versus temperatura do produto, indica o tempo necessaria para que haja uma varia<;ao de 90% na temperatura no trecho linear da reta. No seu significado fisico, o fator f relaciona-se com as mudanc;as de temperatura do produto em relac;iio ao sistema extemo: parametro geometrico do produto, facilidade do produto annazenar calor, facilidade do produto em conduzir o calor e do coeficiente convective de transferencia de calor. 0 fator j, fator de atraso, e uma func;iio do

mimero de Biot, que esta relacionado o coeficiente convective, desde que o pariimetro geometrico e a condutividade termica do material sejam considerados constantes.

3.7. Difusividade tennica.

SINGH (1982), cementa que difusividade termica, a, e a relas:ao entre tres propriedades do material: condutividade tennica, densidade e calor especifico. 0 significado fisico de a e usado para detenninar quiio r:ipido o calor se propaga ou se difunde no material. 0 mesmo autor apresenta modelos, desenvolvidos por Riedel (1969) e Matens (1980), para predizer a difusividade tem1ica relacionando-a com o conteudo de agua.

MURR (1992) determina a difusividade efetiva atraves de metodo de regressiio nao linear ao modele difusional baseado na geometria irucial da amostra.

4.1. MATERIAL.

4.1.1. Microrganismo.

Bacillus rhuringiensis, var kursraki, HD1, proveniente do United States Department Agriculture, USDA, e mantido liofilizado no laborat6rio de Formulaqao e Fermentaq6es do CNPMA/EMBRAP A.

4.1.2. Equipamentos para secagem: 4.1.2.1. Secagem por atomizaqao:

Atomizador:

Marea: Buehl Laboratory Techniques LTD Modele: Buehl 190 (Fig 1)

!.Entrada de ar frio 2.Aquecimento 3.Entrada ar quente 4.Ciclone 5.Exaustiio 6.Medidor de temperatura de entrada 7.Medidor de temperatura de safda 8.Coletor

Figura 1. Esquema do atomizador.

4.1.2.2. Secagem convencional:

'

Secador:

Equipamento construfdo na Faculdade de Engenharia Agricola-UNICAMP. Esquema: Fig 2

Arnostrador:

Caixas de acrflico e vail de seda, com as seguintes dimensoes: 10,0 X 5,0 X 2,0 em, com tampa tipo gaveta, segundo a Fig 3.

@-- --

---,CC:

B AB

~

3 L---~£3~mL---~

1'

E

"

1

F "~

<'71

,.<:>)

/

A.Amostras B.Ventilador C.Soquetes para himpadas ou resistencias D.Tela de dispersiio E. Entrada de ar F. Safda de ar

Figura 2. Esquema de secador convencional

A t -' ' 10 c I _ -/ /

"~'

v ~

<

5 em ) Figura 3. Amostrador.

4.1.2.3. Liofilizador:

Equiparnento da Fundacrao Tropical de Pesquisas e Tecnologia "Andre Tosello"

4.1.3. Inerte:

Argila:

Marca: Sinter Mor Minera<;ao LIDA Tipo: Caolinita A-50

4.1.4. Outros equiparnentos: Agitador de tubos:

Marca: Scientific Industries Inc. Modelo: K-550-G, Vortex-Genie. Agitador rnagnetico:

Marca: Fisatorn Modele: 753 A Agitador incubador:

Marca:New Brunswick Scientific CO. INC. Modelo: G 25

Agitador pneurnatico: Marca: Coleparrner

Anemometro:

Marca: Airflow Developments

Molelo: Airflow LCA 600 , V K Patent n2 _2127972,

Autoclave:

Marca: Fabbe-Prilnar

Modelo: 103, autoclave vertical Balan<;as:

Marca: Mettler

Modelo: AE 160, quatro casas decimais.

Marca: Brinkmann Instruments Co Div of Sybrom Modelo: Sartorius universal, duas casas decimais Oimara de fluxo laminar:

Marca: Engelab

Tamanho: 1200 X 780 X 2280 mm Centrifuga:

Marca: Penwalt S.A. Ind. e Com.

Modelo: T 1 - serie 86 BT 1 1665, tipo Sharples. Contador de col6nias:

Marca: Phoenix Modelo: EC 550 Estufa:

Marca: Precision Scientific Group Modelo: 16

Fermentador: Microferm Fermentor, 14 1 Marca: New Brunswick CO. INC. Modelo: ME 214

Microscopios:

Marca: Carl Zeiss Jena Modelos: Jenaval e Jenamed2 Moinho:

Marca: Motor Brasil Modelo: Tipo Coloidal. Potenciometro:

Marca: Incibr.is Modelo: pH-1400

Pipeta automatica de precisiio: Marca: Gilson

Modelo: P-20, Pipetman P Ultra-som:

Marca: Thorton Inpec Eleteronic SA Serle: GR-GA

4.1.5. Reagentes para analise, composis:ao dos meios de cultura e vidraria.

4.2.1. Produs:ao de Bacillus thuringiensis.

0 material em estudo foi obtido atraves de f<'nnenta.;-ao submersa, realizada no laboratorio de Formula<;ii.o e Fennenta<;6es do CNP:MA/EMBRAPA, usando metodologia de MORAES (1976). 0 processo foi iniciado a partir de microrganismo liofilizado, que foi re-hidratado e inoculado em meio de manuten<;iio, composto de agar nutriente, em tubos de ensaio inclinados.

4.2.1.1. Pre-fennentas:ao.

Para a produs:ao de Bt, por fermenta<;iio submersa, e necessaria uma pre-fermentas:ao. Foram preparados cinco erlenmeyers (500 ml), com 100 ml de meio, com a seguinte composi<;iio:

4,7 gjl NaCl 5,0 gJl Glicose 2,0 gjl ' I ' ' .nptose 20,0 gjl pH= 7,3

0 meio de cultura foi esterilizado a 121 "C, 15 min e depois resfriado a 30"C.

Com uma al9a de platina, inoculou-se o Bt que estava em me10 de manuten9iio, em cada um dos erlenmeyers. Estes foram colocados em agitador a 150 rpm e temperatura de 30"C, por cerca de 16 horas.

Ap6s a contagem de celulas produzidas, com a camara de Newbauer, o material foi padronizado para 3,5*108 celulasfml e inoculado no fermentador.

4.2.1.2 Fermenta9iio.

A cuba de fermenta9iio com o meio, bern como todo o material a ser utilizado na fermentas:iio, foi esterilizado a 121°C, 15 min. Como meio de cultura utilizou-se a seguinte composiqiio:

Caldo Nutriente

K₂HP04

pH 7,3

28 g{l

1,75 g/1

As condi.y6es de fennenta.yao foram:

aerac;ao agitac;ao temperatura

vol. do fennentador vol. meio de fennentac;iio cone. eel. no inoculo vol. inoculoJvol. total

0,4 vvm 200 rpm 30°C 14 I 10 I 3,5*10' celfml 5%

0 tempo de fennentac;ao esteve proximo de 30 horas. 0 acompanhamento foi feito atraves do pH do meio, e microscopicamente atraves de laminas para observac;:ao de fonnac;ao de esporos.

2.4.2. Centrifugac;:ao.

Ap6s a fermentac;ao foi realizada a separac;:ao dos solidos do material fermentado atraves de centrifugac;ao

As condi<;6es para centrifuga<;iio do material fermentado foram:

vaziio rota<;ao

60 ml/min 24 000 rpm

A umidade do material ap6s a centrifuga<;iio esteve entre 78 e 84% e foi determinada pelo metoda de estufa a 60°C.

Poi centrifugada uma cuba de fermenta<;iio por vez, ou seja 10 I de material.

0 rendimento media foi de 8 g de massa umida por litro de caldo.

4.2.3. Preparo do material.

4.2.3.1. Preparo de material para secagem em atomizador.

0 material foi preparado com umidade de 80% Bu (base umida).

Composi<;ao do material: Bt argila solu<;ao de lactose 5% 0,6% 19,4% 80%

A argila escolhida como inerte foi a caulinita (argila de duplacamada) que estava disponivel no CNPMA. Esta ja havia demostrado boa compatibilidade, molhabilidade e suspensabilidade quando usada com material biol6gico, PEREIRA'

A solu<;ao de lactose foi usada para protecrao do material biol6gico, DULMAGE (1990).

Inicialmente misturou-se a solucrao de lactose com a argila que foi colocada por 20 min em urn moinho para diminui<;:iio do tamanho das particula da argila. Acrescentou-se entao o Bt, e o material ficou por mais 2 minutos no moinho.

0 material resultante foi colocado em bequer de 3 l, sob agita<;iio constante, para que niio houvesse decanta<;ao durante o processo de secagem no atomizador.

4.2.3.2. Preparo do material para secagem convencional.

0 material foi preparado em um bequer de 1 l com umidade aproximada de 50% Bu

Composis:ao do material:

Bt 1,5%

argila 48,5%

solucrao de lactose 5% 50%

PEREIRA, A.L. Comunica~ao pessoal. Laborat6rio de Formulayao e

Inicialmente foram misturados os componentes e entao foram colocados em agitador por 20 min, a 50 rpm.

Entao o material foi colocado nas caixas de acn1ico recobertas de tecido, previamente pesadas, para serem levadas ao secador convencional.

4.2.3.3. Preparo do material para secagem par liofiliza<;iio.

Foi entregue o material centrifugado com cerca de 80% de umidade

a

Funda<;iio Tropical de Pesquisa "Andre Tosello", para que fosse realizada a liofiliza<;i'io, confonne metodologia propria do laboratorio.

4.2.4. Secagem.

4.2.4.3. Secagem em atomizador.

As amostras foram secas nas seguintes condi<;oes do equipamento: posi<;iio

aspirador 17

bomba 9,8

fluxo dear 600 Nljh

As condi96es de temperatura variaram em: aquecimento 8 10 12 temp entrada ("C) 120 ± 2 150 ± 2 180 ± 2 temp saida (OC) 80 ± 2 104 ± 2 130 ± 2

A alimenta9ao do atomizador foi feita atraves de uma bomba peristaltica. Segundo esquema apresentado na Fig 4.

Ajustou-se a temperatura de ar de entrada , e secou-se cerca de 600 ml de material umido. Apos resfriamento do equipamento retirou-se a amostra seca que era acondicionada em recipientes de vidro. 0 coletor de material seco era substituido a cada montagem.

0 intervalo entre cada opera9ao nao foi maior que 15 min.

4.2.4.2. Secagem convencional.

Para ajuste da temperatura do ar no secador usou-se uma combina9ao de resistencias e lampadas. Cerca de 30 min antes de serem colocados os amostradores para secar, o secador era ligado e a temperatura estabilizada.

A.Material a ser seco B. Bomba peristaltica C.Material atomizado D.Entrada de agua fria E. Saida de agua quente F.Agulha G.Agitador

Figura 4. Sistema de alimenta<;iio do atomizador.

Os amostradores eram colocados sempre na seguinte ordem: a amostrador 1, amostrador 3 (para determina<;ao de viabilidade) e amostrador 2.

A cada tempo os amostradores 1 e 2 eram pesados e do amostrador 3 era retirada uma amostra para determina<;ao da viabilidade.

As amostras para determinat;:iio de viabilidade foram colocadas em vidro tipo penicilina, para posterior analise.

As pesagens eram feitas imediatamente ap6s retirada, em balant;:a eletr6nica com dois decimais.

A determinaqao da difusividade efetiva foi realizada utilizando va!ores medios obtidos das curvas de secagem, por metodologia de MURR (1992). Foram utilizados dois metodos para a determinaqao. No primeiro usou-se o termo adimensional (X-Xo), que considera a amostra completamente seca (Xe=O) e no segundo o tenno adimensional (X-Xe)/(Xo-Xe) que considera a umidade de equilibria.

4.2.3.3. Secagem por liofilizaqao.

Poi feita pela Dra. Dirce Mithico Yamaoka Yano, da Cole<;iio de Cultura Tropical, da Fundaqao Tropical de Pesquisas e Tecnologia "Andre Toselo", nas condi<;oes utilizadas para preservaqao de culturas.

4.2.4. Analise de Viabilidade.

As amostras coletadas para viabilidade foram preparadas por metodologia desenvolvida por RIOS2 •

As amostras foram pesadas e colocadas em tubos de vidro de diametro 2,0 em, acrescentando 5 ml de solu<;iio salina.

Os tubos contendo o material seco e solu<;ao salina eram colocados por 10

min no ultra-som, para que o p6 se dissolvesse na solu<;iio salina.

;:RIOS, E.M. Correspond@ncia pessoal. Universidade Federal de Pernambuco,

Para reativar os esporos, aplicou-se cheque terrnico, colocando os tubes em banho-maria a 80°C, por 10 mine depois em agua fria, ate que atingissem a temperatura ambiente.

Fizeram-se as dilui<;6es necessanas, para que fosse possivel a contagem de colonias vi!iveis.

Poi feito plaqueamento de superficie, usando meio de cultura nutriente agar 2%, sendo aplicados seis pontes com 20 111 de amostra em cada placa. Foram incubadas a temperatura de 25°C por 15 a 20 h. Foram realizadas tres leituras para cada amostra.

5.1. Atomizador.

5.1.1. Resultados das secagens.

A secagem feita em atomizador teve registradas as seguintes temperaturas:

temperatura de entrada 120 ± 2 150 ± 2 180 ± 2 temperatura de saida 80 ± 2 108±2 128 ± 2

Os resultados da secagem da Tabela 2 estao expresses em cev (mimero de col6nias obtidas de esporos viaveis) e N{No (viabilidade relativa, onde No

e

o numero inicial de col6nias e N o numero de col6nias ap6s a secagem).

Tabela 2. Resultados da secagem por atomizador.

amostra temperatura No (cev) N (cev) N{No (%)

entrada (0 C) 1 120 4650000 2620456,92 57,46 150 4650000 1554004,01 34,08 180 4650000 1058223,45 23,21 2 120 7311000 3057355,99 41,82 150 7311000 2220426,14 30,38 180 7311000 1867072,61 25,54 3 120 10200000 8172120,87 80,12 150 10200000 6309136,09 66,71 180 10200000 3063321,57 30,03 5.1.2. Analise estatistica.

Com base nos dados acima foi feito o teste estatistico com Delineamento de Blocos Casualizados, pois o numero de esporos inicial variou muito, uma vez que cada teste foi feito · a partir de uma fermentaS'iio. Foram usadas duas variaveis para analise: N (transformada em N/1000000) e log N. Houve diferenc;:a significativa entre bs blocos, e entre as temperaturas de secagem com coeficiente de variac;:ao de 30,993% para a varia vel N; e de 1,301% para a variavel log N.

0 Anexo 1 apresenta a amilise de variancias dos resultados do atomizador. 0 resumo do teste de medias para temperaturas se apresenta na Tabela 3.

Tabela 3. Teste de Tukey para medias de temperaturas, em atomizador. temperatura (OC) 120 150 N (cev/1000000) medias 4,616698 3,526220 5%* a a medias 6,604680 6,449324 log N 5%

*

a b 180 1,996168 b 6,258633 c

* Medias segUJdas por letras dJstintas d1terem entre st ao nivel de signiticancia indicado.

Poi usado o teste de Tukey.

5.1.3. Amilises termobacteriologicas.

Com os dados de secagem foram feitas as amilises termobacteriologicas do Bacillus thuringiensis, assim definidas as caracteristicas que podem ser usadas posteriormente para outras secagens. Na Fig 5 se apresenta a influencia das temperaturas na morte das bacterias.

5.1.3.1. Calculo do valor D.

Para o calculo do valor D, considerou-se que a amostra permaneceu em contato com o ar quente por 2 segundos, MICRONAL (Catalogo Tecnico), foi utilizada a declividade media das retas. Os resultados medics estao apresentados na Tabela 4, e nas Fig 6, 7, 8.

:€so

~-0 _z 30 20 10 120 150 Temperoluro ("C)

l

m

omostro 1 - omos!ro 2 ~ omoslro 3

Figura 5. Viabilidade comparativa, em secador do tipo atomizador.

Tabela 4. Valores medics de D, para atomizador.

temperatura ("C) 120 150 180 D medic (s) 9,49 5,88 3,43

z 6. 80

"'

.2 6. 70 6, 60 6,50 1 Tempo (s)

j---

omostro 1 - + - omoslra 2 - omos.tro 3

2

Figura 6. Curva de Sobreviventes, apos secagem em atomizador

a

temperatura de

120°C

5.1.3.2. Calculo de Z.

Com os valores de D foi construida a Fig 9, e por regressao tendo R2 _{de 0,9988,} tem-se o valor de Z que foi de 135,16

oc.

7, 00

r - -_____________________

J

6,90~ 6, 80 6, 70 z 0>6. 60 J! 6, 50 6, 40 6, 30 6, 20 6, 10+---~---~ 0 1 Tempo (s)

J---

omostro 1 - omoslra 2 ~ amostra 3

2

Figura 7. Curva de Sobreviventes, ap6s secagem em atomizador

a

temperatura de

150°C.

5.2. Secagem Convencional.

5.2. 1. Resultados das secagens.

Para a secagem convencional foram realizadas nove fermenta<;5es para obter a quantidade de Bt necessaria ao ensaio, uma vez que uma mesma fermenta<;iio foi insuficiente para as tres diferentes temperaturas de secagem.

As temperaturas utilizadas foram 50°C, 70"C e 90°C.

Para comparaqao das secagens foi usado o parii.metro NfNo, que se encontra na Tabela 5, e na Fig 10.

7, 10~---. 7, 00 6, 90 6,80 6, 70 z 6, 60 0> .Q 6, 50 6, 40 6, 30 6, 20 6, 10 6,00+---~ 0, 00 1, 00 Tempo (s)

1----

amoslro 1 --- omoslro 2 - omoslra 3

2,00

Figura 8. Curva de Sobreviventes, ap6s secagem em atomizador

a

temperatura de 180°C.

Tabela 5. Resultados da secagem convencional.

Temperatura ("C) No N NJNo (%) 50 1,59 E+9 8,4 E+8 53,14 9,01 E+7 1,08 E+7 11,96 4,15 E+8 1,44 E+8 34,66 70 2,00 E+7 2,35 E+6 11,85 9,09 E+7 3,29 E+7 36,18 1,71 E+8 1,21 E+8 70,74 90 3,15 E+8 1,29 E+5 0,04 1,59 E+8 3,89 E+3 0,00 7,55 E+7 1,11 E+5 0,15

1, 00 0,95 0, 90 0, 85 0, 80 0 Ut0, 75 .2 0, 70 0,65 0. 60 0,55 0, 50 120 130 140 150 160 170 Temperoluro (C)

Figura 9. Curva Fantasma de Morte Termica, para secagem em atomizador, nas

temperaturas de 120, 150 e 180°C. 80 70 60 50 ~ ~ 0 40 z

'

z 30 20 10 0 50 50 50 70 70 70 Temperatura ( C)

Figura 10. Viabilidade comparativa ap6s secagem convencional a 50, 70 e 90°C.

Foi usado o Delineamento de Blocos Casualizados. Foram comparados os blocos e tempos de secagem na mesma temperatura. A varia vel foi oN (cev/1000000) e log N. Um resumo da analise de varifmcia se encontra no Tabela 6, e a analise completa no Anexo 2, juntamente com os resultados das diversas secagens.

Tabela 6. Analise de Variancia.

tempera cau...-.as de S \('t:vj !OOOOOfl) log N

"'""'

vari:u;ii.o

("C) v;~Jor F pwb>F .-~r. valor F prob>P ('t;>e[

v:ui;ulil(l variao;iio 50 bloco 108.SS 0.00001 39.442% 61.26 0.00001 5.203% tempo 2.05 O.WJ63 _~· 2.ll 0.08528 _~· 70 bloco 631 0.00~45 77.P35'k 6.39 O,OOS09 5.75~'k tempo lAS 0.23763 ·~ !.<f) 0.1678 _·~ 90 bloco 4.16 {).031':.10 l2.\44U% 0.62 0.55505 _·~ 9,394% tempo 4.30 0.0(1438 15.59 0,00001 '

s-sigrubcatJvo ns-niio sigmhcallvo

Nas tabelas 7, 8 e 9 encontra-se um resumo do teste de medias feito a partir dos dados experimentais para viabilidade em fun9iio do tempo de secagem.

Tabela 7. Teste de Tukey para medias de tempo

a

temperatura de 50°C.

tempo N (cev/1000000) log N

(h) medias 5% medias 5% 0 698,336657 a 8,590000 a 1 587,329992 a 8,450000 a 3 542,546646 a 7,923333 a 5,5 676,083341 a 8,503333 a 8,5 408,309992 a 8,230000 a 11 316,653328 a 7,766667 a 13,5 316,476662 a 7,590000 a 16,5 382,460000 a 7,686667 a 19,5 354,736659 a 8,066667 a 22,5 333,170004 a 8,040000 a

Medias segmdas por letras d1stmtas diferem entre si ao nivel de sigmhcimcJa md1cado.

Tabela 8. Teste de Tukey para medias de tempo

a

temperatura de 70"C.

tempo N (cev/1000000) log N

(h) media 5% media 5% 0 93,899998 a 7,830000 a 1 63,363333 a 7,740000 a 3 106,706665 a 7,943333 a 5,5 42,239999 a 7,550000 a 8,5 75,153333 a 7,706667 a 11 25,620000 a 7,353333 a 13,5 24,960000 a 7,333333 a 16,5 22,273333 a 7,310000 a 19,5 40,800000 a 6,853333 a 22,5 52,076667 a 7,323333 a

Tabela 9. Teste de Tukey para medias de tempo

a

temperatura de 90°C.

tempo N (esporos/1000000) log N

(h) medias 5% medias 5% 0 183,230001 a 8,193333 a 1 108,583331 ab 8,003333 a 3 72,353333 ab 7,296667 ab 5,5 26,483334 b 7,023333 ab 8,5 14,873333 b 7,003333 ab 11 5,616667 b 6,666667 abc 13,5 0,893333 b 5,936667 bed 16,5 0,206667 b 4,993333 cd 19,5 0,036667 b 4,390000 d 22,5 0,080333 b 4,583333 d

Como pode ser observado atraves das analises de variii.ncias apenas o tratamento com temperatura de 90°C causou reduc;ao significativa no mimero de esporos viaveis, no tempo ensaiado.

5.2.3. Analise termobacteriol6gica.

Na Fig 11 e Tabela 7 observa-se que niio houve reduqiio da viabilidade do Bt, ate 22,5 horas de secagem a temperatura de 50 "C.

Na Fig 12 e Tabela 8, relativas a secagem a 70 "C, durante 22,5 horas, o mesmo fato pode ser observado, isto

e,

nao houve decn!scimo na viabilidade do Bt.

Na Fig 13 e Tabela 9, relativas a secagem a 90 "C, apresentam reduqiio de viabilidade do Bt a partir de 5,5 horas quando analizada a variavel transformada N e a partir de 13,5 horas para a variavel Jog N.

5.2.3.1. Calculo do valor D.

5.2.3.1.1. Calculo do valor D a 50°C.

regressiio = 8,352099 - 0,0264785*tempo R2 = 34,77%

9, 50

•

•

•

9, 00

_•

_•

•

•

_•

_•

' '"l

"

"

"'

z 8, 00 :

...

"

"

"

"

"'7, 50 " .Q ₊ + 7,{}0 + 6, 50 + + + 6, 00 + 5,50 0 5 10 15 20 25 Tempo (h)

•

1 + ₂

"

3

Figura 11. Curva de sobreviventes,

a

50oC em secador convencional.

8, 50 + 8,00

•

"

"

"

"

,.

7, 50

_"

•

_"

+ + + + 7, 00

•

+ z ,s, 50 .Q

•

_•

6, 00

_•

5, 50 5, 00

•

_•

•

4, 50 0 5 10 15 20 25 Tempo (h)

•

1 + 2

_"

3

8, 50

•

•

8,00 +

•

7, 50

_"'

_"

7, 00

"

+

_•

il 6, 50 + z

_"

_"

.,6, 00 + .2 li + 5, 50 5, 00

,.

"

!II 4. 50

•

ii 4,00 3, 50 + 0 5 10 15 20 25 Tempo (h)

I

•

1 + ₂

"

3

Figura 13. Curva de sobreviventes,

a

90°C em secador convencional.

5.2.3.1.2. Oilculo do valor D a 70°C. regressao = 7,847931 - 0,0350096*tempo R2 _{= 72,08%} D = 28,56 horas 5.2.3.1.3. Calculo do valor D a 90°C. regressao = 8,132425- 0,1706361 *tempo R2 = 95,25% D = 5,86 horas

5.2.3.2. Calculo do valor z.

Para o estimativa do valor de z sao usados os valores D experimentais, porem como nas regressiies a 50 e 70

•c

o R2

, nao foi maior que 93%, este valor nao pode ser estimado.

5.2.4. Curva de secagem.

Com os dados experimentais foram obtidas as curvas de umidade do produto contra o tempo de secagem. Essas curvas podem ser observadas nas Fig 14, 15 e 16, as quais apresentam o comportamento esperado.

50 50 ~40 ~

•

'8 30

"

.E " 20 10 0 0

•

~

•

;I; 5

•

..

•

*

!I 10 15 20 25 Tempo (h)

60 50

"

~40

*

~ -8 30

_"'

0

,

. E

..

₊ ;:) 20 10 0 0

"

•

+ 5

•

+

"

"'

"

10 15 20 25 Tempo (h)

Figura 15. Curva de umidade do produto durante secagem convencional

a

70°C.

60 50 ~40 Ill >;{ ~

•

+ "8 30

~

,.

;:) 20 _!I! 10

,.

"'

0 0 5 10 15 20 25 Tempo (h)

Figura 16. Curva de umidade do produto durante secagem convencional

a

90°C.

Para o calculo de h foram usadas as eq~6es 1, 2 e 3 citadas por McADAMS,1954. X • p' • g • (3 ;<' Para 109 :<::; X :<::; 1012 tem-se: Para 109 :<::; X :<::; 104 tem-se: *L\t ) • ( (2) (3)

As propriedades do ar seco (a pressao de 1 atm), GASPARETT03

, sao encontrados

na Tabela 10.

Tabela 10. Propriedades do ar seco (a pressao de 1 atm), nas temperaturas

de 50, 70 e 90 °C. Temp p c, k J.I*H/3 13*103 ("C) Kg/m3 _{KcalfKg*oC Kcalfm*h*oC} Kg/m*s 1/"C 50 1,0931 0,2405 0,0239 19,5805 3,10 70 1,0297 0,241 0,0251 20,483 2,92 90 0,9728 0,241 0,02635 21,3755 2,76

Os valores de X e de h para cada temperatura encontram-se na Tabela 11.

Tabela 11. Valores de X e h. Temperatura X h (OC) _(Kcalfh*m2_*0C) 50 58297,64 5,765 70 80002,33 6,693 90 88986,84 7,329

l GASPARETTO, C.A. r ... nota<;Oes de aula. Disciplina de FenOmenos de

5.2.4.2. Calculo dos parametros j e f.

Para o calculo dos parametros j e f foi levada em considera<yiio a quantidade de agua e de argila que havia no produto em cada tempo de secagem. Portanto houve necessidade de obter as propriedades da agua e da argila. Na Tabela 12 encontram-se os valores utilizados.

Tabela 12. Propriedades da agua e da argila em diferentes temperaturas.

Temperatura a k (Kca]*mfh*m2 *"C) "C 50 70 agua(m2

_/h)

1 argila(m2/s)2 0,559 0,18*10'6 0,580 0,18*10'6 90 0,599 1 LILEY et al,1984. 2 BERA et all, 1987 agua1 argila 1 0,0432 0,00916 0,0439 0,00958 0,0447 0,00100

Essas propriedades foram utilizadas para 0 calculo de N Bi• Com 0 valor de N Bi , podem ser estimados os valores de j e f atraves das curvas apresentadas em Pflug et a] apud YOKOY A, HAY AKAWA (1972), anexo 3, os valores encontrados estiio nas Tabelas 13, 14 e 15.

Tabela 13. Valores de j e f, em cada tempo de secagem

a

temperatura de

sooc.

tempo umidade Ns; j f (h) (%) (h) 0 54,08 0,1746 1,01 1,7120 1 44,53 0,1973 1,02 1,6539 3 31,97 0,2368 1,02 1,5658 5,5 21,24 0,2862 1,02 1,4620 8,5 13,28 0,3406 1,03 1,3732 11 8,24 0,3902 1,03 1,2907 13,5 4,93 0,44339 1,03 1,2206 16,5 2,41 0,4757 1,04 1,1554 19,5 1,11 0,5018 1,04 1,1152 22,5 0,73 0,5120 1,04 1,0996

Tabela 14. Valores de j e f, em cada tempo de secagem

a

temperatura de 70°C.

tempo umidade Na, j f

(h) (%) (h) 0 53,53 0,1989 1,03 1,6429 1 38,44 0,2414 1,03 1,5531 3 24,98 0,3043 1,04 1,4366 5,5 13,86 0,3906 1,04 1,2923 8,5 5,30 0,4896 1,05 1,1372 11 1,87 0,5414 1,05 1,0586 13,5 0,88 0,5580 1,06 1,0336 16,5 0,83 0,5589 1,06 1,0323 19,5 0,81 0,5596 1,06 1,0312 22,5 0,80 0,5596 1,06 1,0312

Tabela 15. Valores de j e f, em cada tempo de secagem

a

temperatura de 90°C. tempo umidade Nm j f (h) (%) (h) 0 52,67 0,2161 1,02 1,6063 1 37,02 0,2674 1,03 1,4281 3 19,97 0,3608 1,03 1,3311 5,5 8,44 0,4723 1,04 1,2419 8,5 2,10 0,5692 1,04 1,1587 11 0,14 0,6076 1,04 1,0798 13,5 0,05 0,6095 1,05 1,0026 16,5 0,03 0,6099 1,05 0,9255 19,5 0,01 0,6103 1,06 0,8483 22,5 0,00 0,6106 1,06 0,7712

Para a construqao da curva de penetraqiio de calor, foi necessaria calcular a variaqao da temperatura do produto com o tempo, para isso utilizou-se a equaqao 4 ,

apresentada par SPAGNOL et al, 1989.

Substituindo-se os valores na equac;ao 4, tem-se os perfis de temperaturas, que se encontram na Tabela 16 e Fig 17.

Tabela 16. Perfil de temperaturas em secagem convencional.

tempo T=50°C T=70'C T=90'C (h)

('C)

('C)

('C)

0 25,00 25,00 25,00 1 36,13 45,65 56,92 3 46,02 63,73 82,42 5,5 49,20 69,06 88,95 8,5 49,90 69,93 89,92 11 49,98 69,99 89,99 13,5 50,00 70,00 90,00 16,5 50,00 70,00 90,00 19,5 50,00 70,00 90,00 22,5 50,00 70,00 90,00

5.2.5. Penetra<;iio de calor e viabilidade de esporos durante a secagem.

Cruzando as informac;6es obtidas com a analise termobacterio16gica e a penetrac;ao de calor, tem-se as Fig 18, 19 e 20.

Observa-se que a 50°C nao se apresenta tendencia de reduc;ao de viabilidade dos esporos o que

e

confirmado pelo valor D a esta temperatura que foi de 37,77 h.

Para a temperatura de secagem a 70°C, tambem niio foi notado o declinio da viabilidade dos esporos e o valor D foi de 28,56 h.

100 90 80 U' 70

f;

0 60 c

,

50 0 _c

•

_"- 40 E • 30 ,_ 20 10 0 0 5 10 15 20 25 Tempo (h) 1-so -7o so 1

Figura 17. Curvas de penetra9iio de calor em secagem convencional as temperaturas

de 50, 70 e 90°C.

Porem, para a temperatura de secagem a 90"C, pode ser notado a diminui<;iio de col6nias de esporos viaveis, confirmado pelo valor D

encontrado de 5,86 h.

5.2.6. Calculo da difusividade efetiva.

Utilizando valores medios das curvas de secagem a 50, 70 e 90

oc,

foi aplicado o metoda de regressiio niio linear ao modelo difusional baseado na geometria inicial da amostra. 0 melhor ajuste foi obtido com sete termos da serie, cujos valores de desvio padrao assint6tico (DPA) foram os mais baixos.

100 9,5 0 0 90 0 0 _{9, 0} 0 0 0 0 0 80

"'

"

8, 5

u

70

"

,.

,.

_"

_"

_"'

_{8, 0} 0 60 + +

-

"

z .i! ₀ 50 7, 5

f

0>

-

+ S! ~ 40 + + _{7, 0} ~ 30 + 6, 5 20 ₊ + 10 + 6, 0 0 5, 5 0 5 10 15 20 25 Tempo (h)

I

+ 1

_"'

2 0 ₃

Figura 18. Penetraqiio de calor e log do numero de colonias de esporos viaveis durante

secagem

a

50°C.

Para o termo adimensional (X-Xo), que considera a amostra completamente seca (Xe=O), os resultados obtidos foram:

Temperatura difusividade DPA erro

oc

(1011 _m2_{/s) %}

50 1,5747 3,6482 231,68

70 4,5685 6,6675 145,95

100 8, 5 90 + D 80 D 0 0 0 8, 0 D

<>

70

r

•

•

•

•

•

•

"

_"

60

"

_"

7, 5 0 c _z

,

50 + 0 D 0 0 0> + ₊ .Q c ₊

•

40 7, 0 0. E

•

30 >-20 6, 5 + 10

_"

+ 0 6,0 0 5 10 15 20 25 Tempo (h)

I

+ 1 ~ ₂ D 3

Figura 19.Penetra9iio de calor e log do numero de col6nias de esporos viaveis durante

secagem

a

70'C.

Para o tenno adimensional (X-Xe)/(Xo-Xe) que considera a umidade de equihbrio, os resultados obtidos foram:

temperatura difusividade DPA erro

'C

(1011 _m2_{/s) %}

50 1,9022 4,1565 218,51

70 5,1549 7,4690 144,89