Comportamento de linhagens industriais de Saccharomyces frente a compostos inibitorios presentes no melaço de cana-de-açucar na produção de bioetanol

(1)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO

DEPARTAMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS

COMPORTAMENTO DE LINHAGENS INDUSTRIAIS DE

SACCHAROMYCES FRENTE A COMPOSTOS INIBITÓRIOS

PRESENTES NO MELAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR NA PRODUÇÃO

DE BIOETANOL.

Autora: Gisele Mantei Tosetto

Orientador: Dr. Silvio Roberto Andrietta

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia Química como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Engenharia Química.

Campinas – São Paulo Julho/2008

(2)

ii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

T639c

Tosetto, Gisele Mantei

Comportamento de linhagens industriais de

Saccharomyces frente a compostos inibitórios presentes no melaço de cana-de-açúcar na produção de bioetanol / Gisele Mantei Tosetto.--Campinas, SP: [s.n.], 2008. Orientador: Silvio Roberto Andrietta.

Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química. 1. Fermentação alcóolica. 2. Leveduras. 3. Compostos orgânicos. 4. Inibição. 5. Melaço. 6. Cinética. I. Andrietta, Silvio Roberto. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia

Química. III. Título.

Título em Inglês: Behavior of industrial strains of Saccharomyces front inhibitory compounds presents in sugarcane Molasses in the production of bioethanol.

Palavras-chave em Inglês: Alcoholic fermentation, Kinetics, Industrial substract, Organic compounds, Inhibition, Yeast.

Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos. Titulação: Doutor em Engenharia Química

Banca examinadora: Daniel Ibraim Pires Atala, Marco Antônio de Castro e Souza, Francisco Maugeri Filho e Cláudia Steckelberg.

Data da defesa: 11/07/2008

(3)

Este exemplar corresponde à versão final da Tese de Doutorado em Engenharia Química.

~

Dr. Silvio Roberto Andrietta Orientador

(4)

Tesede Doutorado defendida por Gisele Mantei Tosetto e aprovada em 11 de julho de

2008 pela banca examinadora constituída pelos doutores:

--"

Prof. Dr. - Silvio Roberto Andrietta

~

Dr. Daniel Ibraim Pires Atala

~~~

!k

Dra. Claudia Steckelberg

(5)

vii

Dedico este trabalho ao meu irmão

Aníbal C.M. Tosetto (in Memorian),

(6)

ix AGRADECIMENTOS

• Agradeço a Deus, pela vida ofertada.

• Aos meus pais Aníbal e Alice, que me deram todo o apoio necessário.

• Ao meu irmão Jean e à minha sobrinha Sarah, pelos momentos de descontração.

• Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Silvio Roberto Andrietta, pela sua orientação e amizade.

• À FAPESP pelo apoio financeiro através de bolsa de estudo e reserva técnica.

• A toda minha família e amigos, que sempre me deram forças nos momentos de desânimo.

• À Graça, pela contribuição ofertada a este trabalho.

• Aos amigos inesquecíveis da Divisão de Biotecnologia e Processos/CPQBA: Milene, Klauss, Érika, Raquel e Claudia, pelo bom ambiente de trabalho.

(7)

xi "Hoje levantei cedo pensando no que tenho a fazer antes que o relógio marque meia noite. É minha função escolher que tipo de dia vou ter hoje.

Posso reclamar porque está chovendo ou agradecer às águas por lavarem a poluição. Posso ficar triste por não ter dinheiro ou me sentir encorajado para administrar minhas finanças, evitando o desperdício. Posso reclamar sobre minha saúde ou dar graças por estar vivo. Posso me queixar dos meus pais por não terem me dado tudo o que eu queria ou posso ser grato por ter nascido. Posso reclamar por ter que ir trabalhar ou agradecer por ter trabalho. Posso sentir tédio com o trabalho doméstico ou agradecer a Deus por ter um teto para morar. Posso lamentar decepções com amigos ou me entusiasmar com a possibilidade de fazer novas amizades. Se as coisas não saíram como planejei posso ficar feliz por ter hoje para recomeçar.

O dia está na minha frente esperando para ser o que eu quiser. E aqui estou eu, o escultor que pode dar forma.

Tudo depende só de mim."

(8)

Sumário xiii

UWOıTKQ"

PQOGPENAVWTA00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 zzk TGUWOQ000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 zzkkk ADUVTAEV000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 zzx" EAR¯VWNQ"K"/""KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3 30 LWUVKHKEAVKXA"FQ"VTADANJQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5 40 JKUVłTKEQ"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"PQ"DTAUKN 00000000000000000000000 7 50 PQXQ"EKENQ"FQ"RTQıNEQQN 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 60 RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 : 4.1 Processo Batelada ... 8

4.2 Processo Batelada Alimentada ... 9

4.3 Processo Contínuo... 10 70 DKQSW¯OKEA"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA 0000000000000000000000000000000000000000 32 80 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 34" EAR¯VWNQ"KK"/"EQORQUKÑ’Q"FG"OGNAÑQU"KPFWUVTKAKU 0000000000000000000000000000 37 QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39 30 KPVTQFWÑ’Q 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39 1.1 Efeito da matéria prima sobre as leveduras... 17

1.2 Tratamentos de melaços... 18

1.3 Efeito dos meios que contém mais de um substrato... 20

1.4 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ... 21

1.4.1 Compostos Fenólicos ... 21

1.4.2 Efeito dos compostos fenólicos sobre microrganismos ... 22

1.4.2.1 Mecanismo de ação dos compostos fenólicos... 22

1.4.2.2 Ação dos compostos fenólicos sobre leveduras ... 23

1.4.3 Técnicas de determinação de compostos fenólicos... 23

1.4.4 Compostos Fenólicos encontrados na cana-de-açúcar ... 24

1.4.5 Ácidos orgânicos presentes no melaço ... 26

40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 49 2.1 Méis analisados ... 27

2.2 Compostos Analisados ... 28

2.3 Determinação da Concentração dos Compostos Fenólicos e àcidos orgânicos presentes nos Méis ... 28

(9)

Sumário

xiv 50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 4;

3.1 Compostos Identificados... 29

3.2 Concentrações dos Compostos Encontrados nos Méis... 30

60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 53 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 54" EAR¯VWNQ"KKK"/"AXANKAÑ’Q"FG"FGUGORGPJQ"FG"FKHGTGPVGU"EGRAU" EQOGTEKAKU"FG"Uceejctqo{egu"GO"EQPFKÑ÷GU"FG"GUVTGUUG 00000000000000 59 QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5; 30 KPVTQFWÑ’Q 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5; 40 Rncpglcogpvq"Hcvqtkcn"Eqorngvq 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 63 50 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 64 3.1 Cepas Utilizadas ... 42 3.2 Obtenção do Inóculo ... 42

3.3 Meio Utilizado para a Fermentação ... 42

3.4 Condições dos Ensaios Fermentativos ... 43

3.5 Condução dos Testes ... 45

3.6 Métodos Analíticos... 45

3.6.1 Determinação da Massa Celular Produzida... 45

3.6.2 Determinação do Etanol Produzido (Método Colorimétrico) ... 45

3.6.3 Determinação de ART (Método Colorimétrico) ... 46

3.6.4 Tratamento Estatístico ... 46 60 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 68 4.1 Consumo de ART... 46 4.2 Rendimento em Etanol... 52 4.3 Rendimento Celular ... 54 4.4 Produtividade ... 59 70 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 87 80 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 88" EAR¯VWNQ"KX"/"AXANKAÑ’Q"FQ"GHGKVQ"FQU"EQORQUVQU"QTIÛPKEQU" FGVGEVAFQU"PQ"OGNAÑQ"UQDTG"AU"EGRAU"UA3"G"[;260 000000000000000000000000 8; QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 93 30 KPVTQFWÑ’Q 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 93 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 95 2.1 Cepas Utilizadas ... 73 2.2 Compostos Utilizados ... 73 2.3 Meio de Cultivo ... 74

(10)

Sumário

xv

2.4 Obtenção do Inóculo ... 75

2.5 Execução dos Ensaios... 75

50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 98 3.1 Influência do Ácido Gálico... 77

3.2 Influência do Ácido Cafeico... 78

3.3 Influência do Ácido Vanílico ... 80

3.4 Influência do Ácido Lático ... 81

3.5 Influência do Ácido Siríngico ... 83

3.6 Influência do Ácido Pirúvico ... 85

3.7 Influência do Ácido Acético ... 86

3.8 Influência do Ácido Butírico... 88

3.9 Influência do Ácido Fórmico... 89

3.10 Influência do HMF ... 91 60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;4 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;5" EAR¯VWNQ"X"/"AXANKAÑ’Q"FQ"GHGKVQ"AEWOWNAVKXQ"FG"ANIWOAU" UWDUVÛPEKAU"QTIÛPKEAU"UQDTG"AU"EGRAU"UA3"G"[;26 000000000000000000000000 ;7 QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9 30 KPVTQFWÑ’Q 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;: 2.1 Cepas Utilizadas ... 98 2.2 Compostos Utilizados ... 98 2.3 Meio de Cultivo ... 98 2.4 Obtenção do Inóculo ... 99

(11)

Sumário

xvi 50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 323

3.1 Rendimento em Etanol (YP/S) ... 101

3.2 Rendimento em Células (YX/S) ... 107

3.3 Viabilidade ... 113 3.4 Produtividade ... 119 3.5 Consumo ART ... 125 60 EQPENWU’Q 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 353 70 DKDNKQITAHKA 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 355" EAR¯VWNQ"XK"/"AXANKAÑ’Q"FQU"GHGKVQU"FQU"ıEKFQU"NıVKEQ"G"HłTOKEQ" UQDTG"Q"EQORQTVAOGPVQ"EKPÖVKEQ"FAU"EGRAU"UA3"G"[;260 00000000000 357 QDLGVKXQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 359 30 KPVTQFWÑ’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 359 1.1 Cinética dos Processos Fermentativos ... 137

1.1.1 Modelos Cinéticos... 137 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 364 2.1 Compostos Utilizados ... 142 2.2 Meio de Cultivo ... 142 2.3 Obtenção do Inóculo ... 142 2.4 Descrição do Reator ... 143

2.6 Preparo das Amostras ... 144

2.7 Ajustes dos Parâmetros ... 144

50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 367 3.1 Ajustes de Parâmetros Cinéticos Utilizando a Cepa SA1 ... 146

3.2 Ajustes de Parâmetros Cinéticos Utilizando a Cepa Y904... 149 60 EQPENWU’Q 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 374 70 DKDNKQITAHKA 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 374"

EAR¯VWNQ"XKK"/"EQPENWU÷GU"IGTAKU0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 377 QDLGVKXQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 379"

(12)

Sumário xvii APGZQ"A 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 37; 30 Rcftçq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 383 40 Anxqtcfc000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 385 50 Dgpcneqqn 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 387 60 Eqtqn000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 389 70 Etguekwocn00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 38; 80 Etw|"Anvc 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 393 90 Gswkrcx 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 395 :0 Guvkxc00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 397 ;0 Iqkcuc 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 399 320 Iwctcpk00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39; 330 Octcecî00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:4" APGZQ"D 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:7 30 TGPFKOGPVQ"GO"GVAPQN"*[R1U+ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:9 1.1 BG1... 187 1.2 CL1 ... 189 1.3 SA1 ... 190 1.4 Y904... 192 40 TGPFKOGPVQ"EGNWNAT"*[Z1U+ 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3;5 2.1 BG1... 193 2.2 CL1 ... 195 2.3 SA1 ... 196 2.4 Y904... 198 50 EqpUWOQ"FG"ATV 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3;; 3.1 BG1... 199 3.2 CL1 ... 201 3.3 SA1 ... 202 3.4 Y904... 203 60 Rtqfwvkxkfcfg 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 427 4.1 BG1... 205 4.2 CL1 ... 206 4.3 SA1 ... 207 4.4 Y904... 209 APGZQ"E 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 433 30 ıekfq"Iânkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 435 1.1 Yxs ... 214

(13)

Sumário xviii 1.2 Yps... 214 1.3 Produtividade ... 215 1.4 Conversão... 215 40 ıekfq"Echgkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 438 2.1 YX/S... 217 2.2 yps ... 217 2.3 Produtividade ... 218 2.4 Conversão... 218 50 ıekfq"Xcpînkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 43; 3.1 Yxs ... 219 3.2 Yps... 220 3.3 Produtividade ... 221 3.4 Conversão... 221 60 ıekfq"Nâvkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 444 4.1 Yxs ... 223 4.2 Yps... 223 4.3 Produtividade ... 224 4.4 Conversão... 224 70 ıekfq"Uktîpikeq0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 447 5.1 YX/S... 226 5.2 yps ... 226 5.3 Produtividade ... 227 5.4 Conversão... 227 80 ıekfq"Rktûxkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 44: 6.1 Yxs ... 229 6.2 Yps... 229 6.3 Produtividade ... 230 6.4 Conversão... 230 90 ıekfq"Aeêvkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 453 7.1 Yxs ... 232 7.2 Yps... 232 7.3 Produtividade ... 233 7.4 Conversão... 233 :0 ıekfq"Dwvîtkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 456 8.1 Yxs ... 235

(14)

Sumário xix 8.2 Yps... 235 8.3 Produtividade ... 236 8.4 Conversão... 236 ;0 ıekfq"Hôtokeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 459 9.1 Yxs ... 238 9.2 Yps... 238 9.3 Produtividade ... 239 9.4 Conversão... 239 320 ıekfq"JOH 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 462 10.1 Yxs ... 241 10.2 Yps... 241 10.3 Produtividade ... 242 10.4 Conversão... 242 APGZQ"F 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 465 30 ıekfq"Aeêvkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 467 1.1 SA1 ... 245 1.2 Y904... 245 40 ıekfq"Dwvîtkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 468 2.1 SA1 ... 246 2.2 Y904... 246 50 ıekfq"Iânkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 469 3.1 SA1 ... 247 3.2 Y904... 247 60 ıekfq"Nâvkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 46: 4.1 SA1 ... 248 4.2 Y904... 248 70 ıekfq"Hôtokeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 46; 5.1 SA1 ... 249 5.2 Y904... 249 80 JOH 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 472 6.1 SA1 ... 250 6.2 Y904... 250

(15)

Sumário

xx APGZQ"G 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 473 30 Egrc"UA3 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 475 40 Egrc"[;26 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 476

(16)

xxi

PQOGPENAVWTA"

Kd Constante global de morte celular KI Constante de inibição pelo substrato

KP Constante de morte celular devido à concentração de produto KS Constante de saturação do Substrato

K2 Constante empírica K3 Constante empírica

m Expoente da equação de inibição pela biomassa n Expoente da equação de inibição pelo produto P Concentração de etanol

Pmáx Máxima concentração de etanol na qual cessa o crescimento rx Taxa de produção celular

S Concentração de substrato X Concentração de biomassa

Xmáx Máxima concentração de biomassa na qual cessa o crescimento celular

Xv Concentração de células viáveis Xd Concentração de células mortas Xt Concentração de células totais YP/S Rendimento do processo (etanol)

YX/S Taxa de conversão de substrato por concentração de microrganismo "

" "

(17)

xxii Ngvtcu"Itgicu"

µ Velocidade específica de crescimento celular

µmáx Velocidade específica máxima de crescimento celular

µmáx,i Velocidade específica máxima de crescimento celular na presença de produto

µ0 Velocidade específica de crescimento celular aparente ν Velocidade específica de obtenção de produto

(18)

xxiii TGUWOQ"

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar os efeitos de algumas substâncias orgânicas presentes no melaço de cana-de-açúcar sobre cepas de leveduras de uso industrial. O Capítulo I refere-se a uma breve introdução e histórico da fermentação alcoólica. No Capítulo II, foi analisado amostras de melaços industriais, provenientes de 10 unidades produtoras de açúcar e álcool, localizadas nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Goiás e Paraná, com a finalidade de determinar e quantificar alguns compostos orgânicos presentes no mesmo. Para tanto foi utilizada a técnica de Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE). No Capítulo III foram realizados ensaios para escolher as cepas de melhor desempenho em condições de estresse, utilizando-se o planejamento fatorial 23 tipo estrela com triplicata no ponto central. Os fatores estudados foram: a pressão osmótica (utilizando KCl), temperatura e concentração inicial de Álcool. As cepas Y904 e SA1 foram as que mais se destacaram. No Capítulo IV foram avaliados os efeitos dos compostos orgânicos (ácidos cafeico, gálico, lático, pirúvico, siríngico, vanílico, acético, fórmico, butírico e Hidroximetilfurfural) sobre as cepas SA1 e Y904, através de fermentações em triplicata, utilizando meio sintético controle e variando as concentrações de cada composto. Dentro das concentrações estudadas, apenas os ácidos gálico, lático, acético, fórmico, butírico e Hidroximetilfurfural demonstraram influência sobre as cepas. A avaliação do efeito acumulativo das substâncias quando se trabalha com reciclo de células está descrita no Capítulo V. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos por oito vezes consecutivas (8 ciclos). O ácido lático foi a substância que mais interferiu no rendimento em etanol (YP/S) e na

produtividade, parâmetros estes de maior importância nos processos industriais para produção de álcool. Por outro lado, o ácido fórmico apresentou a menor interferência e efeito negativo para praticamente todos os parâmetros estudados. Finalmente no Capítulo VI, foram analisados os efeitos dos ácidos lático e fórmico sobre o comportamento cinético das cepas SA1 e Y904. Os testes foram realizados em biorreator de bancada, por dez horas de fermentação. O ácido lático aumentou tanto a inibição pelo substrato como pelo produto, mostrando-se ser uma substância com alto grau de toxicidade para as células de leveduras das linhagens estudadas. "

RANAXTAU/EJAXGU" ⁄ fermentação alcoólica, cinética, substratos industriais, compostos orgânicos, inibição, levedura.

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xxv ADUVTAEV"

The general objective of this project was the evaluation of the effects of some organic substances present in molasses, sugar cane on strains of yeast for industrial use. Chapter I refer to a brief introduction and history of alcoholic fermentation. In Chapter II, samples of industrial molasses were examined, from 10 units producing sugar, located in the states of São Paulo, Minas Gerais, Goiás, and Paraná, in order to determine and quantify some organic compounds present in them. In order to this, the technique for High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used. In Chapter III trials were conducted to choose the strains of better performance in terms of stress, using a 23 factorial planning star type with triplicate in central point. The studied factors were: the osmotic pressure (using KCl), temperature and initial concentration of alcohol. The strains Y904 and SA1 were those which stressed most. In Chapter IV were assessed the effects of organic compounds (caffeic, gallic, lactic, pyruvic, syringic, vanillic, acetic, formic, butyric and Hidroximetilfurfural acids) on the strains SA1 and Y904 by the fermentation in triplicate, using synthetic medium and control varying concentrations of each compound. Within the concentrations studied, only the gallic acid, lactic acid, acetic acid, formic, butyric and Hidroximetilfurfural demonstrated influence on the strains. The assessment of the cumulative effect of the substances when working with recycle cell is described in Chapter V. All experiments were performed in triplicate and repeated by eight consecutive times (8 cycles). The lactic acid is the substance that interfere most in income in ethanol (YP/S) and productivity,

these parameters of most importance in industrial processes to produce alcohol. Moreover, the formic acid showed the smallest negative interference for almost all parameters studied. Finally in Chapter VI, were analyzed the effects of lactic acid and formic on the behavior of kinetic strains SA1 and Y904. The tests were performed in bench bioreactor for ten hours of fermentation. The lactic acid increased by inhibiting both the substrate and the product, showing to be a substance with a high degree of toxicity to the strains of yeast cells studied.

MG[" YQTFU" ⁄" alcoholic fermentation, kinetics, industrial substract, organic compounds, inhibition, yeast.

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1

EAR¯VWNQ"K"

KPVTQFWÑ’Q"

30 LWUVKHKEAVKXA"FQ"VTADANJQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5 40 JKUVłTKEQ"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"PQ"DTAUKN 00000000000000000000000 7 50 PQXQ"EKENQ"FQ"RTQıNEQQN 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 60 RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 : 4.1 Processo Batelada ... 8 4.2 Processo Batelada Alimentada ... 9 4.3 Processo Contínuo... 10 70 DKQSW¯OKEA"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA 0000000000000000000000000000000000000000 32 80 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 34

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Introdução

3

30" LWUVKHKEAVKXA"FQ"VTADANJQ"

O Brasil, quando criou o Proálcool (Programa Nacional do Álcool) nos anos 70, não tinha a dimensão do impacto desse programa no século XXI. O governo brasileiro, após a primeira crise do petróleo em 1973, decidiu criar esse programa com o objetivo de produzir um combustível alternativo que substituísse a gasolina para uso carburante. O Brasil já contava com uma matéria prima adequada para esse fim, a cana-de-açúcar. (ANDRIETTA gv0"cn0, 2007)

A herança deixada por este programa, após 30 anos de sua implantação, não se baseou apenas na liderança de produção e utilização de combustível limpo, mas também no domínio da tecnologia que envolve a produção de bioetanol. As usinas brasileiras têm sido objeto de visitação de delegações de todas as partes do mundo, as quais se beneficiam da experiência acumulada pelo setor nessas três últimas décadas para a produção do bioetanol em seus países.

Mesmo o Brasil detendo o que se entende por mais moderno na produção de bioetanol, existem muitos questionamentos em relação à influência da matéria-prima no processo de fermentação alcoólica. A matéria-matéria-prima não se restringe somente ao caldo da cana-de-açúcar. O mel final ou melaço, que é o subproduto da produção do açúcar, também é utilizado associado ao caldo da cana-de-açúcar ou simplesmente diluído em água, como substrato do processo fermentativo.

Embora seja atribuído o nome de mel final ou melaço para o produto obtido depois da cristalização da sacarose contida no caldo de cana-de-açúcar, as particularidades atribuídas a cada processo não permitem uma generalização em relação à composição dessa matéria-prima. Mas o que se conhece é que existem inúmeros compostos comuns, os quais são encontrados em maior ou menor quantidade nos melaços de cana-de-açúcar.

A cana-de-açúcar já sofre alterações antes de seu processamento nas usinas. O mel além de carrear de um modo concentrado essas alterações também é proveniente de um processo, que propicia o acúmulo e ou formação de produtos, que podem atuar como inibidores da fermentação.

(22)

Introdução

4 Entende-se por inibição da fermentação a atuação de compostos sobre as leveduras, que são as responsáveis pela transformação do açúcar em etanol. O nível de inibição deste processo de conversão de açúcar em álcool vai depender do tipo da linhagem de levedura utilizada, associada aos compostos inibitórios e as suas concentrações.

A contribuição dos fatores de inibição provenientes da cana-de-açúcar pode ser atribuída à própria variedade utilizada, assim como à deterioração dessa planta, ocorrida devido às operações envolvidas nos processo de colheita. O ataque de pragas sofridas ainda no campo antes da colheita também têm forte influência na qualidade do caldo de cana-de-açúcar. O mel final, por sua vez, agrega além de todos esses fatores, os provenientes das operações envolvidas na produção do açúcar. (CRUIKSHANK & PERKIN, 1964; FRIEND, 1979; GODSHALL & LEGENDRE, 1988).

Entre os compostos que merecem especial destaque, como inibidores das leveduras dos processos de fermentação alcoólica, estão incluídos, além dos ácidos orgânicos e os compostos fenólicos. Existem na literatura, vários trabalhos que descrevem efeitos danosos de compostos fenólicos sobre uma população microbiana, estando incluídas no grupo suscetível as células de levedura (BORZANI & FALCONE, 1960; O’CONNOR & RUBINO, 1991; MARTIN & JÖNSSON, 2003). Alguns destes compostos estão presentes no caldo da cana como descrito por LEITE (2000). Dentre os compostos citados estão: ácido gálico, ácido salicílico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido sinápico, ácido vanílico entre outros.

Inserido nesse contexto, esse estudo tem como objetivo investigar a presença de alguns dos compostos potencialmente inibidores da fermentação alcoólica em 10 méis finais provenientes de diferentes unidades processadoras da cana-de-açúcar brasileiras. O desempenho fermentativo, em condições de estresse, de quatro cepas de leveduras do gênero Uceejctqo{egu" *Y904, SA1, BG1 e CL1)," mais utilizadas como inóculo nos processos, também foi avaliado nessa primeira fase do trabalho.

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Introdução

5 Esses resultados nortearam a elaboração de um estudo, que avaliou a ação de cada um desses compostos de forma isolada, isto é, adicionado em meio sintético, sob duas das linhagens de leveduras (UC3"g"[;26+0 A influência da ação desses compostos de maneira acumulativa também foi avaliada nesse estudo. Para isso foram realizadas fermentações com reciclo de células. "

40" JKUVłTKEQ"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"PQ"DTAUKN"

No Brasil, produzia-se álcool desde o início do século, mas devido à crise do petróleo no início da década de 70, o governo investiu na produção de álcool, implantando o Proálcool (Programa Nacional de Álcool), em 1975. Com isso, o Brasil tornou-se o primeiro país do mundo a desenvolver um programa alternativo de combustíveis para substituição à gasolina.

Segundo SIQUEIRA (1993), além das razões pelas quais o programa foi criado, destaca-se os seguintes fatores:

- Trata-se de energia renovável e combustível menos poluente; - Utiliza tecnologia 100% nacional;

- Emprega mão-de-obra direta, com fixação do homem no meio rural;

- É um programa de conteúdo estratégico pelo seu caráter nacionalístico e pela sua dispersão territorial.

A partir do lançamento do programa houve, segundo BERTELLI (1992), um crescimento progressivo na produção de álcool, de 500 milhões de litros em 1975, até 12,7 bilhões de litros na safra de 1991/1992. O álcool carburante, anidro e hidratado, participa aproximadamente com 12% do consumo de derivados de petróleo.

No Brasil, o etanol era produzido por processo de fermentação descontínuo, batelada simples. Quando o Proálcool foi implantado, segundo ZAPERLON & ANDRIETTA (1992), todas as novas destilarias foram montadas baseadas no processo Melle-Boinot (batelada-alimentada com reciclo de células),

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Introdução

6 que se mostrou muito conveniente e satisfatório em relação à operação e eficiência de conversão de açúcares a álcool. Mas visando a redução dos custos de produção e o aumento da produtividade, a fermentação alcoólica contínua mostrou ser um processo bastante atrativo.

ANGELIS (1986) já alertava que mesmo com a diminuição do preço do petróleo, ocorrido após o plano Proálcool e sua estabilização, os países que não eram auto-suficientes em petróleo, para prover-se de energia no momento e no futuro necessitariam desenvolver diretrizes que conduziriam ao aperfeiçoamento de todas as possibilidades de alternativas de aproveitamento de energia.

Nos E.U.A existe uma associação de 16 estados na produção de álcool etílico por via fermentativa, utilizando o milho como matéria prima. Segundo PHILIPPIDIS & HATZIS (1997) a produção de etanol através da fermentação alcoólica de substrato açucarado está despertando o interesse dos E.U.A, podendo-se converter em poucos anos num programa vital para a sustentação da próspera economia americana, reduzindo-se significativamente a importação de petróleo e garantindo, para um futuro bem próximo, a continuação do uso de um combustível alternativo e principalmente renovável, tornando-se já um tema de segurança nacional.

50" PQXQ"EKENQ"FQ"RTQıNEQQN"

“As notícias sobre o etanol estão pipocando na mídia. É o presidente dos Estados Unidos da América que vem ao Brasil e propõe a “Opep do Etanol”, são os países da UE que pretendem aumentar o uso para misturar à gasolina, como forma de reduzir os problemas da poluição atmosférica. É o Japão que se interessa pelo assunto e também outros países já demandando etanol como Venezuela, Paraguai, Peru, Colômbia, Canadá, Califórnia/EUA, etc. Esse interesse pelo produto é visível no aumento das exportações de etanol pelo Brasil, que em 2001 foi de 343 milhões de litros e em 2006 de 3,42 bilhões. Enfim, são os consumidores aparecendo. E que consumidores! O tamanho deles impressiona: somente a demanda de etanol derivada do protocolo de Quioto está estimada

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Introdução

7 entre 24 a 64 bilhões de litros até 2010, dependendo do percentual de 5% ou 10% de mistura à gasolina. O programa norte-americano de substituição da gasolina em 20%, até 2017, estima produzir 132 bilhões de litros. No Brasil a demanda de álcool deverá crescer bastante, dado o aumento nas vendas de veículos leves flex fuel, que alcançou em 2006, participação acima de 70%, e em função da substituição da frota atual (conforme aponta um estudo, a perspectiva é de haver um consumo de 25 bilhões de litros no total de seis milhões de veículos até 2010). A produção mundial de etanol é atualmente de 50 bilhões de litros, sendo que o Brasil produz 17,4 bilhões e os EUA produzem 18,5 bilhões, representando juntos 72% do total. Assim, comparando com a atual produção brasileira e estadunidense, que são os principais produtores mundiais de etanol, podemos ver como esse mercado poderá crescer. Outro sintoma das possibilidades de obter lucros com a produção, venda e exportação de etanol é mostrada pela entrada de capital estrangeiro comprando usinas e ou associando-se aos grupos usineiros nacionais, assim como, recentemente, fundos europeus foram captados para investir na compra de usinas no país, conforme se noticiou na imprensa. Para atender esse mercado crescente, incluindo uma participação maior do Brasil no mercado mundial de açúcar, o volume de matéria-prima deverá ser 670 milhões de toneladas em 2010, contra a produção atual de 380 milhões, isto é, crescimento de 76% em poucos anos. A nova área total a ser ocupada ficaria acima de oito milhões de hectares, e como a participação de São Paulo deverá ficar igual, em torno de 60%, isso significaria utilizar cinco milhões de ha com a cana-de-açúcar, representando acréscimo de 1,3 milhões de ha, sendo neste estado da federação que nos deteremos em analisar as conseqüências desse crescimento. Muitos acham esse acréscimo pequeno, pois São Paulo ocupa 19 milhões de ha em atividades agrícolas, compostas por culturas anuais (feijão, milho, soja, hortaliças), perenes (citros, frutas, seringueira), semiperenes (cana-de-açúcar, banana), produção animal (carne, leite, mel), e reflorestamento (pinus, eucalipto), e a área de cinco milhões significaria ocupar 26% do total, em comparação aos 20% atuais. Mas, deve-se alertar que não há mais área

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Introdução

8 agricultável inexplorada a ser incorporada, e o crescimento de algumas delas será sempre por substituição de outras.” (VEIGA FILHO, 2007).

60" RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU"

A evolução da fermentação alcoólica segue a tendência de qualquer outro processo industrial, isto é, a implantação de processos contínuos. Esse tipo de processo traz como vantagens a modernização da usina, aumento da produção, redução de tempos não produtivos (carga, descarga, limpeza) condução da fermentação em estado estacionário, redução de insumos, uniformidade do produto e maior controle do processo. A modernização das plantas brasileiras, isto é a migração das plantas de batelada para contínua se dá de forma lenta nas indústrias brasileiras. Acredita-se que no Brasil 70% das destilarias instaladas ainda utilizam o processo do tipo batelada. A explicação do atraso reside no fato de que, no auge do Proálcool, as primeiras plantas contínuas instaladas foram fruto de adaptações de baixo custo de plantas de batelada já existentes. Essas adaptações foram feitas de forma empírica, o que resultou no geral em processo problemáticos. Isto desencorajou e, desencoraja até hoje o setor no que diz respeito à implantação de plantas que operem de forma contínua. O processo como qualquer outro processo moderno exige um projeto de engenharia para sua concepção. ANDRIETTA gv0"cn. (2007). estudou, utilizando modelagem matemática e simulação um processo de fermentação que opera de forma contínua. O modelo preconizado por esse autor inclui a instalação de quatro reatores de mistura perfeita ligados em série, com a seguinte distribuição de volume em relação ao volume total de reator: 20,96% para o reator 1, 26,72% para o reator 2, 31,56% para o reator 3 e 20,76% para o reator 4.

A seguir serão apresentadas as principais características dos processos de fermentação que as unidades brasileiras fazem uso.

603" RTQEGUUQ"DAVGNAFA"

Este processo no passado foi muito utilizado na produção de etanol, mas segundo MAIORELLA" gv0" cn0 (1981), este processo é lento, pois se gasta muito

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Introdução

9 tempo para o preparo do reator. O reator tem que ser, a cada batelada, limpo e preparado, o mosto e o inóculo carregados no sistema.

Para este processo, podem ser utilizados dois sistemas:

a) Sistema de cortes: consiste em realizar a primeira fermentação, então o volume de mosto é dividido em dois reatores, completando ambos com mosto deixando fermentar, e assim sucessivamente;

b) Sistema de cultura pura ou pé-de-cuba: para cada fermentação, utiliza-se de uma cultura pura, adiciona-se o mosto até completar o volume do reator.

604" RTQEGUUQ"DAVGNAFA"ANKOGPVAFA"

Este processo é uma variante do processo batelada. É também conhecido como Melle-Boinot. Neste processo não se pode ultrapassar um valor limite de substrato, fazendo a alimentação do substrato ao mosto parceladamente, por pulsos ou contínua. Neste caso há o reaproveitamento do inóculo que é separado do vinho por centrifugação.

ALMEIDA (1960) descreve as seguintes vantagens do processo Melle-Boinot:

- Economia de açúcar devido à menor reprodução celular elevando o rendimento em etanol;

- Eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho (separação de células de levedura);

- Fermentação mais pura devido ao tratamento de leite de levedura (tratamento ácido);

- Eliminação da necessidade de cultura pura no preparo do pé-de-cuba, prática exigida no processo clássico, diminuindo, portanto a complexidade das operações da planta.

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Introdução

10 605" RTQEGUUQ"EQPV¯PWQ"

Este processo não sofre interrupções, há a retirada contínua do produto a uma vazão igual à da alimentação, permitindo um fluxo contínuo, diminuindo assim, o efeito inibitório do etanol e do substrato. Este tipo de processo atinge, quando bem operado, maior produtividade e rendimento.

Segundo RODRIGUES"gv0"cn0"(1992) este processo tem apresentado uma maior produtividade, com um aumento que pode atingir 100% em relação à batelada alimentada. Os novos projetos que estão sendo desenvolvidos consideram a cinética do processo e utilizam ferramentas matemáticas e computacionais. Com isto obtêm-se processos que:

- Reduzem gastos em mão-de-obra; - Aumentam a produtividade;

- Reduzem o tempo não produtivo (carga, descarga, limpeza); - Trabalham em condições ótimas de operação no estado estacionário;

- Reduzem a utilização de insumos; entre outros.

70" DKQSW¯OKEA"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"

Segundo AMORIM gv0" cn. (1996), a levedura como entidade viva independente, realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a energia química necessária à sua sobrevivência, sendo o etanol apenas e tão somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metabólica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar às leveduras, condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor, isto é, com maior eficiência na produção de etanol. A célula de levedura possui compartimentos diferenciados para a atividade metabólica, sendo que a fermentação alcoólica (glicólise anaeróbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a oxidação total do açúcar (respiração) se dá na mitocôndria.

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Introdução

11 As leveduras são organismos eucarióticos e formam uma das classes mais importantes dos fungos. As células de Uceejctqo{egu" egtgxkukcg apresentam-se normalmente na forma unicelular e com 2 a 8 micrômetros de diâmetro. Estas se reproduzem basicamente por brotamento, onde a célula mãe, após um período de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula.

Existem dois ciclos distintos que definem o processo de transformação de açúcares solúveis em moléculas menores pela ação de levedura. O primeiro, denominado glicólise, tem a função de “quebrar” a molécula de glicose até ácido pirúvico, através de uma série de reações catalisadas por enzimas específicas, que se situam na parede celular e no interior da célula. Na ausência de oxigênio, há uma tendência para a atuação das enzimas piruvato-descarboxilase e álcool-desidrogenase, produzindo etanol e água a partir do ácido pirúvico. A equação de Gay-Lussac faz um balanço desta etapa. Porém, na presença de oxigênio há um deslocamento reacional de parte do ácido pirúvico para o Ciclo de Krebs, onde será oxidado enzimaticamente a dióxido de carbono e água.

O balanço global dos dois ciclos pode ser resumido pelas equações: C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O + 57 Kcal

Equação de Gay-lussac

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 Kcal Ciclo de Krebs

A reação global da glicólise demonstra que 1 mol de glicose (180g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (88g) e 57 Kcal de energia. Assim, o rendimento teórico (YP/S) para a produção de etanol é de 0,511 g/g. Na prática, segundo OURA (1974), este valor não é observado devido à utilização de parte da glicose para produção de glicerol e alcoóis superiores, substâncias necessárias para síntese de material celular e manutenção da levedura.

Além da presença ou ausência de oxigênio, a disponibilidade de açúcar pode afetar o metabolismo das leveduras. OKADA (1981)o efeito Crabtree, que é

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Introdução

12 o incremento na produção de etanol em concentrações de glicose superiores a 0,5-1,0 g/L (independentemente da concentração de oxigênio) como prejudicial ao processo de produção de leveduras de panificação, pois parte do açúcar disponível é convertida a etanol e dióxido de carbono em detrimento à biomassa, reduzindo o rendimento. Em contrapartida, o efeito Pasteur, causa um elevado rendimento celular em condições de aerobiose e concentração de glicose inferior a 1,5 g/L, diminuindo assim a taxa de fermentação alcoólica ou glicólise anaeróbia.

Assim, frente ao número elevado de reações catalisadas enzimaticamente no metabolismo celular, fatores como pH, temperatura, pressão, concentração de reagentes, concentração de nutrientes, etc., afetam os parâmetros cinéticos que definem as taxas de reprodução celular, consumo de substrato e produção de etanol.

80" DKDNKQITAHKA"

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Introdução

13 CRUIKSHANK, M. & PERKIN, L. Dkqejgokuvt{" qh" rjgpqnke" eqorqwpfu. Ed. Harborne, Academic Press, London, p. 511-544, 1964.

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Introdução

14 PHILIPPIDIS, G. P. & HATZIS, C. Dkqejgokecn" gpikpggtkpi" cpcn{uku" qh" etkvkecn" rtqeguu" hcevqtu" kp" vjg" dkqocuu/vq/gvjcpqn" vgejpqnqi{. Biotechnology Progress, New York, v.13, n.3, may/jun., p.222-231, 1997.

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15

EAR¯VWNQ"KK"

EQORQUKÑ’Q"FG"OGNAÑQU"KPFWUVTKAKU"

QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39 30 KPVTQFWÑ’Q 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39 1.1 Efeito da matéria prima sobre as leveduras... 17 1.2 Tratamentos de melaços... 18 1.3 Efeito dos meios que contém mais de um substrato... 20 1.4 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ... 21 1.4.1 Compostos Fenólicos ... 21 1.4.2 Efeito dos compostos fenólicos sobre microrganismos ... 22 1.4.2.1 Mecanismo de ação dos compostos fenólicos... 22 1.4.2.2 Ação dos compostos fenólicos sobre leveduras ... 23 1.4.3 Técnicas de determinação de compostos fenólicos... 23 1.4.4 Compostos Fenólicos encontrados na cana-de-açúcar ... 24 1.4.5 Ácidos orgânicos presentes no melaço ... 26 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 49 2.1 Méis analisados ... 27 2.2 Compostos Analisados ... 28 2.3 Determinação da Concentração dos Compostos Fenólicos e àcidos orgânicos presentes nos Méis ... 28 50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 4; 3.1 Compostos Identificados... 29 3.2 Concentrações dos Compostos Encontrados nos Méis... 30 60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 53 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 54

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Composição de Melaços Industriais 17

QDLGVKXQ"

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303" GHGKVQ"FA"OAVÖTKA"RTKOA"UQDTG"AU"NGXGFWTAU"

Segundo BASSO gv0" cn0(1996) as cepas de levedura são capazes de utilizar muitos compostos nitrogenados, tais como aminoácidos, bases nitrogenadas, uréia e amônio, utilizando-se de vários sistemas de transporte para as diversas fontes.

O nitrogênio na forma amoniacal (NH4+) é encontrado no mosto proveniente do caldo de cana, e sua concentração influi sobre o brotamento da levedura e a taxa de multiplicação da levedura, além de que a porcentagem de levedo no vinho também está diretamente relacionada com a concentração de NH4+. Segundo BASSO" gv0" cn0" (1996) esta forma de nitrogênio na cana é intermediária, pois o nitrato (NO3-) absorvido do solo pela planta é reduzido a nitrogênio amoniacal e este transformado em aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e demais compostos nitrogenados.

REED (1982) menciona a respeito da necessidade nutricional de leveduras, a importância de vitaminas como a biotina, tiamina, ou outras, que devem ser supridas pelo meio de crescimento. Em experimentos laboratoriais isto é geralmente feito com o uso de extrato de levedura. Em processos comerciais essa suplementação é feita pela adição de compostos minerais solúveis e vitaminas sintéticas, geralmente suplementadas com levedura ou extrato de levedura.

PINOTTI (1991) afirma que nas etapas do processo de produção de álcool existem perdas significantes de nutrientes, notadamente o nitrogênio. Devido a

(35)

Composição de Melaços Industriais

18 estas perdas principalmente na etapa de decantação, ocorre a necessidade da introdução do nitrogênio durante a fermentação, onerando o custo final do álcool.

BASSO gv0"cn0 (1996) relata que a acidez resultante da utilização do sulfato de amônio, embora auxilie no controle a contaminação bacteriana (conseqüentemente reduz as formações de ácidos lático e acético), causa estresse à levedura diminuindo a viabilidade e a sua multiplicação.

SU gv0"cn0"(1969) verificaram que quando a uréia é usada como única fonte de nitrogênio, a levedura produzida apresenta menor teor em proteína e maior produção comparada com o sulfato de amônia.

ABRAMOV gv"cn0 (1994) enfatizam que a síntese de biomassa celular pela levedura é significativamente dependente do conteúdo em nitrogênio no meio de crescimento, uma vez que a proporção de compostos nitrogenados na célula de levedura atinge 50%. Reforçam o conhecimento de que as células de levedura sintetizam todos os aminoácidos e proteínas a partir de nitrogênio inorgânico e carbono orgânico, e também a partir de produtos intermediários da degradação de carboidratos formados durante a fermentação e respiração.

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O mel final utilizado na fermentação é proveniente da produção de açúcar. À medida que ocorre a cristalização do açúcar do mel final, a taxa de cristalização torna-se mais baixa até atingir um ponto em que não se pode mais cristalizar a sacarose a uma dada temperatura, então se diz que o melaço está esgotado e a pureza deste depende principalmente do conteúdo de água. Embora todos os constituintes exerçam certa influência sobre a pureza, somente os que estiverem em maiores quantidades têm um efeito significativo. Destes, os açúcares redutores e cinzas são preponderantes. Estes dois ingredientes exercem efeitos opostos na retenção de sacarose. Os açúcares redutores tomam o lugar da sacarose, quase peso por peso, de maneira que, quanto mais açúcares redutores presentes, menor a quantidade de sacarose retida. Desta forma, quanto maior a porcentagem de açúcares redutores, menor a pureza do melaço esgotado a um dado teor de água. Por outro lado, cinzas em geral e o cloreto de potássio

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19 (principal constituinte das cinzas) em particular, tendem a aumentar a solubilidade da sacarose dando uma pureza maior do mel esgotado (PAYNE -1989).

O tratamento do melaço consiste em: diluição, aquecimento (ou Esterilização), e decantação. A Esterilização é baseada no binômio tempo versus temperatura, para destruição térmica do esporo do microrganismo mais resistente do meio, não devendo ser utilizada uma temperatura que exija muito tempo para a destruição do esporo mais termo-resistente, pois se arrisca destruir os fatores de crescimento essenciais à multiplicação da levedura. Primeiramente, dilui-se o melaço até obter o º Brix desejado, em seguida aquece (140°C/15-20 seg.). Depois de aquecido, o melaço é resfriado e decantado. A lama decantada do melaço é composta principalmente de substâncias inorgânicas contendo muito sulfato de cálcio, sílica e outros materiais “terrosos”, mas contém também pequenas quantidades de proteínas precipitadas, gorduras e materiais celulares vegetais. (FLEISHMAN, 1977)

Métodos mais modernos de tratamento de melaço para a eliminação desta borra utilizam separadoras centrífugas como substitutos da decantação natural.

A Figura II-1 mostra o fluxograma de tratamento do mel bruto realizado pela Mauri do Brasil S.A. Este tratamento se dá em três etapas: (a) Na primeira etapa o mel bruto com concentração inicial de sólidos solúveis (° Brix) em torno de 80% p/p é diluído até uma concentração final de 40% p/p ser atingida. (b) Na segunda etapa o mel previamente diluído na etapa anterior é centrifugado, onde a fase leve sofre um tratamento térmico sendo o mel pré-aquecido a temperatura de 121ºC e resfriado a 80ºC obtendo-se assim o mel tratado. (c) Na terceira etapa a fase pesada obtida na etapa de centrifugação é lavada com água e transferida para um decantador onde o sobrenadante obtido é utilizado na etapa de diluição descrita anteriormente juntamente com água, e o decantado obtido é constituído aproximadamente por 2% de sólidos com concentrações de Açucares Redutores Totais (ART) em torno de 0,2% do total.

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Nas unidades de produção de álcool acopladas a unidades de produção de açúcar, a matéria-prima utilizada para obtenção deste produto é o mel final diluído em caldo de segundo terno ou filtrado após tratamento, ou somente em água.

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Segundo SCHLEGEL (1990), um bom exemplo de efeito de substrato na síntese enzimática é um fenômeno chamado fkcwzkc. O efeito de diauxia consiste no consumo preferencial de um substrato em relação a outro quando mais de um estão presentes no meio fermentativo, que é o caso da fermentação alcoólica com meios à base de sacarose. A aparição de duas fases de crescimento ou duplo ciclo de crescimento é encontrada em meios que contém misturas de substratos. Na mistura de glicose e sorbitol, por exemplo, a G0eqnk utiliza somente a glicose em primeiro. A glicose induz a síntese das enzimas para seu consumo, bloqueando ao mesmo tempo o consumo de sorbitol. O sorbitol só será consumido quando toda a glicose for consumida.

Mel Tratado 80 º Brix 40 º Brix Água Tanque Mel Água 121ºC 80 ºC Sólidos 2% dos Sólidos (10% de ART) Sobrenadante

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Os compostos fenólicos consistem basicamente de um anel de benzeno, ao qual se ligam grupos do tipo hidroxila, carboxila e metoxila. Uma grande variedade de compostos fenólicos, cumarinas, taninos, ligninas e flavonóides são considerados fenóis vegetais (BOVI, 1997).

Segundo CLARKE & LEGENDRE (1996), a cor no caldo e no açúcar é oriunda de diversas fontes, tais como: da planta (flavonóides, compostos fenólicos), caldo (melanoidinas, produtos de reação de açúcares redutores e aminas), fábrica (Caramelos e melaninas) e da refinaria (produtos de degradação da frutose).

Gillet (citado por PULZATTO, 1995) agrupou os compostos coloridos presentes no caldo de cana e na fabricação do açúcar, de acordo com três classes:

a. Não-açúcares coloridos, presentes originalmente na cana, sendo estes clorofilas, xantofilas, carotenos e antocianinas.

b. Não-açúcares da cana que podem desenvolver cor, aqui situando os compostos polifenólicos e compostos amínicos (aminoácidos e amidas).

c. Não-açúcares coloridos obtidos da decomposição de açúcar, formados através dos mecanismos de caramelização, decomposição de açúcares e da reação de Maillard.

Para se estimar a contribuição de diferentes classes de compostos na cor do caldo ou do açúcar tem sido utilizada a característica de sensibilidade a elevados valores de pH. O termo valor indicador (V.I) é o termo aplicado para a razão da cor (absorbância medida a 420 nm) a pH 9,00 e a pH 4,00. O valor indicador dos compostos fenólicos e flavonóides (5,0-14) são significativamente maiores que os dos corantes melanoidinas (1,0-2,0) e caramelos (1,0-1,5), compostos que não apresentam aumento na cor com aumento do pH. Os

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22 compostos oriundos da planta possuem, portanto, o maior efeito na cor conforme o pH é aumentado (CLARKE gv0"cn0 1985).

Segundo SMITH (1976) e CLARKE gv0"cn. (1985), os compostos fenólicos e flavonóides são considerados como aqueles que mais afetam a cor do caldo de cana, tendo sido reportados serem responsáveis por 60-75% da cor no açúcar.

A concentração destes compostos na planta está relacionada à existência de fungos, bactérias e insetos (CRUIKSHANK & PERKIN, 1964; FRIEND, 1979). Em adição, injúria mecânica e química e doenças virais e bacterianas induzem à produção de cor vermelha no tecido possivelmente como resposta ao estresse na cana-de-açúcar (Hokama, citado por GODSHALL & LEGENDRE, 1988).

Os componentes fenólicos sofrem reações não enzimáticas, incluindo oxidação e autopolimerização com pigmentos marrom escuro, reações com proteínas e aminoácidos, para produzirem melaninas, pigmentos de coloração marrom e reações com aldeídos para produzir produtos de condensação vermelhos na presença de ácidos (BOVI, 1997). Os compostos fenólicos também sofrem reações de escurecimento por via enzimática. A reação de cor catalisada por enzima resulta da ação de o-difenol-O2 oxiredutase sobre os fenólicos, particularmente ácido clorogênico. A o-diquinona resultante dessa oxidação é quimicamente reduzida a um o-difenol secundário e a quinina secundária assim formada, polimeriza para formar cor. Compostos poliméricos coloridos podem também ser formados a partir da quinona clorogênica após reação com aminoácidos (GROSS & COOMBS, 1976).

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Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma de ação dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos desinfetantes. Klarmann & Shternov, 1936 (citados por O’CONNOR & RUBINO, 1991), realizaram testes para comprovar a ação germicida de compostos fenólicos

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23 e concluíram que a potência germicida contra os microrganismos testados aumenta com o aumento do peso molecular dos compostos fenólicos.

Cooper 1912,1913 (também citado por O’CONNOR & RUBINO, 1991) relatou que o fenol e seus derivados apresentam diversos tipos de ação bactericida. Em altas concentrações estes compostos atuam como um violento veneno protoplasmático, penetrando e rompendo a parede celular e precipitando as proteínas celulares. Entretanto, em baixas concentrações, os fenóis e seus derivados inativam o sistema de enzimas essenciais.

Segundo BORZANI & FALCONE (1960), o fenol se dissolve no protoplasma. Sua ação depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e os lipídeos do protoplasma. Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa um valor máximo, as proteínas precipitam irreversivelmente e a célula morre. 3060404" Aèçq"fqu"eqorquvqu"hgpônkequ"uqdtg"ngxgfwtcu"

MARTIN & JÖNSSON (2003) compararam a resistência de onze cepas (industrial e laboratório) de Uceejctqo{egu e \{iquceejctqo{egu a inibidores da fermentação de derivados lignocelulósicos. Eles prepararam um coquetel inibidor, em diferentes concentrações, contendo dois ácidos alifático, dois furaldeídos e dois compostos fenólicos. Concluíram que dentro de uma mesma espécie existe uma cepa que é mais resistente ao coquetel inibidor tendo uma redução no rendimento em etanol de 10% em presença do coquetel inibidor na concentração de 100%, enquanto que a cepa mais sensível não produziu etanol na presença de 25% do coquetel inibidor.

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Existem várias técnicas para a determinação dos compostos fenólicos. PRICE & BUTLER (1977) e BUDINI gv0" cn0 (1980) utilizaram o método Azul da Prússia para a determinação de compostos fenólicos totais.

Várias pesquisas com objetivos de analisar os compostos fenólicos têm mostrado a enorme complexidade da mistura de compostos que compõem os corantes presentes na cana-de-açúcar. FARBER & CARPENTER (1972)

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24 empregaram a extração com acetato de etila e análise por eletroforese de alta voltagem para obterem a separação de sete derivados de ácido benzóico, seis derivados de ácido cinâmico, três derivados de cumarinas e três flavonóis, que estão apresentados na Tabela II-1.

PATON (1978) utilizou cromatografia em camada delgada em placas de celulose para a identificação de ácidos fenólicos presentes em folhas de cana-de-açúcar, caldo de cana, e outros produtos oriundos da cana-de-cana-de-açúcar, identificando treze ácidos fenólicos, também apresentados na Tabela II-1.

Análises qualitativas como cromatografia em papel, cromatografia em camada delgada e em coluna aberta e cromatografia gasosa têm sido descritas na literatura para a separação de compostos fenólicos em plantas. Mas para a análise quantitativa são necessários métodos mais satisfatórios. Para tornar a análise desses compostos mais rápida e precisa e com grande seletividade em relação aos métodos clássicos, foi introduzida a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

CURTIN & PATON (1980), PATON & DUONG (1992) e LEITE (2000) utilizaram CLAE para separação de compostos fenólicos extraídos da cana e seus derivados.

LARRAHONDO gv0"cn0 (1996) promoveram a separação e identificação do açúcar bruto empregando cromatografia gasosa (CG) acoplada à espectrometria de massa (MS). Esta análise indicou a presença de diversos ácidos fenólicos no açúcar bruto, os quais estavam presentes na cana-de-açúcar como ácido ferúlico, siríngico e derivados do ácido cinâmico, além de derivados de ácido benzóico.

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Diversos autores identificaram os compostos fenólicos e flavonóides presentes na cana-de-açúcar. Estes compostos estão relacionados na Tabela II-1.

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