Introdução à tecnologia do
Introdução à tecnologia do
DNA
DNA
recombinante
recombinante
ou
ou
clonagem gênica
clonagem gênica
Tratamento do Nanismo Hipofisário com Hormônios de
Crescimento Humano
...Kathy era uma criança típica em relação a muitos aspectos – feliz, gostava de brincar, um pouco levada e inteligente. A única coisa incomum sobre Kathy era sua baixa estatura. Ela nasceu com nanismo hipofisário, que resulta de uma deficiência de hormônio de crescimento (hGH). Entretanto, aos 10 anos de idade, Kathy começou a receber tratamentos de hGH sintetizado em bactérias. Ela cresceu cinco polegadas durante o seu primeiro ano de tratamento. O hGH que permitiu a Kathy ter quase o tamanho normal foi um dos primeiros produtos da engenharia genética, o uso de genes projetados ou modificados para a síntese de produtos desejados...
Tratamento do Nanismo Hipofisário com Hormônios de
Crescimento Humano
O hGH foi inicialmente produzido em E. coli possuidoras de um gene modificado composto da sequência codificante de hGH fusionado a elementos reguladores bacterianos sintéticos
Este gene quimérico foi construído in vitro e introduzido em E. coli por transformação
Em 1985, o hGH produzido em E. coli tornou-se o segundo produto farmacêutico da engenharia genética a ser aprovado para uso em humanos pela U. S. Food and Drug Administration
A insulina humana, que foi o primeiro destes produtos, foi aprovada em 1982
extração
Como isolar o fragmento de
interesse ? Um único gene?
Numa população de DNA extraído de uma célula, a mistura de
fragmentos é complexa
Como construir um gene que irá produzir hGH ou
insulina humana em E. coli?
1972 – Produção da primeira molécula de DNA recombinante
Molécula de DNA recombinante :
DNA formado pela combinação de segmentos
de DNA de origem diferente
Possibilitou a clonagem
Principais passos da clonagem
• A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial
• Clonagem com a amplificação da seq. ocorrendo in vivo: plasmídeo/bactéria
(seq. não precisa ser conhecida)
• Clonagem com a amplificação da seq. ocorrendo in vitro: PCR
Principais passos da clonagem
Transformação em bactérias
Primeiro passo : como o DNA é cortado
Enzimas de restrição : endonucleases que reconhecem e cortam
ligações internas do DNA
Reconhecem sequências de bases específicas do DNA
Origem : bactérias : sistema restrição - modificação
Confere proteção contra DNAs
estranhos (bacteriófagos)
Uma enzima de
restrição
que reconhece e corta uma sequência
particular do DNA, se esta não estiver metilada
Uma metiltransferase que reconhece a mesma sequência e
metila
bases particulares,
modificando-a →
impede a degradação do próprio DNA pelas endonucleasesSeq. Reconhecimento
Enzimas
AA/CGTT
Acl
I
Arthrobacter luteus
A/AGCTT
Hind
III
Haemophilus influenzae
A/CATGT
Pci
I
Planococcus citreus
A/CCGGT
Age
I
Agrobacterium gelatinovorum
ACCTGC(4/8)
Bsp
MI
Bacillus sphaericas
A/CGCGT
MluI
Micrococcus luteus
A/GATCT
Bgl
II
Bacillus globigii
AG/CT
Alu
I
Arthrobacter luteus
AGG/CCT
Stu
I
Streptomyces tubercidicus
AGT/ACT
Sca
I
Streptomyces caespitosus
Tipos de enzimas de restrição :
Tipo I : cliva sítios casuais que podem estar até 1000 pb do sítio
de reconhecimento; requer ATP
Tipo II : cliva o DNA dentro do sítio de reconhecimento; não requer
ATP (sítio-específicas)
Tipo III : cliva o DNA a cerca de 25 pb do sítio de reconhecimento;
requer ATP
Reconhecem sequências específicas do DNA, geralmente
palindrômicas
5’-TG
GC
CA-3’
3’-AC
CG
GT-5’
BalI
5’-TG
G C
CA-3’
3’-AC
C G
GT-5’
Extremidades
não-coesivas (“blunt”)
Clivagem
Extremidades coesivas
Ponto de digestão no eixo de
simetria
Ponto de digestão fora do
eixo de simetria
Maior parte das enzimas tipo 2 reconhecem sequências palindrômicas
Seta indica clivagem da ligação fosfodiéster; * indica bases que são metiladas. O nome dado a enzima refere-se ao organismo de onde foi isolado. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolado.
As Enzimas que reconhecem locais de restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleótidos (44=256). Aquelas que
reconhecem locais com 6 e 8 pb clivam o DNA em média a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente.
Enzima de restrição e o DNA recombinante
plasmídeo
GAATTC
CTTAAG
CTTAAG
GAATTC
CTTAA
G
AATTC
G
CpTpTpApA
G
ApApTpTpC
G
Uma
DNA ligase
sela a união dos segmentos
Pontes H :
Ocorrem
espontaneamente
p
p
Ligação
fosfodiéster :
catalisada pela
DNA ligase
Segundo passo : o DNA é inserido num vetor
Vetores : moléculas de DNA que se reproduzem autonomamente
em uma célula hospedeira, no qual um segmento de DNA (inserto)
pode ser inserido
Alguns tipos de vetores :
Plasmídeos
Bacteriófagos
Cromossomos artificiais de bactérias (BACs)
Cromossomos artificiais de leveduras (YACs)
Capacidade dos insertos dos vetores
freqüentemente utilizados em clonagem molecular
100 a 300
E. coli
Cromossomo artificial derivado do
Bacteriófago P1- PACs
100 a 2.000
levedura
Cromossomo artificial de levedura - YACs
50 a 300
E. coli
Cromossomo bacteriano artificial - BACs
80 a 100
E coli
Bacteriófago P1
35 a 45
E coli
Cosmídeo
10 a 20
E.coli
Bacteriofago lambda
0,1 a 8
E. coli
Plasmídeo
Capacidade de
clonagem (kb)
Sistema
hospedeiro
Sistema Vetor
Plasmídeos
Moléculas circulares de DNA que se duplicam de modo
independente do DNA cromossomal bacteriano
Tamanho de 1 kb a 200 kb
Plasmídios
Separando
um
plasmídio
de um DNA
bacteriano
(10 Kb)
(10 Kb)
Plasmídeos naturais são modificados para serem mais eficientes na
produção de DNA recombinante
ampR – gene marcador
selecionável conferindo resistência a ampicilina à bactéria hospedeira
Um vetor de clonagem tem 3 componentes essenciais:
(1)Uma origem de replicação (2)Um gene marcador dominante
selecionável (gene de resistência a drogas)
(3)Pelo menos um único sítio de clivagem de endonuclease de restrição
Bacteriófago λ
λ
λ
λ
Possui genoma de 50 kb, linear, fita dupla
Cada extremidade possui sequências de fita simples 5´sobressalentes
que são coesivas
Parte central de 15 kb pode ser removida – região necessária para lisogenia
Terceiro passo : a transformação
• A molécula de DNA recombinante precisa ser inserida dentro de uma célula hospedeira, geralmente uma bactéria – transformação
• A membrana plasmática é seletiva – moléculas grandes não entram
• Célula competente : célula com a permeabilidade alterada por exposição a determinadas concentrações de sais, choques elétricos (electroporação), etc.
• Nem todas as células são transformadas
• Geralmente, as células internalizam somente uma molécula de DNA recombinante - fracionamento
Ligação do
DNA alvo ao
plasmídio,
transformação
Após a transformação, as células são semeadas em meio sólido
e depois em meio líquido
Cada colônia é formada por
célulasfilhas – clones
-originadas de uma única
célula, transformada com
uma única molécula de
DNA recombinante
Qual dessas células adquiriu um vetor ?
Seleção de recombinantes
O vetor contém um gene marcador, o qual complementa uma
deficiência da célula hospedeira :
Gene de resistência a antibiótico : ampicilina, tetraciclina,
cloranfenicol
Complementação com gene da β-galactosidase : a enzima
produzida pelo vetor age sobre uma substância incolor (X-gal)
tornando-a azul
2 – O vetor contém o inserto ?
• Um gene marcador é inserido no sítio polylinker. Ex. : β-galactosidase
• A inserção do fragmento causa disrupção do gene
O vetor com o inserto não expressa o gene marcador
Células com vetor,
sem o inserto
Lac Z íntegro
β-galactosidase ativa
converte X-gal
Célula
azul
Células com vetor,
com o inserto
Lac Z é rompido
Sem produção de
β-galactosidase
X-gal não é convertido
Sítio
poly-linker
(policlonagem)
Gene da
β-galactosidase
Gene de resistência a
kanamicina
Colônia azul –
transformada com o
vetor sem o inserto
Colônia branca –
transformada com o
Gene de resistência ao
cloranfenicol
Lac Z é rompido
Célula hospedeira sensível
ao cloranfenicol e incapaz
de produzir
β-galactosidase
Só crescem células
resistentes ao
cloranfenicol
(transformadas)
Só metabolizam X-gal as
que tiverem o Lac Z
Gene da ampicilina no
polylinker
• Céls. transformadas com
o vetor sem inserto:
resistentes a amp e tet
• Céls. transformadas com
o vetor com o inserto:
resistentes a tet
Bibliotecas de DNA
Coleções de clones de DNA obtidas a partir de populações
iniciais de DNA extremamente complexas
Biblioteca de DNA genômico
•Qualquer célula pode ser usada para a obtenção dos fragmentos •Isola o DNA total de um organismo
•DNA é parcialmente digerido com endonuclease – fragmentos maiores
•Os fragmentos de restrição são inseridos em um vetor apropriado de clonagem •Transformação – amplificação por replicação in vivo
Bibliotecas de cDNA (DNA complementar)
• Construídas a partir da população de mRNA – genes expressos
• É tecido-específica ou estágio-específica – a população de mRNA varia
Passos para obtenção de uma biblioteca de cDNA :
Extração do RNA total
Separação do mRNA
Síntese do cDNA – transcriptase reversa
A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2
Triagem de uma Biblioteca genômica ou de cDNA
Genes específicos ou outras sequências de DNA podem ser isolados de bibliotecas de DNA ou cDNA por hibridização com sondas de ácidos nucléicos marcadas contendo sequências de função conhecida
Aplicação
-Após transformação, o gene inserido se expressa
Produção em larga escala de proteínas
-Insulina -Hormônios -Moduladores
-Vacinas (Hepatite B, citomegalovirus) -Enzimas com aplicações diversas
As mais diversas aplicações nas mais diversas áreas.
Existem cada vez mais empresas de biotecnologia.
- Investigações sobre as correlações estrutura-função gênica
- Sequenciamento; comparação com outras seq. em bancos de dados (GenBank; BLAST)
Aplicação
Produção em larga escala de proteínas a partir de genes clonados
Para expressão de um gene exógeno em E. coli sua inserção em um vetor deve permitir que este fique sob o controle desse
conjunto de sinais de expressão
VETOR DE EXPRESSÃO
A expressão de genes exógenos em E. coli depende de três sinais importantes para genes de E. coli: o promotor (reconhecido pela
subunidade σ da RNA polimerase), o terminador (formação de haste), o sítio de ligação do ribossomo (sinal Shine-Dalgarno) e o sinal iniciador
Aplicação
Produção em larga escala de proteínas a partir de genes clonados
A utilização de um vetor de expressão para a produção de uma proteína a partir de um gene exógeno em E. coli
Aplicação
Produção em larga escala de proteínas a partir de genes clonados
A expressão de genes exógenos em E. coli depende de três sinais importantes para genes de E. coli: o promotor (reconhecido pela subunidade σ da RNA polimerase), o terminador (formação de haste), o sítio de ligação do ribossomo (sinal Shine-Dalgarno) e o sinal iniciador de tradução ATG e de término da tradução (códon de terminação)
Promotores: TTTACA, TTGACA – fracos e fortes (promotor lac, trp)
Sequências de regulação: indução e repressão – repressor e operador
(controla a expressão por meio de compostos químicos reguladores);
indutores (IPTG - isopropiltiogalactosídeo, metanol, celulose, arabinose)
Origem de replicação e marcador para seleção
Aplicação
Produção em larga escala de proteínas a partir de genes clonados
Promotores fortes e fracos Exemplos dos dois maiores tipos de regulação gênica que ocorrem em bactéria: (a) um gene induzível, e (b) um gene reprimível
Aplicação
Produção em larga escala de proteínas a partir de genes clonados
Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac. (A) na ausência de indutor; (B) na presença de indutor.
-35 -10
Aplicação
Produção em larga escala de proteínas a partir de genes clonados
• Problemas gerais para produção de proteínas recombinantes em E. coli
1. Problemas resultantes da sequência do gene exógeno
- pode conter íntrons.
- sequências que atuam como sinais de terminação em E. coli.
- viés de códons, tendência de usar preferencialmente determinados códons.
2. Problemas causados por E. coli
- não processar a proteína recombinante corretamente (modificações pós-traducionais). Ex. proteínas animais glicosiladas.
- não enovelar a proteína corretamente (não sintetiza ligações dissulfeto), corpos de inclusão.
• Problemas gerais para produção de proteínas recombinantes em E. coli
Algumas Soluções:
- uso de cDNA
- mutagênese dirigida por oligonucleotídeos (alterar seq. de possíveis terminadores e substituir códons desfavoráveis)
Caracterização dos clones : qual a identidade do inserto ?
Mapeamento de restrição
DNA é clivado com uma ou mais enzimas de restrição
Os fragmentos são separados em gel de agarose; descoberta da
ordem dos fragmentos
Ex. : digestão de um fragmento de 7,5 kb com HindI e SmaI
1 kb 2 kb
M
3 kb 4 kb 5 kbHindI
SmaI
Hind
Sma
2,5
5
2
5,5
2,5
5
2
5,5
2,5 5 5,5 21 kb 2 kb
M
3 kb 4 kb 5 kbHindI
SmaI
Digestão dupla
HindI+
SmaI
2 2,5 32,5
3
2
Hind
Sma
HindI
SmaI
2
5,5
2,5
5
Se dois fragmentos independentes apresentam padrão de bandas similar,
provavelmente contém a mesma seqüência ou são relacionados
(polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição – RFLP)
Construindo
um mapa de
restrição de
um fragmento
de DNA
-Digestão completa -Digestão parcialInformações sobre o mapa de restrição são utilizadas:
- para subclonar partes destes fragmento para o sequenciamento. - DNA mitocondrial - útil na caracterização de linhagens e/ou espécies de vários organismos, auxiliando em estudos taxonômicos e evolutivos.
Diferenças de uma base ou de um nucleotídeo
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
10 milhões dessas variações
Polimorfismos no DNA:
Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição –
RFLP
Restriction
Fragments
Lenght
Polymorphism
Polimorfismo de nucleotídeo único –
SNP
Single
Nucleotide
Polymorphism
Número variável de repetições em tandem –
VNTR
V
ariable
N
umber
T
andem
R
epeats
Polimorfismos por Inserção-Deleção (indels): microssatélites (STR) e minissatélites (VNTR)
Humanos (em nível de seq. de DNA) 99,9% idênticos
Polimorfismo:
• A ocorrência conjunta em uma população de dois ou mais genótipos alternativos, cada um em uma frequência maior do que aquela que poderia ser mantida somente por mutação recorrente (frequência mínima de 1% da população para o alelo polimórfico)
Marcadores genéticos:
• São características genéticas que, pelo seu padrão simples de herança, fenótipos facilmente identificáveis, frequências relativamente altas de seus alelos em diferentes populações e por não sofrerem influencias ambientais, são úteis em estudos familiares, populacionais e de ligação.
PCR
eletroforese
Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição – RFLP
Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP) – marcadores moleculares
Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição – RFLP
Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP)
SNP – marcadores moleculares
6 7 8 9 10 11 12
M B 1 2 3 4 5
91 pb 85 pb 176 pbFIGURA 2: PCR-RFLP para detecção do polimorfismo GSTP1-BsmaI, onde M=
marcador de peso molecular (50 pb) e B= branco (todos os reagentes, exceto DNA). Linhas 1-4, 6, 8-10 = homozigotos para o alelo selvagem; linhas 7 e 11 = homozigotos para o alelo mutante; linhas 5 e 12 = heterozigotos.
VNTR
Lócus VNTR - membro de uma família de DNA repetitivo
Acúmulo próximo às extremidades dos cromossomos
A detecção simultânea de
vários polimorfismos de VNTR
DNA fingerprinting
1 2 3 amostra 4 5 6 7
crime
1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 = amostras indivíduos suspeitos cada repetição usada em um fingerprint
