PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
THAYANNE FRANÇA MUNIZ
CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE INDIVÍDUOS
INFECTADOS PELO Plasmodium vivax NO MUNICÍPIO DE
CRUZEIRO DO SUL (AC)
São Luís – MA 2015
THAYANNE FRANÇA MUNIZ
CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax NO MUNICÍPIO DE CRUZEIRO DO SUL (AC)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. – Marcos Augusto
Grigolin Grisotto
São Luís – MA 2015
THAYANNE FRANÇA MUNIZ
Caracterização imunológica de indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax no município de Cruzeiro do Sul (AC)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou o candidato:
( ) APROVADO ( ) REPROVADO
1) Examinador __________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador ___________________________________
Aos maiores incentivadores, que através da simplicidade sempre me proporcionaram os maiores aprendizados, meus pais.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à Deus pelo dom da vida, por ser o autor e diretor da minha história, sem ti nada sou. Agradeço Pai, por me dá a graça de ter a mãe Maria, a qual sou devota pelo grande exemplo de fidelidade à Deus. Obrigada Nossa Senhora por interceder por mim.
À minha família pelo reconhecimento e apoio, em especial aos meus pais, Gerson e Aurimar Muniz, que apesar das dificuldades, desde muito cedo me fizeram entender a necessidade de estudar. É por vocês que tento melhorar a cada dia e é para vocês o meu maior amor, cuidado e esforço.
Aos meus pais de coração, tia Graça, tio Batista e Fábio Barros por toda a dedicação e acolhimento durante esses anos de convivência, como agradecer a disponibilidade de vocês? Só Deus pra lhes abençoar.
Aos amigos fieis de infância, adolescência e/ou de vida muito obrigada pelas orações fervorosas, pelo companheirismo e pelo abrigo que nunca me deixaram desistir da concretização deste sonho. Em especial ao meu amigo-namorado Robson Gomes que esteve presente nos momentos mais difíceis e ofereceu palavras de encorajamento e carinho.
A todos os professores do mestrado em Biologia Parasitária por contribuírem para minha formação profissional, em especial à Profª. Drª. Elisabeth Fernandes, ao Profº. Drº. Lídio Neto e ao Profº. Drº Silvio Monteiro que sempre se mostraram disponíveis às minhas muitas solicitações com paciência e profissionalismo.
Ao Profº Drº. Claúdio Marinho e seus alunos Robrigo e Jamille que foram primordiais para a coleta das amostras e execução dos experimentos, obrigada pela atenção e esforço em nos ajudar.
Ao meu orientador, Profº. Drº. Marcos Grisotto, meus sinceros agradecimentos pela confiança, compreensão, competência e inúmeros ensinamentos durante todo esse tempo de convivência. Obrigada por me fazer acreditar no meu potencial, quando eu mesma duvidei. Prof. este trabalho é fruto da sua perseverança e do seu
profissionalismo. Mesmo que eu quisesse não tenho palavras pra agradecer tudo o que você já fez por mim.
Aos amigos da turma de mestrado, por todos os momentos de alegrias e desespero que compartilhamos, mas que contribuíram para enriquecer os conhecimentos.
Aos amigos mais que presentes do Laboratório de Imunologia, Cristiane Silva, Domingos Magno, Ione Cristina, João Rodrigues, Larissa Nina e Saulo José que embarcaram comigo nessa jornada, obrigada pelo apoio, pelas caronas e por todos os momentos de dificuldades e alegrias vivenciados dentro e fora do laboratório.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Maranhão (FAPEMA) pela concessão da bolsa de mestrado e pelo financiamento do projeto assim como a CAPES e CNPq.
À Universidade Ceuma, pela infraestrutura e equipamentos necessários para a realização deste trabalho. Em especial à secretária do Mestrado em Biologia Parasitária, Erymônica Câmara, pela prontidão.
Aos indivíduos controles e pacientes pela compreensão e colaboração, pois sem os mesmos seria impossível realizar essa pesquisa.
Muito obrigada a todos que de alguma forma participaram da elaboração deste trabalho.
Se Deus disse que eu posso, então eu posso! Irei e não temerei mal algum.
RESUMO
A malária é uma doença infecciosa aguda causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida ao homem pela picada da fêmea do mosquito Anopheles. Dentre as cinco espécies de Plasmodium que infectam seres humanos, P. falciparum e P. vivax são as mais prevalentes na região Amazônica. As mulheres grávidas são mais suscetíveis à infecção e alguns fatores podem aumentar a vulnerabilidade da gravidez, causando complicações para a mãe e para o feto. Muitos mecanismos imunológicos associados a essa doença ainda não são compreendidos, dessa forma este estudo tem por objetivo realizar um levantamento epidemiológico e a caracterização imunológica de indivíduos gestantes ou não, infectados pelo Plasmodium vivax em uma área de transmissão ativa de malária, o município de Cruzeiro do Sul (AC), em comparação com indivíduos sadios. Para tanto, dados epidemiológicos assim como, o sangue periférico de indivíduos infectados foram coletados para análise hematológica e realização de fenotipagem por citometria de fluxo, onde foram analisados marcadores de ativação, apoptose e a presença de células regulatórias. Além disso, amostras de plasma foram utilizadas para detecção de citocinas e avaliação do estresse oxidativo. Mulheres jovens, apresentando baixa parasitemia, porém com sintomas clássicos da infecção e já infectadas anteriormente foram os indivíduos mais acometidas pela malária. Os pacientes gestantes e não gestantes infectados apresentaram plaquetopenia e aumento na expressão de marcadores de ativação e de apoptose. A infecção também induziu o aumento da expressão de moléculas coestimulatórias (ICOS, OX40 e GITR) em células T, e o aumento das células regulatórias no sangue periférico de gestantes e não gestantes infectados pelo P.vivax. No plasma de infectados gestantes ou não, houve baixa produção das citocinas, porém foram detectadas as citocinas IL-6, IL-10 e IL-17. A produção de marcadores do estresse oxidativo não mostrou diferença significativa nos grupos analisados. Em conjunto, esses dados sugerem que a infecção pelo P. vivax promove mudanças hematológicas e imunológicas em gestantes e não gestantes, uma vez que altera significantemente a expressão de marcadores de ativação e apoptose nos linfócitos de infectados e paralelamente ocorre um aumento das células regulatórias e moléculas coestimulatórias. Estes resultados apontam para a necessidade gerar informações acerca dos mecanismos imunológicos na malária pelo P. vivax que poderão subsidiar o desenvolvimento de futuras pesquisas sobre essa temática e consequentemente novas medidas de intervenção.
ABSTRACT
Malaria is an acute infectious disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and transmitted by the bite of female Anopheles mosquito. Among the five species of Plasmodium that infect humans, P. falciparum and P. vivax are the most prevalent in the Amazon region. Pregnant are more susceptible to infection and some factors may increase the vulnerability of pregnancy, causing complications for the mother and the fetus. Many immunological mechanisms associated with this disease are not yet understood, therefore this study aims to carry out an epidemiological survey and immunological characterization of individuals pregnant or not, infected with Plasmodium vivax in an area of active transmission of malaria, the municipality of Cruzeiro South (AC), compared to healthy subjects. For this purpose, as well as epidemiological data, the peripheral blood of infected individuals were collected for hematological analysis, and performing phenotyping by flow cytometry, where activation markers were analyzed, and the presence of apoptotic regulatory cells. Furthermore, plasma samples were used for detection of cytokines and evaluation of oxidative stress. Young women, with low parasitaemia, but with classic symptoms of infection and already infected individuals were most affected by malaria. Patients infected pregnant and non-pregnant had thrombocytopenia and increased expression of activation and apoptosis markers. The infection also induced the increased expression of costimulatory molecule (ICOS and OX40 GITR) in T cells, and increased regulatory cells in peripheral blood of pregnant and non-pregnant infected with P. vivax. In the plasma of infected pregnant or not, cytokine production was low but was detected cytokines IL-6, IL-10 and IL-17. The production of markers of oxidative stress showed no significant difference in the groups. Together, these data suggest that the P. vivax infection promotes hematological and immunological changes in pregnant and non-pregnant, since significantly alter the activation and expression of markers of apoptosis in infected cells and in addition there is an increase of regulatory cells, and costimulatory molecules. These results point to the need to generate information about the immunological mechanisms in malaria by P. vivax that may inform the development of future research on this topic and consequently new intervention measures.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mapa de risco da malária por Município de infecção. Brasil, 2013. Fonte: (Sivep-Malária/SVS/MS) e (Sinan/SVS/MS)...21
Figura 2 - Ciclo de vida do Plasmodium...23
Figura 3 - Evidência do Plasmodium vivax em esfregaço de lâmina de sangue periférico em indivíduo positivo no exame de gota espessa coradas com Giemsa...44
Figura 4 - Média dos valores de hematócrito (%) (A), leucócitos totais (103/mm3) (C) e plaquetas (103/mm3) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de hematócrito (%) (B), leucócitos totais (103/mm3) (D) e plaquetas (103/mm3)
(F) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium
vivax...47
Figura 5 - Média dos valores de monócitos (%) (A), linfócitos T CD4+ (%) (C), linfócitos B (%) (G) e mediana de linfócito T CD8+ (%) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de monócitos (%) (B), linfócitos T CD4+ (D), linfócitos T CD8+ (F) e linfócitos B (H) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...49
Figura 6 - Expressão dos marcadores CD45RA e CD45RO em linfócitos T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...50
Figura 7 - Média dos valores de células T CD4+CD45RA (%) (A) e T CD4+CD45RO (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+CD45RA (%) (B) e T CD4+CD45RO (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...51
Figura 8 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...52
Figura 9 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...53
Figura 10 - Expressão do marcador CD69 em linfócitos B de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...54
Figura 11 - Mediana dos valores de células T CD4+CD69+ (%) (A), T CD8+CD69+ (%) (C) e CD19+CD69+ (%) (E) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores células T CD4+CD69+ (%) (B), T CD8+CD69+ (%) (D) e CD19+CD69+ (%)
(F) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium
vivax...55
Figura 12 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...56
Figura 13 - Expressão de células T CD4+HLA-DR de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...57
Figura 14 - Mediana da intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos (A) e mediana dos valores de células CD4+HLA-DR (%) (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de HLA-DR em monócitos (B) e mediana dos valores de células CD4+HLA-DR (%) (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...58
Figura 15 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...59
Figura 16 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...59
Figura 17 - Mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ (A) e T CD8+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de CD95 (Fas) em células T CD4+ (B) e T CD8+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...60
Figura 18 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...61
Figura 19 - Expressão da mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD8+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...61
Figura 20 - Mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4+ (A) e T CD8+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de OX40 em células T CD4+ (B) e T CD8+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...62
Figura 21 - Expressão de células T CD4+ICOS de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...63
Figura 22 - Expressão de células T CD8+ICOS de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...64
Figura 23 - Média dos valores de células T CD4+ICOS (%) (A) e T CD8+ICOS (%) (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+ICOS (%) (B) e T CD8+ICOS (%) (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...65
Figura 24 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...66
Figura 25 - Expressão da mediana de intensidade de fluorescência de GITR em células CD4+ de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes)...66
Figura 26 - Mediana da intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ (A) e linfócitos T CD4+ (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana da intensidade de fluorescência de GITR em células CD14+ (B) e linfócitos T CD4+ (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...67
Figura 27 - Expressão de células T CD4+CD25+CD127hi/low de indivíduos controles (gestantes e não gestantes) e infectados (gestantes e não gestantes...68
Figura 28 - Média dos valores de células T CD4+CD25+CD127hi (A) e T CD4+CD25+CD127low (C) em controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Mediana dos valores de células T CD4+CD25+CD127hi (B) e T CD4+CD25+CD127low (D) em gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...69
Figura 29 - Detecção da produção de citocinas (pg/ml) pró (A e E) e anti-inflamatórias (C) no plasma de controles e infectados pelo Plasmodium vivax. Detecção da produção de citocinas (pg/ml) pró (B e F) e anti-inflamatórias (D) no plasma de gestantes controles e infectadas pelo Plasmodium vivax...70
Figura 30 - Dosagem de Nitrito + Nitrato (NOx) (A) e H2O2 (B) no plasma de mulheres
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição das marcações dos anticorpos nas amostras de indivíduos sadios e infectados pelo Plasmodium vivax...39
Tabela 2 - Descrição epidemiológica dos indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax...43
Tabela 3 - Descrição epidemiológica das gestantes infectadas pelo Plasmodium vivax...45
Tabela 4 - Valor do teste de normalidade de Skapiro-Wilk das variáveis numéricas utilizadas no estudo...46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AICD - Morte celular induzida por ativação ANOVA - Análise de variância
CBA – cytokine bead array
CD - Grupamento de diferenciação CS - Proteína circunsporozoíta
CTLA-4 - Antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico (do inglês cytotoxicT-lymphocyte-associated antigen 4)
EDTA - Etilenodiamino tetracético (anticoagulante) EROS - Espécies Reativas de Oxigênio
FACS - Separação celular ativada por fluorescência FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FOXp3 - Gene envolvido na resposta do sistema imune que funciona como regulador das funções das células T
FSC – Forward Scatter (tamanho) Hb - Hemoglobina
Ht – Hematócrito
HLA-DR - Antígeno leucocitário Humano/ Molécula do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe II
H2O2 - Peróxido de Hidrogênio
ICOS – co-estimulador induzível de células T (do inglês inducible T-cell costimulatory)
ICOS-L – ligante do co-estimulador induzível de células T (do inglês IFN-Interferon gama
IL - Interleucina
IPA - Índice parasitário anual
MFI - Mediana da intensidade de fluorescência MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade MiP - Malária na gravidez
NK - Células matadoras profissionais NO - Óxido nítrico
OMS - Organização mundial da saúde PE - Ficoeritrina
PECy5 - Ficoeritrina cianina PM - Malária placentária
RNS - Espécies Reativas de Nitrogênio
SIVEP - Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica SSC – Side Scatter (granulosidade)
TCR – receptor de célula T
TGFTransforming growth factor TH - Linfócitos T auxiliares
TNFFator de Necrose Tumoral alfa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...18
1.1 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA...18
1.2 CICLO DE VIDA DO PARASITA, TRANSMISSÃO E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS...21
1.3 RESPOSTA IMUNOLÓGICA NA MALÁRIA...24
1.3.1 Resposta Imune inata e adaptativa...24
1.3.2 Estresse oxidativo e apoptose...29
1.4 MALÁRIA GESTACIONAL...31
2 OBJETIVOS...35
2.1 GERAL...35
2.2 ESPECÍFICOS...35
3 MATERIAIS E MÉTODOS...36
3.1 POPULAÇÃO ESTUDADA E ASPECTOS ÉTICOS...36
3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO...36
3.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO...37
3.4 COLETA E ESTOCAGEM DE MATERIAL...37
3.5 HEMOGRAMA, SEPARAÇÃO DE PLASMA E ISOLAMENTO DE CÉLULAS DO SANGUE PERIFÉRICO COM TAMPÃO DE LISE...37
3.6 FENOTIPAGEM DE LEUCÓCITOS POR CITOMETRIA DE FLUXO...38
3.7 ANÁLISE DE CITOCINAS DO PLASMA DE PACIENTES UTILIZANDO O KIT CBA...39
3.8 DOSAGEM DE NOX...39
3.9 DOSAGEM DE H2O2...40
3.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...40
4 RESULTADOS...42
4.1 DESCRIÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax...42
4.2 DADOS HEMATOLÓGICOS...45
4.3 ANÁLISE FENOTÍPICA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax...48
4.3.1 População de monócitos, Linfócitos T (CD4 e CD8) e B...48
4.3.2 Expressão de Marcadores de Células naive e de memória...49
4.3.3 Expressão de marcadores de ativação na malária pelo Plasmodium vivax...51
4.3.3.1 Expressão de CD69 em Linfócitos T (CD4 e CD8) e B...51
4.3.3.2 Expressão de HLA-DR em monócitos e linfócitos T CD4...55
4.3.4 Expressão do marcador de apoptose (CD95 Fas) em linfócitos T...58
4.3.5 Expressão de moléculas coestimulatórias...59
4.3.5.1 Expressão de OX40 em linfócitos T (CD4 e CD8)...60
4.3.5.2 Expressão de ICOS em linfócitos T (CD4 e CD8)...62
4.3.5.3 Expressão de GITR em monócitos e linfócitos T CD4...64
4.3.6 Análise da expressão de CD25 em células T CD4: células T ativadas e regulatórias...67
4.4 DETECÇÃO DE CITOCINAS NO PLASMA DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO Plasmodium vivax...69
4.5 PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO...71
5 DISCUSSÃO...72
6 CONCLUSÕES...85
REFERÊNCIAS...86
APÊNDICE...103
1 INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA
A malária, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), é uma das doenças parasitárias mais importante do mundo considerada uma doença infecciosa aguda, causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e transmitida naturalmente ao homem pela picada da fêmea do mosquito Anopheles durante seu repasto sanguíneo (WHO, 2010).
Diferentes determinantes epidemiológicos como clima, forma de ocupação do solo, modalidade de exploração dos recursos naturais e da intensa migração de área rural para urbana aumentam a probabilidade de infecção malárica. A precária vigilância epidemiológica e entomológica e áreas que sofreram ações como o desmatamento contribuem para o agravamento desse quadro (SARAIVA et. al. 2009).
A malária é a principal causa de morte e morbidade em muitos países em desenvolvimento (WHO, 2014). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 182, 2 milhões de casos clínicos de malária ocorrem pelo Plasmodium falciparum (P. falciparum) e 15,8 milhões de casos clínicos pelo Plasmodium vivax (P. vivax), sendo 584 mil mortes são atribuídas à malária todos os anos (WHO, 2014).
Entre adultos expostos à malária, as grávidas são mais suscetíveis à infecção, sendo um dos principais grupos de risco. No mundo, mais de 125 milhões de grávidas vivem em áreas de risco para malária, sendo que 32 milhões estão sob o risco de infecções pelo P. falciparum, 40 milhões por P. vivax e 53 milhões encontram-se em risco de serem infectadas por ambas as espécies, aumentando assim, o risco de complicações associadas às infecções pelo Plasmodium, incluindo o desenvolvimento de malária placentária (PM) (DELLICOUR et al., 2010). A malária placentária decorre principalmente de infecções pelo P. falciparum, mas há estudos que evidenciam alterações morfológicas e histológicas em placentas infectadas pelo P. vivax (ATAÍDE et. al., 2015).
Durante a gravidez, muitas alterações fisiológicas ocorrem no organismo da mulher e alguns eventos podem aumentar a complexidade da gestação, e a malária pode se apresentar como uma complicação (CHAGAS et. al., 2009). Dados provenientes de estudos no Brasil são escassos sobre a distribuição espaço-temporal dos casos de
malária e seus determinantes em uma escala microgeográfica (vilarejo, localidade), principalmente em relação à infecção gestacional. Os dados usualmente analisados provêm dos arquivos do Ministério da Saúde.
As condições ambientais dos Estados brasileiros pertencentes à Amazônia Legal, como elevada temperatura, umidade e condições hídricas abundantes, propiciam o desenvolvimento do mosquito vetor. O risco de contrair a doença não é uniforme, sendo medido por índice parasitário anual (IPA). Este índice classifica as áreas de transmissão em alto risco (IPA maior que 50 casos de malária/1.000 habitantes); médio risco (IPA entre 10 e 50 casos/1.000 habitantes), baixo risco (IPA de 0,1 a 10 casos/1.000 habitantes), e zero – sem risco (SARAIVA et. al. 2009).
Na região Amazônica, em 2011, os estados foram classificados como de alto risco de transmissão (Acre, Rondônia e Amazonas); médio (Roraima, Amapá e Pará); e baixo (Mato Grosso, Maranhão e Tocantins). Todos os estados tiveram redução da incidência quando comparado o ano de 2006 em relação a 2005, exceto o Acre, local de realização desse estudo, mais precisamente a cidade de Cruzeiro do Sul, segundo maior município do Estado e que é uma área de baixa transmissão, devido às medidas de controle realizadas pela política nacional de combate à Malária, como distribuição de mosquiteiros e inseticidas e tratamento precoce dos infectados, entretanto com alta prevalência de infecções por de P. vivax e P. falciparum (SIVEP- MALÁRIA, 2012).
O Estado do Acre está situado na Amazônia Brasileira, no extremo sudoeste da região Norte, ocupando uma área de 153.194 Km2. Administrativamente, é composto por 22 municípios, sendo Cruzeiro do Sul, considerado a segunda maior cidade do Acre. Cruzeiro do Sul foi o município de estudo, localiza-se à margem esquerda do rio Juruá, distante 648 km da capital Rio Branco. Limita-se ao norte com estado do Amazonas, ao sul com o município de Porto Valter, ao leste com o de Tarauacá e ao oeste com os de Rodrigues Alves, Mâncio Lima e com a República do Peru. Ele tem extensão territorial de 7881 km. A população total do município é estimada em 89.095 habitantes, sendo 44.987 mulheres e sua densidade demográfica e de 8,55 habitantes/km(IBGE, 2007). A estrutura de saúde pública do município conta com três hospitais, disponibilizando 243 leitos, desses 74 destinados à obstetrícia. Os partos são realizados de forma intra-hospitalar em 88,7% dos casos, com registro em média de 2112 nascidos vivos/ano. A rede de atenção básica é formada por dois Centros de Saúde e doze Postos de Saúde, com uma cobertura de pré-natal em torno de 22,7%, considerando a realização de sete
ou mais consultas. Em 2006 o número de mulheres atendidas no pré-natal foi cerca de 1010 grávidas/ano. (DATASUS, 2007).
Em Cruzeiro do Sul (AC), a incidência parasitária anual (IPA) em 2006 chegou a 571,5/1.000 habitantes, caracterizando essa área como hiperendêmica. As causas para tamanha endemicidade são mal compreendidas. Acredita-se que, dentre outros fatores, o grande número de tanques destinados à piscicultura, construídos como resultado de um programa estadual de incentivo a essa atividade econômica, tenham-se comportado como criadouros permanentes de Anopheles darlingi, em especial na área periurbana. Do total dos exames positivos confirmados em mulheres entre 2003 e 2008 em Cruzeiro do Sul, 2,6% estavam relacionados à pacientes grávidas (COSTA et al. 2010).
Até a década de 80, houve relativa equivalência entre as espécies parasitárias (P. vivax e P. falciparum), mas o levantamento realizado no Brasil em 2013 mostra que dos 177.722 casos confirmados de malária, 18% das infecções foram causadas pelo P. falciparum e 82% pelo P. vivax. Das 177.722 notificações realizadas nesse ano, 33.715 tiveram o estado do Acre como provável local de infecção. Dos 22 municípios que compõem o estado do Acre, 8 são considerados endêmicos para a malária, sendo 2 de alto risco, 2 de médio risco e 4 de baixo risco (SIVEP MALÁRIA, 2014).
No Brasil em 2013, 26,9 milhões de pessoas residiam em áreas de risco, distribuídas em 9 estados endêmicos. Nestes estados, dos 53 municípios considerados endêmicos, 23 são classificados com de alto risco, 15 de médio e 15 de baixo risco (Figura 1).
Figura 1- Mapa de risco da malária por Município de infecção. Brasil, 2013.
Fonte: (Sivep-Malária/SVS/MS) e (Sinan/SVS/MS).
1.2 CICLO DE VIDA DO PARASITA, TRANSMISSÃO E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A malária é uma doença causada por um protozoário do filo Apicomplexa, família Plasmodidae, gênero Plasmodium que inclui várias espécies que parasitam diferentes hospedeiros vertebrados. Apenas cinco espécies parasitam o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale (de transmissão natural apenas na África) e Plasmodium knowlesi, uma espécie de Plasmodium que infecta naturalmente símios em regiões de florestas no sudoeste asiático. A infecção por cada uma dessas espécies de Plasmodium tem suas características próprias, bem como apresentam diferenças em suas áreas de distribuição (COX-SINGH, 2012).
Dentre as cinco espécies, P. falciparum e P. vivax são as mais prevalentes no mundo. O número de casos de malária pelo P. vivax vem aumentando, e isso pode está
relacionado ao fato da presença imediata de formas sexuadas do parasita no sangue de infectados, existência de hipnozoítos, efeitos colaterais das medicações, assim como existência de cepas resistentes aos antimaláricos (BAIRD et al., 2004 e 2007; ANSTEY, 2009; OLIVEIRA-FERREIRA, 2010).
No Brasil, a grande extensão geográfica da área endêmica e as condições climáticas favorecem o desenvolvimento dos transmissores e agentes causais da malária pelas espécies de P. vivax, P. falciparum e P. malariae (este último com menor frequência) (OMS, 2009).
A malária é transmitida ao homem através da picada da fêmea do mosquito Anopheles, sendo o A. darlingi o principal vetor no Brasil. O ciclo do parasita é dividido em sexuado (que ocorre no inseto vetor) e assexuado (que ocorre no homem).
A fase sexuada se inicia quando os gametócitos ingeridos durante a alimentação são transportados para o intestino do mosquito. Como a temperatura é mais baixa, os gametas emergem das hemácias infectadas, sendo fertilizados, originando os zigotos. Estes se desenvolvem em oocistos, iniciando a esporogonia. Em seguida ocorre o rompimento do oocisto e as formas infectantes do protozoário para o ser humano, os esporozoítos, são libertados, alojando-se na glândula salivar do mosquito. (FREITAS DO ROSÁRIO, 2008) (Figura 2).
A partir da picada do mosquito, a fêmea inocula os esporozoítos do parasito na pele do hospedeiro, estes caem na corrente sanguínea, invadindo os hepatócitos. Dentro dessas células, os esporozoítos multiplicam-se e originam milhares de merozoítos (esquizogonia pré- eritrocítica). Os hepatócitos infectados se rompem e liberam, na corrente sanguínea, vesículas denominadas de merossomas contendo agregados de merozoítos em seu interior. Os merozoítos rompem os merossomas e invadem rapidamente os eritrócitos (Figura 2).
O ciclo sanguíneo (esquizogonia eritrocítica) se repete sucessivas vezes, conduzindo à lise de eritrócitos e sendo responsável pelas manifestações clínicas, hematológicas e processos patogênicos associados à doença. A ruptura de hemácias é normalmente acompanhada por episódios de febre, náuseas, dores de cabeça e outros sintomas em resposta às citocinas pró-inflamatórias sistêmicas.
Figura 2 - Ciclo de vida do Plasmodium. 1 - Os esporozoítos são inoculados na pele humana através da picada da fêmea do mosquito Anopheles. 2 - Os parasitas migram para o fígado, infectando os hepatócitos e iniciam a esquizogonia pré-eritrocítica. 3 – Parasitas seguem para o sangue (esquizogonia eritrocítica) liberando merozoítos que são responsáveis pela sintomatologia da malária. 4 - As formas sexuadas do parasita (gametócitos) são inoculadas pelo mosquito que inicia o ciclo sexuado. 5 – No intestino do mosquito ocorre a fecundação dos gametócitos e forma-se o zigoto. 6 – Os parasitas multiplicam-se e rompem o oocisto liberando esporozoítos que se alojam nas glândulas salivares do mosquito.
Fonte: http: //negritosbio.blogspot.com.br/p/doencas-provocadas-por-protozoarios_6.html. Adaptado pela autora.
As recaídas de malária por P. vivax podem ocorrer apesar da parasitemia não ser mais detectada no sangue, isso se dá pela presença dos hipnozoítos, formas latentes de Plasmodium no fígado. Por isso que a administração de cloroquina por 3 dias e de primaquina, droga que combate os hipnozoítos, por 7 dias (esquema curto) ou por 14 dias (esquema longo) é recomendado como tratamento padrão para prevenir recaídas. As possíveis causas de reincidência da infecção estão relacionadas com resistência a cloroquina, ou à primaquina, dosagem inadequada primaquina, baixa adesão à medicação, ou mesmo a reinfecção. A resistência à medicação sugere a aquisição de novas características fenotípicas por parasitos de diferentes regiões geográficas (PRICE, 2009).
Manifestações hematológicas estão presentes na infecção pelo Plasmodium como anemia, decorrente da lise eritrocitária e leucopenia periférica. Em relação às plaquetas mais recentemente, nos casos de malária por P. vivax com complicações,
tem-se obtem-servado, sistematicamente, o aparecimento de plaquetopenia. Em estudo descritivo de 43 casos de malária infectados pelo P. vivax grave, em Manaus, a média da contagem de plaquetas em pacientes graves, no dia da admissão, foi significativamente menor do que a de pacientes não-graves (DE LACERDA, 2007).
Desta maneira, pode-se dizer que durante o ciclo de desenvolvimento no hospedeiro vertebrado, o parasita pode, portanto, ser alvo da resposta imune em maior ou menor grau em função do seu estágio de desenvolvimento. Mas é durante o ciclo eritrocítico que, fundamentalmente, o sistema imune do hospedeiro responde aos antígenos parasitários levando à resposta imune efetiva contra o Plasmodium ou à imunopatologia (SILVA, 2013). Os ciclos eritrocitários repetem-se a cada 48 horas nas infecções por P. vivax, P. falciparum e P. ovale (terçã), a cada 72 horas nas infecções por P. malariae (quartã) e a cada 24 horas no P. knowlesi (COX-SINGH, 2008).
A transmissão da malária também pode ser acidental, como resultado de transfusão de sangue cujo doador esteja infectado ou de contatos involuntários com sangue contaminado. Outros episódios conhecidos de infecção da doença resultam do compartilhamento de agulhas e seringas contaminadas entre dependentes de droga injetável, cuja forma é chamada de malária induzida (VERONESI; FOCACCIA, 2006). Além disso, a transmissão congênita ou perinatal, apesar de rara, existe quando ocorre mistura do sangue materno com o fetal, ainda na fase intra-uterina ou durante o trabalho de parto (VERONESI; FOCACCIA, 2006).
1.3 RESPOSTA IMUNOLÓGICA NA MALÁRIA
1.3.1 Resposta Imune inata e adaptativa
A composição complexa do parasita apresenta moléculas com propriedades antigênicas que são responsáveis pela ativação da resposta imune do hospedeiro e garantem que a resposta imune na malária seja diversificada e estágio-específica, atuando contra as diferentes formas evolutivas do parasita. Esta resposta pode ser influenciada por fatores relacionados ao hospedeiro e pela exposição ao parasita (PLEBANSKI & HIIL, 2000; MALAGUARNERA & MUSUMECI, 2002; BECKER et al., 2004; LANGHORNE et al., 2008). A imunidade à malaria envolve tanto uma resposta inata como adaptativa.
A resposta imune inata é essencial não somente para limitar a fase inicial de multiplicação do parasita como também para a primeira onda de parasitemia, controlando a infecção até que a imunidade adaptativa seja estabelecida (STEVENSON et al., 2004).
A imunidade inata na malária compreende a participação das moléculas do sistema complemento, ativação de macrófagos, células dendríticas, células NK e NKT. As moléculas do sistema complemento causam a lise direta do parasita, os macrófagos fagocitam os parasitos livres e os eritrócitos parasitados; as células NK e NKT induzem a lise das células parasitadas (ENGWERDA & GOOD, 2005). Além destas, também participam as células dendríticas que junto aos macrófagos, iniciam a resposta imune adquirida (URBAN et al., 1999; DIALLO et al., 2008).
Durante a infecção por Plasmodium, além de atuarem como células apresentadoras de antígenos, os macrófagos apresentam um importante papel devido a sua habilidade de fagocitar eritrócitos infectados na ausência de anticorpos específicos citofílicos e/ou opsonizantes (SERGHIDES et al., 2003).
As células dendríticas iniciam a resposta imune adaptativa promovendo o estímulo de células T e B. BUENO e colaboradores em 2009 demonstraram que indivíduos naturalmente infectados por P. vivax apresentam uma modulação negativa de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que são responsáveis por apresentar de antígenos. Essa modulação pode está diretamente relacionada com a presença do eritrócito infectado (URBAN et al., 1999; URBAN et al., 2001; OCANA-MORGNER et al., 2003).
Na resposta imune inata, as células NK representam uma importante fonte inicial de IFN- e são responsáveis pela eliminação do parasito devido aos processos de citotoxidade desencadeados em resposta à infecção (OJO-AMAIZE et al., 1984; DOOLAN et al., 1999; ARTAVANIS-TSAKONAS et al., 2002).
Os loci genéticos envolvidos na rejeição de tecidos estranhos ou não próprios constituem uma região conhecida como complexo principal de histocompatibilidade (CPH), também chamado de HLA (human leukocyte antigen) em humanos (DONADI, 2000; KLEIN, 2000; TURNER, 2004). O sistema HLA é dividido, didaticamente, em três regiões: classe I, II e III. A região de classe I é composta, principalmente, pelos loci HLA-A, B, C, que codificam as moléculas presentes praticamente em todas as células nucleadas. A região de classe II engloba os loci HLA-DR, -DP e –DQ, que codificam moléculas presentes, principalmente, na superfície de células imunes, como macrófagos,
células dendríticas, monócitos, linfócitos T ativados e linfócitos B. Que atuam na apresentação de antígenos e na regulação da interação entre células e o início da resposta imune. A região de classe III possui genes que codificam componentes do complemento, como C4A, C4B e o fator B, além de conter genes para as enzimas 21-hidroxilase (CYP21), proteína do choque térmico (Hsp.70) e fatores de necrose tumoral (FERNANDES, 2003).
Vários estudos têm investigado a influência do HLA na imunologia da malária (BANIC et al., 2002;. JOHNSON et al., 2004; OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2004). Alguns dos alelos HLA-DR foram associada a uma melhor resposta de anticorpos para P. falciparum (BANIC et al., 2002; JOHNSON et al., 2004) e P. vivax (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2004). Além disso, estudos prévios têm relatado uma associação entre alelos específicos do HLA e a resposta imunológica aos antígenos da malária em ensaios de vacinas humanas (NARDIN et al., 2001; ZHANG et al., 2009), porém pouco sucesso tem-se alcançado devido à grande variabilidade antigênica relacionado aos estágios de vida do parasito (LONGLEY et al., 2015).
A imunidade adquirida na malária envolve tanto uma resposta celular como humoral. As células T são essenciais na estimulação da produção de anticorpos e na indução da imunidade celular. No início da infecção, os anticorpos podem desencadear resposta imune contra os esporozoítos ao reconhecerem a proteína circunsporozoíta (CS), localizada na superfície do parasito, e impedir a invasão dos hepatócitos.
A resposta imune adquirida contra os esporozoítos e os demais estágios hepáticos é limitada e geralmente não impede o desenvolvimento do estágio eritrocítico. Os esporozoítos, assim como as formas sexuais, possuem antígenos de superfície pouco imunogênicos do que os antígenos das formas sanguíneas, provavelmente porque os esporozoítos sofrem menor seleção pelo sistema imune do hospedeiro (STRUIK & RILEY, 2004). Essa baixa ativação da resposta imune contra formas do ciclo pré-eritrocítico pode estar associada a fatores de tolerância inerentes ao fígado ou ao tempo reduzido que o esporozoíto permanece na corrente sanguínea, antes de infectar os hepatócitos (MOORE et al., 2002).
Durante a fase hepática, a resposta imune é predominantemente celular. A redução da densidade parasitária nesse estágio depende da ativação dos linfócitos T CD8+, além de linfócitos T CD4+ capazes de polarizar a resposta para Th1 no início da infecção e direcionar a resposta para Th2 durante o curso da infecção (TAYLOR-ROBINSON et al., 1993; WINKLER et al., 1998; GREENWOOD et al., 2008).
As células T CD8+ e as citocinas INF e TNF conferem proteção contra as formas pré-eritrocíticas nos hepatócitos (SCHMIDT, 2011). O IFN é uma citocina pró-inflamatória produzida pelas células T CD8+, T CD4+ do tipo Th1, células NK e linfócitos Tγδ. Na malária, o IFN tem ação antiparasitária direta e, em sinergismo com o TNF, capaz de induzir a produção do óxido nítrico (NO) e radicais livres. A ação do IFN, assim como das demais citocinas pró-inflamatórias, deve ser controlada para que ocorra produção em nível adequado e, consequentemente, a eliminação da infecção com poucos danos para o hospedeiro (ARTAVANIS-TSAKONAS & RILEY, 2002).
Várias citocinas produzidas por linfócitos T ativados, monócitos, células de Kupffer, células NK e células endoteliais são capazes de inibir o desenvolvimento do estágio hepático, sendo que as principais citocinas envolvidas nessa fase são IFN, IL– 1, IL-6, IL-12 e TNF (FERREIRA & RIBEIRO, 2000; JASON et al., 2001; CLARK et al., 2006).
As formas sanguíneas dos plasmódios são as responsáveis pelas manifestações patológicas da doença, uma vez que os sintomas são decorrentes do desenvolvimento parasitário durante o ciclo assexuado sanguíneo. No estágio eritrocítico, potenciais alvos de uma resposta imune são os merozoítos livres ou parasitos intra-eritrocitários. Neste estágio, a eliminação do parasito parece ocorrer após desenvolvimento de uma resposta específica de anticorpos a antígenos variantes de superfície (GOOD et al., 2005).
As células T CD4+ são importantes no controle do número de parasitas sanguíneos através da secreção de citocinas, ativação de macrófagos e direcionamento para a imunidade humoral (IMAI, 2010). Na fase inicial da infecção, os linfócitos T CD4+ participam da redução da densidade parasitaria, sendo que, durante o curso da infecção, a proporção de células Th2 aumenta, favorecendo o desenvolvimento da imunidade mediada por anticorpos e, consequentemente a redução da parasitemia e a resolução da infecção patente (TAYLOR-ROBINSON et al., 1993; FONSECA et al., 2007).
Se por um lado se tem ativação de células imunológicas a fim de combater a infecção concomitantemente aparecem na corrente sanguínea, células responsáveis por limitar a ativação e proliferação excessiva dos linfócitos, limitando a magnitude de respostas imunes efetoras, o que pode incapacitar o organismo de controlar adequadamente a infecção Estas células são descritas como células regulatórias, que possuem vários marcadores e fatores de transcrição, tendo sido descritas na literatura
por alguns autores com o fenótipo CD4+FOXp3+CD25+CD127low (SEDDIKI et al., 2006; BELKAID E TARBELL, 2009).
Além dos marcadores CD25, CD127 e FOXp3, uma variedade de mediadores de células Tregs podem contribuir para a supressão de respostas imunológicas no hospedeiro, como, CTLA-4 (antígeno-4 do linfócito T citotóxico), GITR (membro da superfamília dos receptores TNF), OX40 (CD134) e ICOS (SHEVACH et al., 2006). Contudo, esses marcadores não são específicos para as células Treg, uma vez que eles também podem ser expressos em outras células T ativadas (BELKAID E TARBELL, 2009). Este estudo é pioneiro na avaliação das moléculas coestimulatórias (GITR, OX40 e ICOS) durante a malária gestacional causada pelo Plasmodium vivax.
A molécula GITR é expressa na superfície de células regulatórias naturais (BELKAID, 2005) e é regulada pela expressão do fator de transcrição FOXp3 (YAGI et al, 2004; NOCENTINI, 2007). Isso também foi demonstrado por Bueno (2010), onde houve aumento do número de circulantes CD4+CD25+FOXp3+ que coexpressam GITR em pacientes infectados pelo P. vivax. Neste contexto, pode-se sugerir que a proliferação de células regulatórias nos infectados é provocada pela expressão GITR, que possivelmente está regulada positivamente pela expressão FOXp3.
O OX40 é uma molécula, presente em linfócitos, faz parte do grupo de receptores membros da família do TNF, que são potentes ativadores da resposta efetora das células T, regulando a ação das células T CD4+ e CD8+. Também tem papel importante na geração de memória (WEINBERG, 2004; SALEK-ARDAKANI, 2006), é expresso nas células virgens que se tornaram ativadas entre 12 e 24 h (SO e CROFT, 2007), tendo um pico de expressão em 48 h, com declínio após 72 e 96 h após e estimulação via TCR (VALZASINA et al., 2005).
Estudos demonstram que a expressão de OX40 está relacionada com a proliferação, homeostase e sobrevivência das células T (ISHII et al., 2010). Na malária, os estudos com a molécula OX40 em camundongos apontam que animais com malária cerebral apresentam alta expressão de OX40 em seus tecidos cerebrais, o que gera indícios que a expressão dessa molécula exerça função na caracterização da patologia (OAKLEY et al., 2009) e a importância dessa molécula na regulação do sistema imune.
O ICOS foi inicialmente caracterizado como uma molécula facilitadora da diferenciação de células T para a produção de IL-4 e IL-10. Foi demonstrado que a expressão da molécula ICOS, está diretamente relacionada com a resposta imune e ativação celular, com grande expansão de células T CD4+ convencionais e permanência
das células Treg (LISHKE et al., 2012). A molécula ICOS exerce papel importante para os mecanismos supressores das células regulatórias.
1.3.2 Estresse oxidativo e apoptose
Em situação normal o sistema antioxidante é capaz de neutralizar a formação de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) pela mitocôndria, porém, quando há um
desequilíbrio entre os componentes pró-oxidantes e antioxidantes, ocorre o que chamamos de estresse oxidativo (ANDRADES et al., 2011). EROS é um termo coletivo
para descrever os radicais livres: anion superóxido (O2-), radical hidroxila (OH-),
radicais peroxila (RO2) e radicais alcoxila (RO) e o peróxido de hidrogênio (H2O2),
embora este último não seja derivado das espécies do oxigênio (CIRCU & AW, 2010). As EROs são produzidas em consequência de processos fisiológicos. E em grandes quantidades durante uma infecção, por células fagocíticas com a finalidade de destruir os micro-organismos invasores (EVANS, 2000; BULGUER, 2001). Por outro lado, quando sua produção é exacerbada existe efeitos deletérios como dano tissular, inflamação, dentre outros (VASCONCELOS et al., 2007).
A infecção pelo Plasmodium é acompanhada por grande aumento do estresse oxidativo, resultado da produção de EROS. Essa produção ocorre por dois mecanismos
separados: o primeiro envolve a degradação da hemoglobina do hospedeiro pelo parasita intracelular, com a oxidação do Fe+² na forma Fe+³ após a separação da heme da globina, produzindo elétrons que reagem com o oxigênio molecular para a formação das EROS. O segundo mecanismo é resultado da ativação da resposta imune do hospedeiro,
pela produção de citocinas (TNF-α e INF-γ) que leva a ativação dos fagócitos e produção EROS principalmente por linfócitos e macrófagos (PABON, et al. 2003).
Como resultado da alta taxa metabólica, os parasitas se multiplicam rapidamente e grandes quantidades de substâncias tóxicas são geradas. Na infecção malárica, a elevação de EROS pode danificar os tecidos, como endotélio do hospedeiro e exercer
um papel significativo na morbidade da doença por causar ativação de produtos inflamatórios e consequentemente aumentar o estresse oxidativo sobre os eritrócitos o que pode contribuir para a hemólise e desenvolvimento da anemia (BECKER et al., 2004). Estudos apontam que indicadores de estresse oxidativo, especificamente da peroxidação de lipídios, como o malondialdeído (MDA), estão aumentados em amostras de sangue de pacientes trombocitopênicos infectados com P. vivax, demonstrando que
as EROS exercem importante papel nas alterações funcionais e estruturais das plaquetas
e no mecanismo da trombocitopenia na malária (ARAUJO et al., 2008).
Além de produzir EROS, a cadeia respiratória mitocondrial pode produzir Óxido
Nítrico (NO), através da ativação da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS) (GRIFFITH et al., 1995). Estes subprodutos são chamados espécies reativas de nitrogênio (RNS)
(PATERSON et al., 2000).
Em mamíferos, o NO participa de diversas funções biológicas que vai desde a regulação da pressão sanguínea (formado a partir da isoforma eNOS) e o processo da neurotransmissão (à partir da isoforma nNOS); até a formação de um mecanismo de proteção contra diversos micro-organismos (à partir da isoforma iNOS) (ALDERTON et al., 2001).
Apesar de evidenciado, o papel do NO na malária ainda é bastante controverso, principalmente no que diz respeito às várias isoformas de enzima e às diferentes locais de produção de NO. No entanto, a produção de NO pela iNOS parece ter um papel de destaque na infecção (MACCHI et al, 2010; MACHI et al, 2013). O NO produzido pelo sistema imunológico em resposta a infecção leva a uma maior ativação endotelial o que resulta na liberação de citocinas e outros mediadores inflamatórios, incluindo IL-12 e IFN que permitem às células ativar respostas imunes (HAN et al., 2009).
Outras manifestações da doença como distúrbios respiratórios e malária placentária, têm sido relacionadas com as alterações no estado redox (BECKER et al., 2004), mas a relação entre o estresse oxidativo e a malária placentária necessita de mais investigações.
A presença de estresse oxidativo leva a danos nas macromoléculas celulares e promove a morte celular (CIRCU & AW, 2010). A apoptose celular é iniciada por sinais intracelulares e extracelulares por duas vias principais: via mitocondrial (intrínseca) e receptores de morte de membrana (extrínseca).
A via extrínseca é mediada por receptores de morte através da membrana celular, incluindo a superfamília dos receptores do TNF, entre eles o TNFR-1, TRAIL e CD95 Fas. Esse último, quando ligado ao ligante específico, Fas-L, sinaliza a agregação e formação de um complexo indutor de morte que recruta a caspase-8 e após ativa as caspases efetoras (caspase-3) (CIRCU & AW, 2010).
A infecção com Plasmodium falciparum causa apoptose das células mononucleares através da participação dos receptores CD95 (Fas/APO-1) e linfocinas (ARIBOT et al., 1996). A literatura descreve que a diminuição dos linfócitos do sangue
periférico é observada em pacientes portadores da malária aguda causada por P. falciparum e P. vivax. E que os processos que podem estar envolvidos são: o de sequestro pelos nódulos linfáticos e também pela morte dessas células por apoptose (RICCIO et al, 2003).
O aumento dos níveis de apoptose foi observado em linfócitos de pacientes com P. falciparum e P. vivax, quando estas células foram cultivadas por 24 horas, sendo que as células T CD4+ foram mais susceptíveis que os linfócitos T CD8+ (RICCIO, et al., 2003). Esta ocorrência da morte por apoptose das células imunes tem sido mostrada em vários estudos realizados em humanos e modelos animais com vários efeitos sobre a gravidade da doença (KASSA et al., 2006). Contudo, a contribuição do estresse oxidativo para o dano no DNA e morte celular em pacientes infectados com malária causada pelo P. vivax foram pouco investigadas e necessitam ser caracterizadas.
1.4 MALÁRIA GESTACIONAL
Na vivência prática a malária associada à gravidez (PAM) é utilizada para definir qualquer infecção pelo parasita durante a gestação, que pode ocorrer em três manifestações: malária gestacional, placentária e/ou congênita. Nesse contexto, a malária gestacional é definida como a evidência de infecção por Plasmodium durante a gravidez ou a presença do plasmódio no sangue periférico detectado por microscopia (ATAÍDE et al., 2015), através da confirmação feita pelo exame de gota espessa, que é o teste recomendado para o diagnóstico em locais endêmicos (CAMPOS et al., 2011). A malária placentária é a presença do parasita, encontrado por testes específicos (incluindo histopatologia) na placenta e malária congênita, é a detecção do Plasmodium no sangue periférico ou cordão umbilical do recém-nascido.
A malária placentária provoca alterações tais como inflamação, deposição de fibrina e infarto interviloso, que podem persistir até o parto e consequentemente afetar a função materno-placentária, contribuindo para resultados adversos no nascimento e aumento da mortalidade e morbidade perinatal (WALTER et at., 1982).
A presença do Plasmodium, assim como seus produtos leva ao acúmulo de células e produtos inflamatórios na microvasculatura placentária, danificam a integridade da mesma e interferem com sua capacidade de transportar nutrientes e oxigênio para o feto. Estudos mostram que isso leva a anemia materna, um aumento da
chance de aborto, diminuição do crescimento intra-uterino e baixo peso ao nascer e natimortos principalmente em infecções pelo P. falciparum. (ROGERSON et al., 2007; DESAI et al., 2007).
Em relação ao P. vivax, com o aumento de casos graves da Ásia e da América do Sul (LACERDA et al., 2012; NURLEILA et al., 2012), as consequências da infecção durante a gravidez ainda precisam ser elucidadas, mas estudos também têm demonstrado que eritrócitos infectados por P. vivax aderem no espaço interviloso, embora em menor grau se comparado com P. falciparum (CARVALHO, 2010; MARIN-MENENDEZ, 2013) e sequestro de glóbulos vermelhos infectados foram encontrados na circulação sanguínea profunda (ANSTEY, 2007; ANSTEY, 2009). Sendo assim, infecções pelo P. vivax também podem exercer seus efeitos adversos sobre o feto através da anemia materna ou indução de uma potente resposta inflamatória com a produção abundante de citocinas, o que vai interferir nos mecanismos uteroplacentários (ANSTEY, 2009; BRABIN, 2004).
A literatura reforça que as alterações histológicas placentárias na infecção pelo P. vivax podem ser relacionadas aos efeitos periféricos, como anemia, febre e liberação de citocinas isso porque as interações do P. vivax com os eritrócitos infectados não são consideráveis como as interações com o P. falciparum. (MAYOR 2012; SOUZA et al, 2013). Isto porque o P. vivax tem raros receptores placentários quando comparado ao P. falciparum (MCLEAN et al, 2015).
Após a fecundação, citocinas pró-inflamatórias contribuem com a implantação e remodelação das artérias para garantir o fornecimento de sangue adequado para o embrião (PICCINNI, 2010). Após a implantação do embrião ocorre a produção de citocinas predominantemente do perfil Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) por linfócitos T CD4+, que garantem a manutenção de um ambiente que tolere bem o feto e o desenvolvimento de uma gravidez saudável (WEGMANN, et al., 1993).
Por outro lado, durante a infecção malárica há a produção de citocinas como TNF-α (SUGUITAN et al., 2003; ROGERSON et al., 2003), IFN-γ (FRIED et al., 1996; MOORE et al., 1999), IL-1β (MOORMANN et al., 1999) e IL-2 (FRIED et al., 1998), no sangue periférico que promovem a proliferação de células T e aumentam a atividade fagocitária de macrófagos pela produção de óxido nítrico (TAYLOR-ROBINSON E SMITH, 1999). Altos níveis de citocinas inflamatórias circulantes durante os paroxismos de P. vivax no sangue periférico (KARUNAWEERA, 2003)
podem ser suficientes para prejudicar o crescimento fetal e causar anemia materna (NOSTEN, 2004).
Na infecção malárica a anemia é a mais comum complicação em gestantes, sendo agravada pela anemia provocada pela própria gestação, tendo uma etiologia multifatorial. Durante a gestação as concentrações de hemoglobina (Hb) e hematócrito (Ht) reduzem drasticamente por conta do aumento da vascularização pela necessidade de uma maior perfusão sanguínea útero-placentária. Na infecção pelo Plasmodium, há aumento na destruição das hemácias devido à ruptura de eritrócitos, fagocitose e febre; além da diminuição na produção de hemácias e alterações na produção de citocinas (SOUZA et al., 2002) como já discutido anteriormente. Além disso, a formação de rosetas é um fenótipo de citoaderência encontrado frequentemente em infecções P. vivax e tem sido associado com um aumento do risco para a anemia (MARÍN-MENÉNDEZ, 2013).
A sintomatologia da malária nas gestantes é semelhante aos demais grupos acometidos, com episódios de febre, calafrios, sudorese, anemia e mal estar geral. Nos casos graves as pacientes apresentam-se em coma com convulsões, choque circulatório, pressão sistólica baixa (<50mmHg), anemia grave (Hb <5g/dl), insuficiência renal, baixa produção de urina (<400ml/dia), angústia respiratória e hipoglicemia (<40mg/dl) (RUBIO, 2000).
A gravidade das manifestações clínicas é determinada pelo grau de imunidade pré-gestacional o que depende da intensidade e da estabilidade da transmissão local de malária. Estudos revelam que em áreas em que ela é baixa ou instável, o grau de imunidade é baixo, e tanto a mãe como o feto podem apresentar doença grave. (CHAGAS, 2009).
Pesquisas também apontam que a imunidade adquirida contra a malária é menor em mulheres primigestas infectadas pelo P. falciparum por não terem imunidade às proteínas específicas do Plasmodium que conferem citoaderência na placenta. Em gestações subsequentes, com o desenvolvimento da imunidade contra as proteínas do parasita na placenta, há redução de efeitos adversos da malária para a mãe e o feto (DUFFY, 2007).
O processo de aquisição da imunidade contra a malária durante a gravidez só começa quando a mulher residente em área endêmica fica grávida, uma vez que a imunidade adquirida previamente em infecções anteriores, não a protege contra a infecção placentária (BEESON E DUFFY, 2005; DUFFY E FRIED, 2005). Portanto, a
exposição repetida a determinados fenótipos de parasitas ao longo de várias gestações, pode resultar em algum grau de proteção. Os níveis de anticorpos contra antígenos presentes na superfície dos eritrócitos placentários infectados são baixos antes da gravidez e aumentam com gestações sucessivas em mulheres expostas ao P. falciparum (FOWKES et al., 2012).
Apesar das alterações ocasionadas pela malária serem comuns em qualquer época da gestação, estudos realizados em áreas de transmissão ativa de malária na Amazônia Legal, como Manaus, Belém, Rio Branco, Macapá e Porto Velho, indicam que o risco de sinais gravidade ocorre com maior frequencia no último trimestre devido as modificações fisiológicas do corpo materno, como aumento do volume plasmático, retenção de líquidos, entre outras (ALMEIDA, 2008). Sendo que a instalação da infecção malárica nesse período gestacional pode contribuir para a acometimento de outras doenças vasculares (CALVOSA, 1995; JARUDE, 2003; SANTOS, 2011; SIMÕES, 2006).
Há um grande interesse no estudo pela malária, entretanto, vários mecanismos imunológicos associados a essa doença em indivíduos gestantes ou não ainda precisam ser compreendidos. Sendo assim, esse estudo realiza a descrição de aspectos epidemiológicos e a caracterização imunológica de indivíduos gestantes ou não infectados pelo Plasmodium vivax residentes no município de Cruzeiro do Sul (AC). Através da análise dados hematológicos, da presença de marcadores de ativação, apoptose, de células virgens, de memória ou regulatórias presentes nos leucócitos do sangue periférico dos infectados. Além disso, avalia mediadores inflamatórios em amostras de plasma de indivíduos infectados pelo Plasmodium vivax.
Nesse contexto, a importância desse trabalho se relaciona com aspectos relevantes da resposta imunológica em especial em gestantes quando da infecção pelo P. vivax. Poucos estudos existem na literatura que abordam essa temática e neste sentido, os resultados aqui apresentados podem propiciar um maior entendimento dos mecanismos de regulação do sistema imunológico durante processos infecciosos. Além disso, alguns marcadores de ativação e regulação do sistema imune foram estudados pela primeira vez em pacientes infectados pelo Plasmodium vivax, inclusive gestantes. Estas informações poderão auxiliar o desenvolvimento de novas estratégias de controle da infecção por este parasita, permitindo assim uma melhora na qualidade de vida das pessoas acometidas.
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Realizar um levantamento epidemiológico e a caracterização imunológica de indivíduos gestantes ou não, infectados pelo Plasmodium vivax no município de Cruzeiro do Sul (AC) em comparação com indivíduos sadios.
2.2 ESPECÍFICOS
Caracterizar os aspectos epidemiológicos e hematológicos durante a malária causada pelo Plasmodium vivax.
Analisar as alterações das populações de leucócitos do sangue periférico de indivíduos gestantes e não gestantes infectados pelo Plasmodium vivax e sadios;
Investigar a ativação de leucócitos de amostras de sangue periférico de indivíduos gestantes e não gestantes infectados pelo Plasmodium vivax e sadios;
Avaliar a produção de mediadores inflamatórios em amostras de plasma de indivíduos gestantes e não gestantes infectados pelo Plasmodium vivax e sadios.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 POPULAÇÃO ESTUDADA E ASPECTOS ÉTICOS
Os indivíduos que participaram deste estudo foram provenientes do município de Cruzeiro do Sul (AC), maiores de 18 anos e de ambos os gêneros. Amostras de todos os indivíduos foram submetidas ao exame de gota espessa para identificação da espécie de plasmódio e análise da parasitemia. As amostras foram coradas com Giemsa usando-se o método tradicional (Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária, 2005, Ministério da Saúde) e a contagem de parasitos foi realizada em microscópio óptico. Para a estimativa dos níveis de parasitemia foi usado o método tradicional semi-quantitativo (método de cruzes). Foram analisados 33 indivíduos acometidos pela malária, sendo 25 não gestantes (homens e mulheres) e 8 gestantes. Todos os pacientes foram analisados na fase aguda da doença (antes do tratamento).
Participaram do estudo também 20 indivíduos sadios e que nunca contraíram qualquer tipo de malária anteriormente, 10 não gestantes (homens e mulheres) e 10 gestantes residentes no Estado do Maranhão.
Por tratar-se de uma pesquisa que envolve seres humanos a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Ceuma (protocolo 00879/09, de 17/12/2009 ANEXO B) e pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Acre (protocolo 136622/12).
3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Integraram o estudo indivíduos de ambos os gêneros, com idade acima de 18 anos, com exame da gota espessa (método de Giemsa) positiva para Plasmodium vivax, que aceitaram participar do estudo, assinaram um Termo de Consentimento Livre e esclarecido (APÊNDICE A) e que responderam ao questionário clínico-epidemiológico (ANEXO A). Como controles participaram indivíduos sem histórico de infecção recente, que passaram por uma entrevista e realização de hemograma.
3.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Indivíduos que fazem uso de anti-inflamatórios não esteróides e/ou esteróides, que se negaram a participar do estudo e a assinar o termo de esclarecimento livre e esclarecido, ou que apresentavam outras co-morbidades.
3.4 COLETA E ESTOCAGEM DE MATERIAL
Em tubos com heparina, cerca de 3 ml de sangue foram coletados de cada indivíduo após a identificação da doença realizada por meio do exame de gota espessa, feito por técnicos treinados em indivíduos com suspeita de malária.
Foram coletadas amostras de sangue total, por punção venosa periférica. No momento da coleta as lâminas de gota espessa e esfregaço do sangue foram preparadas para posterior confirmação da parasitemia e captura de imagens utilizando microscópio óptico (Axio imager Z2, Carl Zeiss) da Universidade Ceuma.
Todo o material obtido no campo foi acondicionado e mantido sob refrigeração por no máximo 6 horas até o processamento laboratorial. As amostras foram encaminhadas para o Centro de Estudos e Pesquisas em Doenças Infecciosas – CEPDI/ Instituto da Biodiversidade/Universidade Federal do Acre (UFAC) – Campus Floresta, para serem então utilizadas para os experimentos obtendo-se amostras de sangue para realização de hemograma, separação de plasma para os estudos do perfil de produção citocinas, anticorpos séricos, óxido nítrico e peróxido de hidrogênio e separação leucócitos para os experimentos de caracterização fenotípica e funcional através de citometria de fluxo.
3.5 HEMOGRAMA, SEPARAÇÃO DE PLASMA E ISOLAMENTO DE CÉLULAS DO SANGUE PERIFÉRICO COM TAMPÃO DE LISE
Um total aproximado de 1 ml do sangue coletado foi processado no analisador automático (ABX Micros 60 - HORIBA) para realização de hemograma. O restante das
