Desenvolvimento de vacinas recombinantes e de teste de
diagnóstico para controle da linfadenite caseosa
Andréa de Fátima Silva Rezende
Pelotas, 2013
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
DESENVOLVIMENTO DE VACINAS RECOMBINANTES E DE
TESTE DE DIAGNÓSTICO PARA CONTROLE DA
LINFADENITE CASEOSA
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia da Universidade
Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Biotecnologia)
Orientadora: Sibele Borsuk
Dados de catalogação na fonte:
Maria Beatriz Vaghetti Vieira – CRB-10/1032 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
R467d Rezende, Andrea de Fatima Silva
Desenvolvimento de vacinas recombinantes e de teste de diagnóstico para controle da linfadenite caseosa / Andrea de Fatima Silva Rezende. – 94f. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2013. – Orientador Sibele Borsuk.
1.Biotecnologia. 2. Vacinas recombinantes. 3. CP0369. 4. ELISA. 5. Linfadenite caseosa. I.Borsuk, Sibele. II.Título.
Banca examinadora:
Prof. Dr Alan McBride, Universidade Federal de Pelotas
Profª Drª Daiane Hartwig, Universidade Federal de Pelotas
Profª Drª Sibele Borsuk, Universidade Federal de Pelotas (Orientadora)
Drª Silvana Marchioro, Universidade Federal de Pelotas
Dedico este trabalho aos meus pais Fátima e Anselmo (in memoriam) e ao meu filho João Henrique por todo amor e carinho.
Agradeço a Deus Pai que em sua infinita misericórdia me deu sabedoria e forças para enfrentar esse desafio.
A minha orientadora Profª Sibele Borsuk por toda confiança e incentivo
durante todo o Mestrado. Muito obrigada por todo carinho e por ser uma verdadeira amiga, sendo um grande exemplo de caráter, humildade e
profissionalismo. Serei grata por toda a minha vida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e à Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade.
Ao meu esposo Carlos Davi, grande parceiro, por todo apoio, paciência e companheirismo nesta caminhada.
Ao meu filho João Henrique por ser minha maior inspiração.
A minha família, principalmente a minha Mãe por me fazer sempre acreditar que sou capaz, por todo amor e carinho.
A minha grande amiga Betânia por toda força e por me aguentar em momentos difíceis .... Valeu flor !!!
Aos meus companheiros de luta do LPDI Alexandre, Cristiane, Márcia, Henrique, Carlos, Alex e Suelen por todo apoio. Em especial a minha “filhusca” Karen por todo carinho e incentivo. Sem vocês eu não teria conseguido.
As minhas queridas Drielly e Gabriela por toda ajuda inicial assim que cheguei ao laboratório. Nunca esquecerei o que vocês fizeram por mim.
Aos professores Alan McBride, Lucielli Savegnago, Daiane Hartwig, Odir Dellagostin, Fabiana Nora, Cláudia Hartleben e Luciano Pinto.
A equipe do Biotério Central, pela atenção e incontáveis auxílios.
Ao meu eterno amigo Professor Ricardo Scher por toda força e por sempre acreditar no meu potencial.
Aos meus amigos sergipanos que mesmo longe sei que torcem por mim Taniara, Alécia, Péricles, Karynne, Inês, Edna, Josinaldo, Jane, Wanessa, Dani, Rose e Geraílda.
Aos demais amigos gaúchos que me ajudaram muito sempre que precisei Helena, Karine, Gizele, Bianca, Sérgio, Charles, Andressa,Thaís, André, Carol Rizzi, Vânia, Neida, Ivânia e Wallace.
A amiga Regina Suarez por todo apoio e carinho.
A todos que não foram mencionados aqui, mas que de alguma forma
foram importantes e contribuíram para mais uma etapa na minha vida.
"É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar;
É melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver ..."
% Porcentagem
BHI Brain Heart Infusion
C Citosina
DL50 Dose letal para 50% da população em teste
DNA Ácido desoxirribonucleico
ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
fagA Proteína Integral de Membrana
fagB Transportador de enterobactina de ferro
fagC ATP-proteína de ligação da membrana
fagD Sideróforos – proteína de ligação de ferro
G Guanina
h Hora
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IFN Interferon
IgG Imunoglobulina G
IPTG Tio-galactopiranosídeo de isopropila
kDa Kilodalton
LB Meio de cultura Lúria-Bertani
LC Linfadenite caseosa
Mb Mega bases
mM Milimolar
mPCR Multiplex-PCR
ºC Graus Celsius
P.S.N.C Projeto Senador Nilo Coelho
pb Pares de base
PBS Solução Fosfato Salina
PBS-T Solução Fosfato Salina com Tween-20
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
RNA Ácido ribonucleico
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Tris-HCl Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride
Β Beta
μg Micrograma
Μl Microlitro
MANUSCRITO 1
Tabela 1: Grupos e preparações vacinais utilizadas no experimento...50
MANUSCRITO 1
FIGURA 1: Western Blotting utilizando anticorpo monoclonal anti- 6Xhis Tag
(Sigma)...51
FIGURA 2: Avaliação da transfecção de células CHO com o DNA do vetor
PTARGET/0369 e pTARGET por Reação de Imunoflurorescência Indireta (RIFI)...52
FIGURA 3: Avaliação da antigenicidade da proteína rCP0369 através de Western
Blotting utilizando soros de ovinos positivos e negativos para
LC...53
FIGURA 4: Curva de sobrevivência dos animais imunizados com as diferentes
formulações vacinais após desafio com a cepa Mic6 de C.
psudotuberculosis...54
FIGURA 5: Determinação do nível de IgG total através de ELISA indireto utilizando a proteína recombinante rCP0369 nos grupos experimentais pós-imunização...55
MANUSCRITO 2
FIGURA 1: Western Blotting utilizando anticorpo monoclonal anti- 6Xhis Tag (Sigma)...73 FIGURA 2: Análise do ELISA-rCP0369 através do Receiver Operating
Characteristic (ROC) usando 182 amostras de soros de
ovinos...74 FIGURA 3: Valor preditivo positivo e negativo associado ao ELISA-r0369 em vários níveis de prevalência de linfadenite caseosa...75
REZENDE, Andréa. DESENVOLVIMENTO DE VACINAS RECOMBINANTES E TESTE DE DIAGNÓSTICO PARA LINFADENITE CASEOSA. 2013.93f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A linfadenite Caseosa (LC) é uma doença que acomete principalmente pequenos ruminantes sendo causada pela bactéria Corynebacterium
pseudotuberculosis. No Brasil a prevalência clínica da LC é de 30%. As
medidas de controle são a vacinação e o diagnóstico dos animais infectados. As vacinas disponíveis comercialmente não são totalmente eficazes, o mesmo ocorre com os métodos de diagnóstico, pois os sinais clínicos não são perceptíveis de imediato. Através de sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos, dentre eles o gene
cp1002_0369, que codifica para uma proteína secretada sendo esta descrita
provavelmente como uma fosfoesterase, potencialmente antigênica, a qual pode vir a ser utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes e no desenvolvimento de testes de diagnóstico. Esta proteína foi utilizada na forma recombinante como vacina de subunidade e como vacina de DNA e também para o desenvolvimento de um teste de diagnóstico baseado em ELISA. Para isso o gene cp1002_0369 foi clonado no vetor de expressão em eucariotos pTARGET e de expressão em procariotos pAE. A proteína CP0369 recombinante foi purificada e avaliada como vacina recombinante associada aos adjuvantes xantana e hidróxido de alumínio e em um ELISA indireto com soros de ovinos. O potencial imunoprotetor foi avaliado em modelo murino
através de desafio com a 104 UFC da cepa Mic6 de C. pseudotuberculosis em
9 grupos vacinais. A formulação vacinal que aumentou a taxa de sobrevida dos animais após o desafio foi o grupo contendo a proteína recombinante (rCP0369 + hidróxido de alumínio). O ELISA para diagnóstico de LC foi avaliado através da análise ROC em um total de 182 soros revelou uma sensibilidade e a especificidade de 90% e 75,6%, respectivamente. O formato de ELISA (ELISA-rCP0369) pode ser utilizado no diagnóstico de LC em rebanhos ovinos com bom índice de sensibilidade. No entanto, novas estratégias vacinas empregando a proteína CP0369 serão avaliadas para melhorar a eficácia da vacina.
Palavras chaves: CP0369. Vacinas recombinantes. ELISA. Linfadenite caseosa
REZENDE, Andréa. DESENVOLVIMENTO DE VACINAS RECOMBINANTES E TESTE DE DIAGNÓSTICO PARA LINFADENITE CASEOSA. 2013.93f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
The caseous lymphadenitis (CLA) is a disease that affects mainly small ruminants and is caused by the bacteria Corynebacterium pseudotuberculosis. In Brazil the clinical prevalence CLA is 30%. The control measures are vaccination and diagnosis of infected animals. Currently, commercial vaccines are not completely effective, the same occur with the methods of diagnosis, because the medical signs are not immediately detectable. By sequencing and additional proteomic analysis, several targets were identified, including
cp1002_0369 gene, which codifies a secreted protein which is probably
described as a potentially antigenic phosphoesterase, that can subsequently be used in the development of recombinant vaccines and development of diagnostic tests. This protein was used as recombinant and it was tested as subunit vaccine and as a DNA vaccine and also to develop a diagnostic test based on ELISA. For this, the cp1002_0369 gene was cloned in the eukaryotic expression vector pTARGET and in a vector of expression in prokaryotes pAE. The recombinant protein CP0369 was purified and evaluated as a recombinant vaccine associated with both of the adjuvants xanthan and aluminum hydroxide and then measured in an indirect ELISA with sheep serum. The immunoprotective potential was assessed in a murine model by challenge with 104 CFU of strain Mic-6 of C. pseudotuberculosis in 9 vaccinal groups. The vaccine formulation that increased the survival rate of animals after challenge was the group containing the recombinant protein (rCP0369 + aluminum hydroxide). The ELISA for diagnostic of CL was evaluated by ROC analysis of 182 sera and showed a sensitivity and specificity of 90% and 75.6%, respectively. The format of ELISA assay (ELISA-rCP0369) can be used in the diagnosis of LC sheep herds with a good sensitivity index. However, new vaccine strategies employing the CP0369 protein will be evaluated to improve the effectiveness of the vaccine.
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 18
2.1 Aspectos microbiológicos e bioquímicos ... 18
2.2 Epidemiologia ... 19
2.3 Impactos Econômicos ... 20
2.4 Resposta Imune ... 21
2.5 Transmissão ... 22
2.6 Determinantes moleculares de virulência e patogenicidade ... 23
2.7 C. pseudotuberculosis e estudos de genômica e proteômica ... 24
2.8 CP0369 uma possível Fosfoesterase ... 26
2.9 Diagnóstico ... 27
2.10 Vacinas... 28
3. OBJETIVOS ... 32
3.1.Objetivo Geral ... 32
3.2. Objetivos Específicos ... 32
4. MANUSCRITO 1: Fosfoesterase recombinante (Cp1002_0369): avaliação como vacina de subunidade para Linfadenite Caseosa...33
5. MANUSCRITO 2: Desenvolvimento de um ELISA indireto utilizando a proteína recombinante CP0369 de Corynebacterium pseudotuberculosis para diagnóstico de linfadenite caseosa em ovinos...57
6. CONCLUSÕES ... 76
1. INTRODUÇÃO GERAL
A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença crônica, infectocontagiosa, que acomete pequenos ruminantes, acarretando sérias perdas econômicas para as atividades de ovinocaprinocultura. É reconhecida como doença de importância mundial, em decorrência da alta prevalência e pelos prejuízos econômicos nos rebanhos (D'AFONSECA et al. 2008). É causada pelo Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria gram-positiva, intracelular
facultativa (D'AFONSECA et al. 2010), pleomórfica e anaeróbica facultativa. C.
pseudotuberculosis são microrganismos cosmopolitas, encontrados predominantemente no solo, na pele, ou mucosas dos animais e, ao abrigo da luz solar direta, pode manter-se viável por longos períodos no ambiente e em secreções purulentas por 6 a 12 meses (BINNS et al. 2002). A forma mais
comum de infecção por C. pseudotuberculosis em animais de produção é causada
pela contaminação de água, alimentos e feridas por descargas purulentas resultantes da fistulação dos abscessos (BAIRD AND FONTAINE 2007).
O Brasil é o 8º maior criador de ovinos e caprinos do mundo com cerca de 26 milhões de cabeças sendo 34% de caprinos e 66% de ovinos. A maior parte do rebanho se localiza na região Nordeste, onde se concentram aproximadamente 9,6 milhões de animais (IBGE 2010). Nesta região, estima-se que a prevalência da doença em rebanhos estima-seja de aproximadamente 30%. Em alguns estados brasileiros como Minas Gerais a prevalència da doença pode chegar a 70% em rebanhos ovinos e 80% em caprinos (SEYFFERT et al. 2010).
Considerando que o tratamento da LC é de alto custo e ineficaz, a medida de melhor custo-benefício contra a disseminação da LC é a imunização. Entretanto, não existe uma vacina eficiente e protetora contra C. pseudotuberculosis. Vários estudos relatam diferentes estratégias que vêm sendo testadas, como o uso de bactérias atenuadas ou inativadas, frações contendo antígenos da parede da bactéria ou do sobrenadante de cultura bacteriana e ainda uma mistura de componentes celulares e sobrenadante (DORELLA et al. 2009). Todas as preparações ofereceram certo grau de proteção contra infecções experimentais e até mesmo naturais. Contudo, os níveis de proteção e a severidade das lesões são variáveis. Vacinas de DNA contra LC já foram testadas, porém com resultado pouco satisfatório (COSTA et al. 2011;De Rose et al.2002).
A identificação de determinantes moleculares presentes no genoma da
bactéria C. pseudotuberculosis permite a formulação de novas estratégias
vacinais, como as vacinas recombinantes, as quais podem possibilitar um controle mais efetivo da LC nos rebanhos (D'AFONSECA et al. 2008). Alguns antígenos já foram avaliados nesta abordagem (BURREL 1980; HODGSON et al. 1990; HODGSON et al. 1999; De ROSE et al. 2002; FONTAINE et al. 2006), no entanto apresentaram proteção pouco satisfatória.
Os dados genômicos sobre C. pseudotuberculosis foram obtidos a partir do
sequenciamento de várias linhagens deste microrganismo (SILVA et al. 2011; PINTO et al. 2012; SOARES et al. 2012; PETHICK et al. 2012b). Através dos dados de sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos importantes, dos quais pode-se citar o gene
cp1002_0369, que codifica para uma provável proteína secretada sendo esta
uma possível fosfoesterase (SANTOS et al. 2012), potencialmente antigênica, a qual pode vir a ser utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes e de um teste de diagnóstico baseado em ELISA.
Com a finalidade de obter uma vacina protetora e mais segura, diferentes estratégias vêm sendo testadas, como vacinas recombinantes de subunidade e de DNA em caprinos e ovinos. Ambas apresentam potencial protetor sem riscos de causar a doença. Além disso, as vacinas de DNA têm
diversas vantagens como estabilidade, baixo custo de produção além de induzir ambos os tipos de imunidade, celular e humoral (BABIUK et al. 2000).
Assim, devido à tamanha relevância econômica e social da ovinocaprinocultura em nosso país e, concomitantemente a este fato, a inexistência de uma vacina nacional eficaz contra LC, este estudo tem como objetivo desenvolver vacinas recombinantes e um teste de ELISA diagnóstico utilizando a proteína recombinanterCP0369 . A utilização da proteína rCP0369 como vacina de subunidade recombinante administrada a diferentes adjuvantes, bem como na estratégia de vacina de DNA contendo a sequencia codificadora do gene cp1002_0369 é apresentado no Manuscrito 1, e a utilização da proteína CP0369 recombinante em um ELISA indireto com soros de ovinos é apresentada no Manuscrito 2. Ambos serão submetidos ao periódico Veterinary Microbiology.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos microbiológicos e bioquímicos
C. pseudotuberculosis é o agente causador da linfadenite caseosa. Esta
bactéria pertence ao gênero Corynebacterium e à ordem dos Actinomicetos,
predominantemente gram-positivos. Este gênero é composto por 50 espécies, algumas das quais podem ser patogênicas para animais e plantas. O gênero
pertencente ao grupo CMNR (Corynebacterium,Mycobacterium,Nocardia e Rhodococcus)
(HARD 1975; SONGER et al. 1988; PAULE et al. 2004), o qual é um grupo que apresenta características específicas, como uma parede celular peculiar e um alto conteúdo de guanina e citosina (47-74%) em seu genoma (GARG AND CHANDIRAMANI 1985; FUNKE et al. 1995; NAVAS 1996; DORELLA et al. 2006b).
C.pseudotuberculosis foi descrito pela primeira vez em 1888 pelo veterinário francês Edmound Nocard (BENHAM et al. 1962). Em 1891, Hugo Von Preisz isolou uma bactéria semelhante de um abscesso renal ovino. A partir daí o patógeno foi nomeado de bacilo de "Preisz-Nocard”, denominação que perdurou por décadas. A nomenclatura atual foi adotada em 1948 na sexta
edição do Manual Bergey, e a designação Corynebacterium ovis é usada como
sinônimo (MOORE et al. 2010).
A bactéria C. pseudotuberculosis é pleomórfica, detentora de fímbrias,
imóvel e anaeróbica facultativa. Exibe formas que variam desde cocóides a bastões filamentosos, não possui cápsula e não esporula. Suas dimensões variam de 0,5 a 0,6 micrometros por 1,0 a 3,0 micrômetros (DORELLA et al. 2006b).
A presença de dois biovares denominados equi e bovis demonstra uma variabilidade nas características bioquímicas do C. pseudotuberculosis que são
definidas pela sua capacidade de produzir a enzima nitrato-redutase, que permite a conversão do nitrato para nitrito em provas bioquímicas (BATEY
1986a). O biotipo equi possui capacidade de reduzir o nitrato a nitrito, enquanto
o biotipo ovis não reduz este substrato. O biotipo equi infecta preferencialmente
os equinos, enquanto o biotipo ovis acomete os pequenos ruminantes. Os
bovinos podem ser infectados pelos dois biovares, com predomínio do equi
(SONGER et al. 1988).
As reações bioquímicas de isolados de C. pseudotuberculosis variam,
principalmente em sua habilidade de fermentação. Todas as linhagens produzem ácido, mas não gás, a partir de fontes de carbono incluindo glicose, frutose, maltose, manose, e sacarose (HOLT et al. 1994). O peptideoglicano apresenta, além de outros constituintes, o ácido meso-diaminopimelico relacionado a resistência da parede celular contra a maioria das peptidases, mas a arabinose e galactose são os principais açúcares da parede (DORELLA et al. 2006b).
As afecções causadas por essa bactéria em animais de produção (ovinos, caprinos e equinos) geram grandes prejuízos aos produtores, que incluem a depreciação da pele e lã, redução na produção de carne e leite em ruminantes, indisponibilidade para o exercício ou treinamento em equinos e morte ocasional de animais com disseminação sistêmica do organismo. Tais perdas econômicas são significativas na ovinocaprinocultura em diversos países do mundo incluindo o Brasil (PEPIN et al. 1989; STING et al. 1998; PAULE et al. 2003).
2.2 Epidemiologia
C. pseudotuberculosis é um patógeno muito importante na pecuária mundial,
pois é o agente causador de doenças como a linfadenite caseosa, linfangite ulcerativa, e acne contagiosa ou dermatite ulcerativa que acomete caprinos e ovinos, equinos e bovinos, respectivamente. Tais doenças apresentam um
grande impacto econômico por afetarem rebanhos ou animais de considerável valor econômico (BROWN et al. 1987).
Em vários países, incluindo Austrália, Nova Zelândia, África do Sul, Estados Unidos, Canadá e Brasil, existem casos relatados de LC, principalmente em pequenos ruminantes (BINNS et al. 2002; ARSENAULT et
al. 2003; PATON et al. 2003; CONNOR et al. 2007). C. pseudotuberculosis
também foi isolada de espécies como camelos, cervos, alpacas, rinocerontes, porcos, roedores, macacos, búfalos e lhamas. Em humanos, foram relatados aproximadamente 25 casos de contaminação por esse microrganismo (PEEL et al. 1997).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde Animal, dos 201 países que relataram suas situações sanitárias, 64 declararam a presença de animais com LC (OIE 2009). O Brasil é considerado o país com a mais alta prevalência de LC. Pinheiro et al.(2000) relataram que 66,9% dos capinos apresentavam sinais clínicos de LC no estado do Ceará. Em Minas Gerais estudos epidemiológicos recentes demonstram uma prevalência de 75,8% para ovinos e de 78,9% para caprinos (GUIMARAES et al. 2011). Na Austrália, 61% dos rebanhos de ovinos apresentaram sinais clínicos da infecção por C.pseudotuberculosis (EGGLETON et al. 1991). Nos EUA, a prevalência pode atingir até 43% em ovinos(STOOPS et al. 1984). No Reino Unido, 45% dos produtores que foram entrevistados mencionaram a presença de abscessos na sua criação de ovinos (UNANIAN et al. 1985; BINNS et al. 2002).
2.3 Impactos Econômicos
No Brasil rebanhos de pequenos ruminantes somam cerca de 26 milhões, sendo 66% de ovinos e 34% de caprinos. A região Nordeste é a que apresenta maior prevalência da LC, devido a maior concentração desses animais com cerca de 90% dos rebanhos de caprinos e 40% de ovinos, Destes, rebanhos cerca de 30% dos animais são acometidos pela LC (IBGE 2010).
A LC tem causado sérias perdas econômicas ao redor do mundo como a diminuição da produção de leite e carne, perda de peso, redução da pele
devido às cicatrizes e dificuldades na locomoção do animal. No entanto as perdas econômicas devido a esta doença ainda não foram devidamente contabilizadas (GUIMARAES et al. 2011).
A LC também está se tornando um problema para as regiões Sudeste, Norte e Centro-Oeste, onde esta atividade cresce rapidamente, afetando negativamente a indústria de processamento de carne ovina (GUIMARAES et al. 2009).
No Nordeste brasileiro, onde caprinos são importantes fontes de alimento e renda, a situação é ainda mais crítica devido ao tipo de vegetação (espinhosa) e ao baixo nível de escolaridade dos agricultores (UNANIAN et al. 1985).
2.4 Resposta Imune
C. pseudotuberculosis é uma bactéria intracelular facultativa que se
multiplica dentro dos macrófagos e sobrevive à ação de enzimas fagolisossômicas com ajuda da camada lipídica externa da parede celular. Nesta parede estruturas como os ácidos micólicos são determinantes da patogenicidade que são muito importantes na sobrevivência dessa bactéria no ambiente (WEST et al. 2002; BAIRD AND FONTAINE 2007;DORELLA et al. 2006b)). Ao penetrar no hospedeiro através das mucosas ou de feridas na pele, esta bactéria se difunde pelo sistema linfático, linfonodos locais e órgãos internos. A camada lipídica da parede desta bactéria tem a capacidade de impedir a sua fusão com o fagolisossomo, aumentando a sua virulência e a sobrevivência no interior dos macrófagos (DORELLA et al. 2006b). A liberação de enzimas lisossômicas acaba formando os abscessos .
A infecção por LC apresenta diferentes fases: uma fase inicial (1-4 dias pós-infecção), caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos para o local da inoculação e linfonodos de drenagem; uma fase de amplificação (5-10 dias pós-infecção), caracterizada pelo desenvolvimento de piogranuloma, e uma fase de estabilização, caracterizada pela maturação e persistência do piogranuloma (PEPIN et al. 1997).
Após a captura do C. pseudotuberculosis por células fagocíticas como neutrófilos e macrófagos, o fagossomo se funde com o lisossomo, formando o
fagolisossomo (BATEY 1986b). No entanto C. pseudotuberculosis é um patógeno
intracelular facultativo capaz de sobreviver dentro de macrófagos por mais de 48 horas. Durante esse tempo, as bactérias são liberadas como resultado de um processo que leva os fagócitos à morte (BASTOS et al. 2012). Ainda não se sabe ao certo quais os mecanismos específicos de morte celular causada por C. pseudotuberculosis, mas a capacidade das bactérias de sobreviver dentro de macrófagos é devido à incapacidade de várias populações desta célula produzirem óxido nítrico em resposta a essa bactéria in vivo (BOGDAN et al.
1997). Isso pode estar associado à presença da camada lipídica externa em C.
pseudotuberculosis e outros componentes antigênicos, que interromperiam a
produção de óxido nítrico pelos macrófagos (BASTOS et al. 2012).
A multiplicação descontrolada da bactéria dentro dos macrófagos leva o hospedeiro a tentar restringir a infecção através da formação de piogranulomas, caracterizados pelo encapsulamento das células infectadas por C. pseudotuberculosis (BATEY 1986b). Além disso, a infecção por C. pseudotuberculosis leva a formação de abscessos por via subcutânea localizada,
que não provem de lesões primárias nos linfonodos (PAULE et al. 2003). No entanto, alguns abscessos podem ser encontrados em estreita associação com os gânglios linfáticos, resultado da destruição dos tecidos associados com abscessos, que posteriormente encapsulam e podem conter pus parcialmente calcificado (MOLLER et al. 2000).
2.5 Transmissão
A transmissão da LC ocorre principalmente através da ingestão de água e alimentos contaminados, bem como, através de ferimentos superficiais na pele, os quais podem ser causados tanto por manejo inadequado como por tosquia, castração e uso de agulhas contaminadas, quanto por fatores naturais como ferimentos por arbustos pontiagudos (ALVES et al. 1997).
O principal fator que contribui para a disseminação dessa doença é a contaminação ambiental, pois o C. pseudotuberculosis é capaz de sobreviver no
umidade. Esse microrganismo pode sobreviver em frestas de piso a temperatura ambiente por até 10 dias e cerca de 8 meses ou mais de um ano em fômites, principalmente em baixas temperaturas (CAMERON AND BESTER 1984).
2.6 Determinantes moleculares de virulência e patogenicidade
Os determinantes moleculares de virulência do C. pseudotuberculosis, e o controle da sua expressão gênica ainda são pouco conhecidos (DORELLA et al. 2006b; MCKEAN et al. 2007). As bactérias patogênicas possuem genes que codificam para antígenos que permitem sua entrada e sua sobrevivência no hospedeiro, bem como os que resultam na doença, os quais são denominados como determinantes de virulência (SCHUMAN W. 2007).
Três genes presentes em um operon fagABC e gene fagD apresentam papel na virulência desta bactéria e foram designados como genes de aquisição de ferro (BILLINGTON et al. 2002). Uma proteína de 40 kDa, identificada como proteína imunogênica que revelou atividade proteolítica, a serina protease também seria um outro determinante de virulência (WILSON et al. 1995).
Entretanto, apenas dois determinantes da C. pseudotuberculosis estão
bem caracterizados: a fosfolipase D (PLD) e os lipídeos da parede celular. A
PLD tem sido considerada como o principal fator de virulência para C.
pseudotuberculosis (CARNE et al. 1956; HODGSON et al. 1992). Essa exotoxina
funciona como um fator de permeabilidade promovendo a disseminação da bactéria a partir do local inicial de infecção a todos os tecidos do corpo do hospedeiro, causando sérios danos, além de contribuir para a passagem do patógeno da derme para pequenos vasos sanguíneos para que acesse os vasos linfáticos (EGEN et al. 1989).
A fosfolipase D é uma enzima encontrada em bactérias, fungos, plantas e animais (PEPIN et al. 1989). Tem como função hidrolisar a esfingomielina que pertence a uma classe de lipídeos cuja função parece estar ligada a transmissão de sinais e reconhecimento celular através da membrana de
e o uso da antitoxina tem reduzido a disseminação desta bactéria no hospedeiro (WILLIAMSON 2001a).
Para que exista uma devida compreensão da patogênese de espécies bacterianas se faz necessário a caracterização dos fatores de virulência
expressos em resposta a certos estímulos. Os lipídios de superfície de C.
pseudotuberculosis têm sido descritos como fatores importantes que contribuem
para a patogênese (CARNE et al. 1956; HARD 1972; HARD 1975). Uma avaliação da toxicidade de material lipídico foi realizada através da indução de necrose em cobaias após injeção intradérmica. Logo após foi analisado o fluido peritoneal dessas cobaias infectadas e foram encontrados macrófagos suscetíveis à ação necrosante de lipídeos de superfície do C.pseudotuberculosis. No entanto, a infecção com C. pseudotuberculosis em cobaias progride até a
morte, invariavelmente, enquanto os macrófagos de cobaias não são sensíveis à ação citotóxica dos lipídios bacterianos (HARD 1975).
O produto secretado de C. pseudotuberculosis foi avaliado pela primeira vez
por BRAITHWAITE et al. (1993). Neste estudo extraíram-se proteínas a partir de um sobrenadante de cultura com sulfato de amônio, no qual foram encontradas sete proteínas com pesos moleculares entre 14 e 64 kDa. Destas
apenas cinco reagiram com soros de cabras infectadas com C.
pseudotuberculosis.
2.7 C. pseudotuberculosis: estudos de genômica e proteômica
Com o início dos estudos de genômica uma informação relativa a uma proteína imunogênica, por exemplo, pode ser rastreada através do seu
genoma. Várias espécies de Actinobacteria têm sido objeto de análise genômica
incluindo Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus equi e
Corynebacterium diphtheriae (LATCHUMANAN et al. 2005). Muitos genes que foram identificados podem desempenhar um papel importante em todo ciclo
biológico do C. pseudotuberculosis, e são promissores para o desenvolvimento de
vacinas.
Já foram sequenciados genomas de 15 linhagens do C.
C231, CIP 52.97, CP162, I19, P54B96, PAT10 e 1002 (TROST et al. 2010; SILVA et al. 2011; CERDEIRA et al. 2011a; CERDEIRA et al. 2011b; LOPES et al. 2012; RAMOS et al. 2012; SILVA et al. 2012; SOARES et al. 2012; HASSAN et al. 2012a; PETHICK et al. 2012a; HASSAN et al. 2012b; PETHICK et al. 2012b; SILVA et al. 2013a).
Várias informações podem ser obtidas através dos dados genômicos
das espécies sequenciadas. Por exemplo, a cepa 1002 de C. pseudotuberculosis
apresenta um genoma de 2.34 Mb (megabases), 2.203 genes que podem expressar provavelmente 2.090 proteínas. Além disso, apresentam um conteúdo de G+C de 52,2% (RESENDE et al. 2011).
Em um estudo realizado por Silva et al.( 2013b) foi possível demonstrar a presença de 11 proteínas que não foram previamente detectadas). Duas linhagens de C. pseudotuberculosis foram avaliadas utilizando a técnica LC-MSE
(Cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massas) que
apresentou vantagens em relação com o 2D – PAGE. A predominância das
proteínas detectadas em cada proteoma extracelular foi compartilhada, o que permitiu observar um total de 93 proteínas extracelulares diferentes das quais 45 foram compartilhadas entre duas linhagens isoladas de C. pseudotuberculosis
cepas 1002 e C231 de hospedeiros distintos. Dessas 11 proteínas
identificadas, três têm funções desconhecidas (hipotéticas) e oito estão relacionadas às funções fisiológicas e a fatores de virulência.
Em outro estudo abordado por Silva et al. (2013a) foi realizada uma análise de exoproteômica de linhagens diferentes de C. pseudotuberculosis. A linhagem 1002 isolada de isolados de cabra, e a C231 referente a isolados de ovelha. Foram identificadas 17 proteínas com funções biológicas diversas tais como envelope celular, metabolismo proteômico e proteólise. Esta análise proteômica revelou exoproteínas de cepas específicas, embora cada gene correspondente foi encontrado em ambos os genomas das cepas.
Estudos de proteômica são de grande importância para a compreensão dos elementos vitais para a manutenção de determinado patógeno em um ambiente. Em um estudo empregando um gene repórter (TnFuZ) para
identificar genes que codificam proteínas extracelulares, foi observada uma grande diversidade de proteínas, incluindo uma subunidade fimbrial, outra relacionada com a absorção de ferro, adesinas e proteínas envolvidas no transporte, bem como proteínas hipotéticas e duas proteínas desconhecidas
(DORELLA et al. 2006a). Uma serino protease secretada, a corynebacterial
protease (CP40) foi encontrada em sobrenadante de cultura de C.
pseudotuberculosis confirmando que provavelmente é secretada por esta bactéria.
Em um estudo descrito por Trost et al. (2010) foi realizado o sequenciamento de uma linhagem isolada de um granuloma de uma menina de 12 anos onde se verificou que a corynebacterial protease (CP40) juntamente com a PLD, os quais são fatores de virulência codificados no genoma deste isolado.
2.8 CP0369 uma possível Fosfoesterase
Diversas linhagens de C. pseudotuberculosis foram sequenciadas
fornecendo dados genômicos sobre este microrganismo (SILVA et al. 2011; PINTO et al. 2012; SOARES et al. 2012; PETHICK et al. 2012b). Com o resultado do sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos, dentre eles pode-se citar o gene cp1002_0369, que codifica para uma proteína secretada sendo esta provavelmente uma fosfoesterase que apresenta 300 aminoácidos, grande densidade celular, é potencialmente imunogênica podendo com isso vir a ser utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes, ou mesmo em diagnóstico. Esses dados foram avaliados a partir de um estudo descrito por Santos et al.( 2012)
onde foi realizada uma análise de pan-genômica com cinco cepas de C.
pseudotuberculosis 1002, C231, I19, FRC41 e PAT10 produzindo 306, 59 e 12
conjuntos de genes. Destes conjuntos, 150 genes provavelmente codificam proteínas secretadas e 227 codificam proteínas de superfície. Essa avaliação in
silico permitiu definir vários candidatos vacinais a partir da análise e dos
genomas completos dessas cinco linhagens de C. pseudotuberculosis. Além disso,
dessa bactéria evidenciando com isso futuros experimentos na área de vacinas, diagnóstico e de drogas para LC.
2.9 Diagnóstico
Mesmo sendo uma doença de grande importância para a ovinocaprinocultura mundial, não existem diagnósticos, tratamentos e vacinas totalmente eficazes para combater a LC. Atualmente o diagnóstico utilizado é a cultura bacteriológica retirada de material purulento dos abcessos superficiais dos animais, com posterior análise através do teste bioquímico API Coryne system (API-bioMérieux, Inc., La Balme les Grottes, France), o qual consiste em 21 testes bioquímicos e pode ser realizado entre 24 e 48 horas.
Ao longo de décadas de estudo uma variedade de testes sorológicos foram desenvolvidos na tentativa de superar o problema dos animais com casos assintomáticos da LC, incluindo o teste de soro aglutinação (AWAD 1960), a imunodifusão em gel, inibição da hemólise (BURREL 1980; ANDERSON AND NAIRN 1984), e diferentes ensaios de ELISA, como ELISAs indiretos utilizando varias preparações da célula bacteriana, proteínas secretadas e a toxina (PLD) de C. pseudotuberculosis (DERCKSEN et al. 2000;
PAULE et al. 2003; BINNS et al. 2007), ELISA sanduiche com PLD (TER LAAK et al. 1992; DERCKSEN et al. 2000) e ELISA para detectar interferon gama
(IFN-γ) como um marcador de imunidade mediada por células contra C.
pseudotuberculosis (PRESCOTT et al. 2002; MENZIES et al. 2004).
Atualmente, o teste ELISA tem sido utilizado com muita frequência para diagnosticar a LC em rebanhos em todo mundo, pois tem a capacidade de detectar animais infectados subclinicamente, além de apresentar altos níveis de sensibilidade e especificidade (DERCKSEN et al. 2000; GUIMARAES et al. 2009).
Um ELISA indireto foi utilizado para detecção de imunoglobulinas
específicas totais para antígenos secretados de C. pseudotuberculosis e
alcançaram 98,5% de especificidade e 93,5% de sensibilidade (SEYFFERT et al. 2010).
A maioria destes de ELISAs ainda não são comercialmente disponíveis e aqueles que estão disponíveis ainda apresentam um custo relativamente elevado (DERCKSEN et al. 2000; KABA et al. 2001; BINNS et al. 2007). A sensibilidade e especificidade são elementos importantes que devem ser considerados ao selecionar um teste de diagnóstico para um programa de rastreamento. Uma abordagem alternativa para o imunodiagnóstico da LC pode ser a análise combinada dos testes in vitro da resposta imune celular aos
antígenos de C. pseudotuberculosis com testes de ELISA simultâneos (BASTOS et
al. 2011).
Outro método de diagnóstico é a detecção do DNA do C.
pseudotuberculosis. Uma análise baseada na reação de PCR multiplex (mPCR)
para amplificar simultaneamente três sequencias de genes específicos, como: 16S rDNA, gene de escolha no estudo de taxonomia bacteriana; rpoB (subunidade beta da RNA polimerase), amplamente usado para análises filogenéticas; e PLD (fosfolipase D), que codifica uma exotoxina associada com a virulência de C. pseudotuberculosis, C. ulcerans e Arcanobacterium haemolyticum. Este teste se mostrou tão especifico quanto a cultura bacteriana seguida de testes bioquímicos. Apesar disso, este método não foi capaz de identificar microrganismos em amostras biológicas (CETINKAYA et al. 2002; PACHECO et al. 2007).
2.10 Vacinas
Várias estratégias vacinais contra a LC foram avaliadas, havendo vacinas comerciais já disponíveis no mercado, porém nenhuma alcançou uma proteção adequada. Apenas algumas vacinas licenciadas para ovinos têm a mesma eficiência para caprinos. Geralmente se faz necessário ajustar o
programa de vacinação a cada caso (WILLIAMSON 2001b). O potencial de
vacinação para prevenir o LC tem sido explorado há décadas e introduziu a aplicação de vacinas de toxóides disponíveis comercialmente (BAIRD AND FONTAINE 2007). Mesmo assim, existem outras abordagens utilizadas para o desenvolvimento de vacinas.
O processo de imunização é deficiente e pode também ser associado ao uso incorreto das vacinas pelos criadores dos rebanhos. No Brasil, existem algumas vacinas disponíveis para utilização, como a vacina viva atenuada produzida a partir da cepa 1002 da C. pseudotuberculosis, desenvolvida pela Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola S.A (EBDA). Outra vacina baseada em toxóide é produzida pela Embrapa Caprinos, e uma outra, já
comercialmente no mercado, contém toxóides purificados de Clostridium septicum,
agente etiológico do edema maligno, C. novyi Tipo B (hepatite necrótica), C. tetani (tétano), C. perfringens tipo D (enterotoxemia) e culturas inativadas de C. chauvoei (carbúnculo sintomático), uma fração do C. pseudotuberculosis (LC) e um
anti-helmíntico (moxidectina) (DORELLA et al. 2009).
As vacinas de bacterina, que consistem em células inteiras de C.
pseudotuberculosis inativadas (mortas), demonstraram proteger ovinos contra os efeitos letais da doença, porém, não evitou a formação de lesões de uma infecção crônica (CAMERON et al. 1972). Em um estudo realizado por Menzies et al, 1991, em um teste de campo em caprinos e ovinos, foi avaliada uma vacina baseada em bacterina a partir de células inteiras e, a qual demonstrou uma diminuição significatica da incidência de LC em ovinos, sugerindo um efeito similar em caprinos. Em outra investigação realizada por MENZIES, et al.
(1991) foi realizada uma imunização em ovinos com a bacterina de C.
pseudotuberculosis virulenta associada ao adjuvante hidróxido de alumínio,
demonstrandouma proteção significativa contra desafio homólogo.
A proteína CP40 de C. pseudotuberculosis é considerada como um antígeno
protetor contra LC em ovinos. Em um estudo realizado por (WILSON et al. 1995) essa proteína foi superexpressa na forma recombinante em E. coli. Neste trabalho foi descrita a clonagem molecular, sequenciamento, expressão, além de análises bioquímicas das formas nativa e recombinante dessa proteína. Esta análise demonstrou uma atividade proteolítica associada, classificando-a como uma serino-protease através da utilização de inibidores específicos. Mesmo não sabendo ao certo a função da CP40 e que as respostas imunológicas desenvolvidas pelos animais vacinados não foram
caracterizadas, sabe-se que ela afeta indiretamente o crescimento da bactéria, podendo até levá-la morte.
Em outra abordagem no desenvolvimento de vacinas contra a linfadenite caseosa, Dorella et al.(2009), utilizando mutagênese aleatória com o TnFuZ na
linhagem T1 produziu 34 linhagens recombinantes de C. pseudotuberculosis, em
21 loci diferentes. Estes 21 mutantes foram utilizados em ensaios de imunização visando a busca por novas alternativas vacinais contra a LC. Das 21 linhagens testadas, as linhagens vivas atenuadas denominadas de CP13 (proteína secretada ligada ao sistema de transporte de ferro) e CP09 (subunidade fimbrial) mostraram os melhores níveis de proteção sendo de 80 e 60% em camundongos, respectivamente. Camundongos imunizados com o mutante CP09 apresentaram 60% de proteção contra o desafio, o mesmo resultado observado no grupo de camundongos imunizados com a vacina comercial Glanvac™3.
Já em relação a vacinas recombinantes para linfadenite caseosa, poucos são os trabalho descritos. A proteína Hsp60 de C. pseudotuberculosis foi
utilizada na sua forma recombinante como vacina associada ao adjuvante Hidróxido de Alumínio em camundongos. Esse teste vacinal não conferiu proteção contra desafio (PINHO et al. 2009). Em outra abordagem realizada por Costa et al. (2011) o gene hsp60 de C. pseudotuberculosis foi caracterizado
como potencial imunogênico como vacina de DNAHsp60 em experimentos com camundongos. Esta vacina induziu uma resposta imune celular, porém falhou ao conferir proteção contra desafio.
Um mutante atenuado da linhagem C231 de C. pseudotuberculosis,
denominado aromático aroQ, demonstrou ter um potencial de ação com vetor vacinal. Esse mutante demonstrou ser bastante eficiente em experimentos com modelo murino em que foi avaliada a importância do INF-gama na infecção
primária pelo C. pseudotuberculosis (SIMMONS et al. 1997). Uma vacina que
completamente eficaz deve ser capaz de induzir uma resposta humoral e celular contra a LC. Vários estudos estão sendo realizados na busca e avaliação de novos alvos capazes de estimular uma resposta imunológica efetiva para combater a doença.
2.11 Adjuvantes
Os adjuvantes vacinais são substâncias naturais ou sintéticas associadas a antígenos que podem atuar potencializando a resposta imune (CHIN & SAN GIL, 1998). Eles podem proporcionar o desenvolvimento de uma resposta imune mais duradoura ou de uma instalação mais precoce (GUPTA &SIBER, 1995).
O adjuvante é responsável pela modificação da resposta imunológica devido à capacidade de suscitar inflamação no local onde foi administrado o antígeno aumentando a possibilidade de atração das células do sistema imune para a área inflamada além de promover a liberação gradual e prolongada do antígeno, favorecendo a interação com os macrófagos (FLAMINIO, et al., 2000).
O hidróxido de alumínio é um adjuvante utilizado há várias décadas e com resultados positivos, todavia, é considerado um adjuvante que induz principalmente resposta imune humoral e não tem capacidade de estimular imunidade celular, causando ainda reações locais como eritremas, nódulos subcutâneos e reações de hipersensibilidade (GUPTA et al., 1998; CLEMENTS et al. 2002; BAYLOR et al. 2002).
A xantana é um polissacarídeo derivado de bactérias do gênero
Xanthomonas, as quais causam doenças em vegetais. A goma xantana
apresenta como propriedades a viscosidade, sendo amplamente utilizado como espessante ou viscosificante e estabilizante nas indústrias alimentícia e não alimentícia (SUTHERLAND et al., 1998; BECKER et al., 1998; CHIOU et al., 2009). A utilização da goma xantana como adjuvante foi caracterizada com um ativador de linfócitos e originalmente descrita em 1980 (ISHIZAKA et al., 1983). Dessa maneira uma cultura in vitro de macrófagos estimulada por X.
campestris produziu interleucina-12 (IL-12) e fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) em resposta a este estímulo. Além disso, formulações vacinais associadas à xantana bioadesiva na imunização intranasal com o vírus influenza foram avaliadas com de sucesso (BERTRAM et al., 2010).
3. OBJETIVOS 3.1.Objetivo Geral
Desenvolver vacinas recombinantes e um teste de ELISA diagnóstico
para controle da linfadenite caseosa utilizando a proteína recombinante
CP0369 de Corynebacterium pseudotuberculosis.
3.2. Objetivos Específicos
Amplificar o gene cp1002_0369 e clonar nos vetores pTARGET e pAE;
Expressar e purificar a proteína recombinante (rCP0369) através de
cromatografia de afinidade;
Purificar em larga escala da vacina de DNA pTARGET/ Cp1002_0369 e
transfecção in vitro de células CHO (ovary hamster chinese);
Inocular camundongos com a rCP0369 purificada e produzir soro
policlonal;
Imunizar camundongos com as vacinas recombinantes e desafiar com a
cepa virulenta de C. pseudotuberculosis Mic6;
Desenvolver um teste de ELISA utilizando a proteína recombinante
4. MANUSCRITO 1
Fosfoesterase recombinante (Cp1002_0369): avaliação como vacina de subunidade para controle da Linfadenite Caseosa
Fosfoesterase recombinante (Cp1002_0369): avaliação como vacina de subunidade para Linfadenite Caseosa
Andréa de Fátima Silva Rezende1; Alexandre Antunes Brum1, Henrique Ramos
Angelo1; Drielly Cristina Braite1; Gizele Lima de Sá2; Claudia Pinho Hartleben2;
Helena Trurow3; Fabiana K. Seixas3; Vasco Azevedo4; Sibele Borsuk1*
1
Laboratório de Pesquisa em Doenças Infecciosas, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, UFPel.
2
Laboratório de Imunodiagnóstico, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, UFPel.
3
Laboratório de Genômica Funcional, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, UFPel.
4
Laboratório de Laboratório de Genética Celular e Molecular, Departamento de Biologia Geral, UFMG.
*Correspondência do autor: Laboratório de Pesquisa em Doenças Infecciosas, Centro de
Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, UFPel. Telefone: (53) 3275 7350. Mail: sibeleborsuk@gmail.com
Resumo
O Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente causador da
linfadenite caseosa, doença que acomete principalmente pequenos ruminantes causando perdas econômicas em todo o mundo. Através de sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos, dentre eles o gene cp1002_0369, que codifica para uma proteína secretada sendo esta descrita como uma provável fosfoesterase, potencialmente antigênica, a qual pode vir a ser utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes. A antigenicidade da rCP0369 foi observada em Western Blotting ao reagir com soros de ovinos infectados naturalmente pela LC. A rCP0369 foi avaliada como vacina recombinante de subunidade e de DNA e o potencial imunoprotetor foi avaliado em modelo murino através de desafio com a 104 UFC da cepa Mic6
de C. pseudotuberculosis em 4 grupos vacinais(pTARGET/0369,
r0369/Xantana, r0369/Al(OH)3 e prime-boost) e 3 grupos controle negativos
(pTARGET, Xantana e Al(OH)3 ) e 2 grupos controles positivos. A indução de anticorpos foi verificada apesar de as vacinas não conferirem proteção contra o desafio; contudo, a formulação vacinal que aumentou a taxa de sobrevida dos animais após o desafio foi o grupo contendo a proteína recombinante (rCP0369) associada ao hidróxido de alumínio. Novas estratégias vacinas empregando a rCP0369 serão avaliadas para melhorar a eficácia da vacina.
1. Introdução
A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença crônica, infectocontagiosa, que acomete pequenos ruminantes como ovinos e caprinos, acarretando sérias perdas econômicas.(D'Afonseca et al. 2008). A LC é causada por C.
pseudotuberculosis, uma bactéria gram-positiva, intracelular facultativa
pleomórfica e anaeróbica facultativa (D'Afonseca et al. 2010). Este microrganismo é cosmopolita, e encontrado predominantemente no solo, na pele, ou mucosas dos animais. As lesões causadas por esta bactéria nos animais são caracterizadas por abcessos em linfonodos superficiais e viscerais (Seyffert et al., 2010). A presença de C. pseudotuberculosis é diagnosticada a partir de sinais clínicos e isolamento dessa bactéria dosabcessos. Técnicas moleculares, tais como sequenciamento de 16S rDNA (Cetinkaya et al. 2002;
Paule et al. 2003) e amplificação por PCR de sequências conhecidas além de
métodos de tipagem molecular como ERIC-PCR podem ser utilizados para diagnóstico e para a identificação do C. pseudotuberculosis (Guimaraes et al. 2011a; Guimaraes et al. 2011b; Huerta et al. 2013; Pavan et al. 2012).
A forma mais comum de infecção por C. pseudotuberculosis em animais de produção é representada pela contaminação de água, alimentos e feridas por descargas purulentas resultantes da fistulação dos abscessos (Sting et al. 1998). As afecções causadas por essa bactéria nesses animais geram prejuízos, que incluem a depreciação da pele e lã, redução na produção de carne e leite em ruminantes, indisponibilidade para o exercício ou treinamento em equinos e morte ocasional de animais com disseminação sistêmica do organismo (Paule et al. 2003), incluindo o Brasil (Seyffert et al. 2010; Sting et al. 1998).
A vacinologia reversa permite a identificação de determinantes moleculares presentes no genoma da bactéria C. pseudotuberculosis (D'Afonseca et al. 2008) para formulação de novas estratégias vacinais, as quais podem possibilitar um controle mais efetivo da LC nos rebanhos. Alguns antígenos como a proteína de choque térmico HSP60 (Costa et al. 2011), uma serino protease secretada, a CP40, um mutante aromático aroQ, bastante eficiente em modelo murino como vacina, (Simmons et al. 1997), um mutante PLD
negativo, atenuando assim a bactéria, (Hodgson et al. 1992) já foram avaliados nesta abordagem.
Várias linhagens de C. pseudotuberculosis foram sequenciadas fornecendo dados genômicos sobre este microrganismo (Pethick et al. 2012; Pinto et al. 2012; Silva et al. 2011; Soares et al. 2012). Com o resultado do sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos, dentre eles pode-se citar o gene cp1002_0369, que codifica para uma proteína secretada sendo esta provavelmente uma fosfoesterase (Santos et al. 2012), potencialmente antigênica, a qual pode vir a ser utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes.
Assim, o objetivo desse estudo foi desenvolver e avaliar vacinas recombinantes de DNA e de subunidade utilizando uma provável fosfoesterase de C. pseudotuberculosis, com a finalidade de avaliar o potencial imunológico destas em modelo murino.
2. Material e Métodos
2.1 Cepas e condições de cultivo
Neste estudo foram utilizadas as cepas de C. pseudotuberculois 1002 (cedida pelo Dr. Roberto Meyer, UFBA) e Mic- 6 (cedida pelo Dr. Vasco Azevedo, UFMG) e Escherichia coli TOP10 e E. coli BL21 Star. C.
pseudotuberculois foram cultivadas em meio “Brain Heart Infusion” (BHI)
suplementado com 0,5 % de Tween 80, a 37 °C por 72 h sob agitação. Para as culturas em meio sólido, 1,5 % de ágar bacteriológico foram adicionados ao meio de cultura. As cepas de E. coli foram cultivadas em meio Luria Bertani (LB) ou LB contendo 1,5 % de ágar bacteriológico por 16 h a 37 °C. Quando necessário o meio LB foi acrescido com 100 µg/mL de ampicilina.
2.2 Expressão da Proteína recombinante CP0369 em E. coli
A amplificação do gene cp1002_0369 foi realizada utilizando os primers F-5’CGG GGA TCC CAG CCA GTG CTT CAG GTC 3’ e R-5’CCC AAG CTT
TTA TTT TTG TAC CGC TTG CTC 3’. Para a PCR foram utilizados 50 ng de
DNA genômico de C. pseudotuberculosis, além de 10 μM de cada primer e
Mastermix (Promega) num volume final de 50 μL. O Produto da PCR foi visualizado em gel de agarose 1 % corado com Blue Green (LGC Biotecnologia). O gene cp1002_0369 foi clonado no nos sítios BamHI e HindIII do vetor de expressão pAE (Ramos et al., 2004),. Para isso, ambos (pAE e
cp1002_0369) foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e HindIII
(FERMENTAS, EUA) e posteriormente, ligados com auxilio da enzima T4 DNA ligase (FERMENTAS). O produto da ligação foi transformado por eletroporação em células de E. coli TOP 10 competentes, e cultivado em meio LB com 100 µg/mL de ampilicina por 16 h a 37 °C. Uma triagem rápida por lise de colônia com fenol clomormio (v/v), seguida de digestão com enzimas e restrição foram realizadas para caracterização dos clones recombinantes.
Para a expressão da proteína CP0369 recombinante, o vetor pAE/0369 foi transformado por choque térmico na linhagem de expressão E. coli BL21 Star. A indução da expressão se deu pela adição de 1 mM de IPTG ao cultivo mantido sob agitação orbital a 37 °C por 3 h. A expressão das proteínas recombinantes foi confirmada através da técnica de Western blotting (Sambrook; Russell, 2001) utilizando anticorpo monoclonal anti-6xhistag
conjugado com peroxidase (Sigma). A purificação foi realizada por
cromatografia de afinidade em coluna de sepharose (HisTrap™; GE Healthcare), carregada com níquel. A pureza das mesmas foi determinada através de um SDS-PAGE 12 % e a concentração determinada pelo kit BCA (Pierce).
2.3 Western blot
A proteína recombinante CP0369 foi utilizada para Western blot para avaliação da antigenicidade utilizando soros de ovinos clinicamente positivos e negativos para LC. Para isso, as amostras contendo rCP0369 foram
misturadas com tampão (100-mM Tris-HCl at pH= 6.8, 100 mM
β-mercaptoetanol, 4 % SDS, 0,2 % azul de bromofenol, 20 % glicerol) sob condições redutoras e aquecidas a 100 °C durante 10 min e em seguida submetidas à eletroforese em gel SDS-PAGE 12 %. Após as proteínas do gel
foram transferidas eletricamente para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare). A membrana foi bloqueada com PBS contendo 5 % de leite desnatado durante 1 h a 37 °C incubando-se, em seguida, com os soros de ovinos na diluição de 1:100 em `PBS-T a 37 °C durante 1 h. A membrana foi lavada três vezes com PBS tween 0,05 % (PBS-T), durante 5 min cada incubou-se em seguida anti-IgG ovino conjugado com peroxidase, diluídos 1:4000 e 1:6000, respectivamente em PBS-T, e incubados a 37 °C durante 1 h. As bandas reativas foram reveladas utilizando 3,3 '-tetrahidrocloreto (DAB) e H2O2.
2.4 Construção da vacina de DNA
O gene cp1002_0369 amplificado no PCR foi clonado no vetor
pTARGET utilizando o kit de clonagem pTARGET™ Mammalian Expression
Vector System (Promega, USA) segundo instruções do fabricante. O produto
da ligação foi usado para transformar E. coli TOP10 por eletroporação, o qual foi cultivado em meio LB contendo ampicilina (100 µg/mL) e X-gal (40 µ/mL). As colônias brancas foram selecionadas e cultivadas em meio LB líquido contendo ampicilina (100µg/mL) por 16 h a 37° C. Após foi realizada a extração de DNA plasmidial e, a confirmação dos clones recombinantes foi caracterizada enzimaticamente através da digestão com a enzima de restrição EcoRI. Um clone (pTARGET/0369) foi cultivado em um volume de 200 mL de LB, e submetido à extração de DNA usando o kit Perfectprep Plasmid Maxi (Eppendorf, Alemanha).
2.5 Transfecção in vitro de células CHO com o plasmídio pTARGET/0369
Células CHO (chinese hamster ovary) foram cultivadas em placas de poliestireno de 96 cavidades. Após confluência de 80 %, estas células foram
transfectadas com 1µg do vetor pTARGET/0369 utilizando
lipofectamine™2000 (Invitrogen) a fim de verificar a expressão da proteína in
vitro. Após 48 h de incubação, a expressão da proteína CP0369 foi avaliada
policlonais produzidos em camundongos anti-CP0369 e anticorpo policlonal anti- camundongo conjugado com Fitc (Millipore).
2.6 Determinação da Dose Letal 50 (DL50)
A cepa patogênica Mic-6 de C. pseudotuberculosis foi utilizada para a determinação da dose mínima requerida para indução da infecção letal em 50 % dos animais (DL50). A DL50 foi determinada pela inoculação de doses seriadas segundo protocolo descrito por Simmons et al. (1997). Para o cálculo da dose letal, grupos de quatro camundongos foram infectados
intraperitonealmente com doses seriadas variando de 106 a 101 unidades
formadoras de colônia (UFC). A DL50 foi determinada como a quantidade de UFC que levou 50% dos camundongos a óbito de acordo com o método de Reed e Muench (1938). A DL50 foi utilizada nos experimentos de imunização para o desafio.
2.7 Imunização e desafio
Nos ensaios de imunização foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas de seis a oito semanas de idade, susceptíveis à infecção por C.
pseudotuberculosis. Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da
Universidade Federal de Pelotas. Foram realizadas três imunizações com intervalo de 15 dias cada, os animais foram divididos em 9 grupos com 8 animais cada conforme tabela 1. Grupos controle positivo como a vacina comercial (Linfovac, VENCOFARMA) e bacterina obtida a partir da inativação de cultivo de C. pseudotuberculosis cepa Mic6 foram utilizados. Os grupos controle negativo (pTARGET, xantana e hidróxido de alumínio) receberam somente o adjuvante. Uma concentração de 50 µg da proteína rCP0369 associada aos adjuvantes xantana (0,3%/dose) e hidróxido de alumínio (15%/dose) foi utilizada. A via utilizada em todos os grupos foi a intramuscular com exceção dos grupos controle positivo. As coletas de sangue foram realizadas nos dias 0, 15, 30 e 45 a partir da primeira imunização e estocado a –20 °C até a dosagem de anticorpos específicos por ELISA.
O desafio foi realizado 21 dias após a última dose da vacinação. Para
isso, 104 UFC da cepa Mic-6 de C.pseudotuberculosis foram inoculadas
intraperitonealmente nos animais, os quais foram observados até 28 dias após o desafio.
2.8 Avaliação da resposta imune
A resposta imune humoral foi determina por ELISA indireto. Placas de 96 cavidades de fundo chato (Maxisorp-Nunc) foram sensibilizadas com 0,5 µg/mL da proteína rCP0369 em tampão carbonato bicarbonato pH=9,8 e incubadas a 4 °C por 16 h. Após, as placas foram lavadas três vezes com PBS-T (PBS 1X
pH= 7.4; 0,1 % de Tween 20) e bloqueadas com 100 μL/cavidade de leite em
pó desnatado 5 % diluído em por 1 h à 37 °C. Após, a placa foi lavada três vezes com PBS-T. Em seguida foram adicionados 100 μL/cavidade das amostras dos soros de camundongos, na diluição de 1:50, em duplicata. Após uma hora de incubação a 37 ºC e três lavagens com PBS-T, foram adicionados 100 μl/cavidade do anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (Sigma) na diluição de 1:6000. Após uma hora de incubação a 37 ºC e três
lavagens com PBS-T, 100 μL/cavidade de solução reveladora (200 moles
ortofenilenodiamina [OPD, Sigma] diluído em 10 mL de tampão citrato-fosfato
pH=7,6 e 10 µL de H2O2) foram adicionados. A absorbância foi medida a 450
nm utilizando um leitor de placas de ELISA (Mindray)
2.9 Análise Estatística
O teste-T foi utilizado para determinar as diferenças significativas nos testes sorológicos. O teste de Fisher e teste da soma de log-rank foram utilizados para determinar diferenças significativas para mortalidade e sobrevivência, respectivamente, entre os grupos imunizados com as vacinas recombinantes e os grupos controles negativos. As diferenças foram consideradas significativas para P ≤ 0,05.
3.Resultados
3.1 Obtenção da proteína recombinante CP0369 e da vacina de DNA A proteína rCP0369 foi expressa na forma insolúvel por E. coli BL21 Star Assim, esta foi solubilizada em 8M de uréia, ao final do processo de purificação o rendimento obtido foi de 10,4 mg.L-1. A identidade da proteína rCP0369 foi caracterizada mediante Western blot com anticorpo monoclonal (Mab) anti-6xHis (Figura 1).A proteína CP0369 foi expressa em células CHO (chinese hamster ovary), a expressão foi detectada através do método de reação de imunofluorescência indireta (RIFI). (Figura 2)
3.2 Avaliação da antigenicidade da proteína rCP0369
A antigenicidade da proteína rCP0369 foi avaliada através de Western
blot utilizando soros de ovinos infectados naturalmente por C.
pseudotuberculosis (Figura3). Foram utilizadas 11 amostras de soros de ovinos,
que foram capazes de reconhecer a proteína rCP0369 expressa na forma recombinante, demonstrando que as características estruturais e antigênicas foram mantidas.
3.3 Ensaio de Desafio
Os camundongos BALB/c foram imunizados com três doses a cada quinze dias e desafiados vinte e um dias após a terceira dose com a linhagem selvagem virulenta Mic-6 de C. pseudotuberculosis. Após o desafio pode-se observar que nenhuma das vacinas testadas conferiu proteção significativa. Os animais vieram a óbito no dia 9 pós-desafio e até o dia 20 pós-desafio nos grupos A (vacina de DNA- pTARGET/0369), B (rCP0369/hidróxido de alumínio), D (duas doses da vacina de DNA e uma dose da formulação vacinal
r0360/Al(OH)3 -Prime Boost), e nos grupos controles negativos G (pTARGET),
H (Xantana) e I (hidróxido de alumínio). No entanto uma sobrevida maior foi observada no grupo dos animais vacinados com a vacina recombinante composta pela proteína rCP0369 associada ao hidróxido de alumínio (grupo C). Os animais vacinados com a bacterina (grupo E) tiveram uma taxa de sobrevivência de 100%, e os animais imunizados com a vacina comercial (grupo F) tiveram uma taxa de sobrevivência de 60 % (Figura 4). Além disso,
