PURIFICACION DE ANTIGENOS S O M A T I C O S DEL P A R A C O C C I D I O I D E S BRASILIENSIS
ESTUDIO PRELIMINAR (*)
Lilis C. BURGOS (1), Luz E. CANO y Angela RESTREPO
S U M A R I O
S e d e s c r i b e n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e p u r i f i c a c i ó n e m p l e a d o s p a r a l a s e p a r a c i ó n d e l a s f r a c c i o n e s a n t i g é n i c a s a p a r t i r d e u n m a t e r i a l s o m á t i c o o b t e n i d o p o r r o t u r a d e c é l u l a s l e v a d u r a s c o m p l e t a s d e P. brasiliensis. D i c h a s f r a c c i o n e s m o s t r a -r o n s e -r p -r o t e í n a s c o n p e s o s m o l e c u l a -r e s d e 66 y 85 K d ; l a p -r i m e -r a d e e l l a s r e a c c i o n ó c o n s u e r o s e s p e c í f i c o s p r o d u c i e n d o u n a b a n d a d e p r e c i p i t a d o i d é n t i c a a u n a d e l a s 3 d e s a r r o l l a d a s p o r el a n t í g e n o t o t a l .
L o s r e s u l t a d o s s e ñ a l a n l a p o s i b i l i d a d d e o b t e n e r a n t í g e n o s p u r i f i c a d o s , quí-m i c a quí-m e n t e i d e n t i f i c a d o s y c u y o u s o p u d i e r a , e n el f u t u r o , r e p r e s e n t a r v e n t a j a s p a r a el d i a g n ó s t i c o s e r o l ó g i c o d e l a p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s , p e r m i t i e n d o s e p a r a r , r e p e t i d a m e n t e , s o l o a q u e l c o m p o n e n t e r e c o n o c i d a m e n t e a c t i v o .
I N T R O D U C C I Ó N
E l e m p l e o d e p r u e b a s s e r o l ó g i c a s p a r a el d i a g n ó s t i c o d e l a p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s h a r e -c i b i d o g r a n i m p u l s o e n l o s ú l t i m o s a ñ o s , e n g r a n p a r t e d e b i d o a l a p o s i b i l i d a d d e p r o d u c i r a n t í g e n o s r e a c t i v o s 3,7,9,10,11,14,15,16,17. S i n e m b a r -go, l a g r a n m a y o r í a d e t a l e s a n t í g e n o s s o n m e z c l a s c o m p l e j a s q u e n o e s t á n c a r a c t e r i z a d a s p l e n a m e n t e y q u e p r e s e n t a n c o m u n i d a d a n t i g é -n i c a c o -n o t r o s d e l o s a g e -n t e s c a u s a l e s d e l a s m i c o s i s s i s t é m i c a s , lo c u a l lleva a r e a c c i o n e s c r u z a d a s i. i 4 , i 6 , i 8 . i g u a l m e n t e , u n b u e n n ú m e r o d e l o s a n t í g e n o s e m p l e a d o s s o n p r e d o m i n a n -t e m e n -t e d e c o m p o s i c i ó n p o l i s a c á r d d a V . E l p r e s e n t e e s t u d i o e x p l o r a l a p o s i b i l i d a d d e ob-t e n e r a n ob-t í g e n o s r e a c ob-t i v o s d e n a ob-t u r a l e z a p r o ob-t e i c a , s u s c e p t i b l e s d e p u r i f i c a c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n b i o q u í m i c a , d e m a n e r a d e o b t e n e r f r a c c i o n e s m e j o r c a r a c t e r i z a d a s y p o s i b l e m e n t e , m á s es-p e c í f i c a s .
MATERIALES Y MÉTODOS
P . b r a s i l i e n s i s y Condiciones de Cultivo S e u t i l i z ó l a c e p a B339 l a c u a l h a b í a d e m o s t r a d o p r e v i a m e n t e u n a a d e c u a d a a n t i g e -n i c i d a d9
. I n i c i a l m e n t e s e h i c i e r o n 3 p a s e s ser i a d o s d e l a f a s e l e v a d u ser a a t u b o s c o n el m e -d i o s i n t é t i c o m o -d i f i c a -d o -d e M c V e i g h y Mor¬ t o n ( S M M - M ) ( 1 2 ) , a 36°C y p o r 5 d í a s h a s t a o b t e n e r u n c r e c i m i e n t o s u a v e y a b u n d a n t e ; és-t e s i r v i ó p a r a i n o c u l a r u n E r l e n m e y e r c o n 150 m i d e SMM-M l í q u i d o , el c u a l s e i n c u b a b a a la m i s m a t e m p e r a t u r a d e l m e d i o s ó l i d o p e r o c o n a g i t a c i ó n c o n s t a n t e a 130 r p m y p o r 3 d í a s c o n s e c u t i v o s . E s t e e r a el c u l t i v o m a d r e . U n a vez c o m p r o b a d a l a a u s e n c i a d e c o n t a m i n a c i ó n p o r m i c r o s c o p í a y c o n el o b j e t o d e o b t e n e r u n a b u e n a c a n t i d a d d e c é l u l a s , s e t o m a b a n a l í c u o t a s d e 10 m i c a d a u n a d e l a s c u a l e s s e r v í a p a -r a i n o c u l a -r 5 -r e c i p i e n t e s t i p o E -r l e n m e y e -r c a d a u n o c o n 250 m i d e l S M M - M l í q u i d o . L o s cultiv o s a n t e r i o r e s s e i n c u b a b a n e n i g u a l e s c o n d i
-(*) Trabajo realizado bajo los auspicios del Pondo Colombiano de Investigaciones Científicas y Proyectos Especiales, Coi¬ ciencias. Proyecto No. 97145-3-07-82
c i o n e s a l c u l t i v o m a d r e p e r o p o r u n p e r í o d o m á s p r o l o n g a d o , 10 d í a s . Al c a b o d e e s t e t i e m p o , s e c o m p r o b a b a m i c r o s c ó p i c a m e n t e el a s p e c t o d e l a s c é l u l a s y l a a u s e n c i a d e c o n t a m i n a c i ó n ; e n a q u e l l o s c u l t i v o s c o n c r e c i m i e n -t o ó p -t i m o s e d e -t e r m i n a b a l a v i a b i l i d a d d e l a s c é l u l a s l e v a d u r i f o r m e s p o r t é c n i c a s d e f l u o r e s -c e n -c i a1 3
. S i l a v i a b i l i d a d e r a m a y o r d e l 8 5 % , s e p r o c e d í a a l a p r e p a r a c i ó n d e l a n t í g e n o .
Preparación del Antígeno S o m á t i c o
L o s c u l t i v o s q u e r e u n í a n l a s a n t e r i o r e s con-d i c i o n e s s e m e z c l a b a n c e n t r i f u g á n con-d o s e (600 x g) a 4°C p o r 30 m i n u t o s . L a s c é l u l a s l e v a d u r a s e m p a c a d a s e r a n l u e g o l a v a d a s r e p e t i d a m e n -t e (5 v e c e s ) , c o n s o l u c i ó n -t a m p ó n d e f o s f a -t o s p H 7 . 2 . Al t é r m i n o d e e s t a o p e r a c i ó n , l a s cé-l u cé-l a s e r a n s u s p e n d i d a s 1:5 e n s o cé-l u c i ó n t a m p ó n f r e s c a , a d i c i o n á n d o s e , e n e s t e m o m e n t o , u n r e a c t i v o p a r a i m p e d i r la d e g r a d a c i ó n d e l a s p r o t e í n a s , el f e n i l m e t i l s u l f o n i l f l u o r u r o ( P M S P )
( S i g m a C h e m i c a l Co.) a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m M2
. L a r o t u r a d e l a s c é l u l a s s e e f e c t u ó p o r m e d i o d e u l t r a s o n i d o ( B r a n s o n S o n i f i e r , M o d e l o 185, D a n b u r y , C o n . U S A ) . P a r a e v i t a r el c a l e n t a m i e n t o q u e p u d i e r a a l t e r a r l a s p r o t e í n a s c i t o p l á s m i c a s , s e u t i l i z ó u n a m i c r o p u n -t a y v a s o s e n f r i a d o r e s ( r o s e -t -t e c o o l i n g c e l l s ) .
La r o t u r a d e l 90% d e l a s c é l u l a s t o m a b a 30 m i n u t o s y s e d e t e r m i n a b a p o r o b s e r v a c i ó n m i -c r o s -c ó p i -c a . S e t u v o e s p e -c i a l p r e -c a u -c i ó n e n m a n t e n e r s i e m p r e el v a s o e n b a ñ o . d e h i e l o . U n a v e z t e r m i n a d o el p r o c e s o d e r o t u r a , l a s u s p e n s i ó n e r a c e n t r i f u g a d a (600 x g.,30 m i n u -t o s , 4°C) p a r a s e p a r a r l a s p a r e d e s c e l u l a r e s d e l m a t e r i a l s o m á t i c o s o l u b l e . E s t e ú l t i m o s e se-p a r a b a , s e se-p r e s e r v a b a n u e v a m e n t e c o n el P M S F
( i g u a l r n o l a r i d a d ) , l i o f i l i z á n d o s e e n p e q u e ñ a s p o r c i o n e s (5-10 m i ) y c o n s e r v á n d o s e e n el con-g e l a d o r ( m e n o s 20"C) h a s t a el m o m e n t o d e s u u s o .
Determinación de la Actividad Serológica
L a a c t i v i d a d s e r o l ó g i c a d e l a n t í g e n o t o t a l fue v e r i f i c a d a p o r l a s t é c n i c a s d e i n m u n o d i -f u s i ó n e n gel d e a g a r ( I D G A ) , -f r e n t e a t r e s s u e r o s d e p a c i e n t e s c o n p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s c o m p r o b a d a , d e a c u e r d o a l o a n t e r i o r m e n t e d e s c r i t o8
.9
.1 0
. S o l o s i el a n t í g e n o t o t a l s e revela-b a a c t i v o y p r o d u c í a revela-bandas de p r e c i p i t a d o ,
s e v e r i f i c a b a n l o s e s t u d i o s t e n d i e n t e s a l a ob-t e n c i ó n d e f r a c c i o n e s .
Determinación del Contenido Proteico
S e d e t e r m i n ó la c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a s e n el a n t í g e n o t o t a l p o r el m é t o d o d e L O W R Y6
, u t i l i z a n d o a l b ú m i n a s é r i c a b o v i n a c o m o e s t á n -d a r . E n s a y o s p r e l i m i n a r e s r e v e l a r o n q u e s o l o l o s a n t í g e n o s q u e c o n t e n í a n p o r l o m e n o s 1.0 m g / m l d e p r o t e í n a s , e r a n s e r o l ó g i c a m e n t e a c t i v o s .
Fraccionamiento del Antígeno Total
C o n el o b j e t o d e t r a b a j a r d i r e c t a m e n t e c o n l a s f r a c c i o n e s q u e t u v i e r e n a c t i v i d a d s e r o l ó -g i c a d e f i n i d a , el a n t í -g e n o t o t a l s e e n f r e n t ó inic i a l m e n t e a u n s u e r o r e a inic t i v o inic o n o inic i d o ( p r o c e d e n t e d e u n e n f e r m o c o n p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s ) , e n l a p r u e b a d e I D G A . C o m o e r a n e c e s a r i o o b t e n e r u n a c a n t i d a d a p r e c i a b l e d e p r e -c i p i t a d o , l a r e a -c -c i ó n s e v e r i f i -c ó e n p l a -c a s d e v i d r i o d e 20 x 30 c m s . , u t i l i z a n d o u n s i s t e m a d e s u r c o s p a r a l e l o s y c o n t i n u o s e n l u g a r d e p o z o s i n d i v i d u a l e s . C a d a s u r c o r e c i b í a 0.5 m i d e u n o d e l o s 2 r e a c t i v o s ; el s i s t e m a s e d e j ó i n c u b a r p o r 48 h o r a s , m a n t e n i e n d o l a p l a c a e n c á m a r a h ú m e d a a 22°C. Al c a b o d e e s t e t i e m p o , for-m a d a s y a l a s b a n d a s d e p r e c i p i t a d o , l a p l a c a e r a l a v a d a e n s o l u c i ó n s a l i n a a l 0.85%, a 4°C p o r 48 h o r a s , r e n o v a n d o l a s o l u c i ó n d e l a v a d o c a d a 8-10 h o r a s . P o s t e r i o r m e n t e , el gel d e a g a r e r a m a c e r a d o s u a v e m e n t e e n m o r t e r o y r e s u s p e n d i d o a l d o b l e d e s u v o l u m e n e n solu-c i ó n t a m p ó n d e f o s f a t o s p H 7.2, a d i solu-c i o n a d a d e 0.2 m M d e g l i c i n a d e m a n e r a d e r o m p e r l a u n i ó n a n t í g e n o - a n t i c u e r p o p e r o s i n a l t e r a r l a r e a c t i v i d a d d e l p r i m e r o4
. E n e s t a s o l u c i ó n s e d e j a b a p o r 12 h o r a s a 4°C; p a s a n d o l u e g o el m a c e r a d o p o r p a p e l d e f i l t r o d e p o r o a m p l i o p a r a r e t e n e r el gel y c o n s e g u i r e n s o l u c i ó n l a s f r a c c i o n e s a n t i g é n i c a s y l o s a n t i c u e r p o s , l o s q u e s e s e p a r a b a n , p o s t e r i o r m e n t e , p o r f i l t r a c i ó n e n c o l u m n a .
Filtración por Columna c o n Gel
-m e n t e , i n s t a l á n d o s e el flujo a u n a v e l o c i d a d d e 0 . 5 m l / m i n u t o . S e r e c o g i e r o n f r a c c i o n e s d e 10.0 m i y s e e s c o g i e r o n p a r a e s t u d i o p o s t e r i o r a q u e l l a s q u e , a l s e r e x a m i n a d a s e s p e c t r o f o t o -m é t r i c a -m e n t e a 280 n -m -m o s t r a b a n t e n e r -m a y o r a b s o r c i ó n .
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
E l p r o c e d i m i e n t o e m p l e a d o fue el d e s c r i t o p o r L A E M L I5
, el c u a l u t i l i z a e l e c t r o f o r e s i s dis-c o n t i n u a e n u n gel d e p o l i a dis-c r i l a m i d a dis-c o n sul-f a t o d o d e c i l s ó d i c o ( S D S - P A G E ) y u t i l i z a n d o u n g r a d i e n t e d e c o n c e n t r a c i ó n d e 5-15%; c o m o t a m p ó n d e c o r r i d a s e u s ó u n a s o l u c i ó n d e t r i s b ó r i c o 0.1 M , s i e n d o l a i n t e n s i d a d d e l a c o r -r i e n t e d e 0.015 m A / c m2
d e gel. D e s p u é s d e l a c o r r i d a , la c u a l d u r a b a 4 h o r a s , e l gel fue fija-d o c o n á c i fija-d o t r i c l o r o a c é t i c o a l 12% p a r u n pe-r í o d o d e 12 h o pe-r a s . L a t i n c i ó n s e e f e c t u ó c o n p l a t a8
y a z u l b r i l l a n t e d e C o o n i a s i e ( E a s t m a n K o d a k , N e w Y o r k ) . E l S D S - P A G E s e e f e c t u ó p a r a l e l a m e n t e p a r a el a n t í g e n o t o t a l , l a s v a r i a s f r a c c i o n e s o b t e n i d a s p o r f i l t r a c i ó n e n c o l u m n a y d o s t i p o s d e c o n t r o l e s , c o n s i s t e n t e s u n o d e e l l o s e n s o l u c i o n e s p a t r o n e s d e p r o t e í n a s c o n p e s o m o l e c u l a r c o n o c i d o . ( M a r c a d o r e s d e p e s o m o l e c u l a r p a r a P A G E - S D S , S i g m a C h e m i c a l Co.) y el o t r o , e n s u e r o h u m a n o t o t a l .
RESULTADOS
L a F i g . 1 i l u s t r a el p e r f i l d e l o s c o m p o n e n -t e s s e p a r a d o s p o r f i l -t r a c i ó n e n c o l u m n a . S e o b s e r v a l a p r e s e n c i a d e v a r i o s p i c o s c o r r e s p o n d i e n t e s a f r a c c i o n e s p r o t e i c a s d e p e s o m o l e c u -l a r d i f e r e n t e . E -l c o n j u n t o d e p i c o s m a y o r e s c o r r e s p o n d e a l a s i n m u n o g l o b u l i n a s d e l s u e r o h u m a n o m i e n t r a s q u e l o s d o s r e s t a n t e s (pe-s o (pe-s m o l e c u l a r e (pe-s d e 85 y 66 K d ) , r e p r e (pe-s e n t a n a n t í g e n o s d e l P. b r a s i l i e n s i s .
E l m é t o d o d e P A G E - S D S ( F i g . 2) m o s t r ó g r a n n ú m e r o d e b a n d a s c o n el a n t í g e n o t o t a l , d o s d e l a s c u a l e s o c u p a b a n p o s i c i o n e s i d é n t i c a s a l a s p r o d u c i d a s p o r l a s f r a c c i o n e s p r e -v i a m e n t e p u r i f i c a d a s p o r c o l u m n a . E l s u e r o h u m a n o , p o r s u p a r t e , p r e s e n t ó t a m b i é n b a n d a s m ú l t i p l e s , u n a d e l a s c u a l e s m o s t r a b a p o -s i c i ó n -s i m i l a r a l a o c u p a d a p o r l a r e -s t a n t e frac-c i ó n p u r i f i frac-c a d a .
L a s f r a c c i o n e s a n t i g é n i c a s f u e r o n c o n c e n -t r a d a s p o r liofilización y r e c o n s -t i -t u i d a s a l 1:10
de_ s u v o l u m e n o r i g i n a l p a r a s u e m p l e o e n la p r u e b a d e I D G A . U n a d e e l l a s , l a c o r r e s p o n d i e n t e a 66 K d , p r o d u j o u n a b a n d a d e p r e c i p i t a d o n í t i d a f r e n t e a s u e r o s c o n t r o l e s , p r o c e d e n t e s d e 3 d i f e r e n t e s p a c i e n t e s c o n p a r a c o c c i -d i o i -d o m i c o s i s . E s t a b a n -d a fue i -d é n t i c a a u n a d e l a s 3 p r o d u c i d a s p o r el a n t í g e n o c i t o p l á s m i -c o t o t a l .
DISCUSIÓN
E l p r e s e n t e t r a b a j o s e a c e r c a a l a defini-c i ó n d e l o s a n t í g e n o s d e l P. brasiliensis e n var i a s f o var m a s . I n i c i a l m e n t e , s e t var a t a d e var e e m p l a -z a r l o s a n t í g e n o s - m e t a b ó l i c o s , e m p l e a d o s fre-c u e n t e m e n t e e n la, p r á fre-c t i fre-c a ' A " p o r p r o d u fre-c t o s d e r i v a d o s d e l a c é l u l a l e v a d u r a m i s m a . E s t e c a m b i o p u d i e r a r e s u l t a r e n u n a m a y o r r e p r o d u c i b i l i d a d d e l o s a n t í g e n o s , p u e s t o q u e s e e m -p l e a n c o m -p o n e n t e s d e l h o n g o m i s m o y n o s u s m e t a b o l i t o s .
E n s e g u n d o l u g a r , s e c o n c e n t r a la a t e n c i ó n e n l a s f r a c c i o n e s p r o t e i c a s c u a n d o , e n la p r á c -t i c a , l o s a n -t í g e n o s d e n a -t u r a l e z a p o l i s a c á r i d a h a n s i d o m á s u t i l i z a d o s3
.9
. E s p r o b a b l e q u e l a f r a g i l i d a d d e l a s f r a c c i o n e s p r o t e i c a s h a y a in-c l i n a d o l a b a l a n z a a f a v o r d e l o s p o l i s a in-c á r i d o s , l o s c u a l e s s o n b a s t a n t e m á s e s t a b l e s . S i n e m -b a r g o , el u s o d e s u s t a n c i a s c o m o el P M S F q u e i n h i b e n l a d e g r a d a c i ó n e n z i m á t i c a d e l a s p r o t e í n a s , h a c e p o s i b l e la p r e s e r v a c i ó n d e l o s a n t í -g e n o s c o r r e s p o n d i e n t e s2
. Al r e s p e c t o v a l e l a p e n a a n o t a r q u e a m e n o s q u e l a m e z c l a cito-p l á s m i c a s e a r á cito-p i d a m e n t e cito-p r e s e r v a d a c o n el P M S F , el a n t í g e n o v a a p e r d e r s u a c t i v i d a d a ú n si s e l o liofiliza y s e l o g u a r d a e n e f c o n g e -l a d o r .
E l t e r c e r p u n t o q u e s e e s t u d i a e n el t r a b a j o , e s el f r a c c i o n a m i e n t o d e u n a n t í g e n o c o m p l e j o d e m a n e r a d e c o n s e g u i r e l e m e n t o s p u r i f i -c a d o s y d e f i n i d o s . A u n q u e p r e l i m i n a r e s , l o s re-s u l t a d o re-s r e v e l a n l a p o re-s i b i l i d a d d e e re-s t a n d a r i z a r f r a c c i o n e s q u í m i c a m e n t e r e c o n o c i b l e s y s e r o -l ó g i c a m e n t e a c t i v a s , a p a r t i r d e m e z c -l a s anti-g é n i c a s c o m p l e j a s . E l P. brasiliensis p o s e e u n v e r d a d e r o m o s a i c o a n t i g é n i c o M6
.1 8
. A d e m á s , m u c h o s d e l o s a n t í g e n o s e x p r e s a d o s p o r el h o n g o s o n s i m i l a r e s a l o s p r o d u c i d o s p o r o t r o s a g e n t e s m i c ó t i c o s , l o q u e l l e v a a r e a c c i o n e s c r u -z a d a s d e i m p o r t a n c i a1 4
.
va-r i a c i ó n e n la a c t i v i d a d d e l o s l o t e s d e a n t i g e n o s p r o d u c i d o s p o r u n m i s m o i n v e s t i g a d o r . A ú n
s i g u i e n d o c u i d a d o s a m e n t e l o s v a r i o s p a s o s d e l p r o c e s o d e o b t e n c i ó n d e l a n t i g e n o , ( e m p l e o d e
la m i s m a c e p a , del m i s m o m e d i o d e c u l t i v o y d e i g u a l e s c o n d i c i o n e s d e i n c u b a c i ó n » , la va-r i a c i ó n e n t va-r e l o t e y l o t e e s c o n s i d e va-r a b l e -
So-l a m e n t e So-la s e p a r a c i ó n d e a n t í g e n o s d e f i n i d o s q u i m i c a m e n t e c a r a c t e r i z a d o s o b v i a r l a e s t e p r o -b l e m a .
H e m o s i n t e n t a d o p r e p a r a r y c a r a c t e r i z a r a l
m e n o s u n o d e los m ú l t i p l e s c o m p o n e n t e s a n t i
-g é r ü c o s del P. b r a s i l i e n s i s . el q u e p u d i e r a
res u l t a r ú t i l e n la b ú res q u e d a d e p r o d u c t o res e res t a n
-d a r i z a -d o s y r e p r o -d u c i b l e s . E n e f e c t o , la
frac-c i ó n d e 66 K d s e m u e s t r a frac-c o m o p r o m i s o r i a .
Al p r e s e n t e , s e a d e l a n t a n e s t u d i o s t e n d i e n
-t e s a la o b -t e n c i ó n d e c a n -t i d a d e s a d e c u a d a s d e
t a l f r a c c i ó n q u e p e r m i t a n d e t e r m i n a r s u
sen-s i b i l i d a d y e sen-s p e c i f i c i d a d c o m o a n t i g e n o
indo-p e n d i e n t e . Al m i s m o t i e m indo-p o , s e t r a b a j a e n la
i d e n t i f i c a c i ó n b i o q u í m i c a de e s t a t r a c c i ó n p r o
S U M M A R Y
Purification of s o m a t i c antigens from P a r a c o c -c i d i o i d e s b r a s i l i e n s i s . Preliminary study
W e d e s c r i b e t h e p r o c e d u r e s f o l l o w e d t o p u -rify a n t i g e n i c f r a c t i o n s f r o m P. brasiliensis so-n i c a t e d w h o l e y e a s t c e l l s . B y m e a so-n s of t h e a g a r gel i m m u n o d i f f u s i o n t e s t , a n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s w e r e a l l o w e d t o p r o d u c e p r e c i p i -t i n l i n e s ; -t h e s e w e r e f u r -t h e r s e p a r a -t e d , e l u a -t e d a n d t w o a n t i b o d y - f r e e a n t i g e n i c f r a c t i o n s w e r e f u r t h e r p u r i f i e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d p o l y a c r i l a m y d e gel e l e c t r o p h o r e s e s . T h e s e f r a c t i o n s p r o v e d t o b e p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s of 66 a n d 85 k d ; t h e f o r m e r r e a c t e d w i t h s p e c i f i c a n t i s e r a a n d p r o d u c e d a p r e c i p i t i n l i n e i d e n t i c a l t o o n e of t h e t h r e e f o r m e d b y t h e t o t a l a n t i g e n .
R e s u l t s i n d i c a t e t h a t i t w o u l d f e a s i b l e t o o b t a i n p u r i f i e d , c h e m i c a l l y c h a r a c t e r i z e d a n t i g e n s . T h e s e c o u l d , i n t h e f u t u r e , b r i n g i m p r o v e m e n t i n t h e s e r o l o g i c d i a g n o s i s of p a r a c o c c i d i o i d o m y c o s i s a s o n l y t h o s e s p e c i f i c c o m p o
-n e -n t s of k -n o w -n s e r o l o g i c r e a c t i v i t y w o u l d b e e m p l o y e d .
A G R A D E C I M I E N T O
Al D o c t o r M a n u e l E l k i n P a t a r r o . y o , d e l De-p a r t a m e n t o d e I n m u n o l o g í a d e l a U n i v e r s i d a d N a c i o n a l , d e B o g o t á , C o l o m b i a , n o s o l o p o r hab e r n o s e n s e ñ a d o el m a n e j o y l a s i m p l i c a c i o -n e s d e l m é t o d o P A G E - S D S s i -n o p o r s u i -n t e r é s e n el p r e s e n t e s t u d i o .
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