Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da
hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii produtores de OXA-23 no Brasil
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção de título de Mestre em Ciências.
São Paulo 2013
ii
Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da
hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii produtores de OXA-23 no Brasil
Orientadora: Profª. Drª. Ana Cristina Gales Co-orientador: Dr. Rodrigo Cayô da Silva
Este trabalho foi realizado com o auxílio financeiro fornecido pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq.
São Paulo 2013
iii Cardoso, Juliana Provasi
Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii produtores de OXA-23 no Brasil
Juliana Provasi Cardoso - São Paulo/SP - Brasil, 2013. xxi, 130f.
Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia. Departamento de Medicina, Disciplina de Infectologia.
Título em Inglês: Contribution of the overexpression efflux pump AdeABC and hiperproduction of AmpC in the resistance to β-lactams in clinical isolates of Acinetobacter baumannii producing OXA-23 in Brazil.
1. Acinetobacter baumannii. 2. OXA-23. 3. Sistema de efluxo.
4. Brasil.
iv
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Professora Drª Maria Tereza Zanella
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Professor Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato
São Paulo 2013
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Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da
hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii produtores de OXA-23 no Brasil
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Titulares:
Profa. Dra. Anna Sara Shafferman Levin
Professora Associada do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Presidente da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do Hospital das Clínicas - HC-FMUSP.
Prof. Dr. José Rodrigues do Carmo Filho
Professor Adjunto da Pontifícia Universidade Católica de Goiás - PUC-GO e Analista em saúde da Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia.
Dra. Paola Cappellano
Médica Infectologista da Comissão de Epidemiologia Hospitalar do Hospital São Paulo - HSP da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP e Coordenadora do grupo de Racionalização de Antimicrobianos em Infecções em pacientes com Doenças Onco- Hematológicas e Transplante de Medula Óssea.
Suplente:
Profa. Dra. Silvia Figueiredo Costa
Professora Associada ao Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina da Uiversidade de São Paulo - USP e chefe do Laboratório de Investigação Médica LIM-54 do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina - HC- FMUSP.
vi
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”
Madre Tereza de Calcutá
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Dedicatória Dedico este trabalho a todas as pessoas que contribuíram, de alguma forma, para sua
realização e àquelas, que um dia, o poderão usufruir.
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Agradeço primeiramente a Deus, por me conceder a vida e a sabedoria, por ser a minha força nos momentos de fraqueza e por intervir por mim quando tudo parecia ser impossível;
... à todos da minha família, em especial à minha mãe Valquiria Provasi, ao meu pai Vitor Eduardo Cardoso, à minha avó Terezinha Bariani Provasi e ao meu avô Ari Provasi (in memoriam) por não pouparem esforços, me dando a melhor educação, por me ensinarem princípios, sempre acreditando no meu sucesso e por me apoiarem em cada decisão difícil da vida;
... agradeço principalmente à minha mãe. Posso imaginar o quanto foi difícil para você ver sua única filha saindo de casa... mas você sempre me apoiou nas minhas decisões e sempre me deu muita força para seguir com os meus sonhos, me ajudou a superar as dificuldades e esteve comigo nos momentos mais importantes. Muito obrigada... por absolutamente tudo!
... ao meu tio Udo Kehrle, à minha tia Zuleika Provasi por serem meus pais postiços, sempre me dando bons conselhos, me recebendo com todo coração e por terem me ajudado tanto nesses anos em que eu mais precisei;
... às minhas primas Aline, Karen e Ellen Kehrle, pelos conselhos acadêmicos, mesmo quando não entendiam nada sobre o assunto do meu estudo, pela amizade, pelas muitas risadas, pela companhia, mesmo algumas de vocês estando longe, pela força e por aguentarem minhas reclamações. Vocês são as irmãs que eu não tive;
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primeiros a me receber em São Paulo de braços abertos, pelo carinho com que me acolheram e por sempre me apoiarem nos meus estudos;
... à minha orientadora Profa. Drª. Ana Cristina Gales, por me acolher em seu laboratório e acreditar na minha capacidade, por seus ensinamentos, conselhos e conhecimentos incontestáveis, por ser a grande pesquisadora que é e por permitir a concretização deste estudo. Não poderia ter realizado meu mestrado num lugar melhor;
... ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por todo conhecimento e apoio no LEMC;
... ao meu co-orientador Dr. Rodrigo Cayô, por todo ensinamento, paciência, dedicação, amizade, puxões de orelha e também incentivos, pelo apoio fundamental no final do mestrado e por me guiar nesta jornada dos Acinetos;
... à Dra. Renata Cristina Picão que me recebeu no ALERTA, pela amizade e carinho, pelos ensinamentos acadêmicos e da vida e por estar sempre à disposição;
... à querida Jéssica Werneck, que me introduziu ao maravilhoso mundo dos Acinetos;
... à todos do Laboratório ALERTA: Adriana Nicolletti, Adriana Matos, Ana Carolina Ramos, Bruna Nonato, Cecília Carvalhaes, Dandara Cassu, Danilo Xavier, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun, Jhonatha Moura, Lorena Fehlberg, Lucas Andrade, Lygia Schandert,
x
conhecimentos trocados, pela amizade e pela ótima convivência diária, que fez com que esses três anos de estudo se tornassem mais divertidos e leves;
... à Raquel Girardello por todo apoio, auxílio e conhecimento que me ofereceu ao longo do meu mestrado, principalmente na reta final, e por me ensinar a fazer aquelas contas...;
... em especial à Adriana Matos, Ana Carolina Ramos, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun, Marina Visconde e Talita Baroni que me ajudaram imensamente no final dos meus experimentos, pelos momentos de estudo, de desabafo e de alegrias compartilhados. Vocês se tornaram mais que companheiras de laboratório;
... à todos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, pelo apoio e auxílio para a concretização deste trabalho, em especial a Elke Gump, Talita Rochetti e Paulo Bispo pelo suporte no Real Time;
... às minhas professoras e também “avó e mãe microbiológicas” da PUC-GO, Cláudia Duque e Edlaine Rodrigues, por plantarem a sementinha da micro no meu coração;
... ao Prof. Dr. José Rodrigues do Carmo Filho, meu primeiro orientador na Iniciação Científica, por despertar a pesquisadora que existe em mim;
... aos meus amigos, pela compreensão da minha ausência, por vibrarem a cada vitória e por entenderem e me apoiarem na decisão de vir para São Paulo... por mais que a distância nos separe, estarão sempre no meu coração;
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gratidão pela ajuda que vocês me ofereceram num momento tão delicado;
... ao meu namorado Rafael Teixeira, que passou tantas noites, feriados e finais de semana no laboratório comigo, sempre me incentivando a seguir em frente com meu projeto, compreendendo a minha ausência e me acalmando nos momentos em que eu parecia explodir, por ser meu companheiro de todas as horas e por ser o ombro amigo sempre que precisei;
... à banca, que gentilmente aceitou meu convite para participar da minha defesa e que reservou um tempo para estudar e contribuir com o meu trabalho;
... aos funcionários da UNIFESP, do Laboratório Central, médicos, pessoal da limpeza e ao porteiro Edilson, pelos serviços e ajudas prestados;
... ao meu gatinho Ozzy, que me fez companhia enquanto eu escrevia minha tese;
... e as minhas “bichinhas” bactérias, em especial aos meus “filhinhos” Acinetos que aprendi a “amar” e principalmente a respeitar esses seres tão pequenos e complexos, aos quais tive o prazer de estudar seus mecanismos de resistência mais afundo.
xii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xiv
ÍNDICE DE TABELAS ... xviii
ÍNDICE DE FIGURAS ... xix
RESUMO ... xx
ABSTRACT ... xxi
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 4
2.1. Agente Etiológico ... 4
2.2. Epidemiologia das Infecções Causadas por A. baumannii ... 7
2.3. Opções de Tratamento para Infecções Causadas por A. baumannii ... 10
2.3.1. Ampicilina/Sulbactam ... 10
2.3.2. Minociclina ... 11
2.3.3. Tigeciclina ... 12
2.3.4. Polimixinas ... 14
2.3.5. Carbapenens ... 15
2.4. Mecanismos de Resistência aos Carbapenens em A. baumannii ... 18
2.4.1. Produção de β-Lactamases ... 18
2.4.1.1. β-Lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs)...19
2.4.1.2. Metalo-β-Lactamases (MβL)...20
2.4.1.3. Cefalosporinase do Tipo AmpC (ADCs)...21
2.4.1.4. Oxacilinases...22
2.4.1.4.1. OXA-23...23
2.4.1.4.2. OXA-24/40...29
2.4.1.4.3. OXA-51...30
2.4.1.4.4. OXA-58...30
2.4.1.4.5. OXA-143, OXA-182 e OXA-235 ...30
2.4.2. Impermeabilidade de Membrana Externa... 31
2.4.3. Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ... 33
2.4.3.1. Sistema AdeABC...35
2.4.4. Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) ... 37
3. OBJETIVOS ... 39
3.1. OBJETIVO PRINCIPAL ... 39
3.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS ... 39
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 40
xiii
4.2.1. “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass
Spectrometry” (MALDI-TOF MS) ... 42
4.2.2. Sequenciamento do Gene rpoB ... 43
4.3. Análise da Similaridade Genética por PFGE ... 45
4.4. “Multilocus Sequence Typing” (MLST) ... 47
4.5. Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos ... 49
4.5.1. Avaliação Fenotípica da Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ... 50
4.6. Pesquisa e Identificação de Genes de Resistência ... 51
4.6.1. Avaliação da Hiperprodução de ADC (AmpC) ... 54
4.7. Avaliação das Proteínas de Membrana Externa por SDS-PAGE ... 54
4.8. PCR em Tempo Real (qRT-PCR) para Quantificação da Transcrição do Sistema de Efluxo AdeABC e das Proteínas de Membrana Externa CarO, 33-36 kDa, OmpHMP e OmpW ... 55
4.8.1. Extração do RNA Total e Síntese de cDNA ... 55
4.8.2. Quantificação Relativa da Transcrição Gênica ... 56
4.8.3. Análise da Quantificação Relativa da Transcrição Gênica ... 58
5. RESULTADOS ... 60
5.1. Identificação dos isolados bacterianos ... 60
5.2. Análise da similaridade genética (PFGE) e da ancestralidade (MLST) ... 60
5.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos ... 65
5.4. Avaliação dos genes codificadores de β-lactamases e a relação desses com a presença de ISAba1 ... 67
5.5. Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo ... 72
5.6. Avaliação fenotípica da alteração das proteínas de membrana externa pela técnica de SDS-PAGE ... 76
5.7. Quantificação da expressão dos genes coficadores de porinas e do sistema de efluxo AdeABC pela técnica de qRT-PCR ... 79
6. DISCUSSÃO ... 81
7. CONCLUSÃO ... 100
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 102
xiv ABC - ATP Binding Cassette
ADC - Acinetobacter-derived cephalosporinases AFLP - Amplified Fragment Lenght Polimorfism AK - Amicacina
AmpC - Cefalosporinase chromosomal AMP/SUL - Ampicilina/Sulbactam
ApaI - Acetobacter pasteurianus sub. pasteurianus ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ARI - Acinetobacter Resistant to Imipenem
ATCC - American Type Culture Collection ATP - Adenosina trifosfato
AZT - Aztreonam
BSA - Albumina de soro bovino
BSAC - British Society of Antimicrobial Chemotherapy C - Citosina
CAZ - Ceftazidima CC - Complexo Clonal
CCCP - Carbonyl Cyanide m-Chlorophenyl Hydrazone cDNA - DNA complementar
CESP - Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Providencia stuartii, Pseudmomonas aeruginosa e Morganella morganii
CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase CHEF-DR - Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields CIM - Concentração Inibitória Mínima
CIP - Ciprofloxacino
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
xv CTX-M - Cefotaximase
Da - Dalton
DHP-1 - Dehidropeptidase-1 DLV - Double Locus Variant
DMT - Drug-Metabolite Transporter E - Eficiência
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus - Polimerase Chain Reaction
ESβL - β-lactamase de Espectro Ampliado EU - Clone Europeu
EUCAST - The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing F - Forward
FEP - Cefepima G - Guanina
GES - Guiana Extended Spectrum GIM - German Imipenemase GM - Gentamicina
HMM - High molecular mass IMP - Imipenemase
IPM - Imipenem
ISAba - Insertion Sequence Acinetobacter baumannii kDa - Kilodaltons
KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase LB - Luria Bertani
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
xvi M - Molar
MALDI-TOF MS - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry
MC - Minociclina
MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion MDR - Multirresistentes
MER - Meropenem
MFS - Major Facilitador Superfamily MgCl2 - Cloreto de magnésio
MGTs - Transglicosilases monofuncionais MH - Müeller-Hinton
MLST - Multilocus Sequence Typing mM - Milimolar
MRSA - Staphylococcus aureus resistente à meticilina MTPX - Multiplex
MβL - Metalo-β-lactamase NaCl - Cloreto de sódio
NDM - Nova Deli metalo-β-lactamase NMP - 1-(1-naphthylmethyl)-piperazine OMP - Outer Membrane Protein
OmpHMP - Outer membrane protein Heat-Modified Protein OXA - Oxacilinase
PaβN - Phenylalanine arginyl β-naphtylamide pb - Pares de base
PBPs - Proteínas ligadoras de penicilina PCR - Reação em cadeia da polimerase
xvii pH - Potencial Hidrogeniônico
pmol - picomol PO - Polimixina B
qRT-PCR - Quantificação da transcriptase reversa - reação em cadeia da polimerase R - Reverse
Rep-PCR - Repetitive Element Palindromic – Polimerase Chain Reaction RND - Resistance-Nodulation Division
rRNA - RNA ribossômico
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SG - Sequence Group
SHV - Sulfhydryl-Variable β-Lactamase SIM - Seul Imipenemase
SLV - Single Locus Variant
SMR - Small Multidrug Resistance SPM - São Paulo metalo-β-lactamase ST - Sequence Type
TBE - Tris-Boreto-EDTA TEM - Temoniera β-Lactamase TGC - Tigeciclina
Tm - Temperatura de melting TPPCl - Cloreto de tetrafenilfosfónio TSB - Caldo Tríptico de Soja
VEB - β-Lactamase de Espectro Ampliado Vietnamita VIM - Verona Imipenemase
VRE - Enterococcus resistente à vancomicina
xviii
Tabela 1 - Variantes de OXA-23 descritas de acordo com a espécie de isolamento, ano e país de origem... 07 Tabela 2. Sequência de oligonucleotídeos das zonas internas e flanqueadoras do gene rpoB para identificação de Acinetobacter spp. de acordo com La Scola e colaboradores (2006)... 44 Tabela 3. Oligonucleotídeos empregados para os sete genes utilizados para a caracterização do MLST, de acordo com Nemec e colaboradores (2008)... 48 Tabela 4. Sequência de oligonucleotídeos para identificação dos genes codificadores de - lactamases e sequência de inserção... 51 Tabela 5. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para a quantificação dos genes codificadores do sistema de efluxo AdeABC, e dos genes das principais proteínas de membrana externa, pela técnica de qRT-PCR... 57 Tabela 6. Temperatura de melting e eficiência dos oligonucleotídeos utilizados na reação de qRT-PCR...………... 58 .
Tabela 7. Distribuição dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 de acordo com a região geográfica e os genótipos determinados pelas técnicas de PFGE e MLST... 62 Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23... 66 Tabela 9. Caracterização das β-lactamases e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os 31 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23... 69 Tabela 10. Resultados da CIM para ceftazidima, cefotaxima, imipenem e meropenem dterminadas pela técnica de microdiluição em caldo, realizada na presença e na ausência do inibidor de sistemas de efluxo PAβN... 75 Tabela 11. Perfil das proteínas de membrana externa dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 baseando nos géis de SDS-PAGE... 77 Tabela 12. Expressão relativa dos genes codificadores das OMPs OmpW, CarO, Omp33-36 e OmpHMP e da bomba de efluxo AdeB dos isolados clínicos comparados a expressão basal dos mesmos genes na ATCC BAA-1709... 80
xix
Figura 01. Estruturas químicas das moléculas dos carbepenens e de seus precursores... 16 Figura 2. Distribuição mundial de OXA-23 em isolados clínicos de A. baumannii resistentes aos carbapenens... 25 Figura 3. Distribuição mundial das variantes de OXA-23 descritas em Acinetobacter spp. e em K. pneumoniae... 28 Figura 4. Esquema do sistema de efluxo AdeABC... 35 Figura 5. Representação do operon do sistema AdeABC...………...……. 36 Figura 6: Distribuição dos 31 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 apresentando distintos perfis clonais de acordo com a unidade da federação brasileira... 41 .
Figura 7. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de PFGE dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 avaliados neste estudo.…... 61 Figura 8. Árvore filogenética entre os diferentes STs encontrados no presente estudo e os demais STs descritos no mundo até o momento.………...…... 64 Figura 9. Géis de SDS-PAGE das proteínas de membrana externa dos diferentes isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil.…...…. 78 Figura 10. Modelo de um complexo clonal...…...…. 86
xx
A produção de OXA-23 é o principal mecanismo de resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii no Brasil e surtos causados por esses micro-organismos têm sido reportados em todo o mundo. Embora as cefalosporinas de espectro ampliado (ESCph) não sejam hidrolisadas pelas carbapenemases de classe D, isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 apresentam altos níveis de resistência a esses antimicrobianos. O presente estudo objetivou avaliar a contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23. Para o estudo foram selecionados 31 isolados de A.
baumannii produtores de OXA-23 de quatorze hospitais privados localizados em sete estados brasileiros e que apresentavam diferentes padrões de PFGE. A identificação dos isolados de A.
baumannii foi realizada pelo MALDI-TOF MS e confirmada pelo sequenciamento do gene rpoB.
O perfil clonal foi novamente confirmado pela técnica de PFGE e analisado pelo programa
“BioNumerics”. A produção de genes codificadores de β-lactamases e sua associação com a presença de ISAba1 foi confirmada por PCR seguido de sequenciamento. O teste de sensibilidade foi realizado pela metodologia de microdiluição em caldo, segundo o CLSI. Para avaliar fenotipicamente a hiperexpressão de sistemas de efluxo, as CIMs para os β-lactâmicos foram comparadas na presença e na ausência do inibidor de sistemas de efluxo PAβN. A ancestralidade dos diferentes clones foi avaliada pela técnica de MLST. O perfil de proteínas de membrana externa foi avaliado por SDS-PAGE. Os níveis de transcrição dos genes adeB, carO, ompA, ompW e omp33-36 foram avaliados pela técnica de qRT-PCR comparando com os resultados obtidos da ATCC BAA-1709 de A. baumannii multissensível. Todos os isolados foram identificados como A. baumannii. Foi observada a presença de ISAba1 localizada a montante dos genes blaOXA-23, blaOXA-51-like e blaAmpC em 100%, 54,8% e 77,4% dos isolados, respectivamente. Um grande número de variantes da CHDL cromossômica do grupo OXA-51 foi verificada entre os isolados brasileiros de A. baumannii, estando a variante estreitamente relacionada ao respectivo padrão de PFGE/ST. Altos níveis de resistência foram observados para ampicillina/sulbactam, ESCph, aztreonam, carbapenens, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos e tigeciclina. Somente a polimixina B e a minociclina apresentaram atividade contra os isolados avaliados (CIM90 de 0,5 µg/mL, ambos). Os 31 perfis de PFGE foram agrupados em 12 STs diferentes, dos quais sete apresentaram sequências alélicas únicas. A maioria dos isolados pertencia aos complexos clonais CC79, CC15 e CC1, sendo o ST79 o mais prevalente entre os isolados avaliados (n=12; 38,7%). Os demais STs encontrados foram:
ST15 (n=6; 19,4%), ST1 (n=4; 12,9%) e ST162, ST46, ST188, ST189, ST190, ST191, ST192, ST228 e ST299 (n=1; 3,2%, cada). Os isolados apresentando o gene blaAmpC associado a ISAba1 apresentaram altas taxas de resistência às ESCph (ceftazidima, CIMs de 32 a >1024 µg/mL; cefotaxima, CIMs de 256 a >1024 µg/mL), contrastando com os isolados que não apresentavam tal associação (ceftazidima, CIMs de 8 a 128 µg/mL; cefotaxima, CIMs de 16 a 64 µg/mL). Diminuição da CIMs ≥ 2 diluições para meropenem e ceftazidima foi verificado em 80,6% (n=25) e 54,8% (n=17), respectivamente. A hiperexpressão do gene adeB foi observada em 74,2% (n=23) dos isolados, principalmente naqueles isolados pertencentes aos complexos clonais. Por outro lado, foi observada uma diminuição da expressão do gene carO. Apesar disso, o perfil de SDS-PAGE demonstrou uma grande reorganização das proteínas de membrana externa entre os isolados avaliados, destacando-se a ausência de uma porina de 21 kDa, compatível com a OmpW. A resistência às ESCph nos isolados brasileiros de A.
baumannii produtores de OXA-23 está relacionada a hiperprodução de AmpC, além disso, a hiperexpressão de sistemas de efluxo contribui na elevação das CIMs para meropenem e ceftazidima. A maioria dos clones de A. baumannii produtores de OXA-23 circulantes no Brasil, pertencem aos principais complexos clonais descritos no mundo e apresentam um fenótipo MDR. A resistência aos β-lactâmicos entre os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil é multifatorial, o que dificulta o seu completo entendimento.
xxi
The production of OXA-23 is the main mechanism of carbapenem-resistance among isolates of A. baumannii in Brazil, and outbreaks caused by these microrganisms have been reported worldwide. Although extended-spectrum cephalosporins (ESCph) are not hydrolyzed by the carbapenemases of class D, OXA-23-producing A. baumannii isolated in Brazil show high resistant rates to these antimicrobials agents. The present study aimed to evaluate the contribution of overexpression of efflux pumps AdeABC and overproduction of AmpC to the β- lactams resistance among A. baumannii Brazilian isolates producers of OXA-23. For this study, we selected 31 un-related isolates of A. baumannii producing OXA-23 from fourteen private hospitals located in seven Brazilian states. The identification of the isolates as A. baumannii was performed by MALDI-TOF MS and confirmed by sequencing of the rpoB gene. The genetic relatedness was evaluated by PFGE technique and analyzed by the BioNumerics software. The production of β-lactamase encoding genes and its association with the presence of ISAba1 was confirmed by PCR followed by sequencing. The susceptibility testing was performed by broth microdilution method according to CLSI. To assess the phenotype overexpression of efflux pumps, the MICs for the β-lactams were compared in the presence and absence of the inhibitor efflux pumps, PAβN. The filogenetic relationship among different clones was assessed by MLST. The outer membrane protein profiles were evaluated by SDS-PAGE. Transcription levels of the genes adeB, carO, ompA, ompW and omp33-36 were assessed by qRT-PCR technique compared to those obtained for the ATCC BAA-1709, multi-drug susceptible A. baumannii strain. All isolates were identified as A. baumannii. It was observed the presence of ISAba1 located upstream of the gene blaOXA-23, blaOXA-51-like and blaAmpC in 100%, 54.8% and 77.4% of the isolates, respectively. A large number of variants of the OXA-51 group was found among the A. baumannii Brazilian isolates, which were closely related to the corresponding PFGE pattern/ST. High resistant rates were observed for ampicillin/sulbactam, ESCph, aztreonam, carbapenems, fluoroquinolones, aminoglycosides and tigecycline. Only polymyxin B and minocycline showed activity against these isolates (MIC90, 0.5 μg/mL, for both drugs). The 31 PFGE profiles were grouped into 12 different STs, of which seven had unique allelic sequences.
Most isolates belonged to clonal complexes CC79, CC15 and CC1, being ST79 the most prevalent among the isolates (n=12, 38.7%) evaluated. The remaining STs founded were: ST15 (n=6, 19.4%), ST1 (n=4, 12.9%) and ST162, ST46, ST188, ST189, ST190, ST191, ST192, ST228 and ST299 (n=1, 3.2%; each). The isolates presenting the blaAmpC gene associated with ISAba1 showed high resistant rates to ESCph (ceftazidime MICs from 32 to >1024 μg/ml;
cefotaxime MICs from 256 to >1024 μg/mL), in contrast to those isolates that did not carry ISAba1 upstream blaAmpC and showed lower ceftazidime (8 to 128 μg/mL) and cefotaxime MICs (16 to 64 μg/mL). A ≥ 2 dilution decrease in the MICs of meropenem and ceftazidime was observed for 80.6% (n=25) and 54.8% (n = 17) of OXA-23-producing Acinetobacter baumannii, respectively. Overexpression of the gene adeB was observed in 74.2% (n=23) of isolates, particularly those isolates belonging to clonal complexes. Moreover, we observed a decrease of carO gene expression in the majority of the isolates. Nevertheless, the profile of SDS-PAGE showed a major reorganization of the outer membrane proteins among isolates, highlighting the absence of a 21 kDa porin, consistent with the OmpW. Resistance to ESCph in A. baumannii Brazilian isolates producers of OXA-23 is related to overproduction of AmpC coupled with the overexpression of efflux pumps, which contribute to the increased MICs for ceftazidime and meropenem. Most of OXA-23-producing A. baumannii clones circulating in Brazil belong to the major clonal complexes described in the world Resistance to β-lactams among isolates of A.
baumannii producing OXA-23 in Brazil is multifactorial, which hinders its complete understanding.
1 1. INTRODUÇÃO
Acinetobacter spp. são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza, possuindo a característica de se adaptarem a diversos locais e condições que seriam desfavoráveis para muitos outros micro-organismos (Higgins et al., 2010). Essas características estão relacionadas ao fato de que isolados de Acinetobacter spp.
necessitam de poucos nutrientes para se manterem metabolicamente ativos, o que os tornam facilmente adaptados ao ambiente nosocomial (Higgins et al., 2010). Além de serem intrinsicamente resistentes a diversos antimicrobianos, possuem uma grande capacidade em adquirir novos genes de resistência, sendo assim, são considerados patógenos de grande importância clínica, principalmente, no ambiente hospitalar.
Cepas de Acinetobacter spp. multirresistentes (MDR) tem se tornado uma preocupação mundial. Uma vez instaladas em uma determinada unidade ou, até mesmo, em todo o hospital, esses micro-organismos podem causar surtos de difícil controle e erradicação (Villegas & Hartstein, 2003). O fenótipo MDR limita, consideravelmente, as opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por Acinetobacter spp., dentre as quais, se destacam os carbapenens, a tigeciclina, a ampicilina/sulbactam e as polimixinas (Karageorgopoulos & Falagas, 2008).
Entretanto, na última década, as taxas de resistência aos carbapenens vem aumentando consideravelmente em todo o mundo.
De acordo com os dados do Programa SENTRY (Gales et al., 2012), a taxa de resistência aos carbapenens entre as amostras de Acinetobacter spp. isoladas em centros brasileiros, aumentou 60% em uma década, passando de 12,6%, no período de 1997 a 1999, para 71,4% no período de 2008 a 2010. A causa desse aumento pode ser justificada, em parte, pela disseminação de clones produtores da carbapenemase de classe D OXA-23, não somente no Brasil, mas em todo o mundo (Perez et al., 2007; Werneck et al., 2011a). Apesar das altas taxas de resistência aos carbapenens verificadas nos isolados brasileiros de A. baumannii, esses
2 antimicrobianos ainda constituem a primeira opção para o tratamento empírico de infecções causadas por esses micro-organismos, pois se difundem amplamente pelos tecidos, são bem tolerados e apresentam reações adversas mínimas (Nicolau, 2008).
No Brasil, a produção de OXA-23 é o mecanismo de resistência aos carbapenens mais frequentemente relatado em isolados clínicos de A. baumannii;
porém, sua produção isolada não afeta, de modo significativo, a atividade dos carbapenens, fazendo-se necessária a presença da sequência de inserção ISAba1 para aumentar a expressão da mesma e, dessa forma, elevar o grau de resistência a esses antimicrobianos (Poirel & Nordmann, 2006). Embora a produção de OXA-23 associada à ISAba1 justifique a resistência aos carbapenens nos isolados brasileiros, o mesmo não ocorre com as altas Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) para às cefalosporinas de amplo espectro verificadas nesses isolados (Werneck et al., 2011a;
Gales et al., 2012).
A OXA-23 é uma CHDL (Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase) mundialmente disseminada e, portanto, foco de muitos estudos, o que acarreta no desinteresse em estudar outros mecanismos de resistência aos β-lactâmicos pouco conhecidos, porém não menos importantes. Vários sistemas de efluxo foram descritos em A. baumannii e, quando hiperexpressos, conseguem ejetar diferentes classes de antimicrobianos, contribuindo para o fenótipo MDR. Entretanto, seriam os carbapenens e as cefalosporinas de amplo espectro ejetados eficientemente para o meio extracelular? O sistema de efluxo AdeABC é o mais importante e estudado dentre os sistemas descritos em A. baumannii e estudos anteriores demonstraram, ainda que indiretamente, que a hiperexpressão desse sistema pode contribuir com a resistência aos carbapenens, principalmente quando associado à produção de CHDLs (Héritier et al., 2005a, Héritier et al., 2005b).
O estudo de Peleg e colaboradores (2007a) analisou a ação do inibidor de sistema de efluxo PAβN (Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide) em isolados clínicos de A.
baumannii com elevadas CIMs para tigeciclina, cefepima e ceftazidima. Os autores
3 verificaram uma diminuição expressiva das CIMs para esses antimicrobianos na presença do inibidor, bem como para os carbapenens. No mesmo ano, foi demonstrado ser o sistema de efluxo AdeABC, o responsável pela resistência a tigeciclina nesses isolados (Peleg et al., 2007b).
Acredita-se que a associação da hiperexpressão de sistemas de efluxo com a produção de OXA-23 em A. baumannii poderia aumentar significativamente as CIMs dos β-lactâmicos, podendo levar à falência terapêutica quando estes forem utilizados clinicamente. As amostras de Acinetobacter spp. isoladas em hospitais brasileiros geralmente são resistentes a todos os β-lactâmicos, incluindo as cefalosporinas de amplo espectro, que não são substratos das CHDLs. Sendo assim, outros mecanismos presentes concomitantemente, poderiam estar contribuindo com esse fenótipo, como o aumento da produção de AmpC associado a ISAba1, ou o aumento da expressão de sistemas de efluxo (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Bou &
Martínez-Beltrán, 2000; Corvec et al., 2003; Segal et al., 2004).
A real contribuição dos sistemas de efluxo e/ou da hiperprodução de AmpC na elevação da CIMs para os carbapenens e para as cefalosporinas de amplo espectro em isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 ainda é desconhecida.
Diante do provavável papel dos mecanismos apresentados e da interação dos mesmos, o presente trabalho teve por objetivo estudar a contribuição do sistema de efluxo AdeABC e da hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil.
4 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Agente Etiológico
A história do gênero Acinetobacter começou na Holanda em 1911, onde o pesquisador Martinus Willem Beijerinck descreveu em uma amostra de solo, o primeiro micro-organismo originalmente denominado como Micrococcus calco-aceticus (Beijerinck, 1911). Durante muitos anos, espécies como Micrococcus calco-aceticus, Alcaligenes hemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginicola e Bacterium anitratum foram classificadas como sendo espécies diferentes. Somente em 1954, Brisou & Prevot (1954) propuseram o gênero Acinetobacter - que em grego significa bacilo não móvel - para separar as espécies sem motilidade das demais espécies móveis dentro do gênero Achromobacter a qual pertenciam.
Em 1968, Baumann e colaboradores (1968) fizeram um amplo estudo e reclassificaram essas espécies, agrupando-as no gênero Acinetobacter, proposto por Brisou e Prevot, 14 anos antes (Howard et al., 2012). Essas bactérias continham diversas características bioquímicas em comum, sendo elas: (i) diferentes formas de apresentação na coloração de Gram, ou seja, bacilos Gram negativos em sua fase exponencial e morfologia de cocobacilos Gram positivos ou lábeis em sua fase estacionária, devido a sua resistência à descoloração pelo álcool; (ii) produção de cápsula por algumas cepas; (iii) assimilação de nitrato; (iv) crescimento somente na presença de oxigênio; (v) não fastidiosas; (vi) não fermentadoras da glicose; (vii) não produtoras de oxidase; (viii) produtoras de catalase; (ix) imóveis; (x) não formadoras de esporos; (xi) não produtoras de pigmentos e (xii) relação G+C em torno de 39 a 47% (Baumann et al., 1968).
Somente em 1971, através do admirável trabalho de Baumann e colaboradores realizado em 1968, o Subcomitê de Taxonomia de Moraxella e Bactérias Relacionadas reconheceu o gênero Acinetobacter (Howard et al., 2012). Em 1986, Bouvet & Grimont propuseram mais quatro novas espécies: A. baumannii, A. junii, A. haemolyticus e A.
5 johnsonii e, desde então, novas espécies tem sido descritas. Em 1991, Gerner-Smidt e colaboradores propuseram um grupo incluindo as espécies de Acinetobacter de maior importância clínica e que possuíam características fenotípicas semelhantes, denominando-o “Complexo Acinetobacter calcoaceticus-baumannii”. Esse complexo inclui as espécies A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii e A. nosocomialis. Como possuem características bioquímicas muito semelhantes, a distinção dessas espécies constitui um grande desafio para os laboratórios clínicos de microbiologia. Entretanto, com os avanços da biologia molecular, essas quatro espécies conseguem ser bem diferenciadas. A exceção do A. calcoaceticus, que é comumente encontrado no meio ambiente, as outras três especies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus- baumannii são frequentemente isoladas no ambiente hospitalar e, portanto, possuem grande relevância clínica (Espinal et al., 2012).
Atualmente, isolados do gênero Acinetobacter spp. pertencem ao Reino Bacteria, Filo Proteobacteria, Classe Gammaproteobacteria, Ordem Pseudomonadales e Familia Moraxellaceae (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). Até o momento, foram descritas 27 espécies reconhecidas e validadas e mais seis espécies propostas, mas ainda não reconhecidas pela comunidade internacional (Towner, 2009;
Cayô, 2012). Nos laboratórios de pesquisa é comum identificar essas espécies por metodologias moleculares, de modo a se obter resultados confiáveis e discriminatórios. Porém, a implementação dessas técnicas nem sempre são custo- efetivas na rotina laboratorial.
Em muitos laboratórios de microbiologia, as técnicas bioquímicas manuais para identificação bacteriana ainda são empregadas. Entretanto, tais técnicas são demoradas e para algumas bactérias, como no caso do gênero Acinetobacter, não são discriminatórias o suficiente devido à semelhança catabólica entre suas espécies, principalmente dentro complexo A. calcoaceticus-baumannii. Tais problemas também comprometem o uso dos aparelhos automatizados como o Phoenix® (BD, New Jersey, USA), o MicroScan-WalkAway® (Siemens, Munich, Germany) e o Vitek® (Biomerieux,
6 Marcy l'Etoile, France) na diferenciação das espécies de Acinetobacter spp. (Espinal et al., 2012).
Recentemente, a técnica “Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight Mass Spectrometry” (MALDI-TOF MS) foi desenvolvida para a identifcação rápida e acurada de micro-organismos (Seng et al., 2009). O MALDI-TOF MS é uma técnica de proteômica que ioniza proteínas e as identifica pela sua relação massa/carga e, nos últimos anos, vem sendo empregada na rotina laboratorial por apresentar boa acurácia na identificação de muitas espécies bacterianas, com uma ótima relação custo/benefício e, principalmente, pela rapidez na liberação dos resultados (Seng et al., 2009, Espinal et al., 2012). O MALDI-TOF MS constitui uma boa metodologia para a identificação do complexo A. calcoaceticus-baumannii desde que se inclua o espectro de A. nosocomialis em seu banco de dados (Espinal et al., 2012).
Além do MALDI-TOF MS, uma vasta gama de técnicas moleculares são utilizadas na identificação e diferenciação das espécies de Acinetobacter spp., dentre as quais podemos citar: i) a hibridização DNA-DNA que é utilizada na avaliação da taxonomia para novas espécies descritas (Dijkshoorn & Nemec, 2008); ii) o sequenciamento da porção 16S do rRNA (Ibrahim et al., 1997); iii) o ARDRA
“Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis” (Vaneechoutte et al., 1995); iv) o AFLP “Amplified Fragment Lenght Polimorfism” (Janssen et al., 1996); v) a ribotipagem (Gerner-Smidt et al., 1991), vi) o sequenciamento das regiões espaçadoras intergênicas da porção 16S-23S do rRNA (Chang et al., 2005) e vii) a análise de restrição das regiões espaçadoras intergênicas da porção 16S-23S ribossomal (Dolzani et al., 1995). Além destas, outras técnicas como a análise dos perfis das proteínas do envelope celular (Dijkshoorn et al., 1987; Dijkshoorn et al., 1990) e a tipagem do antígeno O por anticorpos monoclonais, constituem outras técnicas utilizadas para identificação de amostras de Acinetobacter spp. (Pantophlet et al., 2002).
7 Dentre tantas técnicas descritas, o sequenciamento do gene rpoB, codificador da porção β da RNA polimerase, é considerado como o mais fidedigno, pois diferencia não somente as espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii como também as demais espécies do gênero (Gundi et al., 2009). Esse gene de apenas uma cópia é altamente variável, apresentando quatro regiões que são altamente discriminatórias, sendo duas regiões internas (zona 1, 350 pb e zona 2, 450 pb) ao gene rpoB e duas regiões flanqueadoras variáveis, sendo a primeira de 301 pb a 310 pb e a segunda de 86 pb a 177 pb (La Scola et al., 2006).
2.2. Epidemiologia das Infecções Causadas por A. baumannii
A. baumannii, ao contrário de outras espécies deste gênero, raramente é encontrado no meio ambiente (Peleg et al., 2008), sendo isolado principalmente no ambiente nosocomial, como, equipamentos médicos, fômites e colonizando funcionários e pacientes do hospital (McConnell et al., 2013). O habitat natural de A.
baumannii ainda não é conhecido e, apesar de muito especulado, nenhum estudo concluiu o seu nicho ecológico até o momento (Peleg et al., 2008). Entretanto, a sazonalidade parece estar correlacionada à frequência de isolamento de A. baumannii em amostras clínicas, sendo mais prevalente em climas tropicais, como mostrado no estudo de Chu e colaboradores (1999) em Hong Kong. Esse estudo relatou que durante o verão, 53% dos estudantes de medicina e enfermeiras avaliados tiveram sua pele colonizada por A. baumannii, enquanto no inverno, essa porcentagem reduziu para 32%. Fora do ambiente hospitalar, um dado interessante foi publicado no estudo conduzido por La Scola & Raoult (2004), o qual encontrou A. baumannii no corpo de 21% dos Pediculus humanus estudados provenientes de moradores de rua. Eles concluíram que a alta prevalência desse patógeno em piolhos humanos eventualmente poderia causar bacteremia nesses indivíduos. Já Berlau e colaboradores (1999b) estudaram a prevalência de Acinetobacter em vegetais e constataram que de 177 amostras, 27% continham A. baumannii. Esse dado contradiz
8 com a informação de que A. baumannii raramente é encontrado fora do ambiente hospitalar. Por outro lado, A. baumannii raramente é encontrado colonizando o corpo humano, sendo isolado de 0,5% a 3% na pele (Seifert et al., 1997, Berlau et al., 1999a) e em 0,8% do trato gastrointestinal de humanos saudáveis (Dijkshoorn et al., 2005).
Embora sua fonte natural ainda permaneça uma incógnita, sabe-se que este é o principal micro-organismo relacionado a surtos hospitalares, capaz de causar infecção em diversos sítios corpóreos de pacientes hospitalizados (Peleg et al., 2008).
As infecções mais comumente causadas por A. baumannii serão descritas a seguir.
A pneumonia associada à ventilação mecânica é uma das infecções mais comuns causada por A. baumannii no ambiente hospitalar e é precedida pela colonização das vias aéreas (Dijkshoorn et al., 2007), cuja taxa de mortalidade nestes casos fica entre 40% a 70% (Fagon et al., 1996; Garnacho et al., 2003). A pneumonia adquirida na comunidade causada por este patógeno é rara e tem sido associada a fatores predisponentes como alcoolismo ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
Nesses casos, a taxa de mortalidade também é alta, variando entre 40% e 60%
(Anstey et al., 1992; Chen et al., 2001; Anstey et al.,2002; Leung et al., 2006).
Embora as queimaduras também sejam um importante sítio de infecção por A.
baumannii, é difícil a diferenciação entre colonização e infecção nesses casos. Além disso, o tratamento possui uma dificuldade a mais, pois há uma menor penetração do antimicrobiano nesses locais (McConnell et al., 2013). Durante a guerra do Afeganistão e Iraque, por exemplo, 22% das infecções causadas por A. baumannii, em soldados americanos feridos em campo de batalha, tiveram como sítio infeccioso a pele queimada, sendo que 53% desses isolados eram MDR (Keen et al., 2010). Outro problema comum em combatentes de guerra é a infecção de pele e partes moles (Murray et al., 2006; Johnson et al., 2007; Scott et al., 2007; Sebeny et al., 2008). Scott e colaboradores (2007) coletaram amostras de pele de soldados feridos, do solo e das áreas de tratamento nos campos de batalha do Iraque, para verificar a presença de A.
9 baumannii. Os autores isolaram A. baumannii somente em 0,6% da pele dos pacientes e em 2% das amostras de solo. Entretanto, esse micro-organismo foi isolado em todas as áreas de tratamento coletadas, sugerindo que essa era a fonte de contaminação.
Fora do contexto militar, A. baumannii também foi encontrado em feridas de sobreviventes do tsunami que ocorreu no final de 2004 na Ásia (Garzoni et al., 2005;
Maegele et al., 2005). Osteomielite causada por A. baumannii também é outra infecção frequente em combatentes de guerra (Davis et al., 2005; Murray et al., 2006;
Johnson et al., 2007; Petersen et al., 2007; Schafer & Mangino, 2008).
Outro quadro infeccioso causado por A. baumannii são as meningites. Nos últimos anos tem-se observado um aumento dos casos de meningite causada por esse patógeno, principalmente associada a pacientes submetidos a neurocirurgias (Siegman-Igra et al., 1993; Katragkou et al., 2006; Cascio et al., 2010). Rodríguez Guardado e colaboradores (2008) identificaram 51 casos de meningite pós- neurocirúrgica causadas por A.baumannii em dois hospitais universitários, entre 1990 a 2004, que apresentaram uma elavada taxa de mortalidade (33%). Esses casos representaram 10,9% de todos os casos de meningites identificados nos dois hospitais durante o período de estudo. Em um estudo similar, Metan e colaboradores (2007) avaliaram 28 casos de meningite causada por A. baumannii e observaram uma mortalidade de 71%. Embora pouco frequentes, casos de meningite por A. baumannii adquirida na comunidade também já foram relatados (Chang et al., 2000; Taziarova et al., 2007; Lowman et al., 2008; Ozaki et al., 2009). Outros quadros infecciosos causados por A. baumannii, ainda que raros, como endocardite associada à prótese valvar (Olut & Erkek, 2005) e ceratite em paciente submetido à cirurgia ocular (Kau et al., 2002) também foram relatados.
A habilidade de sobreviver em ambientes desfavoráveis, observada em isolados clínicos de A. baumannii constitui sua principal característica em relação a outros Gram negativos e deve-se, em parte, a sua capacidade em formar biofilmes, resistindo à dissecação (Donlan & Costerton, 2002; Gaddy & Actis, 2009). A
10 dificuldade em erradicar A. baumannii do ambiente hospitalar, torna os surtos causados por esse patógeno de difícil controle (Wilks et al., 2006).
2.3. Opções de Tratamento para Infecções Causadas por A. baumannii Diante das características apresentadas, A. baumannii é uma bactéria de difícil tratamento já que poucos são os antimicrobianos disponíveis clinicamente que apresentam atividade contra esses micro-organismos na atualidade. Infelizmente, algumas cepas apresentam resistência a todos os antimicrobianos que serão aqui abordados.
2.3.1. Ampicilina/Sulbactam
Sulbactam é um inibidor de β-lactamase que possui atividade contra Acinetobacter spp. (Brauers et al., 2005), pois se liga à proteína ligadora de penicilina 2 (PBP2), uma das enzimas responsáveis pele síntese de peptideoglicano da parede celular bacteriana (Cayô et al., 2011b). No Brasil, sulbactam é comercializado juntamente com a ampicilina, porém, apenas o sulbactam apresenta atividade contra isolados de A. baumannii (Corbella et al., 1998; Brauers et al., 2005).
O tratamento com ampicilina/sulbactam vem sendo descrito como uma alternativa eficaz em infecções causadas por Acinetobacter spp. (Jiménez-Mejías et al., 1997, Tuon et al., 2010). Mesmo nos casos de infecções causadas por Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens, o uso da ampicilina/sulbactam tem sido preferido ao das polimixinas (Oliveira et al., 2008). Embora a monoterapia não seja recomendada para os casos de infecções graves (Maragakis & Perl, 2008), a associação de ampicilina/sulbactam com outros antimicrobianos, como amicacina, rifampicina ou colistina tem apresentado resultados promissores (Appleman et al., 2000; Savov et al., 2002; Ko et al., 2004, Kiffer et al., 2005; Tong et al., 2006; Song et al., 2007; Peleg, 2007c; Shrivastava et al., 2009). O uso de ampicilina/sulbactam é indicado e eficaz no tratamento de meningites, pneumonia associada à ventilação
11 mecânica e bacteremia associada ao uso de cateter (Jiménez-Mejías et al., 1997;
Corbella et al., 1998; Wood et al., 2002, Oliveira et al., 2008).
As principais vantagens desse antimicrobiano são o custo reduzido e a sua boa tolerabilidade (Jellison et al., 2001; Oliveira et al., 2008). Apesar disso, alguns estudos tem mostrado um constante aumento na resistência a esse antimicrobiano, como apresentado no trabalho de Yang e colaboradores (2010), em Taiwan, onde a taxa de resistência observada foi em torno de 70%. Já Wieczorek e colaboradores (2012) apresentaram um estudo de resistência in vitro, onde a CIM para sulbactam em isolados de A. baumannii passou de 0,5 µg/mL para 4 µg/mL, quando os isolados foram induzidos a 0,9x o valor da CIM inicial. Mesmo não sendo mais expostos ao sulbactam, a CIM dos isolados de A. baumannii não retornaram ao seu valor original, sugerindo que o uso do sulbactam poderia favorecer o surgimento de cepas resistentes, para as quais o tratamento com esse antimicrobiano, mesmo em altas doses, poderia não ser efetivo.
2.3.2. Minociclina
A minociclina é um derivado da tetraciclina que foi introduzida na década de 60 (Neonakis et al., 2011) e que voltou a ser utilizada pela redução de opções terapêuticas eficazes e pelo surgimento de cepas de A. baumannii MDR. Seu mecanismo de ação consiste em completar os ribossomos, impedindo a ligação do tRNA e, consequentemente, inibir a transcrição da síntese proteica (Chopra et al., 1992). A minociclina apresenta concentrações sanguíneas e teciduais ideais, boa penetração no sistema nervoso central e uma menor taxa de resistência comparada à tetraciclina. Ela apresenta atividade contra micro-organismos Gram positivos e Gram negativos (Bishburg & Bishburg, 2009), incluindo isolados de A. baumannii (Pei et al., 2012; Fernández-Cuenca et al., 2013).
Embora poucos estudos descrevam o uso da minociclina, os resultados demonstram que esse antimicrobiano pode ser uma boa opção terapêutica no
12 tratamento de isolados de A. baumannii MDR. Griffith e colaboradores (2008) relataram o sucesso do tratamento com minociclina em sete de oito casos de ferida traumática, ocasionada por isolados MDR pertencentes ao complexo A. calcoaceticus- baumannii. Já Wood e colaboradores (2003), descreveram o tratamento efetivo em pacientes com pneumonia. Entretanto, algumas cepas de A. baumannii apresentam resistência a esse antimicrobiano que, aparentemente, possuem dois mecanismos de resistência: o primeiro seria decorrente dos genes moduladores tetB e otr, específicos de sistemas de efluxo, responsáveis por fazer a extrusão da tetraciclina e da minociclina, mas não da tigeciclina (Chopra et al., 1992; Huys et al., 2005a); e o segundo é a síntese da proteína Tet(M) e Tet(O), que se ligam ao ribossomo, modificando sua conformação e impedindo a ligação da minociclina, da tetraciclina e da doxiciclina (Chopra & Roberts, 2001; Ribera et al., 2003).
2.3.3. Tigeciclina
A tigeciclina é um antimicrobiano semissintético da família das glicilciclinas, que foi sintetizado a partir de modificação na molécula de minociclina. Seu mecanismo de ação consiste em inibir a síntese proteica da bactéria, ligando-se a subunidade 30S do ribossomo. Possui atividade contra micro-organismos Gram negativos, incluindo os isolados produtores de carbapenemases, Gram positivos [incluindo isolados de Sthaphylococcus aureus resistentes à oxacilina (ORSA) e Enterococcus spp.
resistentes à vancomicina (VRE)] e anaeróbios (Bergeron et al., 1996).
Para este antimicrobiano, não existem critérios de sensibilidade estabelecidos pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2012), “British Society for Antimicrobial Chemotherapy” (BSAC, 2010) e “The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” (EUCAST, 2012), para categorizar os isolados de Acinetobacter spp. (Neonakis et al., 2011). Entretanto, pelo seu valor de CIM baixo, a tigeciclina atinge baixas concentrações séricas e, as poucas opções de tratamento
13 observadas para isolados de A. baumannii MDR, fazem da tigeciclina um antimicrobiano oportuno (Peleg et al., 2007a; Neonakis et al., 2011).
Vários estudos foram realizados como intuito de avaliar a eficácia clínica da tigeciclina em infecções causadas por A. baumannii, já que esse antimicrobiano possui boa atividade in vitro contra esses isolados (Neonakis et al., 2011). Poulakou e colaboradores (2009) relataram que, de 15 pacientes infectados com A. baumannii MDR, 11 obtiveram melhora ou cura com a monoterapia por tigeciclina. Esse resultado se contrapõe ao estudo de Gallagher & Rouse (2008), no qual os autores relataram que, dos 28 pacientes com infecção causada por A. baumannii MDR avaliados, apenas oito obtiveram melhoria ou cura com a monoterapia com tigeciclina. Da mesma forma, Schafer e colaboradores (2007) retrataram um caso de pneumonia e bacteremia causado por um isolado de A. baumannii MDR, que veio a desenvolver resistência a tigeciclina durante o tratamento. Resultado semelhante foi observado por Reid e colaboradores (2007), que verificaram o aumento da CIM de tigeciclina em um isolado de A. baumannii ao longo do tratamento de infecção urinária pós-transplante de rim e fígado. Por essas razões, os autores concluíram que pacientes acometidos por infecções causadas por A. baumannii MDR, que fazem uso de tigeciclina, devem ser monitorados quanto ao desenvolvimento de resistência durante o tratamento (Reid et al., 2007).
A terapia combinada pode constituir uma alternativa para desfavorecer o desenvolvimento de resistência à tigeciclina. Estudos tem relatado sinergismo das combinações de tigeciclina com carbapenens, levofloxacino, amicacina ou rifampicina (Entenza et al., 2009; Lim et al., 2009; Principe et al., 2009). Resultados controversos da combinação da tigeciclina com a colistina tem sido reportados (Petersen et al., 2006; Arroyo et al., 2009; Dizbay et al., 2010). Estudos prospectivos ainda são necessários, incluindo um maior número de pacientes, para melhor definir a real eficácia da tigeciclina nas infecções causadas por A. baumannii (Neonakis et al., 2011).
14 2.3.4. Polimixinas
Polimixina B e polimixina E (também denominada colistina) são polipeptídeos provenientes da bactéria Paenibacillus polymyxa que foram descobertos em 1947 (Girardello, 2012). Seu mecanismo de ação consiste em permeabilizar a parede celular bacteriana, deslocando as moléculas de cálcio e magnésio, ligadas ao lipopolissacarídeo bacteriano, o que desestabilizaria os componentes da membrana celular externa e interna (Hancock, 1997).
Durante muito tempo, a polimixina teve o seu uso restrito devido à sua toxicidade (Wolinsky & Hines, 1962; Koch-Weser et al., 1970; Gales et al., 2001;
Falagas et al., 2007). Entrentanto, estudos recentes relatam que as polimixinas não são tão tóxicas como se imaginava (Conway et al., 1997; Kasiakou et al., 2005; Reina et al., 2005; Falagas et al., 2007) e, devido as restritas opções terapêuticas, atualmente, esses antimicrobianos são empregados com uma frequência cada vez maior no tratamento das infecções causadas por bactérias Gram negativas MDR.
As polimixinas apresentam diversas formas de administração, tópica, inalatória ou parenteral (Karageorgopoulos & Falagas, 2008; Landman et al., 2008). Elas são utilizadas para tratar infecções de corrente sanguínea, feridas, infecção do trato urinário (Gounden et al., 2009), pneumonias e meningites causadas por micro- organismos Gram negativos MDR (Karageorgopoulos & Falagas, 2008). Entretanto, o relato do fenômeno de heterorresistência que ocorre quando subpopulações geneticamente idênticas são mais resistentes que o clone original é preocupante (Perez et al., 2007), já tendo sido reportado em isolados de A. baumannii (Li et al., 2006). No estudo de Li e colaboradores (2006) foi observado que de 16 isolados, 15 apresentavam heterorresistência, indicando que esse fenômeno pode ser frequente.
Felizmente ainda são raros os relatos de resistência às polimixinas (Gales et al., 2001; Gales et al., 2006) e muitos estudos tem demonstrado sucesso no tratamento de infecções causadas por A. baumannii utilizando antimicrobianos dessa classe (Levin et al., 1999; Michalopoulos et al., 2005b; Holloway et al., 2006; Kallel et
15 al., 2007; Falagas et al., 2010). Nos casos de isolados resistentes aos carbapenens, o tratamento de primeira escolha é aquele que emprega as polimixinas (Garnacho- Montero et al., 2003; Michalopoulos et al., 2005a; Matthaiou et al., 2008).
2.3.5. Carbapenens
Em 1967, com o surgimento de isolados produtores de β-lactamases e a ineficiência da penicilina contra esses agentes, a indústria Beecham Pharmaceuticals (London, UK) começou um estudo para encontrar um inibidor de β-lactamase proveniente de fonte natural (Basker, 1982). Apenas em 1976, foi isolado em várias culturas de Streptomyces olivaceus, o ácido olivânico, que não foi considerado apenas um inibidor de β-lactamase, mas também um antimicrobiano com um espectro mais amplo do que outros β-lactâmicos disponíveis naquela época. Devido a sua pouca penetração na célula bacteriana e a sua instabilidade química, esse composto teve o seu desenvolvimento interrompido (Brown et al, 1976; Butterworth et al., 1979; Hood et al., 1979). Em paralelo, pesquisadores da Merck, Sharp and Dohme Research Laboratories (Harlow, UK), se voltavam para a descoberta de antimicrobianos que bloqueavam a síntese de peptideoglicano e analisavam um novo antimicrobiano obtido de culturas de Streptomyces cattleya que foi, posteriormente, nomeado como tienamicina. Coincidentemente, esse composto possuía o mesmo núcleo carbapenêmico do ácido olivânico, mas se diferenciava quanto à estrutura química (Albers-Schonberg et al., 1978; Kahan et al., 1979). Anos mais tarde, foi desenvolvido o imipenem, cuja molécula precursora foi a tienamicina, que teve o início da sua utilização clínica em 1985 (Miyadera et al., 1983; Papp-Wallace et al., 2011). Desde então, novas moléculas foram sendo desenvolvidas e aprimoradas e, atualmente, existem seis carbapenens para uso clínico que se diferem pela sua estrutura molecular, como apresentado na Figura 1. No Brasil, somente o ertapenem, o imipenem e o meropenem estão disponíveis para uso clínico.
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Figura 1. Estruturas químicas das moléculas dos carbepenens e de seus precursores (Figura obtida de Papp-Wallace et al., 2011). 1: ácido olivânico; 2: tienamicina; 3:
imipenem; 4: meropenem; 5: ertapenem; 6: doripenem; 7: panipenem, 8: biapenem.
Os carbapenens, assim como todos os β-lactâmicos, possuem efeito bactericida, pois inibem a síntese da parede celular. O anel β-lactâmico é um análogo esterioquímico do terminal D-alanina-D-alanina, se ligando às PBPs da bactéria, que são enzimas responsáveis pela síntese de peptídeoglicano. Uma vez ocorrida essa ligação, é observada uma lenta hidrólise do anel β-lactâmico, impedindo, dessa forma,
17 que as PBPs sintetizem o peptideoglicano, principal composto da parede celular (Zapun et al., 2008; Drawz & Bomono, 2010).
Os carbapenens são os antimicrobianos utilizados como primeira opção terapêutica nas infecções causadas por A. baumannii, por possuirem um amplo espectro de ação, que engloba tanto bactérias Gram negativas como Gram positivas e por apresentarem boa tolerabilidade e eficácia (Papp-Wallace et al., 2011). Os carbapenens mais utilizados no Brasil são o imipenem, meropenem e ertapenem e algumas observações a respeitos desses compostos devem ser consideradas: (i) o imipenem, primeiro carbapenem descrito, é degradado pela enzima dehidropeptidase- 1 (DHP-1) e, por isso, é administrado juntamente com a cilastatina, um inidor dessa enzima (Zhanel et al., 2007); (ii) o meropenem não é tão potente quanto o imipenem na ação contra A. baumannii, mas não é uma regra geral, pois varia de acordo com a cepa (Oliver et al., 2004); e (iii) o ertapenem tem um espectro restrito e não possui atividade contra isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (Oliver et al., 2004).
Altas taxas de resistência aos carbapenens verificadas entre os isolados de A.
baumannii tem sido descritas em todo o mundo (Poirel & Nordmann, 2006; Peleg et al., 2008). Os principais mecanismos de resistência aos carbapenens descritos nesse micro-organismo são: (i) a produção de carbapenemases do tipo OXA, principalmente a OXA-23 associada ao elemento de inserção ISAba1, OXA-58 associada aos elementos de inserção ISAba2, ISAba3 e ISAba18 e OXA-24/40 (Poirel & Nordmann, 2006; Turton et al., 2006); (ii) perda ou redução da porina CarO (29kDa) (Mussi et al., 2005); (iii) redução da expressão da PBP2 (Fernández-Cuenca et al., 2003a) e (iv) a hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC (Marqué et al., 2005). Todos esses mecanismos podem estar presentes no mesmo isolado, uma característica muito comum em cepas MDR de A. baumannii, que será discutida posteriormente.
Na tentativa de combater infecções mais graves, a terapia combinada surge como uma importante alternativa. Entretanto, o surgimento de micro-organismos resistentes é um risco que deve ser levado em consideração. Para tratar isolados de
