CORRELAÇÃO ENTRE DISTRIBUIÇÃO DE EPHRINAS-B E
GLICOCONJUGADOS PNA-POSITIVOS E TRAJETOS MIGRATÓRIOS DE CÉLULAS DA CRISTA NEURAL: ANÁLISE AO NÍVEL VAGAL EM EMBRIÕES DE
GALINHAS LEGHORN, E DE GALINHAS LEGHORN E SEDOSA JAPONESA AO NÍVEL DO TRONCO
CURITIBA 2006
CORRELAÇÃO ENTRE DISTRIBUIÇÃO DE EPHRINAS-B E
GLICOCONJUGADOS PNA-POSITIVOS E TRAJETOS MIGRATÓRIOS DE CÉLULAS DA CRISTA NEURAL: ANÁLISE AO NÍVEL VAGAL EM EMBRIÕES DE
GALINHAS LEGHORN, E DE GALINHAS LEGHORN E SEDOSA JAPONESA AO NÍVEL DO TRONCO
Tese apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Biologia Celular e Molecular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná.
Orientação: Profª Drª Cloris Ditzel Faraco
CURITIBA 2006
Dedico esta tese
Ao Adriano e aos meus pais, Jair e Leonina, pelo apoio em todas as horas.
ii
À Cloris, pelos exemplos de ética e humildade, e por toda paciência e amizade em todos os momentos.
Aos meus pais, Jair e Leonina, por todo amor e pelas oportunidades que me ofereceram.
Ao Adriano, em quem sempre encontrei o refúgio necessário para renovar minhas forças, pelo apoio em todos os momentos que precisei.
Às minhas irmãs, Priscila e Poliana, por compartilharem comigo este momento especial.
Às minhas amigas e companheiras do Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, Cláudia, Marisa e Cristina pelo companheirismo e amizade.
À Maria Aparecida, pelo apoio e incentivo, principalmente nos momentos difíceis.
À Da Granja Agroindustrial Ltda. pela doação dos ovos de galinhas da raça Leghorn, essenciais à execução deste trabalho.
Ao Afonso Budziak, técnico do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), pelo empréstimo do equipamento Pipette puller (puxador de pipetas).
Ao Antonio Carlos Valomin e ao Ricardo Mickus Fujihara pelo auxílio técnico na confecção da fonte elétrica, indispensável à execução das microinjeções.
À Dra. Carol A. Erickson pela cessão de alguns materiais indispensáveis à realização deste trabalho.
À Professora Carla Wanderer pelo empréstimo do equipamento de captura de imagens de campo claro.
À Professora Sônia Regina Grotzner pela atenção durante a utilização do equipamento de captura de imagens.
À Coordenação e aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Celular, Marlene, Gerizalda, Ana, Nino, Eliane, e Rozalina.
Aos colegas do Programa pela convivência.
À CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - pela bolsa concedida.
iii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... vi
LISTA DE ABREVIATURAS ... viii
RESUMO ... xii
ABSTRACT ... xiii
CAPÍTULO 1 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA ... 01
1.1. O DESTACAMENTO DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL DO TUBO NEURAL ... 05
1.2. A ESPECIFICAÇÃO DA CRISTA NEURAL ... 07
1.3. A MIGRAÇÃO DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL E OS NÍVEIS AXIAIS ... 09
1.4. ARCOS BRANQUIAIS E CÉLULAS DA CRISTA NEURAL ... 13
1.5. CRISTA NEURAL CARDÍACA ... 18
1.6. CÉLULAS DA CRISTA NEURAL E TUBO DIGESTIVO ... 23
1.7. AS MOLÉCULAS ENVOLVIDAS NA MIGRAÇÃO DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL ... 28
1.8. RECEPTORES Eph E SEUS LIGANTES, AS EPHRINAS ... 35
1.9. MIGRAÇÃO X CRESCIMENTO DIFERENCIAL ... 40
2. JUSTIFICATIVA ... 42
3. OBJETIVOS ... 44
CAPÍTULO 2 – THE DISTRIBUTION OF EPHRINS AND PNA-POSITIVE… ... 46
ABSTRACT ... 47
INTRODUCTION ... 48
EXPERIMENTAL PROCEDURES ... 50
RESULTS ... 52
DISCUSSION ... 58
ACKNOWLEDGMENTS ... 63
REFERENCES ... 64
CAPÍTULO 3 – MAPEAMENTO DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL... RESUMO ... 77
3.1. INTRODUÇÃO ... 78
3.2. MATERIAL E MÉTODOS ... 81 iv
3.2.2. INJEÇÃO DO CORANTE VITAL (DiI) POR IONTOFORESE ... 81 3.2.3. IMUNODETECÇÃO DE LIGANTES EPHRINA-B ... 83 3.2.4. DETECÇÃO DE GLICOCONJUGADOS PNA-POSITIVOS E
CÉLULAS DERIVADAS DA CRISTA NEURAL ... 84 3.3. RESULTADOS ... 86 3.3.1. INJEÇÕES DE DiI E IMUNOMARCAÇÃO DE CÉLULAS DA CRISTA
NEURAL ... 86 3.3.2. DETECÇÃO DE LIGANTES EPHRINA-B E DE GLICOCONJUGADOS
PNA-POSITIVOS ... 88 3.4. DISCUSSÃO ... 99 CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 105 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 108
v
CAPÍTULO 1
Ilustração 1- Representação esquemática do ovo de ave no momento
da postura ... 01
Ilustração 2- Destacamento das células da crista neural durante o fechamento do tubo neural ... 03
Ilustração 3- Embrião de ave no estágio 17 ... 09
Ilustração 4- Representação esquemática de corte de embrião de ave ... 10
Tabela 1- Nomenclatura atual da família Eph e seus ligantes ... 35
Ilustração 5- Estrutura molecular dos receptores Eph e seus ligantes ... 36
Ilustração 6- Interação entre os membros das subclasses A e B de receptores Eph e ligantes ephrina ... 38
CAPÍTULO 2 Figure 1- Schematic drawings of individual sections comparing the migration pattern of melanoblasts of SK and WL embryos at stages 20, 24 and 28 ... 69
Figure 2- Sections through the thoracic level of SK embryos at stage 26 labeled with SL serum ... 70
Figure 3- Sections through the thoracic level of SK and WL embryos at stages 20 and 24 labeled with EphB2-Fc to determine the distribution of ephrin-Bs ... 71
Figure 4- Sections through the thoracic level of SK (A, B, E and F) and WL (C, D, G and H) embryos at stage 28 labeled with EphB2-Fc and PNA-FITC lectin ... 72
Figure 5- Sections through the thoracic level of SK (A) and WL (B) embryos at stage 28 labeled with antibody to fibronectin ... 73
Figure 6- Sections through the thoracic (A and C) and sacral (B and D) level of SK embryos at stages 20 and 22 labeled with EphB2-Fc ... 74
Figure 7- Sections through the thoracic level of SK (A, B, C, G, H and I) and WL (D, E and F) embryos at stage 28 labeled with SL serum after injection with ephrin-B1-Fc (A, D and G), PNA-FITC lectin (B, E and H) and PBS (C, F and I) ... 75
vi
labeled with SL serum after injection with PNA-FITC... 76 CAPÍTULO 3
Ilustração 1- Representação esquemática da porção anterior de embrião
de ave no estágio 10 ... 82 Figura 1- Mapas esquemáticos de cortes de embriões em diferentes estágios
do desenvolvimento injetados com DiI ao nível do somito 2 ... 91 Figura 2- Mapas esquemáticos de cortes de embriões em diferentes estágios
do desenvolvimento injetados com DiI ao nível do somito 3 ... 92 Figura 3- Mapas esquemáticos de cortes de embriões em diferentes estágios
do desenvolvimento injetados com DiI ao nível do somito 4 ... 93 Figura 4- Mapas esquemáticos de cortes de embriões em diferentes estágios
do desenvolvimento injetados com DiI ao nível do somito 5 ... 94 Figura 5- Fotomicrografias de fluorescência de cortes de embriões injetados
com DiI ... 95 Figura 6- Cortes histológicos ao nível vagal de embriões em diferentes
estágios do desenvolvimento imunomarcados com HNK-1... 96 Figura 7- Cortes histológicos ao nível vagal de embriões em diferentes
estágios do desenvolvimento imunomarcados para detecção de ligantes
ephrina-B ... 97 Figura 8- Cortes histológicos ao nível vagal de embriões em diferentes
estágios do desenvolvimento imunomarcados com HNK-1 (rodamina)
e citoquimicamente marcados com PNA (fluoresceína) ... 98
vii
A-CAM - molécula de adesão celular N-caderina ad - aorta dorsal
ANNA-1 - anticorpo que reconhece neurônios AP - fosfatase alcalina
BCIP - 5-bromo-4-cloro-3-idolil fosfato BMP - proteína morfogenética do osso BrdU - bromodeoxiuridina
BSA - soro albumina bovina c - região cardíaca Ca2+ - íon cálcio
cc - crista circunfaringeal
c-cad - moléculas de adesão celular da família caderina cfrzb - inibidor da molécula sinalizadora Wnt
c-kit - molécula receptora do fator Steel cp - cavidade pericardial
CSAT - anticorpo que reconhece a subunidade E1 de integrina de galinha
d - dermátomo
da - aorta dorsal
DiI - 1,1’-dioctadecil-3,3,3’,3’-tetrametilindocarbocianina perclorato dl - via dorsolateral
drg - gânglio de raiz dorsal
E/C8 - anticorpo monoclonal que reconhece uma população de células da crista neural que migra do nível vagal para os arcos branquiais EDN3 - endotelina 3
viii
Edn3 - gene para endotelina 3 EDNRB - receptor B de endotelina
Ednrb - gene para o receptor B de endotelina Eph - receptores tirosina quinases
et al. - et alli
ET3 - endotelina 3
f - faringe ou tubo digestivo anterior FGF - fator de crescimento de fibroblasto FITC - isotiocianato de fluoresceína FN - fibronectina
FoxD3 - membro da classe de fatores de transcrição hélice-alada g - tubo digestivo
GalTase - galactosiltransferase
GFAP - anticorpo que reconhece células da glia GFP - proteína fluorescente verde
GlcNac - N-acetilglucosamina gt - gânglio transitório de Froriep HH - Hamburger & Hamilton, 1951
HNK-1 - anticorpo monoclonal que reconhece um oligossacarídeo [sulfato-3- GlcAE(1o3)GalE(1o4)GlcNAcE(1o3)GalE(1o4)GlcE(1o1)-ceramida]
de superfície celular de células da crista neural IgG - imunoglobulina G
IgM - imunoglobulina M lac-z - gene repórter
LZ10 - retrovírus deficiente na replicação
ix
M - molar mM - milimolar
MMP - metaloproteinase de matriz extracelular
MSA - “migration staging area” - uma região entre o tubo neural e a porção mais dorsal do somito
msx - gene homeobox
n - notocorda
NAPA-73 - antígeno neuronal específico NBT - nitrobluetetrazolio
NC-1 - anticorpo monoclonal que reconhece células de crista neural N-CAM - molécula de adesão celular da família caderina
nt - tubo neural
PBS - solução salina tamponada com fosfato
PDZ - domínio carboxiterminal de receptores Eph e ligantes Ephrina-B PNA - lectina de amendoim (Arachis hypogaea)
QCPN - anticorpo que reconhece células da crista neural de codorna RALDH2 - enzima responsável pela síntese de ácido retinóico
Raldh2 - gene para a enzima RALDH2
RGD - seqüência dos aminoácidos arginina-glicina-asparagina RTK - receptor tirosina quinase
s - esclerótomo
SAM - domínio alfa estéril C-terminal de receptores Eph SHH - Sonic Hedgehog
shh - gene para Sonic Hedgehog
x
SL - soro Smyth line
SNE - sistema nervoso entérico SOX - fatores de transcrição
Sox - gene para o fator de transcrição SOX td - tubo digestivo anterior ou faringe te - trato de efluxo do coração
TGF - fator de crescimento transformante
TIMP - inibidor tecidual de metaloproteinase de matriz extracelular tn - tubo neural
TRICT - isotiocianato de rodamina v - via ventral
vc - veia cardinal anterior vr - raiz ventral
WL - aves da raça Leghorn Branca
Wnt - molécula sinalizadora da família de proteínas de secreção parácrina altamente conservadas que regulam interações célula-célula
D-LA - alfa-lactalbumina Pm - micrômetro
xi
Ao nível vagal as células da crista neural povoam diferentes regiões no embrião em três ondas migratórias: uma dorsolateral precoce (crista circunfaringeal), uma ventral (linhagens glial e neuronal) e uma dorsolateral tardia (melanoblastos).
Ao nível do tronco estas células se segregam em duas ondas: ventral (linhagens glial e neuronal) e dorsolateral (melanoblastos). Galinhas da raça Sedosa Japonesa (SJ) exibem intensa pigmentação de órgãos internos, que é resultado da dispersão atípica de melanoblastos. Muitas moléculas têm sido descritas por influenciar positiva ou negativamente a migração das células da crista neural. Ephrinas-B e glicoconjugados PNA-positivos estão presentes na porção posterior do somito, conferindo o padrão segmentado de distribuição de precursores neuronais, que usam exclusivamente a porção anterior do somito para migração. Melanoblastos parecem ser estimulados por ephrinas para seguir a via dorsolateral.
Correlacionando o padrão de expressão de ephrinas e a distribuição de glicoconjugados PNA-positivos na região do tronco com a dispersão atípica de melanoblastos em embriões de SJ, é possível verificar que áreas mais ventrais, incluindo o somito posterior, expressam ephrinas num padrão que está correlacionado com caminhos livres de glicoconjugados PNA-positivos. Embriões de galinhas da raça Leghorn, usados como controle, não apresentam ephrinas em caminhos ventrais, estando estes ocupados por glicoconjugados PNA-positivos. Os resultados sugerem que ephrinas e glicoconjugados desempenham um papel combinatório, os primeiros estimulando migração de melanoblastos e sendo necessários, enquanto os outros atuariam como influência inibitória estando portanto ausentes dos caminhos seguidos por melanoblastos. Injeções pontuais do corante vital DiI ao nível vagal (do somito 2 até 5) confirmaram a ocorrência das três ondas migratórias, não sendo observadas diferenças no padrão de dispersão da crista neural entre os 4 primeiros somitos permanentes. As primeiras células seguem a via dorsolateral entre os estágios 9 e 14, e se aglomeram ao redor da veia cardinal anterior. As células que seguem a via ventral, migram entre os estágios 13 e 15 através do esclerótomo logo adjacente ao dermátomo, contornam a aorta dorsal e mais tarde se posicionam em torno da faringe. A terceira onda ocorre através da via dorsolateral e se inicia no estágio 20. Estes resultados foram confirmados com a utilização de imunomarcação das células da crista neural com o anticorpo HNK-1.
Analisando a distribuição de ligantes ephrina-B neste nível axial, é possível observar que a via dorsolateral é positiva, enquanto que o caminho ventral é negativo para estes ligantes em todos os estágios analisados (12-22). Da análise da distribuição de glicoconjugados PNA-positivos no nível vagal, observa-se que eles estão ausentes nos tempos e caminhos correspondentes a cada onda migratória, corroborando a sugestão do seu papel inibitório à migração da crista neural.
xii
Neural crest cells at vagal level populate various embryonic regions, following three migratory waves: one early, dorsolateral (circumpharyngeal crest), one ventral (neuronal and glial lineages) and a later, dorsolateral one (melanoblasts). At trunk level neural crest cells segregate in two waves: ventral (neuronal and glial lineages) and dorsolateral (melanoblasts). Japanese Silky chicken (SK) exhibits massive pigmentation of internal organs, which is the result of atypical melanoblast dispersion.
Several molecules have been described as positive or negatively influencing neural crest cells migration. Ephrins and PNA-positive glycoconjugates are present in the posterior somite, giving a segmented pattern to the distribution of neuronal precursors that use only the anterior half of the somite for migration. Melanoblasts seem to be stimulated by ephrins to follow the dorsolateral path. Correlating the expression pattern of ephrins and PNA-positive glycoconjugates distribution in trunk region with the atypical melanoblast dispersion in SK embryos, it was possible to verify that more ventral areas, including posterior somite, expressed ephrins, in a pattern that correlates to the paths free of PNA-positive glycoconjugates. Leghorn embryos, used as control, displayed no ephrin in the ventral paths that were occupied by PNA-positive glycoconjugates. From these results it is possible suggest that ephrins and glycoconjugates play a combinatory role, the first ones stimulating melanoblast migration and being necessary, while the others have an inhibitory influence and so have to be absent of the paths followed by the cells. Focal injections of the vital dye DiI at vagal level (somite 1 to 4), confirm the occurrence of three migratory waves, without differences in the dispersion pattern of neural crest between the first four somites. The first cells follow the dorsolateral path between stages 9 and 14, and agglomerate around of the anterior cardinal vein. The cells that follow the ventral path, migrate between stages 13 and 15 through the sclerotome just adjacent to the dermatome, turn to the dorsal aorta and later on are located around the pharynx. The third wave occurs through the dorsolateral path and is initiated at stage 20. These results were confirmed by immunolabeling with HNK-1 antibody. Analysing the distribution of ephrin-B ligands at this axial level, it was possible to observe that the dorsolateral path expresses the ligands, while the ventral path is negative for them at all analysed stages (12-22). Analysis of the PNA-positive glycoconjugates at vagal level, showed that they are absent of the paths at the time of each migratory wave, reinforcing the suggestion of an inhibitory role in neural crest migration.
xiii
INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
O desenvolvimento embrionário nas aves se dá externamente ao corpo da fêmea, e para tanto deve ocorrer o acúmulo de grande quantidade de vitelo. Por esse motivo, os ovos das aves são do tipo telolécitos, ovos com grande quantidade de vitelo ocupando-os quase totalmente ficando a região que dará origem ao novo indivíduo, restrita a uma pequena porção da célula, denominada citoplasma ativo ou cicatrícula. A fecundação é interna e ocorre na porção mais superior do oviduto da fêmea, uma região alargada chamada de infundíbulo. A clivagem é dita discoidal, o que significa que apenas a região do citoplasma ativo sofrerá mitoses sucessivas, levando à formação de uma blástula em forma de disco denominada de blastoderme ou blastodisco (Ilustração 1). O processo de clivagem nas aves ocorre enquanto o ovo, que contem o embrião, ainda se encontra no interior do corpo da fêmea. Assim, quando a fêmea põe o ovo, o embrião já se encontra na fase de blastoderme (ou blástula).
blastodisco
vitelo
Ilustração 1
Representação esquemática do ovo de ave no momento da postura.
Após a postura do ovo, se houver o devido aquecimento, o embrião já em fase de blástula continuará seu desenvolvimento, dando início ao processo chamado gastrulação. A gastrulação é a fase em que ocorrem profundas mudanças na estrutura geral do embrião, tornando-o uma complexa estrutura tridimensional que já
possui seu plano corporal estabelecido. Ela se caracteriza por intensos movimentos de células e camadas celulares, que culminam com a formação dos três folhetos embrionários, endoderme, mesoderme e ectoderme, dos quais todos os órgãos deste novo organismo serão derivados. Da endoderme se originam o epitélio respiratório, a bexiga, o trato digestivo e seus derivados. A mesoderme dá origem ao sistema músculo-esquelético, tecidos conjuntivos e outros órgãos internos como rins e coração. Já da ectoderme se originam a epiderme, seus anexos e o sistema nervoso. Assim sendo, erros que ocorram nesta fase poderão ser fatais, o que levou o autor Lewis Wolpert à seguinte conclusão: “It is not birth, marriage, or death, but gastrulation, which is truly the most important time in your life”.
O desenvolvimento do embrião de ave é dito ântero-posterior, pois ao mesmo tempo em que ainda está ocorrendo a gastrulação em regiões posteriores deste embrião, tem início, na sua região anterior o próximo evento do desenvolvimento, a neurulação. Durante a neurulação ocorre a separação da ectoderme em dois compartimentos distintos: ectoderme de revestimento (que dará origem à epiderme e seus anexos) e ectoderme neural (que formará o sistema nervoso).
A neurulação consiste na formação de uma placa neural (que é um espessamento da ectoderme neural, através da mudança morfológica das células que a compõem) na linha média do embrião, a qual se invagina formando o sulco neural ao centro, com as dobras(ou pregas) neurais nas laterais. Esta invaginação progride até que as pregas neurais se toquem e se fundam, fechando assim um tubo que percorre todo o eixo ântero-posterior do embrião, o qual é recoberto pela ectoderme suprajacente – a ectoderme de revestimento (Ilustração 2). Este tubo é chamado de tubo neural e a sua porção mais anterior, localizada na região cefálica, dará origem ao encéfalo, enquanto que a porção posterior (o restante de sua extensão) originará a medula espinhal. As células contidas nas extremidades das dobras neurais irão se segregar e formar uma população distinta de células, a crista neural.
Ilustração 2
Destacamento das células da crista neural durante o fechamento do tubo neural.
Fonte: WOLPERT et al., 2000.
Esta seqüência de eventos no desenvolvimento embrionário inicial é comum a todos os vertebrados, com algumas peculiaridades em cada fase, dependendo do grupo animal em questão.
As células da crista neural se soltam deste neuroepitélio através de uma transformação epitélio-mesenquimal pouco antes ou logo após o fechamento do tubo neural e iniciam sua migração, que se dá na mesma orientação ântero-posterior (BRONNER-FRASER,1994).
Muitas vias de sinalização estão envolvidas na morfogênese da crista neural.
A sinalização Notch apresenta dois papéis durante o desenvolvimento da crista neural. O primeiro é no estabelecimento do domínio da crista neural dentro da ectoderme via indução lateral, e subseqüentemente na diversificação dos destinos de células que se originam da crista neural via inibição lateral (CORNELL & EISEN, 2005). Uma das conseqüências imediatas da indução da crista neural é a ativação de um grande número de genes “crista-específicos” de múltiplas famílias de
reguladores transcricionais. Entre estes, os fatores de transcrição da família SOX.
Em embriões de aves, SOX 8, SOX 9, SOX 10 E LSOX 5 podem promover a formação da crista neural enquanto que SOX 2 é expresso pela placa neural prospectiva (HONG & SAINT-JEANNET, 2005).
1.1. O DESTACAMENTO DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL DO TUBO NEURAL
ERICKSON (1993) relacionou hipóteses propostas na tentativa de explicar como as células da crista neural se destacam do tubo neural e iniciam sua migração.
A primeira é com relação à lâmina basal que recobre a região mais dorsal do tubo neural (onde as células da crista neural se desligam do tubo neural), propondo que esta lâmina basal deve estar incompleta no momento do desligamento, por alterações causadas pelas próprias células da crista neural (por proteases), ou por ausência ou pequena produção de moléculas da matriz extracelular, formando uma lâmina basal incompleta.
A segunda proposta seria quanto ao estabelecimento de um substrato apropriado à migração das células da crista neural na região acima do tubo neural, combinada com a expressão de receptores celulares que possam interagir e aderir a esse substrato. ERICKSON & PERRIS (1993) já relataram que fibronectina, laminina, colágenos I, IV e VI, e proteoglicanos de heparam sulfato estão localizados na matriz extracelular que cobre a superfície dorsal do tubo neural antes da emigração das células da crista neural.
A terceira proposta de ERICKSON (1993) trata da geração de motilidade pelas células da crista neural. Em muitas ocasiões durante o desenvolvimento, as células são imóveis até um momento apropriado, quando então elas repentinamente iniciam a migração. Os fatores que ativam a motilidade celular nos sistemas de desenvolvimento ainda são desconhecidos, mas uma classe de moléculas, conhecidas como fatores estimulantes da motilidade, podem desempenhar um importante papel na coordenação e regulação dos movimentos morfogenéticos.
A quarta proposta diz respeito a mudanças na adesividade entre as células da crista neural e as células do epitélio neural, que parecem preceder e conseqüentemente favorecer a emigração. Moléculas de adesão como a A-CAM (N- caderina) e N-CAM parecem estar reduzidas em células pré-migratórias, podendo desencadear a migração. ERICKSON (1993) propõe também alguns mecanismos que poderiam levar a essa diminuição nas moléculas de adesão: a) regulação negativa das moléculas de adesão; b) degradação das moléculas de adesão por proteases; c) modificações bioquímicas nos ligantes de adesão que poderiam mudar a afinidade (ex.: fosforilação).
A quinta hipótese de ERICKSON (1993) é a geração de uma força tracional suficiente para puxar as células da crista neural para fora do complexo juncional (não há evidências diretas que comprovem esta hipótese).
E a sexta e última hipótese é que o plano de clivagem durante a citocinese poderia separar as células-filhas das junções apicais. Se o fuso mitótico for orientado perpendicular à superfície do epitélio, o plano de clivagem seria tal que uma das células-filhas estaria presa às vizinhas no lado voltado para a luz do tubo neural via junções aderentes, enquanto que a outra célula-filha estaria livre para migrar. Após as células da crista neural terem se destacado do epitélio neural, elas iniciam sua migração através do embrião.
1.2. A ESPECIFICAÇÃO DA CRISTA NEURAL
Por enquanto pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que regulam os processos de migração das células da crista neural. Uma hipótese, proposta por LE DOUARIN (1982; 1993), é de que as células da crista neural são multipotentes e migram ao acaso se dispersando de acordo com as condições do meio, seguindo pelos caminhos mais favoráveis e se diferenciando conforme o ambiente em que se encontram. Outra hipótese sugere que as células da crista neural assumem primeiro determinadas características e então selecionam um caminho migratório particular com base em sua especificação de desenvolvimento. Estudos recentes vêm demonstrando isto, ao nível torácico, em que células da crista neural são especificadas como precursoras de melanócitos antes de entrarem no caminho dorsolateral (ERICKSON & GOINS, 1995).
DORSKY e colaboradores (2000) em seu artigo de revisão, relataram a existência de classes de moléculas sinalizadoras que são secretadas: Wnts (moléculas sinalizadoras que podem controlar diretamente o destino celular em vertebrados e invertebrados), BMP2 e BMP4, e TGFE1, 2, 3, as quais se mostraram suficientes para especificação de derivados particulares da crista neural. Entretanto, até agora, somente Wnts têm se mostrado necessárias para esta especificação em fases precoces do desenvolvimento. Além disso, podem existir outras moléculas ainda não conhecidas que desempenhem papéis essenciais para este processo, seja sozinhas ou combinadas com os fatores já identificados. De qualquer forma, os sinais Wnt, BMP e TGFE devem estar presentes antes que as células da crista neural iniciem sua migração, enquanto estas se encontram na chamada MSA (“migration staging area” - uma região entre o tubo neural e a porção mais dorsal do somito), para mediar a especificação do destino celular em crista neural pré- migratória.
JIN e colaboradores (2001), usando hibridização in situ, notaram que, embora Wnts sejam expressos no tubo neural dorsal durante o período de migração das células da crista neural, o inibidor de Wnt, cfrzb-1, é expresso por precursores gliais e neuronais e não por melanoblastos, sugerindo que Wnt pode estar envolvido na especificação da linhagem melanocítica. Estes autores também observaram que Wnt-3a adicionado ao meio de cultura aumenta muito o número de células
pigmentares em cultura de células da crista neural de codorna, enquanto que diminui o número de células neuronais e gliais, sem alterar a proliferação. Já BMP-4 é expresso no tubo neural dorsal enquanto as células da crista neural neuronais estão migrando, mas é reduzido no momento em que está ocorrendo a migração de melanoblastos, sugerindo que sinalizadores BMP podem estar envolvidos na diferenciação celular neuronal e glial ou na repressão da melanogênese. BMP-4 purificado reduz o número de células pigmentares em cultura, enquanto aumenta o número de células gliais e neuronais, também sem alterar a proliferação celular.
Com estes resultados JIN e colaboradores (2001) sugerem que o sinalizador Wnt especifica melanócitos ao invés das linhagens neuronal e glial, e além disso, que Wnt e BMP têm funções antagônicas na especificação da crista neural do tronco.
Outras moléculas têm sido citadas pelo seu envolvimento na especificação e segregação das células da crista neural, como por exemplo o FoxD3, um membro da classe de fatores de transcrição hélice-alada. KOS e colaboradores (2001) observaram que FoxD3 é expresso na região dorsal do tubo neural, sugerindo que FoxD3 pode ser importante na segregação das células do epitélio neural.
Observaram também que células da crista neural melanogênicas não expressam FoxD3. Através do bloqueio da expressão de FoxD3 estes autores observaram que ocorre expansão da linhagem melanocítica, provavelmente às custas das linhagens neuronal e glial, in vivo e in vitro. Contrariamente, a persistência da expressão de FoxD3 em células da crista neural que migram tardiamente resultou na falha em desenvolver melanoblastos. Com estes resultados os autores sugerem que FoxD3, além de estar envolvido na segregação das linhagens da crista neural do neuroepitélio, reprime melanogênese, por isso permitindo que outros derivados da crista neural se diferenciem durante estágios precoces de padronização da crista neural.
1.3. A MIGRAÇÃO DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL E OS NÍVEIS AXIAIS
A crista neural é um modelo muito rico em se tratando de estudos em biologia celular, como por exemplo estudos de migração e diferenciação celular, pois, além de originar muitos fenótipos diferentes como neurônios e células gliais do sistema nervoso periférico, células pigmentares (como melanócitos), células endócrinas e paraendócrinas, componentes conjuntivos e esqueléticos do crânio ainda, estes derivados migram através de diferentes vias e de diferentes formas dependendo do nível axial analisado (LE DOUARIN & KALCHEIM, 1999).
Didaticamente costuma-se dividir a crista neural ao longo do eixo ântero- posterior em quatro regiões principais (Ilustração 3):
x crista neural cefálica, que compreende a crista localizada ao nível do diencéfalo, mesencéfalo e romboencéfalo;
x crista neural vagal, compreendendo a região entre os somitos 1 e 7;
x crista neural do tronco, desde o somito 8 até o somito 27;
x crista neural sacral, do somito 28 em diante.
1 2 3
4
5
6
broto da asa
broto da perna
1- diencéfalo
2- mesencéfalo crista neural cefálica 3- romboencéfalo
4- somitos 1 a 7 ĺ crista neural vagal 5- somitos 8 a 27 ĺ crista neural do tronco 6- somitos 28 em diante ĺ crista neural sacral
Ilustração 3
Embrião de ave no estágio 17.
Fonte: HAMBURGER & HAMILTON, 1951.
Ainda se faz referência à crista neural cardíaca que origina precursores que vão participar da septação do trato de efluxo do coração (MIYAGAWA-TOMITA et al., 1991). Esta se encontra colocalizada com as cristas cefálica e vagal, se estendendo desde a região correspondente à metade da vesícula (ou placóide) ótica até a região correspondente ao somito 3 (KURATANI & KIRBY, 1991).
As células da crista neural cefálica em sua maioria, migram superficialmente aos somitômeros. Entretanto, existe uma pequena subpopulação da crista cefálica que invade a mesoderme somitomérica e vai segregar precursores miogênicos de músculos voluntários do arco visceral do mesênquima subjacente (NODEN, 1988).
Ao nível do tronco, as células da crista neural seguem dois caminhos migratórios em dois momentos diferentes. A primeira via de migração, assim que o tubo neural se fecha, é ventral, entre o tubo neural e o dermomiótomo e mais tarde através do esclerótomo (Ilustração 4). Estas células que migram ventralmente vão originar neurônios e células gliais do sistema nervoso periférico e células adrenomedulares (BRONNER-FRASER, 1986; SERBEDZIJA et al., 1989). A segunda onda de migração, 24 horas após a primeira, é dorsolateral, entre o somito e a ectoderme (Ilustração 4), e estas células originarão as células pigmentares, os melanócitos (HULLEY et al., 1991).
ec
Ilustração 4
Representação esquemática de corte de embrião de ave. Seta: via ventral de migração; seta tracejada: via dorsolateral de migração; tn: tubo neural; n: notocorda;
ad: aorta dorsal; es: esclerótomo; d: dermomiótomo; ec: ectoderme; en: endoderme.
n
s s
en tn
es es
d d
n ad ad
Na região vagal, ocorrem três ondas migratórias diferentes. Uma primeira onda dorsolateral, uma onda intermediária ventral e uma última onda também dorsolateral (Ilustração 4). As células da primeira onda dorsolateral invadem os arcos branquiais e compõem uma população de células que não se diferenciam como melanócitos in vitro, tendo-se sugerido que o ambiente dos arcos branquiais não permite a sobrevivência ou diferenciação de células da crista neural melanogênicas (CIMENT & WESTON, 1985). Na última onda migratória, também dorsolateral, as células não invadem os arcos branquiais e são especificadas como melanoblastos (REEDY et al., 1998). A onda migratória ventral povoa o intestino e origina os gânglios entéricos (LE DOUARIN & TEILLET, 1973).
Na região sacral, as células da crista neural migram através dos caminhos dorsolateral e ventral, e originam melanócitos e os gânglios entéricos da porção pós-umbilical do tubo digestivo (LE DOUARIN & TEILLET, 1974).
Através de cultura de tecidos foi demonstrado que o direcionamento da migração das células da crista neural é provavelmente devido à inibição por contato.
Resultados obtidos de experimentos com enxertos sugerem que quimiotaxia e haptotaxia não desempenham um papel no controle do desprendimento das células da crista neural do tubo neural. A extraordinária habilidade das células da crista neural na dispersão dentro do embrião tem sido documentada, quando se realizam enxertos de células de crista neural de um local para outro onde normalmente elas não migram. Há evidência de que a produção celular de ativador de plasminogênio, uma enzima proteolítica, e também a força tracional mínima que as células da crista neural exercem sobre o substrato no qual elas migram, contribuem para esta habilidade migratória (ERICKSON, 1988).
ERICKSON e colaboradores (1980) verificaram que células da crista neural e seus derivados são altamente invasivos em seu caminho migratório normal, bem como em ambientes não familiares, sugerindo que as células da crista neural por si só apresentam habilidades migratórias especiais em tecidos embrionários.
Além disso, BEUVAIS e colaboradores (1995) observaram que células do sarcoma 180 são capazes de seguir a mesma rota das células da crista neural. Então além de habilidades migratórias especiais das células da crista neural, ainda o ambiente embrionário é permissivo à migração não só de células da crista neural como
também de células transformadas que também apresentam alta motilidade e invasividade.
Estudos anteriores sugerem que receptores de adesão celular estão envolvidos no controle da migração da crista neural, os quais incluem integrina, N- CAM e caderina (revisado por ERICKSON & PERRIS, 1993). As células da crista neural expressam integrinas e usam-nas para aderir à matriz extracelular (BRONNER-FRASER, 1985; DUBAND et al.,1991; LALLIER & BRONNER-FRASER, 1993).
1.4. ARCOS BRANQUIAIS E CÉLULAS DA CRISTA NEURAL
Os arcos branquiais (ou arcos faríngeos, ou viscerais) são estruturas embrionárias transitórias, em pares, que servem como as paredes lateral e ventral da faringe primitiva dos vertebrados e são contíguas com o tubo digestivo em desenvolvimento. O primeiro par de arcos (mais anteriores) está localizado imediatamente caudal à abertura oral primitiva e estes são chamados de arcos mandibulares por seu envolvimento na formação do processo mandibular (PATTEN, 1953). Eles aparecem no embrião por volta do estágio 14, juntamente com o aparecimento do próximo par de arcos, os arcos hióides. Refere-se a estes dois primeiros pares de arcos branquiais como arcos anteriores. Os arcos posteriores (3o, 4o, 5o e 6o pares) aparecem nos estágios subseqüentes, estando bem individualizados no estágio 23 (HAMBURGER & HAMILTON, 1951).
Os ossos craniofaciais de vertebrados se diferenciam de células mesenquimais originadas da crista neural cranial (metade posterior do diencéfalo, mesencéfalo e romboencéfalo) que coloniza o broto nasofrontal mediano e os primeiros arcos branquiais (revisado por CREUZET et al., 2005). Deve haver uma regulação coordenada de padronização e movimentação da crista neural cranial para o desenvolvimento correto da cabeça. Para este fim mecanismos moleculares e interações de tecidos devem ser empregados. Foram propostos dois modelos para a padronização da crista neural cranial: 1) modelo da pré-padronização, em que as células são especificadas antes da emigração do tubo neural, ou 2) elas adquirem seus padrões enquanto migram através da cabeça do embrião para suas posições finais (CHAMBERS & McGONNELL, 2002). Por meio de ablações ou enxertos de regiões endodermais definidas da nêurula de ave, observou-se que a endoderme instrui as células da crista neural quanto ao tamanho, forma e posição de todos os elementos esqueléticos da face (COULY, et al. 2002). CREUZET e colaboradores (2005) também sugerem que a morfogênese do esqueleto craniofacial é regulada por uma “conversa” bidirecional epitélio-mesenquimal.
As células da crista neural vagal que vão para os arcos branquiais posteriores, embora não apresentem potencial melanogênico, podem se desenvolver em neurônios espontaneamente em cultura, ou podem migrar para tubos digestivos aneurais com os quais elas são cocultivadas e formam gânglio
entérico (CIMENT & WESTON, 1983). Examinando algumas propriedades fenotípicas e de desenvolvimento das células mesenquimais derivadas da crista neural dos arcos branquiais de embriões de ave, CIMENT & WESTON (1985) observaram que as células mesenquimais dos arcos branquiais posteriores expressam o antígeno neuronal específico NAPA-73 e originam neurônios, células gliais, tecido glandular e tecidos conjuntivos, enquanto que as células mesenquimais dos arcos branquiais anteriores não expressam este antígeno e produzem somente derivados do tecido conjuntivo. Sugerem então que as células mesenquimais dos arcos branquiais anteriores e posteriores compreendem diferentes tipos celulares intermediários derivados da crista neural, parcialmente restritos em seu destino final.
WALL & HOGAN (1995) estudaram a expressão de BMP-4, BMP-7, FGF-8 e SHH (Sonic Hedgehog) nos arcos branquiais de embriões de ave e propuseram possíveis papéis para estas moléculas no desenvolvimento dos arcos branquiais:
BMPs podem inibir o crescimento; FGF-8 pode mediar interações entre células da crista neural migrantes, e ectoderme e endoderme, e estimular o crescimento; e SHH pode estar envolvida no estabelecimento do eixo ântero-posterior do segundo arco branquial. O balanço entre BMP e FGF pode ser o que determina o crescimento correto dos arcos branquiais.
LUMSDEN e colaboradores (1991) estudando os caminhos percorridos pela crista neural cranial, utilizando injeções de DiI (corante vital carbocianina lipofílica fluorescente) e vídeo-microscopia, observaram que os arcos branquiais 1, 2 e 3 estão cheios de células da crista neural migrantes dos rombômeros 2, 4 e 6 respectivamente, formando três fileiras de células migrando ventralmente separadas por regiões onde não há células migrando. Estas regiões correspondem aos rombômeros 3 e 5, estando estes associados com níveis aumentados de morte celular entre células da linha média dorsal, sugerindo que a crista pode ser formada nestes níveis mas é então eliminada. Gene homeobox da família msx, mais precisamente, o msx-2 é expresso numa colocalização precisa, momentos antes da apoptose sofrida por células da crista neural dos r3 e r5 em embriões de galinha. E quando r3 e r5 são isolados do restante do neuroepitélio, ambos produzem células de crista neural e a expressão de msx-2 é abolida, sugerindo que deve haver uma interação dentro do neuroepitélio. Assim, deve haver uma correlação entre msx-2 e a programação da apoptose neste sistema (GRAHAM et al.,1993).
Os genes homeobox msx-1 e msx-2 estão envolvidos em muitas desordens que afetam o desenvolvimento craniofacial em humanos. Camundongos mutantes para msx1/2 exibem profundas deficiências no desenvolvimento de estruturas derivadas da crista neural cranial e cardíaca, dentre elas gânglios e nervos craniais hipoplásicos e padronizados erroneamente, hipoplasia de derivados dos arcos faríngeos e organização anormal de estruturas conotruncais no desenvolvimento do coração. Nestes embriões mutantes foram observados retardo na migração de subpopulações de células da crista neural cranial e vagal e mistura das células de crista neural de diferentes subpopulações. Além disso, a expressão de marcadores do encéfalo posterior (Krox20 e EphA4) foi alterada, sugerindo que defeitos em populações da crista neural possa ser resultado, em parte, de defeitos na identidade dos rombômeros. Também foi observado aumento na expressão de BMP-4 por células migratórias da crista neural cranial e dos arcos faríngeos. E finalmente, notou-se que a proliferação do mesênquima derivado da crista neural não foi alterada, porém o número de células apoptóticas foi substancialmente aumentado, podendo contribuir para a hipoplasia observada em gânglios e nervos craniais e em derivados dos arcos faríngeos (ISHII et al., 2005).
Entretanto, existe a observação de que as células da crista neural cranial emergem ao longo da linha média dorsal de todos os rombômeros, e aos níveis dos rombômeros 3 e 5 as células da crista neural migram em direção caudal ou rostral para se unir com as células migrantes existentes adjacentes aos rombômeros 2, 4 ou 6. Além disso, elas se misturam nas regiões de divisa entre um rombômero e outro, e apresentam uma grande diversidade de comportamento de migração dentro das diferentes subregiões da crista neural cranial, sugerindo que fatores de influência podem variar espacialmente ao longo do eixo rostrocaudal na região da cabeça (KULESA & FRASER, 1998). O padrão de migração das células da crista neural no encéfalo posterior (romboencéfalo) emerge dinamicamente, com a comunicação célula-célula desempenhando um papel importante no seu direcionamento (KULESA & FRASER, 2000).
ITO & SIEBER-BLUM (1993), investigaram por análises clonais in vitro, os potenciais de desenvolvimento das células mesenquimais do arco faríngeo posterior, as quais em sua maioria consistiam de células pós-migratórias da crista neural rombocefálica posterior, e observaram quatro tipos distintos de clones, e as células
dentro destes clones expressaram fenótipos característicos. Os clones DP (densely polygonal cells) consistiam de células poligonais densamente aglomeradas, com grandes células achatadas localizadas predominantemente na periferia destes clones. Análises de imunohistoquímica mostraram que os clones DP contém células musculares lisas, células do tecido conjuntivo, condrócitos, e neurônios serotonina (5-HT)-positivos, e que mais de 90% de células/clone foram HNK-1-positivas, sugerindo que as células formadoras destes clones são células derivadas da crista neural pluripotentes com a capacidade de se desenvolver em derivados ectomesenquimais e neurônios serotonérgicos. Os clones DS (densely spindle- shaped cells) consistiam de células alongadas densamente aglomeradas, incluindo células musculares lisas, células do tecido conjuntivo e condrócitos, não sendo observados fenótipos neuronais, apresentando uma média de 0,4% de células/clone HNK-1-positivas, parecendo serem estes clones formados por células derivadas da crista neural que são parcialmente restritas, expressando somente fenótipos ectomesenquimais. Os clones DF (flattened large cells) consistiam de pequenas células densamente aglomeradas e células grandes achatadas. Embora não sendo células HNK-1-positivas, estes clones continham células do tecido conjuntivo e/ou células musculares lisas, parecendo serem derivados de células bipotentes. Os clones LF (loosely arranged flattened large cells) consistiam de células grandes achatadas e frouxamente arranjadas, não HNK-1-positivas, sendo estes clones formados por precursores comprometidos com a linhagem de células musculares lisas. Estes resultados sugerem um padrão característico de segregação de linhagens durante o desenvolvimento da crista neural romboencefálica posterior, indicando que a especificação de alguns tipos celulares pode ocorrer nos locais finais de localização das células da crista neural.
Com o objetivo de examinar possíveis alterações no comportamento migratório e/ou na expressão gênica de populações da crista neural rostral e caudal à região onde a porção dorsal do encéfalo posterior foi removida por procedimento cirúrgico, SALDIVAR e colaboradores (1997) demonstraram que células da crista neural dos níveis vizinhos do tubo neural podem ajustar suas trajetórias migratórias para compensar a perda de populações da crista neural e subseqüentemente se diferenciam em estruturas craniofaciais apropriadas às suas novas localizações, sugerindo que a especificação regional ao longo do eixo neural pode não ser
absoluta, mas pode ser guiada por influências ambientais ao menos em pequenas distâncias. Estas influências podem ser emanadas da mesoderme adjacente, da crista/tubo neural vizinho e/ou da ectoderme.
1.5. CRISTA NEURAL CARDÍACA
Uma população de células da crista neural, com características de transição entre a crista neural cranial e do tronco, recebeu a denominação de crista cardíaca por sua participação na septação do trato de efluxo do coração. Esta população segrega da região do tubo neural localizada entre a linha média da vesícula ótica e somito 3 (KIRBY & WALDO, 1990). As células da crista neural cardíaca migram dorsolateralmente e ventrolateralmente. As primeiras células (que migram dorsolateralmente) param temporariamente no aspecto dorsal do corno pericardial dorsal, dentro da parede lateral do corpo, formando um grupo consolidado e distinto de células. Por sua localização ao redor da faringe primitiva, esta subpopulação recebeu a denominação de crista circunfaringeal. À medida que as bolsas faríngeas se expandem lateralmente e a cavidade pericardial recua ventralmente, as células da crista circunfaringeal se movem para povoar o ectomesênquima faríngeo. Uma linha de células da crista neural, chamada de trato anterior, parte do nível medial da vesícula ótica e termina na crista circunfaringeal. No estágio 14 (HH), ao nível dos somitos occipitais, observa-se a migração ventrolateral de células da crista neural na metade anterior de cada somito. Algumas destas células estão contínuas com a porção caudal da crista circunfaringeal e nota-se uma contribuição precoce ao sistema nervoso entérico nesta região. No estágio 16 (HH) aparece uma outra linha de células dorsal à crista circunfaringeal, chamada trato posterior, formando um caminho em forma de arco ao longo da borda anterior do segundo somito (KURATANI & KIRBY, 1991).
Células da crista neural que partem da região compreendida entre o nível medial da vesícula ótica e o limite rostral do somito 1 povoam o terceiro arco faríngeo, enquanto que as células migrantes do nível dos somitos 1 e 2 ocupam o quarto arco faríngeo (NODEN,1983). As células da região faringeal são capazes de se desenvolver em ectomesênquima e elementos neuronais. As células ectomensenquimais limitam sua distribuição aos derivados do aparato faríngeo e trato de efluxo do coração, enquanto que os elementos neuronais contribuem a estas áreas e aos sistemas pulmonar e gastrointestinal (MIYAGAWA-TOMITA et al.,1991).
Por volta do estágio 18 (HH), como resultado da formação do sistema de arcos faríngeos, surge um sulco na superfície do embrião que circunda os arcos faríngeos 3 e 4, o sulco circunfaringeal. Este sulco é preenchido por células da crista cardíaca que são reconhecidas pelos anticorpos E/C8 e HNK-1. As células E/C8- positivas estão contínuas com o ectomesênquima faringeal posterior à vesícula ótica (arcos 3 e 4), células da crista entérica e células ao redor do nervo hipoglossal. A massa de células da crista circunfaringeal é segmentada ântero-posteriormente durante a formação dos arcos faríngeos. Desta forma, a porção mais caudal da população de células, as células de crista entérica E/C8-positivas, espalha-se na parede do tubo digestivo ao nível caudal do ectomesênquima do último arco faríngeo formado. As células neuronais entéricas parecem constituir duas populações de células, uma ventrolateral HNK-1-positiva, e outra derivada da crista circunfaringeal, que é E/C8-positiva. Na porção proximal do tubo digestivo, as células HNK-1- positivas localizam-se sobre o aspecto dorsal, enquanto que as E/C8-positivas estão localizadas no aspecto lateral do tubo digestivo. Esta distribuição complementar parece estar correlacionada com os caminhos de migração iniciais destas populações. A distribuição das células da crista circunfaringeal e de seus derivados coincide com a distribuição dos ramos periféricos dos nervos craniais IX, X e XII, cujo desenvolvimento é seletivamente afetado na ausência da crista cardíaca, a fonte da crista circunfaringeal (KURATANI & KIRBY, 1992).
Os processos que envolvem migração e distribuição das células da crista neural dependem muito da arquitetura do embrião. Ao nível anterior à vesícula ótica (pré-ótico), onde não existem somitos, as células da crista neural migram adjacentes aos rombômeros de números pares (r2, r4, r6, r8), estabelecendo assim um padrão metamérico de morfogênese de raízes nervosas periféricas baseado em arcos faríngeos, denominado braquimerismo. Entretanto, na região posterior à vesícula ótica (pós-ótico) somitos e arcos faríngeos coexistem, e os nervos espinhais se segmentam metamericamente, ou seja baseados em somitos, sempre ocupando apenas a porção anterior de cada somito (KURATANI, 1997).
Além da participação na septação do trato de efluxo do coração, a crista neural cardíaca contribui para a padronização das grandes artérias. Se a crista neural cardíaca é deletada de embriões de codorna entre os estágios 13 e 18 (HH), seu arco aórtico arterial forma sua luz, porém não se separa da endoderme
faríngea, indicando que crista neural não é necessária para a sua formação precoce.
No dia embrionário 3, ocorrem conexões anormais com a aorta dorsal, e perda da simetria bilateral, sugerindo que a falta do ectomesênquima derivado da crista neural desestabiliza a artéria nascente. Então é sugerido que a crista neural cardíaca é essencial para a persistência do arco arterial, mas não para sua formação. E mudanças no desenvolvimento do arco arterial são observadas antes da formação da túnica média, sugerindo que existe um período crítico no desenvolvimento do arco arterial, após a formação de sua luz, mas antes da formação da túnica média, em que a presença da crista neural cardíaca se faz necessária (WALDO et al., 1996).
Quando é realizada a ablação da crista neural cardíaca, seguida da marcação com corante vital DiI da porção ventral remanescente do tubo neural, antes do estágio de 5 somitos, poucas células da crista neural cardíaca são regeneradas.
Entretanto, se a ablação é realizada após o estágio de 6 somitos, nada é regenerado, não existindo resposta compensatória de regiões adjacentes da crista neural. Observa-se que células da crista neural que migram ventralmente também não se regeneram, enquanto que melanócitos, que migram dorsolateralmente, craniais e caudais à região da ablação migram radialmente e preenchem a região da ablação, não havendo interrupção do padrão normal de pigmentação (SUZUKI &
KIRBY, 1997).
Células da crista neural sempre foram descritas emigrando apenas da porção dorsal do tubo neural (LE DOUARIN & TEILLET, 1973; 1974; KURATANI & KIRBY, 1991; 1992; LE DOUARIN e KALCHEIM, 1999; entre outros). Recentes estudos (SOHAL et al., 1998) têm sugerido que um outro grupo de células que emigram do lado ventral do tubo neural ao nível do encéfalo posterior também contribuem para o desenvolvimento do sistema cardiovascular. Entretanto, mesmo com o uso de técnicas como injeção de retrovírus que expressa o gene repórter lacZ na luz do encéfalo posterior e tubo neural ao nível dos somitos 10-12 e construção de quimeras codorna-galinha, não se observa contribuição de células do tubo neural ventral para o desenvolvimento do sistema cardiovascular durante o desenvolvimento normal (BOOT et al., 2003). Além disso, pode-se observar que, em contraste a estudos anteriores que descreviam a janela de emigração das células da crista neural cardíaca entre os estágios 9 e 11 (HH) (TOSNEY, 1982), foi observada
migração da crista cardíaca em embriões injetados com retrovírus lacZ no estágio 12 (HH), poucas células marcadas em menos de 20% dos embriões injetados no estágio 13- (HH) e nenhuma célula marcada em embriões injetados no estágio 13+ (HH). Assim sendo, sugere-se que a janela de tempo de emigração das células da crista neural cardíaca ocorre desde o estágio 9 até 13- (HH) (BOOT et al., 2003).
Influências ambientais que perturbam o desenvolvimento da crista neural cardíaca causam defeitos cardíacos congênitos em animais de laboratório e humanos. Plexina A2 é expressa por células da crista neural cardíaca em migração e pós-migratórias em camundongos. Plexinas funcionam como co-receptores para moléculas de sinalização semaphorinas, e fazem mediação de direcionamento axonal. Células da crista neural cardíaca que não expressam Plexina A2 estão padronizadas de maneira anormal em muitas linhagens de camundongos mutantes com doenças cardíacas congênitas, incluindo aquelas em que falta a secreção de Semaphorina 3C, sugerindo que possa existir um paralelo entre a sinalização por semaphorinas/plexinas e a padronização da crista neural cardíaca (BROWN et al., 2001).
Camundongos transgênicos e nulos para D1conexina revelam que junções tipo Gap são importantes no desenvolvimento cardíaco, envolvendo a modulação da migração e da função das células da crista neural. Acredita-se que segundos mensageiros químicos, originados de cascatas de sinalização celular disparadas por interações receptor-ligante na superfície celular, possam se mover entre as células da crista neural que migram em linhas via canais juncionais do tipo Gap, e que isso possa servir para coordenar a migração, diferenciação, e/ou proliferação das células da crista neural cardíaca (LO et al., 1999).
Metaloproteinases de matriz (MMPs) são mediadores importantes na migração das células de crista neural. Possuem inibidores endógenos que regulam sua atividade enzimática (“tissue inhibitor of metalloproteinase”, TIMP). Através de hibridização in situ observa-se que TIMP-2 é expresso no estágio 11 (HH) no neuroepitélio e somente em células da crista neural cardíaca em migração, e que TIMP-3 é expresso somente na notocorda no estágio 8 (HH) e mais tarde no trato de efluxo do miocárdio (CANTEMIR et al., 2004).
Camundongos nulos para sonic hedgehog (shh) apresentam defeitos na padronização dos arcos faríngeos, com conseqüentes defeitos craniofaciais, bem
como defeitos no sistema cardiovascular. Os defeitos do sistema cardiovascular lembram uma forma severa da malformação congênita humana observada na síndrome tetralogia de Fallot, com completa atresia da artéria pulmonar. Existe a sugestão de que SHH não atua diretamente sobre as células da crista neural, mas sim em domínios restritos que as células da crista neural podem povoar durante estágios precoces (dias embrionários 8.5 a 10.5) do desenvolvimento cardiovascular e craniofacial (SMOAK et al., 2005).
Em embriões de camundongo geneticamente mosaico para N-caderina é possível observar que ocorre a migração e chegada das células da crista neural na região do trato de efluxo do coração. Entretanto estas células não são capazes de sofrerem as mudanças morfogenéticas normais associadas com o remodelamento do trato de efluxo. Também foi possível observar que a perda de N-caderina no epicárdio leva à interrupção nas interações celulares heterotípicas entre epicárdio e miocárdio, resultando num miocárdio ventricular delgado. Além disto, a rotação do trato de efluxo é incompleta, sugerindo que o alinhamento dos canais é dependente de forças do citoesqueleto geradas por N-caderina. Então, além do seu papel na adesão celular do miocárdio, N-caderina é necessária para rearranjos críticos das células da crista neural para a padronização do trato de efluxo e na manutenção de interações celulares entre epicárdio e miocárdio (LUO et al., 2006).
Tem-se especulado a possibilidade de a crista cardíaca também contribuir para o miocárdio e epicárdio. Dados para esta especulação vêm de resultados inesperados obtidos com o uso de animais transgênicos, em que doenças cardíacas congênitas são criadas artificialmente para o estudo da crista neural cardíaca. Nota-se que existe uma relação entre estas doenças envolvendo o trato de efluxo e a deficiência na diferenciação de tecido muscular (STOLLER & EPSTEIN, 2005).
1.6. CÉLULAS DA CRISTA NEURAL E TUBO DIGESTIVO
Células da crista neural das regiões vagal e sacral alcançam o intestino, participando da formação dos gânglios entéricos, enquanto que células da crista neural da região do tronco não alcançam regiões mais ventrais (LE DOUARIN &
TEILLET, 1973; DE FREITAS et al., 2003). TUCKER e colaboradores (1986) usando os anticorpos monoclonais NC-1 e E/C8, que reconhecem uma população de células da crista neural, no momento em que elas migram do nível vagal do tubo neural e colonizam a região dos arcos branquiais de embriões de galinha de 2 e 3 dias, observaram que algumas das células imunorreativas parecem entrar no mesênquima do tubo digestivo no terceiro dia de incubação pela porção caudal à 3a. fenda branquial. Após entrar no tubo digestivo, estas células migram numa direção rostro-caudal, usando primeiro o epitélio mesodermal esplâncnico superficial do tubo digestivo como substrato, onde a maioria destas células permanece associada com a esplancnopleura. Nos níveis anteriores poucas delas entram no mesênquima ao redor da endoderme enquanto que próximo à região umbilical elas são encontradas por todo o mesênquima, e nos níveis pós-umbilicais estão distribuídas em ambos os lados da camada muscular em diferenciação, mas não dentro desta. Estes autores analisaram também se a distribuição de fibronectina está relacionada com a localização das células imunorreativas, e observaram que, embora a fibronectina possa ser encontrada em toda a parede do tubo digestivo, não existe relação aparente dela com a localização das células. Com estes resultados os autores sugerem que um mecanismo mais complexo que a mera interação com fibronectina possa contar para migração das células derivadas da crista neural para o tubo digestivo.
O envolvimento de outras moléculas nesta diferença no comportamento migratório observado para as duas subpopulações de células (vagal e do tronco) tem sido estudado. Foi observado que Slit2 é expressa pelo mesênquima da entrada do tubo digestivo, e que receptores Robo para Slit2 são expressos por células da crista neural do tronco e não por células da região vagal, sendo, a resposta destas duas subpopulações diferentes quando colocadas na presença de células ou membranas célulares que expressam Slit2: células da crista neural do tronco evitam tais membranas, enquanto que células da região vagal não as evitam. Isto sugere que
Slit2 pode contribuir para esta capacidade diferenciada de populações da crista neural invadirem e inervarem o tubo digestivo. Além disto, foi observado ainda que a exposição a Slit2 solúvel aumenta significativamente a distância percorrida por células da crista neural do tronco, sugerindo que Slit2 pode apresentar duplo papel na motilidade (repelindo ou estimulando) de células da crista neural do tronco (DE BELLARD et al., 2003).
Com o uso de camundongos mutantes duplos para Sox10/Ednrb e Sox10/Edn3 foi possível analisar as interações genéticas entre as moléculas SOX10, endotelina-3 e EDNRB durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Entérico (SNE) e de melanócitos. Para que o desenvolvimento destas estruturas transcorra normalmente, deve existir uma interação coordenada e balanceada entre estas moléculas (STANCHINA et al., 2006). Estes mutantes duplos apresentaram aumento na quantidade e tamanho de manchas brancas na pelagem e defeitos severos no SNE.
Resultados obtidos através de remoção de diferentes segmentos da crista neural vagal, sugerem que a inervação do intestino posterior in vivo depende especificamente da crista neural adjacente aos somitos 3-5, enquanto que a inervação do intestino médio pode ser originada por todos os segmentos dentro da crista neural vagal e o intestino anterior pode ser inervado também por células de origem fora da crista neural vagal (PETERS-VAN DER SANDEN et al., 1993).
ROTHMAN e colaboradores (1990) fizeram enxertos de segmentos de intestino de embriões de codorna no quarto dia do desenvolvimento entre os somitos e o tubo neural na região do tronco de embriões hospedeiros de galinha no segundo dia do desenvolvimento. Observaram que células da crista neural (imunomarcadas com anticorpo monoclonal NC-1 específico) são capazes de migrar para fora dos segmentos de intestino enxertados e colonizar tubo neural, raiz espinhal e gânglios, nervos periféricos, gânglio simpático e adrenais do embrião hospedeiro. As células do enxerto não migram para o tubo digestivo do embrião hospedeiro e nem produzem pigmento. Estes autores concluíram então que as células derivadas da crista neural, mesmo após já terem inervado o tubo digestivo ainda são capazes de migrar e ainda são multipotentes.
Com o uso do corante vital DiI e retrovírus LZ10 injetados entre tubo neural e ectoderme (antes da migração das células da crista neural) nas regiões vagal, tronco
e sacral, foi confirmado que as células da crista neural vagal povoam a região anterior do tubo digestivo, sendo encontradas na moela e duodeno. Células da crista neural do tronco não foram encontradas no tubo digestivo, mas foram observadas no gânglio simpático e no gânglio da raiz dorsal, enquanto que as células da crista neural sacral povoam o tubo digestivo pós-umbilical e gânglio de Remak (POMERANZ et al., 1991). ROTHMAN e colaboradores (1993) transplantaram células derivadas da crista neural vagal e sacral que já haviam colonizado o intestino anterior, para seus caminhos migratórios iniciais em embriões mais precoces, e observaram que estas células são capazes de migrar novamente através de caminhos definidos da crista neural nestes embriões hospedeiros.
EPSTEIN e colaboradores (1994) avaliaram a contribuição de diferentes regiões da crista neural vagal para o Sistema Nervoso Entérico, marcando células da crista neural por injeções entre os somitos 1-10 com o vírus vetor da necrose de baço deficiente na replicação, o qual contém o gene marcador lacZ. Após incubação em X-gal, células lacZ-positivas foram encontradas na parede do tubo digestivo em três locais: a maioria foi encontrada à margem periférica do músculo circular em desenvolvimento e dentro da submucosa em desenvolvimento, locais característicos de desenvolvimento de gânglio. Estas células lacZ-positivas nestes locais gangliônicos foram também imunomarcadas pelo HNK-1 confirmando sua origem na crista neural. Células lacZ-positivas foram também vistas na camada de músculo circular do esôfago e papo, e estavam separadas dos elementos gangliônicos HNK- 1-positivos, sendo estas células provavelmente células musculares derivadas de células mesodermais marcadas do somito. As injeções ao nível dos somitos 3, 4, 5 e 6 resultaram numa maior porcentagem de preparações com células derivadas da crista neural lacZ-positivas e no maior número de células positivas no tubo digestivo, sendo estas células encontradas em todas as regiões do tubo digestivo, do proventrículo ao reto. Poucas células positivas derivadas da crista neural foram encontradas no esôfago. As injeções em somitos 1, 2 e 7 resultaram numa menor porcentagem de preparações com células positivas derivadas da crista, e nestas preparações, o número de células positivas também foi menor, e estas estavam restritas ao tubo digestivo anterior e médio. A moela foi a região do tubo digestivo que mais freqüentemente continha células marcadas, e o reto a que menos freqüentemente continha estas células, sugerindo que o número de células da crista
neural avaliável para colonização do tubo digestivo decresce conforme a distância em relação à moela aumenta. Com estes resultados os autores concluíram que a região do neuroeixo entre somitos 3-6 é a principal fonte de células da crista neural para o tubo digestivo e que células da crista neural de diferentes segmentos do neuroeixo não parecem ser segregadas para diferentes regiões do tubo digestivo.
BURNS & LE DOUARIN (1998), através de enxertos quimera codorna/galinha em conjunto com marcação por anticorpos para identificar células derivadas do enxerto (QCPN), neurônios (ANNA-1) e glia (GFAP), mostraram que células da crista neural vagal e sacral seguem caminhos precisos dentro do tubo digestivo em desenvolvimento durante o povoamento deste. As células da crista neural vagal migram numa direção próximo-distal (ou rostro-caudal), colonizando todo o comprimento do tubo digestivo, enquanto que células da crista neural sacral migram numa direção distal-proximal (ou caudal-rostral) formando o nervo de Remak e contribuindo com neurônios e glia do Sistema Nervoso Entérico, distal ao umbigo.
Além disso, os mesmos autores mostraram que o colo-reto é povoado de modo complexo por células derivadas da crista vagal que primeiro colonizam a região da submucosa, então migram por fora através da camada muscular circular para a região do plexo mientérico. Já as células da crista neural sacral entram no colo-reto externas à camada de músculo circular ao nível do plexo mientérico e subseqüentemente migram para dentro do gânglio submucosal. Assim sendo, dentro do colo-reto, células de duas regiões distintas da crista neural migram em direções opostas para formar o gânglio entérico.
BURNS e colaboradores (2000), através de remoção de diferentes segmentos da crista neural vagal, observaram que precursores derivados da crista neural sacral colonizam o intestino em número significante somente quatro dias após as células derivadas da crista neural vagal terem completado sua migração ao longo de todo o intestino. Isto sugere que o destino da subpopulação de células da crista neural sacral pode ser predeterminado pela necessidade da presença de precursores entéricos derivados da crista neural vagal como uma condição para colonizar o intestino posterior, sendo estes capazes de alterar dramaticamente a proliferação ou diferenciação das células de origem sacral. Estes autores sugerem ainda que esta interdependência pode também explicar a inabilidade de células da crista neural sacral em compensar a falta de gânglio na região terminal do intestino posterior na
