PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRINCÍPIOS DA CIRURGIA
LETICIA ELIZABETH AUGUSTIN CZECZKO RUTZ
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA DO CD133, c-MYC E AXL NO ADENOCARCINOMA E PÓLIPOS COLORRETAIS E SUA ASSOCIAÇÃO
PROGNÓSTICA E CLÍNICO-PATOLÓGICA
CURITIBA 2019
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA DO CD133, c-MYC E AXL NO ADENOCARCINOMA E PÓLIPOS COLORRETAIS E SUA ASSOCIAÇÃO
PROGNÓSTICA E CLÍNICO-PATOLÓGICA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia da Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná como requisito parcial para a obtenção do grau acadêmico de Doutora.
Orientador: Prof. Dra. Carmen A. P. M. Ribas Co-orientador: Prof. Dr. Nicolau Gregori Czeczko Coordenador: Prof. Dr. Osvaldo Malafaia
CURITIBA 2019
R982 Rutz, Letícia Elizabeth Augustin Czeczko.
Análise imunoistoquímica do CD133, c-MYC e AXl no adenocarcinoma e pólipos colorretais e sua associação prognóstica e clínico patológica / Letícia Elizabeth Augustin Czeczko Rutz. — Curitiba, 2020.
Orientadora : Profa. Dra. Carmen Austrália Paredes Marcondes Ribas.
Co-orientador : Prof. Dr. Nicolau Gregori Czeczko.
Tese (doutorado) – Instituto Presbiteriano Mackenzie, Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná, Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, 2019.
1. Neoplasias colorretais. 2. Pólipos do colo. 3. Biomarcadores tumorais. I. Título.
CDD 616.99434
Dedico essa tese ao meu pai, meu maior exemplo de médico e de vida.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização e divulgação deste trabalho.
Agradeço ao minha orientadora, Prof.a Dr.a Carmen Astralia Paredes Marcondes Ribas por seu apoio, sabedoria, correções e incentivos.
Agradeço ao meu co-orientador e pai Prof. Dr. Nicolau Gregori Czeczko, que com sua infinita experiência, paciência, amor e sabedoria me auxiliou e me apoiou e me mostrou o melhor caminho em todas as etapas desse doutorado.
Especiais agradecimentos ao Dr. Martin Gasser e a Dra. Ana Maria Waaga- Gasser, que tanto pessoalmente quanto a distância sempre engrandeceram essa pesquisa com sua enorme experiência e conhecimento.
Ao Prof. Dr. Osvaldo Malafaia por todos os anos de dedicação a pós- graduação que me permitiram hoje realizar esse doutorado.
Agradeço a cada membro da minha família por cada incentivo, paciência e preocupação.
Agradeço ao Dr. Daniel Cury Ogata por seu trabalho na imunomarcação das lâminas.
Agradeço a meu marido Fernando por ter me apoiado desde o início desse projeto, e que com seu amor e dedicação me auxiliou na sua conclusão. Às minhas filhas, que tão serenamente me deram seu amor, e aceitaram minha ausência em tantos momentos.
Especiais agradecimentos à minha mãe, que me deu a vida, me ensinou a ter força e doçura e, sem medir esforços, esteve ao meu lado em todos os momentos.
Especiais agradecimentos a Camila Yamakawa e Guilherme Gionedis, alunos de iniciação científica, que auxiliaram com muita paciência e, desde o início, apresentaram inesgotável dedicação e responsabilidade pelo projeto.
Especiais agradecimentos a minha sogra Josane e minha cunhada Paula por todo amor, ajuda e incondicional apoio que sempre deram a mim e as minhas filhas.
Agradeço ao meu braço direito, Marli, pelo seu amor e dedicação comigo e com toda minha família.
Agradeço à Sarah Shima Khoe por todo apoio na diagramação, formatação e correções ortográficas desse trabalho.
E a Deus por me dar a oportunidade de realizar esse projeto, me dar saúde, proteção, resiliência e persistência para vencer todas as etapas que surgiram ao longo do caminho.
“Só existem dois dias no ano que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o outro se chama amanhã, portanto hoje é o dia certo para amar, acreditar, fazer e principalmente viver”
DALAI LAMA
ADENOCARCINOMA E PÓLIPOS COLORRETAIS E SUA ASSOCIAÇÃO PROGNÓSTICA E CLÍNICO-PATOLÓGICA
Introdução: O câncer colorretal (CCR) tem sido extensivamente caracterizado molecularmente nos últimos anos para fornecer ferramentas que possam permitir a diferenciação de subgrupos com implicações prognósticas e terapêuticas diferentes. O CD133, é uma glicoproteína transmembrana atualmente considerada como o marcador de superfície mais robusto das células tronco tumorais do câncer colorretal. O c-MYC é um dos principais genes responsáveis pela regulação do crescimento e metabolismo celular e sua superexpressão o transforma em um potente oncogene. O AXL é um receptor tirosina quinase, que no contexto da malignidade, impulsiona processos abrangentes, incluindo transição epitelial para mesênquima. Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar o prognóstico e características clínico-patológicas do CD133, c-MYC e AXL nos adenocarcinomas colorretais e associar sua positividade com a displasia e morfologia nos pólipos. Material e Método: No grupo adenocarcinoma foram incluídos 122 pacientes de ambos os gêneros, os quais tiveram diagnóstico entre os anos de 2010 e 2015. No grupo pólipos foram estudados 39 pólipos colorretais resultantes de polipectomias realizadas em colonoscopias entre os anos de 2009 e 2012. Foi realizada imunoistoquímica para os biomarcadores CD133, c-MYC e AXL em todas as amostras. Dados clínicos retrospectivos foram coletados e plotados em duas tabelas de dados. Através da técnica TMA (tissue microarray) os tecidos foram submetidos a imunoistoquímica pela técnica de peroxidase. As informações clínico-epidemiológicas foram cruzadas com o resultado obtido pela imunomarcação e sua análise estatística. Resultados: No grupo adenocarcinoma a amostra era de 63 homens (51,6%) com idade média de 61,9 anos. Houve uma distribuição de 40 casos em cólon direito (34,4%) e 75 em cólon esquerdo e reto (61,4%). A maioria dos pacientes apresentou uma classificação UICC avançada III e IV (n=74). Do total, 68 (55,7%) morreram e observou-se que são fatores de risco independentes para o óbito (p<0,05) adenocarcinomas histologicamente pouco diferenciados e a presença de progressão de doença. O tempo mediano de sobrevida geral estimado foi de 30 meses. O CD133+ (tumores CD133 positivos) apresentou relação de proteção contra o óbito na análise univariada, porém essa relevância não ocorreu na análise multivariada. Houve associação entre os tumores c-MYC+ (tumores c-MYC positivos) e a presença de metástase para outros locais (não hepática, pulmonar e peritoneal).
O AXL teve quatro casos positivos, impossibilitando análises adicionais. Não houve associação significante entre as demais características analisadas. No grupo pólipo havia 31 adenomas (79,5%) e 15 (38,5%) presentaram displasia de alto grau. Dos 39 pólipos, marcaram positivamente para CD133: 35,9% (n=14); para c-MYC: 15,4%
(n=6) e para AXL: 15,4% (n=6). Não foi encontrada associação estatisticamente significante entre os tumores positivos e o tamanho dos pólipos, localização, tipo, diagnóstico histológico e displasia de alto grau. Foi encontrada uma concordância moderada entre os biomarcadores c-MYC e AXL por apresentarem 28 (71,8%) casos concordantes e 11 (28,2%) discordantes. Conclusão: o CD133 não é um fator independente de proteção contra o óbito no adenocarcinoma colorretal, enquanto o c- MYC possui associação com metástase a distância. Os pólipos não apresentaram associação entre o CD133, c-MYC, AXL e variáveis clinico-patológicas Há uma tendência do c-MYC e do AXL serem superexpressos no mesmo perfil de tumores
ADENOCARCINOMA AND COLORECTAL POLYPS AND THE PROGNOSTIC AND CLINICAL-PATHOLOGICAL ASSOCIATION
Introduction: Colorectal cancer (RCC) has been extensively molecularly characterized in recent years to provide tools that can allow differentiation of subgroups with different prognostic and therapeutic implications. CD133 is a transmembrane glycoprotein currently considered to be the most robust surface marker of colorectal cancer tumor stem cells. C-MYC is one of the major genes responsible for regulating cell growth and metabolism and its overexpression makes it a potent oncogene. AXL is a receptor tyrosine kinase that in the context of malignancy drives comprehensive processes including epithelial transition to mesenchyme. Objectives: The purpose of this study was to evaluate the prognosis and clinical and pathological characteristics of CD133, c-MYC and AXL in colorectal adenocarcinomas and to associate its positivity with dysplasia and morphology in polyps. Material and Method: The adenocarcinoma group included 122 patients of both genders, who were diagnosed between 2010 and 2015. In the polyp group, 39 colorectal polyps resulting from polypectomies performed in colonoscopies between 2009 and 2012 were studied. Immunohistochemistry was performed for CD133, c- MYC and AXL biomarkers in all samples. Retrospective clinical data was collected and plotted in two data tables. Through TMA (tissue microarray) technique, the tissues were subjected to immunohistochemistry by the peroxidase technique.
Clinical-epidemiological information was crossed with the result obtained by immunostaining and its statistical analysis. Results: The adenocarcinoma group had 63 men (51.6%) with a mean age of 61.9 years. There was a distribution of 40 cases in the right colon (34.4%) and 75 in left colon and rectum (61.4%). Most patients had an advanced UICC classification (III and IV) (n = 74). From the total number of patients, 68 (55.7%) died and poorly differentiated tumors and disease progression were found to be independent risk factors for death (p <0.05). The median estimated overall survival time was 30 months. CD133+ (CD133 positive tumors) showed a protective relationship against death in univariate analysis but this relevance did not occur in multivariate analysis. There was an association between c-MYC+ (c-MYC positive tumors) and metastasis to other sites (non-hepatic, pulmonary and peritoneal). AXL had four positive cases, precluding further analysis. There was no significant association between the other characteristics analyzed. In the polyp group there were 31 adenomas (79.5%) and 15 (38.5%) presented high-grade dysplasia. Of the 39 polyps, 35.9% (n=14) scored positive for CD133: 15.4% (n = 6) for c-MYC and 15.4%
(n = 6) for AXL. There was no statistically significant association between positive tumors and polyp size, location, type, histological diagnosis and high-grade dysplasia.
Moderate agreement was found between the c-MYC and AXL biomarkers due to 28 (71.8%) cases in agreement and 11 (28.2%) cases in disagreement. Conclusion:
CD133 is not an independent protective factor against death in colorectal adenocarcinoma, whereas c-MYC is associated with distant metastasis. Polyps showed no association between CD133, c-MYC, AXL and clinico-pathological variables. There is a tendency for c-MYC and AXL to be overexpressed in the same tumor profile.
Keywords: CD133, c-MYC, AXL, colorectal cancer, colorectal polyps, tumor biomarkers, prognosis
FIGURA 1 - APARELHO UTILIZADO PARA REALIZAÇÃO DE BLOCOS
MULTIAMOSTRAIS. ... 48 FIGURA 2 - LÂMINA CORRRESPONDENTE AO BLOCO DOADOR E BLOCO
DOADOR. HÁ, NA LÂMINA, A PRESENÇA DA MARCAÇÃO FEITA DA ÁREA DESEJADA E NO BLOCO DE PARAFINA A ÁREA
RETIRADA PELO PUNCH DO TMA (SETA). ... 49 FIGURA 3 - REALIZAÇÃO DO PUNCH DA ÁREA SELECIONADA UTILIZANDO
O APARELHO DE TMA 2MM ... 49 FIGURA 4 - COLOCAÇÃO DO FRAGMENTO NO BLOCO DE PARAFINA -
MOLDE DO TMA ... 50 FIGURA 5 - BLOCO DE TMA FINALIZADO A ESQUERDA E A DIREITA LÂMINA
DE PRONTA PARA LEITURA DA IMUNOISTOQUÍMICA ... 50 FIGURA 6 - ADENOCARCINOMA CD133+: FOTOMICROGRAFIA (400X)
MOSTRANDO POSITIVIDADE CITOPLASMÁTICA (SETA) ... 58 FIGURA 7 – ADENOCARCINOMA C-MYC+: FOTOMICROGRAFIA (400X)
MOSTRANDO POSITIVIDADE NUCLEAR (SETA) ... 59 FIGURA 8 – ADENOCARCINOMA AXL+: FOTOMICROGRAFIA (400X)
MOSTRANDO POSITIVIDADE COMBINADA (MEMBRANA
CITOPLASMÁTICA, CITOPLASMA E NÚCLEO - SETA) ... 60
GRÁFICO 1 - DISTRIBUIÇÃO DO GRUPO ADENOCARCINOMA POR
DÉCADAS ... 53 GRÁFICO 2 - DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES CONFORME A TOPOGRAFIA
DO ADENOCARCINOMA PRIMÁRIO AO DIAGNÓSTICO. ... 54 GRÁFICO 3 - CURVA DE INCIDÊNCIA CUMULATIVA DO EVENTO
PROGRESSÃO ... 56 GRÁFICO 4 - INCIDÊNCIA CUMULATIVA DA PROGRESSÃO DE DOENÇA
CONFORME O RESULTADO DA IMUNOMARCAÇÃO PARA O CD133 ... 62 GRÁFICO 5 - INCIDÊNCIA CUMULATIVA DA PROGRESSÃO DE DOENÇA
CONFORME O RESULTADO DA IMUNOMARCAÇÃO PARA O C-MYC ... 63 GRÁFICO 6 - INCIDÊNCIA CUMULATIVA DA PROGRESSÃO DE DOENÇA
CONFORME O RESULTADO DA IMUNOMARCAÇÃO PARA O AXL ... 63 GRÁFICO 7 - INCIDÊNCIA CUMULATIVA DE PROGRESSÃO CONFORME
UICC AGRUPADO (ESTADIO PRECOCE 0/I/II E TARDIO III / IV) ... 65 GRÁFICO 8 - GRÁFICO DE KAPLAN-MEIER GERAL ... 70 GRÁFICO 9 - CURVA DE KAPLAN-MEIER CONFORME UICC AGRUPADO EM
EM ESTADIO PRECOCE (0/I/II) E TARDIO (III/IV) ... 70 GRÁFICO 10 - CURVA DE KAPLAN-MEIER CONFORME UICC ... 71
TABELA 1 - ESTADIAMENTO DO CÂNCER COLORRETAL BASEADO NA
CLASSIFICAÇÃO UICC/AJCC ... 42 TABELA 2 - DESCRIÇÃO DOS ANTICORPOS PRIMÁRIOS COM SEUS
RESPECTIVOS FABRICANTES E DILUIÇÕES. ... 51 TABELA 3 - LOCALIZAÇÃO DAS METÁSTASES À DISTÂNCIA AO
DIAGNÓSTICO ... 54 TABELA 4 - QUANTIDADE DE ÓRGÃOS AFETADOS POR METÁSTASE AO
DIAGNÓSTICO ... 55 TABELA 5 - TEMPO DE SEGUIMENTO DOS PACIENTES QUE NÃO
MORRERAM DURANTE O PERÍODO ESTUDADO. CALCULADO A MÉDIA, MEDIANA, MÍNIMO E MÁXIMO EM MESES ... 56 TABELA 6 - DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES CONFORME O ESTADIAMENTO
LINFONODAL PATOLÓGICO (PN) ... 57 TABELA 7 - DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES CONFORME A PRESENÇA DE
METÁSTASE PATOLÓGICA (PM) ... 57 TABELA 8 - ANÁLISE UNIVARIADA PARA O EVENTO PROGRESSÃO DE
DOENÇA ... 61 TABELA 9 - ANÁLISE MULTIVARIADA PARA O EVENTO PROGRESSÃO DE
DOENÇA, INCLUINDO O CD133 ... 64 TABELA 10 - ANÁLISE MULTIVARIADA PARA O EVENTO PROGRESSÃO DE
DOENÇA, INCLUINDO O C-MYC ... 64 TABELA 11 - ANÁLISE MULTIVARIADA PARA O EVENTO PROGRESSÃO DE
DOENÇA, INCLUINDO O AXL... 65 TABELA 12 - ANÁLISE UNIVARIADA PARA O EVENTO ÓBITO ... 66 TABELA 13 - ANÁLISE MULTIVARIADA PARA O EVENTO ÓBITO INCLUINDO
O CD133 ... 67 TABELA 14 - ANÁLISE MULTIVARIADA PARA O EVENTO ÓBITO INCLUINDO
O C-MYC ... 68 TABELA 15 - ANÁLISE MULTIVARIADA PARA O EVENTO ÓBITO INCLUINDO
O AXL ... 68
TABELA 17 - TEMPO DE SOBREVIDA GERAL E CLASSIFICADO SEGUNDO UICC AGRUPADO EM ESTADIO CLÍNICO PRECOCE (0/I/II) E TARDIO (III/IV) ... 69 TABELA 18 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E A DISTRIBUIÇÃO POR IDADE
... 72 TABELA 19 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O GENERO MASCULINO E
FEMININO ... 72 TABELA 20 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E A TOPOGRAFIA DO TUMOR
PRIMÁRIO ... 72 TABELA 21 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O STATUS DE METÁSTASE
PULMONAR ... 72 TABELA 22 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O STATUS DE METÁSTASE
HEPÁTICA ... 73 TABELA 23 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O STATUS DE METÁSTASE
PERITONEAL ... 73 TABELA 24 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O STATUS DE METÁSTASE
PARA OUTROS LOCAIS ... 73 TABELA 25 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO
... 73 TABELA 26 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E A CLASSIFICAÇÃO TUMORAL
AGRUPADA ... 74 TABELA 27 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O SATUS DA METÁSTASE
LINFONODAL ... 74 TABELA 28 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O ESTADIAMENTO TUMORAL
PRECOCE (UICC 0/I/II) E TARDIO (UICC II/IV) ... 74 TABELA 29 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E A IDADE ... 75 TABELA 30 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O GÊNERO MASCULINO E
FEMININO ... 75
TABELA 32 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O STATUS DA METÁSTASE PULMONAR ... 75 TABELA 33 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O STATUS DA METÁSTASE
HEPÁTICA ... 75 TABELA 34 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O STATUS DA METÁSTASE
PERITONEAL ... 76 TABELA 35 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O STATUS DA METÁSTASE
PARA OUTROS LOCAIS ... 76 TABELA 36 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E A CLASSIFICAÇÃO TUMORAL
AGRUPADA ... 76 TABELA 37 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O STATUS DA METÁSTASE
LINFONODAL ... 76 TABELA 38 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC O ESTADIAMENTO TUMORAL
PRECOCE (UICC 0/I/II) E TARDIO (UICC II/IV) ... 77 TABELA 39 - RELAÇÃO DA QUANTIDADE DE PÓLIPOS POR NÚMERO DE
PACIENTES ... 77 TABELA 40 - LOCALIZAÇÃO DO PÓLIPO CONFORME LAUDO DA
COLONOSCOPIA ... 78 TABELA 41 - TIPO DE PÓLIPOS CONFORME LAUDO DA COLONOSCOPIA. . 78 TABELA 42 - STATUS DA IMUNOMARCAÇÃO DO CD133 PARA O GRUPO
PÓLIPO ... 79 TABELA 43 - STATUS DA IMUNOMARCAÇÃO DO C-MYC PARA O GRUPO
PÓLIPO ... 80 TABELA 44 - STATUS DA IMUNOMARCAÇÃO DO AXL PARA O GRUPO
PÓLIPO ... 80 TABELA 45 - ESTUDO DA CONCORDÂNCIA ENTRE OS BIOMARCADORES
CD133 E AXL ... 80 TABELA 46 - ESTUDO DA CONCORDÂNCIA ENTRE OS BIOMARCADORES
CD133 E C-MYC ... 81
TABELA 48 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E A CLASSIFICAÇÃO
ENDOSCÓPICA ... 82 TABELA 49 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E A TOPOGRAFIA ... 82 TABELA 50 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O DIAGNÓSTICO
HISTOLÓGICO ... 82 TABELA 51 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O STATUS DA DIPLASIA DE
ALTO GRAU ... 82 TABELA 52 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O CD133 E O TAMANHO ... 83 TABELA 53 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E A CLASSIFICAÇÃO
ENDOSCÓPICA ... 83 TABELA 54 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E A TOPOGRAFIA ... 83 TABELA 55 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O DIAGNÓSTCIO
HISTOLÓGICO ... 84 TABELA 56 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O STATUS DA DISPLASIA .... 84 TABELA 57 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O C-MYC E O TAMANHO ... 84 TABELA 58 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O AXL E A CLASSIFICAÇÃO
ENDOSCÓPICA ... 85 TABELA 59 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O AXL E A TOPOGRAFIA DO TUMOR ... 85 TABELA 60 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O AXL E O DIAGNÓSTICO HISTOLÓGICO
... 85 TABELA 61 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O AXL E A DISPLASIA ... 85 TABELA 62 - ASSOCIAÇÃO ENTRE O AXL E O TAMANHO ... 86
1 INTRODUÇÃO ... 18
1.1 OBJETIVOS ... 20
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 21
2.1 ADENOCARCINOMA COLORRETAL... 21
2.1.1 Bases moleculares do câncer colorretal ... 21
2.1.2 CD133 ... 25
2.1.3 c-MYC ... 28
2.1.4 AXL... 32
2.2 PÓLIPOS COLORRETAIS ... 35
2.2.1 CD133 ... 35
2.2.2 c-MYC ... 36
2.2.3 AXL... 38
3 MATERIAL E MÉTODO ... 39
3.1 AMOSTRA ... 39
3.2 GRUPO ADENOCARCINOMA ... 40
3.2.1 Coleta de casos ... 40
3.2.2 Variáveis relativas ao paciente ... 41
3.2.3 Variáveis relativas ao tumor ... 43
3.3 GRUPO PÓLIPO ... 45
3.3.1 Coleta de casos ... 45
3.3.2 Variáveis relativas ao paciente ... 46
3.3.3 Variáveis relativas ao pólipo ... 46
3.4 ANÁLISE DOS BIOMARCADORES TUMORAIS ... 47
3.4.1 Confecção dos blocos multiamostrais (tissue microarray - TMA) ... 47
3.4.2 Imunoistoquímica ... 51
3.4.3 Laudo da imunomarcação ... 51
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 52
4 RESULTADOS ... 53
4.1 GRUPO ADENOCARCINOMA ... 53
4.1.1 Variáveis relativas ao paciente ... 53
4.1.2 Variáveis relativas ao tumor ... 57
4.1.3 Avaliação de fatores associados à progressão da doença... 60
4.1.6 Avaliação de fatores associados aos biomarcadores ... 71
4.1.7 Análise de concordância entre o CD133 e o c-MYC ... 77
4.2 GRUPO PÓLIPO ... 77
4.2.1 Variáveis relativas ao paciente ... 77
4.2.2 Variáveis relativas ao pólipo ... 78
4.2.3 Nível de concordância ... 80
4.2.4 Avaliação de fatores associados aos biomarcadores ... 81
5 DISCUSSÃO ... 87
5.1 GRUPO ADENOCARCINOMA ... Erro! Indicador não definido. 5.1.1 Variáveis clínico-epidemiológicas ... Erro! Indicador não definido. 5.1.2 Biomarcadores ... Erro! Indicador não definido. 5.2 GRUPO PÓLIPO ... 95
5.3 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 99
6 CONCLUSÕES ... 101
REFERÊNCIAS ... 102 APÊNDICES ... 113-149
1 INTRODUÇÃO
De acordo com a agência Internacional de Pesquisa em Câncer, no ano de 2018, houve uma incidência de mais de 18 milhões de pessoas no mundo com câncer e estima-se uma mortalidade de mais de nove milhões de casos. Para 2040, há uma expectativa de incidência de câncer de mais de 29,5 milhões de pessoas. No Brasil, no ano de 2018, havia mais de 582.590 pessoas afetadas pela doença, incluindo o câncer de pele não melanoma. A estimativa para o Brasil biênio 2018-2019 aponta a ocorrência de cerca de 600 mil casos novos de câncer para cada ano (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER). O câncer colorretal é o terceiro tipo de câncer mais comum entre homens e o segundo entre mulheres, em 2018, chegava a aproximadamente 1,8 milhões de casos novos no mundo, com uma mortalidade estimada de 880.000 pessoas (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER; WORLD CANCER RESEARCH FUND INTERNATIONAL).
Dienstmann et al. (2014) afirmaram que o câncer colorretal tem sido extensivamente caracterizado molecularmente nos últimos anos, fornecendo ferramentas que permitem a diferenciação de subgrupos de câncer colorretal com implicações prognósticas e terapêuticas diferentes. Estudos descrevem a complexidade da expressão gênica no câncer colorretal e confirmam sua heterogeneidade e necessidade de mais pesquisas.
Uma das maneiras de caracterizar as alterações somáticas (adquiridas) do câncer colorretal é através do uso de biomarcadores tumorais. A história dos marcadores tumorais utilizados atualmente começou com a alfa-fetoproteína em 1956, seguida pelo antígeno carcinoembrionário em 1965 (BUZÁS, 2013). Os marcadores tumorais (ou marcadores biológicos - biomarcadores) são macromoléculas presentes no tumor, no sangue, ou em outros líquidos biológicos, cujo aparecimento e/ou alterações em suas concentrações estão relacionados com a gênese e o crescimento de células neoplásicas (ALMEIDA et al. 2007).
O biomarcador CD133, também chamado de Prominin-1, é uma glicoproteína transmembrana cuja expressão é associada com células progenitoras e células tronco tumorais. O seu gene CD133, promin 1 (PROM1) está localizado no cromossomo 4 em humanos (GLUMAC e LEBEAU, 2018). O número de células CD133+ (células que apresentam a presença do CD133) se mantém relativamente constante na medula
óssea, no sangue e nos diferentes tecidos e tumores. Quando há lesão tecidual, as células CD133+ são ativadas para se auto renovar, proliferar e diferenciar com objetivo de reparar o dano. Ainda há um vasto campo de pesquisa para melhor compreender o envolvimento do CD133 na gênese tumoral, sua relação com metástases, com a quimio-resistência e sua função proteica no metabolismo, na apoptose, na autofagia e na regeneração celular (LI, 2013).
Outro marcador tumoral de grande interesse no carcinoma colorretal é o c- MYC. Esse é originado do gene c-MYC, localizado no cromossomo 8, um dos principais proto-oncogenes responsáveis pela regulação do crescimento e do metabolismo celular. Sua mutação o transforma em um potente oncogene que coordena outras famílias de genes também atreladas a proliferação celular, e, como resultado, forma um ambiente com o suporte metabólico necessário para proliferação celular rápida. (MILLER et al., 2012). De acordo com Satoh et al. (2017), as reprogramações metabólicas do câncer colorretal são causadas preferencialmente pela expressão aberrante do gene MYC.
O marcador tumoral AXL é um receptor tirosina quinase membro da família TYRO3, AXL e MerTK, e é responsável pela regulação de vários processos celulares vitais, incluindo proliferação, sobrevivência, motilidade e resposta imunológica.
Embora não seja um propulsor oncogênico por si, o AXL é superexpresso em várias neoplasias hematológicas e sólidas, incluindo leucemia mieloide aguda, câncer de pulmão não pequenas células, adenocarcinoma gástrico e colorretal, e câncer de mama e próstata. Quando superexpresso, o AXL é relacionado com processos oncogênicos como a transição epitelial para mesênquima, angiogênese tumoral, resistência a agentes quimioterápicos além da diminuição da resposta imune antitumoral (GAY et al., 2017).
Acredita-se que os pólipos colorretais sejam os precursores dos cânceres colorretais, no entanto, os diversos tipos de pólipos apresentam diferentes taxas de oncogênese e velocidade de progressão. (YANG et al., 2015). É de extrema importância compreender quais são as alterações mutacionais que ocorrem desde o adenoma até o adenocarcinoma para se ter uma ampla compreensão do caminho molecular do câncer colorretal.
Em um primeiro momento, é interessante compreender com clareza quais as vias moleculares que estão ativadas e supressas no câncer e lesões pré-neoplásicas,
isso também pode ser realizado através dos biomarcadores tumorais. Após, deve-se compreender se a presença ou ausência de tal biomarcador é associado com maior agressividade tumoral. Em um segundo momento inicia-se a busca por medicamentos que ajustem essa nova via desregulada, via oncogênica, a chamada terapia-alvo.
Dessa maneira, há uma maior chance de se conseguir uma resposta terapêutica com menor efeito colateral e maior eficácia.
Ainda há muita divergência na literatura sobre os resultados associados a biomarcadores tanto para câncer quanto para pólipos colorretais, por isso, o presente estudo avaliou três diferentes biomarcadores (CD133, c-MYC e AXL) através da técnica de tissue microarray (TMA), com seu desfecho prognóstico e características clínico-patológicas nos adenocarcinomas e pólipos colorretais.
1.1 OBJETIVOS
Estudar a imunoistoquímica do CD133, c-MYC e AXL:
1. em relação as características clínico-patológicas e ao prognóstico dos adenocarcinomas colorretais e
2. avaliar a imunomarcação dos pólipos colorretais quanto a variáveis morfológicas e displasia.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ADENOCARCINOMA COLORRETAL
2.1.1 Bases moleculares do câncer colorretal
MARKOWITZ e BERTAGNOLLI (2009) publicaram um artigo de revisão sobre as bases moleculares do câncer colorretal. Afirmaram que a neoplasia colorretal é segunda causa de óbito por câncer nos USA. O seu início ocorre como um pólipo adenomatoso benigno, que progride para um adenoma com displasia de alto grau, e evolui para um tumor invasivo. Os cânceres invasivos restritos a parede colônica são potencialmente curáveis, porém, seguindo sua história natural sem tratamento, podem metastizar para linfonodos regionais e sítios distantes. Os estádios clínicos mais precoces (1 e 2) são potencialmente curáveis por cirurgia, e o estádio 3 possui mais de 73% dos casos curáveis com cirurgia e quimioterapia. Entretanto, o estádio 4, que se caracteriza por metástases à distância, normalmente não possui cura. Os autores afirmam que há um grande desafio na compreensão da fisiopatologia molecular do câncer, avaliando-se as suscetibilidades individuais, que determinam os fatores que iniciam seu desenvolvimento, sua progressão e sua resposta terapêutica. Dentre as vias carcinogênicas conhecidas para o câncer colorretal, há a instabilidade genômica caracterizada pela instabilidade cromossômica e os defeitos de reparação do DNA.
Há também a metilação aberrante de DNA, que é um mecanismo epigenético que pode, por exemplo, levar ao silenciamento bi-alélico do gene MLH1. Também ocorrem as mutações adquiridas que induzem as vias claramente carcinogênicas, são essas chamadas de mutações que inativam genes supressores tumorais. Nessas vias, encontram-se as mutações no gene APC (da via de sinalização Wnt), no gene TP53 e no gene TGFBR2 da via supressora tumoral TGF-β. O desenvolvimento do câncer também ocorre através da ativação de oncogenes como, por exemplo, as mutações nos genes RAS e BRAF (que ativam a via MAPK), e no gene PTEN (que ativa a via PI3K). O sequenciamento completo do genoma humano mostrou 848 mutações somáticas encontradas no câncer colorretal, dessas, 140 eram possíveis candidatas para o fenótipo neoplásico. Nas etapas finais do genoma do câncer colorretal, foram encontrados 15 genes mutados e 61 genes com mutações de muito baixa frequência,
o que reflete uma enorme heterogeneidade entre as neoplasias colorretais e o grau de dificuldade em determinar os efeitos clínicos de cada evento mutacional. Quando se avaliou as etapas do câncer colorretal desde o adenoma até o carcinoma e metástase, verificou-se que não há novas mutações nas metástases, inferindo assim que novas mutações não são necessárias para que um tumor progrida para sítios distantes. Estudos que objetivam a compreensão do câncer colorretal a nível molecular são especialmente importantes na formação de testes genéticos para pacientes com alto risco familial, na implementação de terapia personalizada e na formação de novas ferramentas prognósticas, preditivas e terapêuticas.
LI e LAI (2009) publicaram um artigo questionando se o câncer colorretal é uma entidade única ou três doenças diferentes; explicam que cada porção intestinal possui origens embriológicas distintas e com isso diferentes vias de carcinogênse. A alteração genômica mais comum do câncer de colón proximal (ceco, cólon ascendente e transverso) é a instabilidade de microssatélite (MSI-high), enquanto o câncer de cólon distal (cólon descendente e sigmóide) é usualmente relacionado à instabilidade cromossômica. No reto, há mais mutação no gene TP53, na via APC/b- catenina, maior expressão COX2 e menos mutação do gene K-ras. Há fatores externos, como a dieta e o uso de álcool, que influenciam de maneira distinta os diferentes tipos de mucosa de cada segmento. Reiteram que, no mesmo raciocínio, os diversos tipos de câncer de cólon e do reto são entidades com tratamentos diferentes. Assim, o conceito das três diferentes entidades pode ser importante no desenho de estudos clínicos e das estratégias terapêuticas. Porém, ainda há inconsistências na literatura em relação aos mecanismos carcinogênicos específicos de cada topografia do cólon. Concluem que, para que haja a definitiva consolidação do conceito de que o câncer colorretal são três entidades distintas, há necessidade de se obter mais evidências sobre a origem do câncer para cada segmento colorretal, para que, no futuro, sejam realizadas as respectivas terapias-alvo.
PRITCHARD e GRADY (2010) publicaram um artigo, revisando os avanços moleculares do câncer colorretal na prática clínica. Afirmaram que o maior avanço é na terapêutica, onde se buscam alterações moleculares para guiar o tratamento com anticorpos monoclonais, como Cetuximabe e Panitumumabe, os quais são inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Os novos objetivos são encontrar biomarcadores para: detecção precoce e estratificação de risco
(biomarcadores diagnósticos), biomarcadores de prognóstico e de resposta ao tratamento (biomarcadores preditivos). Concluíram que a mutação KRAS é suficientemente validada no uso clínico rotineiro para guiar um tratamento anti-EGFR.
As mutações MSI e BRAF já possuem um papel claro na triagem genética molecular na síndrome de Lynch, e esses marcadores terão um grande espaço no prognóstico e resposta terapêutica para câncer esporádico. Outros biomarcadores tais como VIM, CIN, CIMP, PIK3CA, MSI, dentre outros, exigem mais estudos para que se consiga relacionar sua presença com a evolução clínico-terapêutica.
SANABRIA, UMAÑA, SERRANO, SÁNCHEZ, MESA e HERNÁNDEZ (2012) publicaram um artigo, relacionando as vias de carcinogênese do tumor colorretal com suas implicações clínicas. Dentre os mecanismos de malignização do epitélio colorretal, estão as vias de sinalização secretadas pelas células-mãe na zona de proliferação das criptas intestinais. Nesse local, há um predomínio de sinais anti- apoptóticos (proteína Bcl-2) e proliferativos (via Wnt/Beta-catenina). Mais acima do epitélio colorretal, na zona de diferenciação, há sinais anti-proliferativos (proteína APC e Bmp), que regulam negativamente a via Wnt/Beta-catenina. Macroscopicamente, essa disfunção entre os estímulos de proliferação e de apoptose geram pólipos de diferentes tipos, que podem possuir células displásicas ou não; afirmam que dividir o cólon em esquerdo distal e direito proximal, tendo como referência o ângulo esplênico, é importante pelas diferenças embriológicas, morfológicas e moleculares. Corroboram que, do ponto de vista genético, o câncer colorretal pode ser classificado em genético e esporádico. Há síndromes por mutações genéticas de alta penetrância, porém, a maior parte dos casos é do tipo esporádico, que implica na interação de múltiplos fatores ambientais com mutações somáticas e polimorfismo em genes de baixa penetrância. Em qualquer um dos dois casos, a progressão da doença ocorre por alterações nos genes importantes do controle do ciclo celular, que são chamados de oncogenes, genes supressores tumorais e genes de manutenção. Atualmente, define- se duas grandes vias de carcinogênese: o que conhecemos como via clássica (seqüência adenoma-carcinoma), descrita por Volgestein em 1988, e as vias alternativas, que permitem a progressão de um pólipo serrilhado a adenocarcinoma, conhecida como via serrilhada. A sequência adenoma-carcinoma é a via mais comum no carcinoma colorretal, responsável por 85% dos casos esporádicos e das alterações presentes na polipose adenomatosa familiar; afeta mais frequentemente o cólon distal,
e se caracteriza por instabilidade cromossômica, aneuplodia e perda de heterogeneidade. Os genes mais mutados nessa via são o APC e o CTNNB1 – importantes na via de sinalização Wnt/Beta-catenina, o que gera um fenótipo hiperproliferativo, e favorece outras mutações gênicas, permitindo a progressão a adenoma precoce. Nos casos de polipose adenomatosa familiar, a mutação APC é germinativa; um adenoma precoce progride para um intermediário pela mutação do oncogene KRAS, esse evolui com instabilidade cromossômica, perdendo cópias de genes no braço longo do cromossomo 18. Essas perdas favorecem a imortalização das células e sua progressão para adenoma tardio, que, por sua vez, adquire mais mutações, como a do TP53, o que desencadeia a sequência para o adenocarcinoma.
A outra via de carcinogênese é através da instabilidade de microssatélite, associada a 15% dos casos de câncer colorretal esporádico, a síndrome de Lynch 1 e ao câncer colorretal hereditário não poliposo. É a via mais comum no cólon proximal, e consiste em mutações em regiões de microssatélite, alterando genes importantes no controle do ciclo celular, além de ser acompanhado de instabilidade cromossômica – são tumores diploides. Sua principal diferença é que não há uma cascata de eventos progressivos em escala genética; seu início se dá por uma mutação ou inativação de um dos alelos em um gene da família MMR (mismatch repair gene). Há também a via alternativa (ou serrilhada) de carcinogênese caracterizada por mutações dos genes KRAS e BRAF. Antigamente, se considerava os pólipos serrilhados como benignos, porém, hoje se sabe que aproximadamente 20% de todos os carcinomas colorretais ocorrem por essa via. Em relação as implicações clínicas, sabe-se que tumores originados por instabilidade cromossômica são de pior prognóstico do que os originados por instabilidade de microssatélite; concluem que é importante compreender o câncer colorretal de maneira integral e aprofundar os estudos nos seus mecanismos de controle que incluem o diagnóstico precoce, tratamento e seguimento.
Em 2012, foi publicado na revista Nature o resultado de mais uma etapa do The Cancer Genoma Atlas: a caracterização molecular do câncer de cólon e reto. Para definir as alterações somáticas do carcinoma colorretal, foram estudadas 276 amostras; dessas, foi analisado a sequência do exoma, o número de cópias de DNA, a metilação do promoter e do RNA mensageiro, e a expressão dos microRNAs. 97 amostras foram submetidas a um sequenciamento profundo de todo o seu genoma.
Como resultado, 16% possuíam hipermutação; três quartos desses possuíam a
esperada taxa de instabilidade microssatélite, usualmente com hipermetilação e silenciamento do MLH1, enquanto o restante apresentava mutações em genes de reparo do DNA (MMR) e na POLE (polimerase ε). Excluindo os cânceres hipermutados, verificou-se que o câncer de cólon e reto apresentou padrões de alteração genômicas similares. 24 genes estavam significativamente mutados, e, além das mutações esperadas de APC, TP53, SMAD4, PIK3CA e KRAS, encontrou-se mutações frequentes em ARID1A, SOX9 e FAM123B. Amplificações gênicas (aumento do número de cópias) foram vistas em ERBB2 e IGF2, podendo ser consideradas potencias terapia-alvo. As translocações cromossômicas recorrentes incluem a fusão do NAV2 e a via WNT membro do TCF7L1. A análise integrativa sugere novos marcadores para o carcinoma colorretal agressivo e um papel importante da ativação e repressão transcricional dirigida pelo MYC. Concluíram que os dados aqui apresentados fornecem um recurso útil para compreender esta doença mortal, e identificar possibilidades de tratá-la de forma direcionada.
2.1.2 CD133
SILINSKY, GRIMES, DRISCOLL, GREEN, CORDOVA, DAVIS e LI (2013) publicaram um artigo, questionando se células de câncer de cólon possuem CD133 e CXRCR4 como marcadores para metástase linfonodal; afirmam que as células tronco de câncer colorretal e as células iniciadoras de tumores são responsáveis pela recorrência do câncer e metástases extranodais. O CD133 e o CXCR4 são biomarcadores de superfície específicos que indicam a presença das células iniciadoras de tumores. Foram estudadas 27 amostras tumorais através de imunofluorescência e imunoistoquímica, sendo encontrados 3,94% de células CD133+ e 6,15% de CXCR4+. A porcentagem de células duplamente positivas (CD133+ e CXCR4+) foi de 0,45%; correlacionando as células marcadores positivo com os pacientes com metástase linfonodal, encontrou-se uma relação estatisticamente significante para o CD133+, isoladamente e em conjunto com CXCR4+ (duplo positivo). Concluíram que os biomarcadores de superfície CD133+, e CD133+ e CXCR4+ são associados com a presença de metástases linfonodais no câncer colorretal.
MIA-JAN, JUNG, KIM, OH, CHOI, CHANG, KANG e CHO (2013) publicaram um estudo sobre a expressão do CD133 no câncer colorretal; afirmaram que as células-tronco tumorais são notórias por sua capacidade de progressão tumoral, metástase e resistência à quimioterapia. Entretanto, o papel desse marcador de célula tronco tumoral ainda não é claro. Foram avaliados 271 carcinomas colorretais primários em estádio clínico II e III, ressecados cirurgicamente, sendo 171 com tratamento adjuvante e 100 casos sem o tratamento. A expressão do CD133 foi analisada por imunoistoquímica e RT-PCR em tempo real, a metilação do promotor do CD133 foi quantificada por pirosequenciamento. A expressão imunoistoquímica do CD133 foi significativamente correlacionada com a expressão de mRNA, e inversamente correlacionada com a metilação do promotor. Os tumores CD133+
foram significativamente associados a uma melhor sobrevida em pacientes com terapia adjuvante, em comparação com aqueles sem a referida terapia. Concluíram que a expressão do CD133 não é um fator prognóstico independente nos estádios de câncer colorretal II e III, mas pode prever o melhor resultado em pacientes com terapia adjuvante.
ZHAO, PENG, ZHANG, JIANG, LI, ZHANG, ZHANG e NIU (2016) fizeram uma meta-análise sobre a expressão do CD133 como marcador prognóstico no câncer colorretal, para otimização terapêutica e apoio à teoria da célula tronco tumoral;
revisaram 28 estudos, com um total de 4546 pacientes. Verificaram que os pacientes que possuíam tumores com marcação CD133alta (marcação fortemente positiva na imunoistoquímica) possuíam menor sobrevida global em 5 anos e menor tempo livre de doença em relação ao grupo marcado com CD133baixa (CD133 com baixa marcação a imunoistoquímica). Ambas as associações foram observadas em diferentes raças, técnicas de pesquisa e terapêuticas. As células-tronco tumorais (CTTs) possuem um papel essencial na tumorigênese, na progressão de doença e na falha terapêutica. Diversos biomarcadores foram usados em estudos clínicos para definir a existência das células tronco tumorais como CD133, CD44 e ALDH1. O CD133 já foi identificado e isolado em diversas células tronco tumorais, em uma variedade de tumores humanos. Muitos estudos tentaram caracterizar as células com marcação CD133+ (com marcação positiva) com desfechos clínico-patológicos como maior chance de metástase linfonodal, maior tamanho tumoral e menor grau de diferenciação tumoral. Consistentemente com esses achados, tumores CD133+
apresentam maior resistência a tratamento adjuvante pós ressecção cirúrgica. Esses resultados sugerem que o biomarcador CD133 serve como um preditor de mau prognóstico e de falha terapêutica; assim, pacientes com marcação CD133 baixa poderiam se beneficiar de tratamentos adjuvantes, enquanto os pacientes com CD133
alta deveriam receber novos tratamentos, além da terapia adjuvante. Esses resultados também fornecem evidências em apoio a hipótese da célula tronco tumoral.
FATHI, MOSSAD, HUSSEIN, ROSHDY e ISMAIL (2017) estudaram a evidência prognóstica do CD133 e da Ezrin no carcinoma colorretal; nesta avaliação, feita em 50 carcinomas colorretais primários e da mucosa colônica normal circundante, quantificou-se os biomarcadores CD133 e Ezrin por duas técnicas:
quantificação gênica através do RT-PCR e quantificação proteica através da imunoistoquímica. Em seguida, realizou-se a correlação entre a expressão do CD133 e da Ezrin com parâmetros clínicos e patológicos. A expressão do RNAm e das proteínas CD133 e Ezrin do câncer colorretal foi significativamente maior do que o encontrado na mucosa normal. Os níveis elevados de ambos os marcadores estiveram significativamente associados ao estádio clínico, ao comprometimento linfonodal, e à presença de metástase à distância. Concluem que os biomarcadores CD133 e Ezrin são potenciais preditores de agressividade e pior prognóstico no câncer colorretal.
LEE, YEO, SEONG e KIM (2018) realizaram um estudo, objetivando avaliar a expressão do CD133 entre as células de adenoma, adenocarcinoma colorretal e células do microambiente tumoral (para avaliar a sequência de adenoma-carcinoma), além de investigar o valor clínico-patológico da expressão do CD133 nos adenocarcinomas colorretais como marcador prognóstico. Estudou-se 58 adenomas, 132 carcinomas colorretais primários e 27 adenocarcinomas colorretais metastáticos, e a sua expressão do CD133; a expressão citoplasmática e nuclear do CD133 foi pontuada por um método semi-quantitativo. Os adenomas mostraram expressão CD133 citoplasmática e nuclear significativamente menor do que os adenocarcinomas colorretais (p<0,001). Entre os adenocarcinomas, os tumores primários demonstraram níveis mais altos de expressão citoplasmática e nuclear de CD133 do que os metastáticos (p <0,001). Além disso, a diminuição da expressão nuclear do CD133 em células de adenocarcinoma colorretal foi correlacionada com um pior desfecho, incluindo menor tempo livre de doença (DFS) por análise uni e multivariada (p<0,05).
Os adenomas com displasia de alto grau apresentaram expressão significativamente maior de CD133 do que os adenocarcinomas (p<0,001). A expressão combinada (citoplasmática e nuclear) do CD133 em células de adenocarcinoma colorretal e displasia de alto grau pode desempenhar um papel importante na carcinogênese, porém a expressão somente nuclear possuiu valor inverso: quando está diminuída possui associação com a presença de metástase. Sugerem os autores que mais estudos devem ser realizados para definir o prognóstico e terapêutica de acordo com a localização da expressão do CD133.
2.1.3 c-MYC
MILLER, THOMAS, ISLAM, MUENCH e SEDORIS (2012) afirmam em seu estudo de revisão que o oncogene MYC desempenha um papel central de regulação do crescimento celular e do metabolismo celular, e sua superexpressão é responsável por muitas das mudanças que levam a alterações malignas. Os múltiplos efeitos da expressão do c-MYC ocorrem ao nível molecular, e afetam quase todas as atividades da vida celular; afirmam que esse oncogene possui um papel central na sustentação de células em rápida proliferação, fornecendo o maior aporte de ácidos nucléicos, proteínas e lipídios. Ao mesmo tempo, sua hiperexpressão também afeta famílias de genes que apresentam como função o aumento da proliferação celular. Assim sendo, o c-MYC é um oncogene primário, ativado por amplificação ou translocação, e possui um efeito secundário em outros oncogenes ativados. Essa dualidade de funções caracteriza o gene c-MYC como um “grande maestro”, e, apesar de algumas tentativas de utilizar o c-MYC como alvo terapêutico terem sido frustrantes, imagina-se que isso deve mudar nos próximos anos.
WIEGERING, PFANN, UTHE, OTTO, RYCAK, MADER, GASSER, WAAGA- GASSER, EILERS e GERMER (2013) publicaram um estudo sobre a influência da CIP2A na sobrevida do câncer colorretal. O inibidor da proteína fosfatase 2A (CIP2A) foi identificada em 2007 em carcinomas de cabeça, pescoço e cólon. Sua expressão inibe a PP2A, e assim evita a degradação do MYC. O MYC ativado induz a imortalização e malignização das células humanas. Estudos prévios mostraram resultados conflitantes quanto a sua presença e o prognóstico dos pacientes. Neste estudo, houve a análise prospectiva da expressão de CIP2A em 104 pacientes com
câncer de cólon. Para determinar se a expressão CIP2A é elevada no câncer de cólon,foi quantificada a expressão do seu RNA mensageiro (mRNA) através do método PCR em tempo real (PCR-RT), e confirmando os achados através de imunoistoquímica, utilizando congelação das amostras pós ressecção cirúrgica.
Encontrou-se o mRNA da CIP2A superexpresso em 93 amostras (89,4%), e nessas houve uma correlação significatica com o estádio UICC (Union for International Cancer Control) avançados, metástases linfonodais e metástases à distância. Em seguida, dividiu-se o grupo CIP2A em 2 subgrupos: de alta e baixa marcação. A análise mostrou que a alta marcação CIP2A e o UICC avançado eram fatores independentes de pior prognóstico. Para determinar quais vias moleculares são reguladas pela CIP2A, foram empregados 3 linhas de células de cólon, e, utilizando pequenos RNAs de interferência (siRNA) e hairpin curto (shRNA), o gene CIP2A foi silenciado. A depleção da proteína CIP2A inibiu substancialmente o crescimento de linhas celulares de câncer colorretal, além de reduzir os níveis de c-MYC. Concluíram que a CIP2A representa um novo fator prognóstico no câncer colorretal, além de ser um alvo terapêutico promissor no desenvolvimento de terapias para o câncer colorretal.
TOON, CHOU, CLARKSON, DESILVA, HOUANG, CHAN, SIOSON, JANKOVA e GILL (2014) realizaram um estudo retrospectivo, no qual foram avaliados 1421 carcinomas colorretais; esses foram submetidos a imunomarcação com anticorpo anti-MYC, e também foi feita a pesquisa das proteínas de reparo (MMR) e da proteína BRAF. A superexpressão do gene MYC tem sido relatada como um biomarcador de prognóstico favorável no carcinoma colorretal. No entanto, a análise da expressão do MYC não está disponível no cenário clínico de rotina. Investigaram a expressão imunoistoquímica para a proteína MYC, usando um novo anticorpo monoclonal de coelho, disponível comercialmente: o clone Y69. Este já possui uso clínico difundido para o diagnóstico de linfoma e poderia também ser usado para prever o desfecho em câncer colorretal ressecado. O resultado foi dado como positivo ou negativo, e do total, 980 (69%) carcinomas apresentaram sua superexpressão (positivo). Após diversas análises multivariadas, concluiu-se que a superexpressão do MYC possui relação com a melhor sobrevida em 5 anos (93,2% vs. 57,3%), independentemente dos resultados de MMR e BRAF. Esse relação de melhor prognóstico já havia sido demonstrada previamente em 1996 por Smith e Goh.
Concluíram que o biomarcador MYC estudado por imunoistoquímica pode ser usado
para prever a sobrevida global em pacientes com carcinoma colorretal submetidos à ressecção cirúrgica.
BAKER, VAN NOORDEN, RODRIGUEZ-JUSTO, COHEN, WRIGHT e LAMPERT (2016) publicaram um estudo sobre a distribuição dos produtos do gene c- MYC na neoplasia colorretal. Foram estudados 15 tecidos colônicos normais, 4 pólipos hiperplásicos e 55 amostras de neoplasias de cólon, através da marcação da proteína c-MYC por imunoistoquímica, usando dois anticorpos diferentes: o dirigido ao N-terminal Y69 e o direcionado ao C-terminal 9E10. As distribuições da proteína MYC foram então comparadas com a localização do RNAm (RNA mensageiro) do MYC, determinado por ISH (in-situ hybridization); concluíram que a localização do RNAm do MYC correlaciona-se com a distribuição de proteína determinada pelo anticorpo dirigido ao N-terminal Y69. A distribuição da proteína determinada com o anticorpo 9E10 C-terminal nem sempre foi associada ao RNAm do MYC e mostrou frequentemente um padrão de expressão paradoxal, sendo a marcação mais forte em células não proliferativas. Tentativas recentes para estudar a distribuição MYC em amostras humanas foram confundidas por uma falta de concordância na coloração imunoistoquímica entre anticorpos dirigidos ao N-terminal e aqueles que têm como alvo o C-terminal da proteína MYC. Afirmaram os autores que o objetivo do estudo foi usar uma nova abordagem de hibridização in-situ (ISH) para detectar o RNAm do gene MYC em amostras clinicamente relevantes e, assim, determinar a confiabilidade de anticorpos do MYC. A discrepância observada entre os padrões de coloração sugere que a significância de 9E10 na coloração imunoistoquímica é atualmente incerta e, portanto, deve ser interpretada com cautela.
SCHAUB, DHANKANI BERGER, TRIVEDI, RICHARDSON, SHAW, ZHAO, ZHANG, VENTURA, LIU, AYER, HURLIN, CHERNIACK, EISENMAN, BERNARD e GRANDORI (2018) descreveram as alterações do oncogene MYC e fatores transcricionais; embora o oncogene MYC tenha sido relacionado ao câncer, ainda falta uma avaliação sistemática das alterações do MYC, dos seus fatores de transcrição e das suas proteínas de regulação, o que foi nominado rede proximal do MYC. Ao analisarem o Atlas do Genoma do Câncer, definiu-se as características genômicas e proteômicas associadas ao MYC e sua rede proximal em 33 tipos de câncer.
Considerando todas as amostras estudadas, 28% tinham pelo menos um dos genes MYC amplificados. Em contraste, os antagonistas do MYC como os genes MGA e
MNT foram os membros mais frequentemente mutados ou deletados, propondo seu papel como supressores tumorais. Comparando-se as mutações do MYC com alterações de outros genes como PIK3CA, PTEN, APC ou BRAF, não foi encontrado qualquer relação significante entre suas alterações, e isso sugeriu que o MYC é um oncogene independente. Os autores descrevem que as oncoproteínas MYC em tumores sólidos são ativadas principalmente por amplificação gênica, e que mesmo pequenas mudanças nos níveis de MYC podem conduzir à oncogênese. A análise das vias mostrou que o MYC influência diversos caminhos tumorais, desde a resposta imune até a sinalização do fator de crescimento. Esta análise abrangente do MYC e sua rede proximal é importante para definir sua relevância como biomarcador e os potenciais alvos nas terapias contra o câncer.
LEE, NAM, SEO, PARK, OH, KIM, KANG e KIM LEE (2019) publicaram um estudo sobre o uso da reação em cadeia da polimerase digital para detectar aumento de cópias do c-MYC em tecidos e no plasma de pacientes com câncer colorretal. Foi utilizado o método da reação em cadeia da polimerase digital de gota (ddPCR) para detectar o número de cópias do gene c-MYC livre no plasma, e, no mesmo período, o mesmo gene foi quantificado no tecido neoplásico através da técnica de SISH (in situ hybridization), do mesmo paciente com câncer colorretal. A verificação do gene c- MYC foi dividida em dois grupos: grupo 1: retrospectivo, com 192 pacientes, e grupo 2: prospectivo, com 64 pacientes. No primeiro grupo, a expressão do MYC foi observada em 34 pacientes (17,5%) por SISH, e em 7 casos (3,6%) por ddPCR. Nesse grupo os dois métodos se correlacionaram significativamente e o ganho de cópias do c-MYC por SISH e ddPCR, foi independentemente correlacionado com pior prognóstico (p = 0,002). Porém, no grupo prospectivo (grupo 2) o número de cópias do gene c-MYC por SISH se relacionou com ddPCR plasmático com significância limítrofe (p = 0,050) Os autores concluem que a detecção do ganho do oncogene c- MYC no plasma com ddPCR pode ter sensibilidade relativamente baixa, mas alta especificidade. Como é um método não invasivo, pode ser uma ferramenta útil para detectar o ganho do c-MYC em pacientes com câncer colorretal mais avançado, e deve ser usado com cautela em pacientes com estádios clínicos iniciais.
2.1.4 AXL
BOSURGI, BERNINK, CUEVAS, GAFLIANI, JOANNAS, SCHIMID, BOOTH, GHOSH e ROTHLIN (2013) estudaram o papel paradoxal do proto-oncogene - Axl e do receptor tirosina quinase - Mer no câncer de cólon; relatam que os receptores tirosina quinases Axl e Mer, pertencentes à família de receptores Tyro3, Axl e Mer (TAM – sigla da respectiva família), e são expressos em várias células tumorais, e têm papéis oncogênicos bem caracterizados. O direcionamento terapêutico dessas quinases é considerado uma estratégia anticâncer, e vários inibidores estão atualmente em desenvolvimento. Ao mesmo tempo, o Axl e o Mer são expressos em células dendríticas e macrófagos, e têm uma função essencial na limitação da inflamação. Os autores referem que a inflamação é uma característica facilitadora de muitos tipos de câncer. Essas funções oncogênicas e anti-inflamatórias contrastantes do Axl e do Mer são um paradoxo em termos de terapia antineoplásica. Utilizando o modelo de câncer em ratos AOM/DSS (azoximetano/dextran sulfato de sódio), combinado com a inibição dos genes Axl e Mer, descobriram que a sinalização do Axl e Mer previne a colite, e reduz significativamente o número e tamanho dos adenomas colorretais. Microscopicamente, foi detectado um aumento significativo no número de neutrófilos apoptóticos e na produção de citocinas pró-inflamatórias na lâmina própria de camundongos Axl negativo e Mer negativo. A análise endoscópica revelou que os camundongos duplamente negativos desenvolveram significativamente mais pólipos, e que esses foram mais numerosos e significativamente maiores em comparação aos camundongos controle. Portanto, a ablação da sinalização Axl e Mer está associada ao aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias e à incapacidade de eliminar neutrófilos apoptóticos na lâmina própria intestinal, favorecendo, assim, um ambiente promotor de tumor. Esses resultados levantam a possibilidade de potenciais efeitos adversos de terapias anticâncer sistêmicas com os inibidores Axl e Mer, e ressaltam a importância de compreender as funções específicas do tecido e do tipo celular no câncer e nas suas terapias alvo.
WU, LIU, KOUL, LEE, ZHANG e HALMOS (2014) descrevem o AXL quinase como um novo alvo terapêutico no câncer; nessa revisão, os autores afirmam que o receptor AXL e seu principal ligante, o GAS6 (growth arrest-specific protein 6) têm sido encontrados superexpressos em diversos tipos de câncer, como no pulmão, mama e
pâncreas. Sua presença tem sido relacionada com pior prognóstico, aumento da agressividade, aumento de metástases, resistência a medicações e um fenótipo EMT (Epithelial–Mesenchymal Transition). Este descreve uma mudança reversível de um fenótipo epitelial para um fenótipo mesenquimal, e é um programa global que permite às células epiteliais migrar e invadir o tecido circundante. Focar o AXL como alvo terapêutico, utilizando inibidores específicos de quinases ou anticorpos isoladamente, ou em combinação com outras drogas pode levar à inativação de vias de sinalização mediadas por AXL, e, assim, à recuperação da sensibilidade à droga e eficácia terapêutica. Concluem que os dados apoiam o desenvolvimento de medicamentos, visando o eixo AXL / GAS6 como um novo candidato no tratamento de uma variedade de cânceres.
MARTINELLI, MARTINI, CARDONE, TROIANI, LIGUORI, VITAGLIANO, NAPOLITANO, MORGILLO, RINALDI, MELILLO, LIOTTI, NAPPI, BIANCO, BERRINO, CIUFFREDA, CIARDIELLO, IAFFAIOLI, BOTTI, FERRAIOLO e CIARDIELLO (2015) estudaram o AXL como novo alvo terapêutico no câncer colorretal. O AXL é um membro da família tirosina quinase TAM (TYRO3, AXL, MER), e é superexpresso em vários cânceres humanos, incluindo várias leucemias e tumores sólidos, onde está associado a um mau prognóstico. Utilizou-se quatro linhas de células de câncer colorretal humana, SW620, SW480, LOVO e HCT116, que apresentavam o receptor AXL. Para se confirmar a presença do AXL e seu ligante GAS6, foi utilizado a técnica de RT-PCR, e para se identificar os genes e vias relacionadas à expressão do AXL, foi utilizado microarray comparando-se as linhas celulares de câncer colorretal (CRC) que expressavam AXL, e linhas que não expressavam AXL. A seguir, utilizou-se o Foretinibe (um inibidor c-MET e VEGFR2 multiquinase) nas quatro linhagens celulares de CRC, o qual suprimiu a proliferação, migração e sobrevivência em células CRC. Em um modelo de cólon ortotópico, células HCT116 em um camundongo nude, o tratamento causou inibição significativa do crescimento do tumor e disseminação metastática peritoneal. Além disso, foi também estudada a expressão da proteína AXL em 223 pacientes diagnosticados com câncer colorretal. A expressão da proteína AXL por imunoistoquímica foi vista em 171 de 223 espécimes de tumor (76,7%), enquanto a expressão de AXL foi indetectável em 52 de 223 (23,3%). A superexpressão de AXL e GAS6 por imunoistoquímica (IHQ) foi encontrada em 76,7% e 73,5%, respectivamente, correlacionando-as com a
graduação histológica menos diferenciada. Concluem os autores que a inibição do AXL pode representar uma nova abordagem terapêutica no câncer colorretal.
GAY, BALAJI e BYERS (2017) fizeram uma revisão do AXL no câncer humano; referem que o receptor tirosina quinase AXL é ativado por uma interação complexa entre a GAS6 e a fosfatidilserina, regulando vários processos celulares vitais, incluindo proliferação, sobrevivência, motilidade e resposta imunológica.
Embora não esteja implicado como propulsor oncogênico, o AXL, membro da família TYRO3, AXL e MERTK dos receptores tirosina quinase, é superexpresso em várias neoplasias hematológicas e sólidas, incluindo leucemia mieloide aguda, câncer de pulmão de não pequenas células, gástrico e adenocarcinomas colorretais, e cânceres de mama e próstata. No contexto da malignidade, evidências sugerem que a superexpressão do AXL impulsiona processos abrangentes, incluindo a transição entre o padrão de atividade epitelial para mesenquimal, a angiogênese tumoral, a resistência a agentes quimioterápicos, e diminuindo resposta imune antitumoral.
Como resultado, o AXL é um candidato atraente, não apenas como um biomarcador prognóstico em malignidade, mas também como um alvo para terapias antineoplásicas.
URIBE, MANDELL, WATSON, MARTINEZ, LEIGHTON, GHOSH e ROTHLIN (2017) estudaram como o receptor tirosina quinase AXL promove migração e invasão no câncer colorretal; afirmam que os receptores tirosina quinase (RTQs) TYRO3, AXL e MERTK (nominados em conjunto de receptores TAM) têm funções oncogênicas bem descritas em vários tipos de câncer e também são inibidores potentes e indispensáveis de processos inflamatórios. A deleção combinada de Axl e Mertk em camundongos aumenta a inflamação crônica e a autoimunidade. Foram pesquisados os conjuntos de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) para avaliar a expressão de todos os três RTQs TAM em adenocarcinomas colorretais; posteriormente, estudaram 18 casos de adenocarcinoma colorretal, abrangendo todos os estádios clínicos, e a expressão dos RTQs TAM foi avaliada através de PCR-RT. Em seguida, examinaram experimentalmente a função molecular do AXL em células de CRC in vitro; verificaram a expressão dos RTQs TAM em um painel de linhas celulares de câncer colorretal.
Como a expressão do AXL encontrada nas linhas celulares do câncer colorretal não foi homogênea, optou-se por examinar a função desse gene tanto nas células RKO- AS45-1 (com alta expressão), quanto nas HCT 116 (baixa expressão). Em seguida, o
gene AXL foi silenciado através de dois siRNAs independentes; foram observados os efeitos do silenciamento do AXL na migração, invasão celular, proliferação/sobrevida, aumento da apoptose e sensibilidade à quimioterapia. Os resultados indicam que, embora todos os três RTQs TAM tenham sido detectados no câncer colorretal, somente o AXL é responsável pela invasão do câncer, e somente ele é encontrado nos tumores tardios. O seu silenciamento mostrou inibição significativa da migração e invasão das células tumorais, porém não diminuiu a proliferação/sobrevida e não estimulou o aumento da apoptose/quimio-sensibilidade. Estes resultados indicam que a inibição seletiva do AXL sozinho pode conferir benefícios terapêuticos suficientes no câncer colorretal, preservando pelo menos alguns dos efeitos benéficos anti- inflamatórios dos outros RTQs MERTK e TYRO3.
2.2 PÓLIPOS COLORRETAIS
2.2.1 CD133
YANG, TSENG, CHEN, CHOU, GAO, HUA, LIN, LIN e JIANG (2015) publicaram um estudo nominado “As alterações no número de cópias e na expressão do CD133 caracteriza os subconjuntos de pólipos de cólon”. Afirmam que os pólipos colorretais são os precursores do câncer colorretal, no entanto, a proporção e velocidade de progressão diferem amplamente em diferentes subconjuntos de pólipos. Foram estudados 18 pólipos sincrônicos de câncer (CSP), 9 pólipos displásicos (CPP) e 16 casos de pólipos incidentais (IP) através de hibridização por microarray e imunomarcação do CD133. Alterações genômicas progressivas foram observadas a partir dos pólipos IP, CSP, CPP até o carcinoma colorretal. Essas alterações abrangem desde uma região inteira de um cromossomo nos pólipos incidentais até regiões sub-cromossômicas nos pólipos sincrônicos de câncer e pólipos displásicos. A análise da relação clonal demonstrou que 50% dos CSP e 67%
dos CPP foram relacionados ao desenvolvimento concomitante ou posterior de carcinoma. A expressão do CD133 foi significativamente mais alta nos pólipos sincrônicos de câncer e nos pólipos displásicos, e não apresentou relação com os pólipos incidentais. Os autores concluíram que houve mais mudanças genômicas nos
pólipos sincrônicos de câncer e nos pólipos displásicos, ambos apresentando alta expressão do CD133, destacando a sua importância na carcinogênese colorretal.
KAZAMA, KISHIKAWA, KIYOMATSU, KAWAI, NOZAWA, ISHIHARA e WATANABE (2017) publicaram um estudo titulado “A expressão do marcador de célula tronco tumoral é relacionada ao desenvolvimento tumoral na carcinogênese colorretal”. Nesse estudo, foram avaliados 200 pólipos colorretais e 20 mucosas normais através de imunoistoquímica para CD133, no qual 17,9% obtiveram marcação positiva. As mucosas normais e os pólipos hiperplásicos não apresentaram marcação para CD133. Dos 145 adenomas, 26 apresentaram marcação positiva (17,9%), e 20 dos 35 pólipos com carcinoma (57,1%). A expressão do CD133 apresentou correlação estatisticamente significante com o grau de diferenciação (com pouco, moderado ou alto grau de atipia) e com o tamanho tumoral (<10mm ou >=
10mm) dos pólipos sem carcinoma. Não foi encontrado resultado significante em relação aos pólipos com carcinoma. Concluíram que a relação entre a expressão do CD133 com grau de displasia e o tamanho tumoral sugere que as células tronco tumorais apresentam um papel importante no desenvolvimento do câncer colorretal.
2.2.2 c-MYC
SATOH, YACHIDA, SUGIMOTO, OSHIMA, NAKAGAWA, AKAMOTO, TABATA, SAITOH, KATO, IGARASHI, AIZAWA, KAJINO-SAKAMOTO, KOJIMA, FUJISHITA, ENOMOTO, HIRAYAMA, ISHIKAWA, TAKETO, KUSHIDA, HABA, OKANO, TOMITA, SUZUKI, FUKUDA, AOKI e SOGA (2017) estudaram a reprogramação metabólica global do câncer colorretal ocorrendo no estágio de adenoma e sua indução pelo MYC. Uma das características mais proeminentes das células neoplásicas é a sua capacidade de sustentar altas taxas de glicólise, para geração de ATP, independentemente da disponibilidade de oxigênio, esse atributo é chamado de efeito Warburg. Estudos recentes mostraram que, no câncer, as células mudam as vias metabólicas para facilitar a captação e incorporação de nutrientes como a glicose, as glutaminas, os aminoácidos e os lipídios, que são essenciais para células altamente proliferantes; essa parece ser uma característica universal dos tumores altamente malignos independente de sua origem histológica. Uma análise multiômica de tecidos normais e tumorais pareados de 275 pacientes revelou que as
alterações metabólicas ocorrem no estágio de carcinogênese do adenoma, em uma maneira não associada com uma mutação gênica específica. A expressão do MYC induz pelo menos 215 reações metabólicas através da mudança dos níveis de expressão de 121 genes metabólicos e 39 genes de transporte. Assim, o MYC regula negativamente a expressão de genes envolvidos na biogênese e manutenção mitocondrial, e regula positivamente os genes envolvidos na metilação das histonas e do DNA. Uma inibição de expressão (knockdown) do MYC em células de câncer colorretal redefiniu o metabolismo alterado e suprimiu o crescimento celular. Além disso, a inibição dos efeitos do MYC através dos genes de síntese de pirimidina, tais como DAC, UMPS e TPSP, bloqueou o crescimento celular e, portanto, esses genes são alvos potenciais para a terapia do câncer colorretal.
SU, WASHINGTON, NESS, REX, SMALLEY, ULBRIGHT, CAI, ZHENG e SHRUBSOLE (2017) publicaram um estudo sobre a comparação da expressão dos biomarcadores entre os adenomas colorretais proximais e distais: o estudo de recorrência Tennessee-Indiana; afirmam que não está claro se os adenomas proximais e distais apresentam diferenças moleculares que contribuem para heterogeneidade do câncer entre essas duas topografias. Assim, foram estudados 380 adenomas divididos em subgrupos baseados na sua localização: proximal, distal ou equivalente de ambos os lados. Sete biomarcadores foram avaliados por imunoistoquímica: Ki-67, COX-2, TGFβRI, EGFR, β-catenina, ciclina D1, c-Myc, e também realizada técnica de TUNEL para identificar células em apoptose. Após parear as amostras pelas características patológicas, não houve diferença significativa entre os adenomas proximais e distais para nenhum dos biomarcadores. Por outro lado, os níveis de expressão variaram de acordo com tamanho, componente viloso e presença de sincronia. Os adenomas grandes tiveram maiores níveis de expressão de Ki-67 (p<0,001), TGFβRII (p<0,0001), c-Myc (p<0,001) e ciclina D1 (p<0,001) em comparação com os adenomas pequenos. Concluíram que a localização do adenoma não é um dos principais determinantes da expressão biomarcadores estudados, e sim outras características patológicas.
