PRUEBAS EN TARJETA PARA LA LEPRA’
Joseph Porfnoy2
Se estudia el principio de la prueba en tarjeta, empleando antígenos que contienen carbón vegetal en una reacción de aglutinación con suero o plasma no calentado, como prueba para el diagnóstico de la lepra.
La Organización Mundial de la Salud estima que hay de 12 a 15 millones de enfer- mos de lepra en todo el mundo, la mayoría de los cuales viven en los trópicos. La enfer- medad se registra en casi todos los países de América, con elevada prevalencia en Sudamérica y, en menor grado, en América Central (1). Además, de los casos registra- dos en el mundo occidental casi la mitad se han clasificado como lepromatosos. Sin embargo, como la localización de casos suele ser deficiente, sobre todo en las zonas ru- rales, los datos de prevalencia son indudable- mente cifras mínimas.
Según Cañizares (2), el diagnóstico de la lepra se funda por lo menos en tres elemen- tos: 1) el hallazgo de Mycobacterium leprae
en un frotis tomado de un sitio adecuado; 2) la alteración de la sensibilidad nerviosa y de la función sudoral, y 3) el examen histo- lógico.
Aunque se han realizado progresos en el cultivo de M. ieprae (3-5) y en el trata-
miento de la enfermedad (2, 4, 6), no hay una prueba serológica para diagnosticarla. Se ha observado, sin embargo, que las reac- ciones positivas a pruebas serológicas para el diagnóstico de la sífilis ocurren hasta un grado considerable en la forma lepromatosa de la lepra (2, 7-9), y un informe reciente indica la posibilidad de que la doble difusión
1 La versión original en inglés apareció con el titulo “Card Tests for Leprosy” en el Int J Leprosy 34:420- 426, 1966.
‘Ph.D., Director de 10s Laboratorios de Investiga- ciones Biológicas Hynson, Wescott y Dunning, Inc., Baltimore, Maryland, E.U.A.
en geles pueda ser útil para caracterizar los sueros de enfermos de lepra (10).
Con el objeto de tener una prueba que pudiera practicarse sobre el terreno o en el consultorio, sin necesidad de usar aparatos como centrífuga, baño de María, máquina rotatoria y microscopio, se ideó la prueba rápida de reagina en plasma (RRP) para el diagnóstico de la síflis y otras treponemato- sis (II), y cuya eficacia se ha confìrmado (12, 13). Como la prevalencia de la enfer- medad en zonas bastante remotas indicó la utilidad de este tipo de prueba, se emprendie- ron estudios con la esperanza de obtener una prueba de gran capacidad para descubrir la lepra.
248 BOLETíN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA - Marzo 1967
títulos uniformemente más altos con sueros leprosos que los antígenos que contenían cardiolipina, lecitina y colesterol. Portnoy
(18) observó una diferencia en el comporta- miento de los sueros leprosos en compara- ción con los sueros sifilíticos por lo que respecta a la presencia de cloruro de colina en la suspensión antigénica: el cloruro de colina inhibía las reacciones producidas con sueros leprosos pero no las producidas con sueros sifilíticos.
Este trabajo proporciona datos relativos a la elaboración de pruebas en tarjeta para el diagnóstico de la lepra tanto sobre el terreno, mediante el empleo de agitación manual, como en gran escala utilizando una máquina rotatoria.
Materiales y métodos Antígenos
De soluciones alcohólicas de cardiolipina (de corazón de buey) y lecitina (de corazón de buey o de huevo) se obtuvieron solu- ciones madre de antígenos en alcohol abso- luto. El colesterol estaba exento de cenizas, doblemente precipitado con alcohol. Se había comprobado también que todos los reactivos eran satisfactorios para su empleo en la pre- paración de antígenos utilizados para el diagnóstico serológico de la sífilis. En algunos casos se hicieron soluciones de antígenos mezclando proporciones adecuadas de solu- ciones alcohólicas de los lípidos.
Preparación de la suspensión de antígeno
El método seguido fue básicamente similar al empleado cuando se prepara la suspensión de antígeno para la prueba RRP (II ) . El primer paso se asemeja al seguido en la preparación de suspensiones de antígeno en lámina para la prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory (18), y, donde era indicado, se emplearon de este modo. Luego se centrifugaron las suspen- siones de antígeno a 2,000 veces la fuerza de gravedad y se suspendieron de nuevo los
sedimentos en un volumen de líquido de suspensión igual al de la centrifugada y que tenía la composición siguiente:
Acido etilenodinitrilotetracético
(sal disódica), en solución
0.25M, con pH 7.0 0.5 ml
Solución salina amortiguada con fosfato, de pH 6.4, que contiene
mertiolato al 0.118 % X.5 ml
Suspensión acuosa de carbón ve-
getal (al 0.25%) 1.0 ml
Sueros
Los sueros de enfermos de lepra los pro- porcionó el Dr. John R. Trautman, Jefe del Departamento Clínico del Hospital del Servi- cio de Salud Pública de los Estados Unidos, Carville, Luisiana, cuya cooperación se agradece. Los diagnósticos clínicos, facili- tados por el Dr. Trautman, eran o de lepra lepromatosa o del tipo dimorfo. En Carville se habían practicado pruebas cualitativas
VDRL en lámina, y las muestras que eran
reactivas (únicamente del tipo lepromatoso) resultaron no reactivas a la prueba ITP. También se obtuvieron muestras de suero del Departamento de Salud del Estado de Mary- land, cuya cooperación igualmente se agra- dece. Consistían de especímenes ordinarios adoptados para diagnósticos serológicos de la sífilis.
Pruebas en tarjeta para el diagnóstico de la
lepra
Portnoy - PRUEBAS EN TARJETA PARA LA LEPRA 249
la prueba se practicó con 0.03 ml de suero y 0.01 de suspensión de antígeno. Cuando se utilizó el método de lágrima en superti- cie, la prueba se practicó con 0.03 ml de suero y 1/66 ml de suspensión de antígeno; se empleó balanceo manual durante 4 mi- nutos y después se leyeron los resultados. Las pruebas cuantitativas se practicaron me- diante la preparación de diluciones en solu- ción salina fisiológica al 0.9% directamente sobre las tarjetas círculo, Si los títulos exce- dían de 1:32, se hicieron diluciones en suero humano no reactivo al 1:50 para facilitar la difusión de las diluciones del suero.
Resukados
Se prepararon soluciones alcohólicas que contenían concentraciones constantes de colesterol (0.9 % ) , cardiolipina (0.15 % ) y concentraciones variables de lecitina (O-O.45 % ) . Las suspensiones de antígeno del tipo VDRL se prepararon y se probaron con el método VDRL en lamina con tres sueros testigos. Los resultados obtenidos se presentan en el cuadro 1. No se encontraron manifestaciones de reactividad, aunque la
CUADRO l-Resultados de pruekas del tipo VDRL con
antígenos leprosos.
Antígeno mímerc
1 2 3
4 n 6 7
VDRL f3Il
lámina &. .
Proporción de cardiolipina por lecitina
13 1:2 1:l 1.5:l
5:l 7.5:1 Sin lecitina
l:T
SUWOS
A __--
R(l:S) (Título)
B
N N N N N N N n -
C -
N N N N N N N N -
a Antígeno de la prueba ordinaria VDRL en lámina. R-Reactivo
g-F$activo. débil
N-No reactivo
Para pìepa~ar los sueros A y B se diluyó una mezcla de sue- r 09 positivos (a nxu.) en ~uen3 C no reactivo.
lámina VDRL dio un título de 1:s con el suero A.
Cuando esas suspensiones de antígeno fue- ron centrifugadas y suspendidas de nuevo en la forma descrita en la sección titulada “Materiales y métodos”, se hicieron pruebas con sueros de enfermos de sífilis y de lepra. Los antígenos 1 y 2 presentaron alguna reac- tividad con los sueros siftlíticos, pero las reacciones fueron más débiles que las de las pruebas RRP en tarjeta y VDRL en lamina. Los antígenos 3 y 4 resultaron más promete- dores, pues no indicaron reacción con el suero sifilítico y dieron un alto grado de positividad con los sueros de enfermos de lepra. Estos antígenos contenían una pro- porción de 1: 1 y de 1.5 : 1, respectivamente, de cardiolipina por lecitina. La concentra- ción de cardiolipina fue de 0.15 por ciento. Las proporciones más altas de cardiolipina en relación con lecitina fueron mucho menos reactivas, y sin lecitina (antígeno 7) sólo se observaron reacciones débiles.
250 BOLETÍN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA - Marzo 1967
CUADRO 2-Resultodos obtenidos con suspensiones de antígeno de pruebas en tarjeta para la lepra con proporciones variables de cardiolipina por lecitina en sueros de pacientes con sífilis o lepra.
- -- --- --- --- .__
SlWO __ _--. -
rarJe-
1 2 3 4 5 6 7 ,a RPR
_- - .___ - - - -- -- _- __-
A R N N N N N N R
B N N N N N N N Rlll
C N N N N N N N N
D R R, N N N N N R
E R, &l N N N N N R
F R,” R, N N N N N R
G R, R, N N N N N R
H N N N N N N N N
Ll N N N N N N N N
L2 40 8 16 32 N N N N
L3 4 16 32 64 N N N N
L4 2 8 16 64 1 1 1 N
L5 N 2 2 4 1 1 N N
L8 2 8 16 32 N N N N
LS 8 16 256 512 N N N N L 10 2 8 16 64 1 N N N L 11 4 16 32 64 1 1 1 N L 12 8 64 256 512 N N N N L 13 8 16 64 256 1 1 1 N L 14 4 8 32 64 1 N N N
L 15 N 2 4 64 1 1 1 N
L 16 N N N N N N N N
L 17 N N N N N N N N
L 18 N N N N N N N N
L 19 N N N N N N N N
L 20 N N N N N N N N
L 21 N N N N N N N N
L 22 N N N N N N N N
T-
- - PP--- -
n Antígenos iguales a los del cuadro 1.
b Resultados renistrndos en el Hospital del Servicio de Salud Pública de Carsille. 0 Recíproco de la dilución III& alta que da un resultado reactivo o minimamente reactivo.
Los sueros A. B y C iguales a los del cuadro 1.
Los sueros D a H representan la dilución de un solo suero sifilítico en solucibn salina. R-Reactivo
Antígenos experimentales empleados en pruebas en tarjeta círculo =
Rm-Mínimamente reactivo N-No reactivo
D-Reactivo dhbil L-Lepra
se observó intensa reactividad con los antíge- nos seleccionados para la prueba en tarjeta. El antígeno 26 tendió a producir los títulos más altos, aunque la intensidad de la agluti- nación propendió a ser mayor con el antí- geno 19.
A fin de determinar la capacidad de los antígenos destinados al diagnóstico de la
íDEL b Zl?“& --
R D N R R R D N N N N N N R R R R R R R N N N N N N N N
Diagnóstico
Suero en testigos de suero. Suero en testigos
de solución salina que representa diluciones seria- das al doble. Tipo lepromatoso
‘<
“
“
I<
,‘
l‘
“
‘,
“
6‘
Tipo dimorfo ‘I ‘C I‘ “ I< “ II
PortPzoy * PRUEBAS EN TARJETA PARA LA LEPRA 251
CUADRO 3-Efecto de las alteraciones, tanto en ta proporción de cardiolipina por lecitina como en la concentración absoluta de estos lípidos, sobre la reactividad con sueros de sifilíticos y leprosos.
Antígeno número Cardio- lipina
70 f
_---_- __--
Pro- porción le cardio- ipins por lecitina --- 8 .... ...
9 ...
10 .... ... ll... 12 ... 13 ... 14 ... ... 15 ... 16 ... 17 ...
18 ... 19 ...
20 ... 21. .. ... 22 ... 23 ... 24 ... 25. ... 26 ... RRP en tarjeta ... VDRL en lámina.
. . . . 1
. .05
, .038 . . .1 . . .05
.038 .l . . . . 1 . . .1
.2 .15 . . . . 1 .05 . .038 . . . . 1 . . . 1 . . . . 1 . . . . 1
. . . . 1
1:3 1:3 1:3 1:2 1:2 1:2 1:1.9 1:1.6 1:1.3 1:l 1:l 1:l 1:l 1:l 1:.9 1:.8 1:.7 1:.6 1:.5 . . , - - A --- R* nm N N N N N N N N N N N N N N N N R R - - B --- N N N N N N N N N N N N N N N N N N N RDI D - - C N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N - D __ R R R* R, R, N R, R, %a R R N N N N N N N N R R E --- R R R* RIZO %l N RLLl RIU N R, R* N N N N N N N N R R - F --- R R RUI R, R, N % R, N N N N N N N N N N N R R - - G -- R R RI0 R, N N JLl N N N N N N N N N N N N R D - - H --- N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N - LPP -- 16 8 8 16 16 16 32 64 64 64 128 128 64 32 12s 12s 12s 128 128 N D - -- 8 LNP -- N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
8 Mínimamente reactivo en todas las diluciones ensayadas hasta la de 1:32. A 8. H-Véase nota al pie del cuadro 2.
LPP-Mezcla de sueros positivos 8. la lepra. LNP-MemIa. de suexm negativos 8. la lepra.
R-Reactivo
Rm-Minimamente reactivo N-No reactivo
D-Reactivo d6bil
reaccionaron con los tres antígenos de lepra mostrando un título de cuatro. De 22 muestras reactivas a la prueba RRP en tarjeta, sólo una reaccionó con los antígenos de lepra, y dio un título de 16.
Las pruebas en que se empleó el método de lágrima en superficie se practicaron uti- lizando los antígenos descritos en el cuadro 5, y los resultados fueron similares a los obtenidos con la tarjeta círculo.
Comentarios
Los resultados de esta investigación seña- lan la superioridad de los antígenos que con- tienen una proporción de cardiolipina por lecitina de 1: 1 a 2: 1 para descubrir n-ani- festaciones de reactividad serológica en la
252 BOLETÍN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA * Marzo 1967
CUADRO 4-Reactividad comparada de antígenos leprosos seleccionados, utilizando sueros individuales.
Sueros leprosos
L 1. ... L2 ... L 3 ... L 4. ... L 5. ... L 9. ... L 11. ... L 13. ... L 14. ... D 15 ... D 16 ... D 17 ... D 18 ... D 19 ... D 20 ... D Zl...
D 22 ...
- - --
- L-Tipo lepromatoso D-Tipo dimorfo Rm-Mínimamente reactivo
N-No reactivo D-Reactivo d6bil
Proporción de cardiolioina wr lecitina y número del &tíg&o 1:1.6
-- 15 --
1:1.3 --
16 1:1 --
19 ~-
1:.7 24 __-
1z.5 --
2û ~-
VDRL en I&mina
RUl n, N N N N
16 32 32 16 16 N 64 64 64 12s 256 N 32 64 64 64 64 N
8 16 8 4 8 N
128 12s 256 256 1,024 1 64 64 12s 12s 12s N 12s 256 256 256 256 1 64 64 64 128 256 N
8 16 8 8 16 n
N N N N N N
N N N N N N
N N N N N D
N N N N N N
N N N N N N
N N N N N N
N N N N N No practicada
- -
CUADRO 5-Reactividad de tres antígenos leprosos seleccionados, utilizando suero no leproso.
RRP cualitativa vma cualitativa Número de
en tarjeta en IAmina muestras
N ... N ... R R ... R ...
R ... R ... R ... R ...
R ... R ...
Nn practicada 24 No prscticnd:~ 2
1 4
2 2
2 1
4 2
8 3
16 2
32 1
64 6
128 1
- ,
-
28
Cardiolipinn 1% Lecitina
1%
N 4 N N 16 N N N N N N
30 Card;$pinn
Lecitha .075% ____-
N
4 N N 16 N N N N N N
- (
-
hrd?&pinn 1% Lecitina
.95%
N 4 N N 16 N N N N N N
Portnoy * PRUEBAS EN TARJETA PARA LA LEPRA 253
hibe la reactividad de los sueros de lepra y propende a aumentar la reactividad de los sueros sifilíticos (8). En este fenómeno estriba la mayor especiticidad de la prueba RRP en tarjeta en comparación con la prueba VDRL en lámina con sueros de enfermos de lepra (II, 12). Este estudio indicó, además, que los antígenos leprosos reaccionaron sólo ligeramente con sueros no leprosos y no se observó correlación de esta reactividad con sueros sifilíticos.
Matthews y Trautman (9) indicaron que la supresión de la fracción crioproteínica de los sueros leprosos produjo un resultado no reactivo a la prueba VDRL en lámina en muestras anteriormente reactivas. Los datos obtenidos en este informe señalan que la reactividad observada con los antígenos leprosos no estaba asociada con las crio- proteínas. Aunque hubo una reducción evi- dente de la reactividad de la prueba VDRL en lamina (compárese el cuadro 1 con el cuadro 4), tal como la obtuvieron en este laboratorio, en comparación con los resul- tados en Carville, la reactividad con los antígenos leprosos se mantuvo elevada a pesar de que las muestras habían estado en estudio durante cuatro meses y se habían liltrado para eliminar partículas.
Las propiedades de la prueba en tarjeta pueden señalar su utilidad para trabajar en las condiciones de campo y consultorio, especialmente en zonas remotas de países en vías de desarrollo, donde más se necesitan. Aunque concierne a estudios ulteriores deter- minar si la sensibilidad de la prueba en tar- jeta para el diagnóstico de la lepra es sufi- ciente o no, la observación de títulos bastante altos en cuatro de cinco casos lepromatosos que no indicaron reacción a Ia prueba VDRL en lamina, y en uno de siete casos de tipo dimorfo, es alentadora.
Resumen
Aunque no hay prueba serológica para el diagnóstico de la lepra, se han observado reacciones positivas a pruebas serológicas de Ia sííihs en Ia forma lepromatosa de la lepra, y se ha indicado que la prueba rápida de reagina en plasma (RRP), que ha mos- trado ser práctica y eficaz para el diag- nóstico de la sífilis tanto sobre el terreno como en el consultorio, pueda aplicarse a la lepra. Se exponen algunas observaciones que parecen confirmarlo.
Este trabajo proporciona valiosos datos sobre la elaboración de pruebas en tarjeta para el diagnóstico de Ia lepra, tanto sobre el terreno como en gran escala.
Se obtuvieron soluciones de antígenos que contenían cardiolipma, lecitina y colesterol. La suspensión de antígenos siguió un método similar al empleado en Ia prueba RRP, co- menzando por un proceso parecido al de la prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) , centrifugando después las suspensiones a 2,000 veces la fuerza de gra- vedad y volviendo a suspender 10s sedimen- tos en un volumen de Iíquido de idéntica suspensión y compuesta de sal disódica, solución salina amortiguada con fosfato y suspensión acuosa de carbón vegetal.
Se llevaron a cabo, pruebas en tarjeta en círcuIos de 18 y 14 mm, extendiendo suero sobre una tarjeta revestida de pIastic y agregándosele la suspensión de antígeno con carbón vegetal. Se empleó máquina rotatoria en el círculo de 18 mm; en el método de lágrima en superhcie, balanceo manual.
De las pruebas efectuadas con sueros de enfermos de sífilis y de lepra, parece despren- derse que las suspensiones de antígenos que contienen cardiolipina y lecitina en propor- ciones de 1: 1 a 2: 1 ofrecen buenas perspecti- vas para el diagnóstico de la lepra. Cl
REFERENCIAS
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254 BOLETÍN DE LA OFICINA SANITARIA PANAMERICANA - Marzo 1967
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Card Tests for Leprosy (Summary)
Although there is no serological test for the lecithin, and cholesterol were compounded. In diagnosis of leprosy, it has been observed that
positive reactions to serological tests for syphilis preparing was essentially the antigen solutions similar to that employed the method used in pre- occur to a fairly high degree in the lepromatous
form of the disease. This suggested the possi- paring antigen suspension for the RPR card bility that che rapid plasma reagin (RPR) test, test. The first step is similar to that used in whose effectiveness in the field and under clinic preparing the VDRL test suspension. The anti- conditions has been confirmed, might be em- gen suspensions were then centrifuged at 2,000 ployed for leprosy. times the forte of gravity, and the sediments
This article contains some observations which were resuspended in a volume of suspending appear to conflrm this possibility, and furnishes fluid equal to that of the suspension centrifuged data pertaining to the development of card tests and consisting of disodium Salt, phosphate buf- for leprosy both for field use and for large-scale fered saline, and aqueous charcoal suspension. testing. Leprosy tests were then carried out with 18
Portnoy * PRUEBAS EN TARJETA PARA LA LEPRA 255
spread on the plastic coated card and antigen Tests carried out on the serum of patients
suspension containing charcoaL was added. suffering from syphilis and leprosy indicate that
Wben 18 mm cards were used a mechanical antigen suspensions containing a ratio of Car-
rotator was used for rotation. When tbe tear- diolipin to lecithin of 1: 1 up to a ratio of drop surface was used, hand-rocking was em- cardiolipin to lecithin of 2: 1, offer good pros-
ployed. pects for the detection of leprosy.
Provas em Cartão para a Lepra (Resumo) Embora náo exista prova sorológica para o
diagnóstico da Iepra, observaran+se reacóes positivas a provas sorológicas da sífilis na forma lepromatosa da lepra e indicou-se que talvez a prova rápida de reagina em plasma (RRP) , que se demonstrou prática e eficaz para o diagnóstico da sífilis tanto no campo como no laboratório, possa aplicar-se à lepra. Expóem- se algumas observacóes que parecem confirmá-
10.
Esse trabalho proporciona valiosos dados sobre a realizacáo de provas em cartáo para o diagnóstico da lepra, tanto no campo como em grande escala.
Obtiveram-se solucóes de antígenos que con- tinham cardiolipina, lecitina e colesterol. A suspensáo de antígenos obedeceu a um método semelhante ao empregado na prova RRP, inici- ando-se por um processo parecido ao da prova VDRL (Venereal Disease Research Labora-
tory) , centrifugando-se depois as suspensóes a 2,000 vezes a fôrca de gravidade e voltando- se a suspender os sedimentos num volume de líquido de idêntica suspensáo e composto de sal dissódico, solucáo salina tamponada com fos- fato e suspensáo aquosa de carváo vegetal.
Fizeram-se provas em cartóes de círculos de 18 e 14 mm estendendo-se soro sobre um cartáo revestido de plástico e juntando-se-lhe a sus- pensáo de antígeno com carváo vegetal. Se empregou máquina rotativa no círculo de 18 mm; no método de gota em superfície, agitacáo manual.
Das provas efetuadas com soros de pacientes de sífilis e de lepra, parece deduzir-se que as suspensóes de antígenos que contêm cardio- lipina e lecitina em proporcóes de 1 :l a 2:l oferecem boas perspectivas para o diagnóstico da lepra.
tipreuves sur carte pour le diagnostic de la Ièpre (Résumé) Bien qu’il n’existe pas d’épreuve sérologique
pour le diagnostic de la lèpre, on a constaté des réactions positives aux tests sérologiques de la syphilis dans les formes Iépromateuses de la lèpre, et on a envisagé la possibilité que l’épreuve rapide des réagines dans le plasma (RRP) qui s’est révélée pratique et efficace pour le diagnostic de la syphilis, tant sur le terrain qu’au dispensaire, pourrait également s’appli- quer à la Ièpre. L’auteur présente certaines ob- servations qui semblent confirmer cette possi- bilité.
Cette étude fournit des données précieuses sur I’élaboration des épreuves sur carte pour le diagnostic de la lèpre, tant sur le terrain que pour celles effectuées sur une grande échelle.
On a obtenu des solutions d’antigènes renfer- mant de la cardiolipine, de la lécithine et du cholestérol. Pour la suspension d’antigènes on a suivi une méthode analogue à celle qui est employée dans l’épreuve RRP. La Premiere opération est analogue à l’épreuve VDRL (Ve- nereal Disease Research Laboratory) . Les sus-
pensions d’antigènes étaient ensuite centrifugées à 2,000 fois la forte de gravité et les sédiments ont fait l’objet d’une nouvelle opération de
suspension dans un volume de liquide en SUS-
pension égal à la suspension centrifugée com- posée de sel bisodique, de solution saline en présence d’une solution tampon de phosphate, et d’une suspension aqueuse de charbon végétal. On a ensuite effectué épreuves sur carte en utilisant les cercles de 18 èt 14 mm, en étalant le sérum sur une carte recouverte de matière plastique et en ajoutant à la suspension d’anti- genes du charbon végétal. On a employé un mécanisme rotatoire pour le cercle de 18 mm; pour la méthode de la larme en superficie, l’agi- tation manuelle.
