DR. HECTOR G. ARAMBURUZ El campo de la fiebre aftosa no ha sido
4 precisamente uno de los más fértiles en la investigación, a pesar de haber sido su agente etiológico el primero de los virus filtrables caracterizado como tal en 1897 por Loeffler y Frosch (l), en investigaciones memorables. Con esto quedó cerrada para c siempre la era del wntagium vivum @idu
para dejar paso a otra, no mucho menos oscura pero de explicaciones e hipótesis más aceptables para la razón humana.
Tratamos de pasar revista a todo lo ocurrido en el capftulo de la tipificación ti del virus aftoso y en este caso hemos de
actuar en gran medida como epistemólogos de los trabajos de los colegas de todo el mundo, quienes hicieron posible que se llegase a un grado de adelanto que permite la interpretación de gran número de hechos y el análisis de ciertos aspectos, no sólo del virus mismo, sino de la enfermedad tal cual 4 ocurre en su huésped natural.
c
En los últimos 15 años, es decir, casi ayer, se produjeron los más decisivos avances de nuestro conocimiento de la naturaleza y particularidades de este virus causante de una de las más terribles plagas del ganado. Esto fué posible, no sólo a consecuencia de los fundamentos ofrecidos por trabajos anteriores o a los portentosos adelantos de otras disciplinas, sino también al estallido de las dos guerras mundiales más devasta- doras de la edad contemporánea, que causa- .
ron un hambre de proteínas que está muy lejos de ser satisfecha, así como también al desarrollo de nuevas áreas y a la elevación del nivel de vida de colectividades de lenta evolu- ción. Por estos tristes motivos las ciencias veterinarias entraron así de lleno en el 1
campo de la economía, y el médico veteri- nario está hoy, salvo excepciones de la
* Trabajo presentado en el II Congreso Pana- mericano de Medicina Veterinaria, celebrado en São Paulo, Brasil, del 3 al 10 de abril de 1954.
2 Laboratorios Lauda, S. A., Argentina.
práctica de la profesión, dedicado de lleno a trabajar en la esfera económica.
Mucho falta aún por conocer en cuanto se refiere a conocimientos básicos, pero estamos echando los cimientos sobre los cuales han de edificar con más seguridad los investiga- dores futuros y es indudable que se han llenado muy importantes vacíos en los últi- mos 15 años. El camino es largo, pero el premio es tentador.
Hace ya tiempo que nadie duda que la fiebre aftosa es un problema internacional y los veterinarios son los que más arraigada tienen dicha idea. Piensan además que debe ser combatida, con una amplitud de medios de que hoy se carece, en todas partes del mundo sin excepción, pues la existencia de la enfermedad en un lugar es una amenaza más o menos directa para todos los países. En este punto se ha llegado a un acuerdo muy amplio y solo cabe lamentar que no todos los órganos directivos oficiales estén dis- puestos a traducir sus convicciones en medidas enérgicas y acertadas para llegar, por lo menos, al control de esta plaga como primera medida hacia su total extinción. Las epizootias que han azotado a Europa en los últimos 15 años, a pesar de las enér- gicas medidas de policía sanitaria veteri- naria, la aparición de la enfermedad en algunos países de las Américas, considerados hasta hace poco como indemnes a la misma, como México, Venezuela y Colombia, y la instalación de focos en Canadá, Jersey y Guernsey, sin contar con la presencia de la enfermedad en el hemisferio oriental y occidental en forma enzoótica, hacen peren- torio el establecimiento de una firme polftica defensivo-ofensiva a fin de salva- guardar los verdaderos depósitos de carne del mundo.
ser el organismo encargado de canalizar los esfuerzos tendientes á terminar con la fiebre aftosa, basándose en las investiga- ciones hechas en un laboratorio de corte internacional, del cual el actual laboratorio Panamericano de la Fiebre Aftosa, instalado en Brasil, constituiría un laboratorio-piloto.
La especial contagiosidad y propagación de la fiebre aftosa no ~610 está favorecida por su amplia gama de huéspedes, sino también por la existencia de varios tipos de virus que son capaces de sostener la infección y vencer la resistencia relativamente pobre que se manifiesta en los casos que sobreviven a la enfermedad. A ello debe sumarse la existen- cia de ciertas cepas de virus dentro de los tipos tradicionales 0, A y C, a las que llamaron variantes Trautwein (2), y Traut- wein y Reppin (3) ; hoy día se conocen 3 del tipo 0; 7, del tipo A, y 2 del tipo C, sin que haya perspectivas de que su número haya sido agotado. A dichas variantes debemos sumar ciertas cepas de virus procedentes de Africa del Sur, que vienen siendo estudiadas desde hace tiempo en Dinamarca (4) e Inglaterra (5, 6), y que son, según los últimos informes, inmunológica y serológica- mente distintas de los tipos representativos. Ello no viene, ciertamente, a aclarar el cuadro etiopatogénico de la fiebre aftosa, ,y no sabemos qué importancia pueden tener en el futuro, ni si son productos autóctonos o formas nuevas y resistentes del virus. El problema de las variantes no se resolverá demasiado pronto, a juzgar por los conceptos anteriores; la capacidad de los virus para cambiar sus características es de la mayor significación en la práctica, y se manifiesta en procesos de mutación y selección, dos aspectos fundamentales de los seres vivos.
Por lo que se refiere a las variantes, al- gunos autores han destacado la analogía entre el virus de la fiebre aftosa y el de la influenza humana, pues en el caso de esta enfermedad, los higienistas encuentran en ellas uno de los escollos para llegar a esta- blecer buenas medidas de prevención activa. Pero en el caso de la aftosa tenemos la impresión de que la situación no es análoga
en manera alguna frente al mismo problema, ya que se cuenta con la ventaja, que, paradójicamente, se convierte en nuestro mayor obstáculo, de poder producir “a piacere” el padecimiento en su huésped natural, con mínimas deformaciones bio- lógicas y con muestras de virus que no han sufrido mayores manipulaciones que lo alejen de sus características primigenias, sin contar que es allí, en el huésped natural, donde se realizarán las pruebas definitivas de protección, de un medio preventivo o curativo dado, frente a la agresión de un virus conocido; todo ello en condiciones de verdadero rigor científico.
Tal vez sea apropiado afirmar ahora, sin desautorizar, en su verdadero sentido, todas las investigaciones previas, que en materia de fiebre aftosa recién estamos entrando en la era cuantitativa, tras un prolongado lapso de índole cualitativa; las implicaciones de tal hecho son mucho más profundas de lo que parece 51 primera vista, puesto que si se está en condiciones de valorar cuantitativa- mente un fenómeno biológico, se estará más cerca de su comprensión total. Hoy estamos ya en condiciones de medir muchas características, tanto de la enfermedad como del virus mismo o de su acción, sea in vivo o in vitre. En materia de fiebre aftosa el apartarse de lo subjetivo a favor de realiza- ciones objetivas, marcará sin duda, uno de los más grandes avances en la investigación de esta enfermedad; en este sentido nuestros colegas ingleses han señalado el camino que debe recorrerse.
imperiosa cuando Saldmann y Trautwein (8) descubrieron en 1926 un tercer tipo de virus, distinto desde el punto de vista inmunológico de los tipos 0 y A, y al que llamaron C.
La conducta epizootiológica de la infec- ción aftosa, que por muchos años fue oscura (ya que de Jerónimo Fracastoro (1483- 1553) proviene la primera información acerca de una enfermedad que no puede ser otra que la fiebre aftosa) se presentó enton- ces bajo una luz que, si bien resolvía varias incógnitas, planteaba nuevos y no menos arduos problemas. Se tornó imprescindible poder identificar los distintos causantes de la fiebre aftosa, no ~610 por la determinación del tipo de una infección dada, sino también por la necesidad de mantener cepas puras destinadas a la preparación de productos inmunizantes, amén de la no menos im- portante necesidad de poder seguir la trayectoria del virus en la naturaleza.
Puede decirse que en los años que siguieron al esclarecimiento de la pluralidad del virus aftoso, se produjo un principio de anarquía en cuanto se refiere a denominación de cepas, ya que, a falta de apropiados sistemas de comparación o tipificación, las distintas muestras de virus estudiadas por diferentes investigadores, se bautizaban comúnmente, o por el lugar de su recolección o por otras consideraciones no más exactas y con frecuencia, menos indicadoras de sus caracte- rísticas. Sin embargo, con el correr de los años, la situación se clarificó y hoy estamos a este respecto de la taxonomía del virus aftoso perfectamente en claro en cuanto concierne a la denominación de los tipos principales como 0, A y C, y con un pro- blema de 12 variantes y nuevos tipos de virus, ambos aparentemente consolidados, pero que introducen dentro del problema general de la taxonomía, un elemento de desconcierto que la dan una fisonomía incierta.
Es indudable que no se ha alcanzado aún el estado de equilibrio y no parece que se pueda alcanzar. Ahora, si se siguen las ideas de Burnet, las cuales parecen acertadas,
se puede observar que se ha ido estableciendo una tolerancia virus-huésped que no augura nada bueno para el futuro de la fiebre aftosa tal como ahora se conoce en sus manifestaciones clííco-epizootiológicas.
La correcta caracterización del virus aftoso es hoy una ineludible necesidad tanto de orden científico como de orden industrial y práctico, y no es necesario añadir mayores detalles para sustentar dicha necesidad, que no ~610 atañe al virus de la fiebre aftosa misma, sino a otros virus capaces de pro- ducir una infección clinicamente indistin- guible de la fiebre aftosa o que, por lo menos, causan en huéspedes susceptibles a ella lesiones generalmente vesiculosas y a veces vesico-pustulosas, de diagnóstico diferencial no siempre fácil. Con ello queremos re- ferirnos tanto a la estomatitis vesicular equina como al exantema vesicular del cerdo, y aún, con ciertas salvedades, al ectima contagioso del ovino. No es sola- mente el laboratorio de investigaciones o de producción el que reclama hoy métodos seguros, rápidos y reproducibles de diag- nóstico, sino que esta necesidad es especial- mente sentida en el campo de la policía sanitaria veterinaria, nacional e interna- cional; aquí una demora de pocos días puede significar la diferencia entre el control 0 el desastre. Han sido pues estas presiones las que nos han llevado a un estado tal en que podemos gozar de una cierta seguridad diagnóstica, sin que nos lleve a “dormir sur les deux oreilles”.
Trataremos de hacer, pues, la historia de los métodos de diagnóstico o tipificación del virus aftoso, a manera de introducción, pero antes diremos que los métodos ultilizados para la diferenciación de los tipos fueron varios, o mejor dicho, que se han seguido para diferenciarlos distintos procedimientos con mayor 0 menor éxito.
inmunidad cruzada desarrolladas inicial- mente por Valée y Carré (7) en bovinos, y que luego se aplicaron al cobayo, conquista que se debe a la escuela alemana de Riems (9). Veremos más adelante las particulari- dades del método.
Debemos citar entre los métodos puros in vivo la prueba de protección en cobayos, descrita por Waldmann y Pape (9) y destinada inicialmente a la valorización de sueros terapéuticos aprovechando la capa- cidad que tienen de proteger al cobayo de una infección generalizada con un tipo homólogo de virus.
Junto a los medios in vivo puros y par- ticipando parcialmente de algunas de sus características, encontramos un método, desarrollado por Frenkel en 1949 (lo), que utiliza tejidos vivos de lengua bovina in vitro.
Entre los medios mixtos in vivo-in vitre, citaremos las pruebas de neutralización, previstas ya por Loeffler y Frosch (1) en su clásico trabajo de 1897, en que anunciaban la facultad del virus aftoso de pasar los filtros bacterianos, y que fueron amplia- mente estudiadas por Bedson, Maitland y Burbury (ll).
Nos quedan ahora por citar las pruebas in vitro puras, que son las que han pagado más altos dividendos a la investigación, debido quizá a la persistencia con que se ha seguido esta lfnea al valorar los poco consistentes resultados obtenidos con los otros métodos. Hallamos aquí las pruebas de: reacción meiostágmica; aglutinación; pre- cipitación; conglutinación; hemoaglutina- ción; fijación del complemento e inhibición de la fijación del complemento.
De todos los métodos enunciados, pocos han conseguido afianzarse por su seguridad en la determinación, y desde ahora podemos decir que han subsistido los métodos in
vivo puros, o sean las pruebas de inmunidad
cruzada, en sentido directo e inverso, en apropiadas especies animales y la prueba de la fijación del complemento. De las demás pruebas sólo algunas de ellas, la sero-neutralización y las de protección tienen
algún valor; del resto diremos que no se han popularizado, debido quizás a artificios de técnica muy especiales o a sus pocas condiciones para reproducirlas.
Las pruebas de inmunidad cruzada en bovinos y cobayos han resistido bien los embates del tiempo, y consisten en la inmunización previa, por un ataque experi- mental, con un tipo dado y la prueba de su resistencia, o no en el caso heterólogo, frente a otro ataque experimental de otro tipo. Tenemos en esta prueba las ventajas de poder estudiar el desarrollo de la misma en su huésped natural, sin mayor interferencia biológica, y de gran sensibilidad o de poder utilizar animales de laboratorio, como el cobayo, que reaccionan de una manera típica a la aftosa y también de gran sensi- bilidad, aunque ésta, condicionada, como pronto veremos.
Sus desventajas son consecuencia del largo plazo que media entre la enfermedad y la curación de los animales de experiencia, del costo de los mismos, de la posible, y de hecho muy frecuente, falta de adaptación de muestras de virus aftoso de origen bovino al cobayo, de que el bovino y el cerdo no siempre enferman de un segundo ataque, aunque sea heterólogo, como lo prueban las investigaciones de Trautwein (12), que confirman la formación de anticuerpos protectores heterólogos, y de la imposibilidad de obtener una reacción de amplio espectro. Con esto se quiere aludir a la imposibilidad que tienen ciertas muestras de virus, no puras en su tipo o de composici6n antigénica compleja en cuanto al tipo, de manifestar en forma patogénica la presencia de débiles componentes antigénicos y que quedan oscurecidas por la reacción de la componente más fuerte o más hábil para reproducirse.
r
van a dar también muy importantes datos acerca de las características de agresividad de una muestra de virus y que pueden ser fundamentales en la elaboración de planes de lucha. Es interesante hacer notar aquí que, a Michelsen y Schjerning Thiesen (4), en el estudio de una muestra de virus aftoso procedente de Venezuela, sólo les dió una respuesta concreta la prueba de inmunidad cruzada en bovinos.
Negri en 1939 (13) introduce la modifica- ción de inmunizar previamente los cobayos con una vacuna de tipo Vallée-Schmidt- Waldmann, de tipo homólogo, antes de inmunizarlos con las cepas de estricta adaptación, con el objeto de reducir el índice de mortalidad, que puede llegar al 100 %.
La prueba de protección en bovinos y cobayos puede servir igualmente para la clasificación de una muestra de virus, y consiste, como su nombre lo dice, en la protección de dichos animales de experiencia por medio de un suero homólogo que impida la infección, en caso de que haya correspon- dencia de tipo, por la cepa en examen. Iniciada originalmente por Waldmann y Pape (9) para la estimación del valor pro- tector de sueros antiaftosos inmunes e hiperinmunes, posee las dificultades que se derivan de la adaptación de cepas; necesidad de que las muestras de examen sean segura- mente infecciosas; obtención de sueros protectores de alto valor y la mortalidad de cobayos por acción tóxica del suero bovino, que demostraron Michelsen y Johnson (14).
Nosotros hemos utilizado la prueba de protección en ratones y ratas lactantes, y pudimos observar que si bien es posible, en algunos casos, llegar a una determinación del tipo en materiales enviados desde la campaña, la prueba no resulta práctica debido a que dichas muestras, generalmente con poco contenido de virus, producen la muerte en el mejor de los casos, ya que falta adaptación, a las 90 y hasta 120 horas; vale decir, que tanto en el grupo homólogo como en los heterólogos puede no haber muertes; no
hay, por supuesto, indicación de presencia de débiles componentes antigénicos.
Frenkel, de Holanda (lo), en el trans- curso de sus renombrados trabajos acerca del cultivo del virus aftoso en tejidos de lengua mentenidos vivos en medios nutritivos especiales, pudo observar la presencia de lesiones histopatológicas, representadas por una necrobiosis colicuativa de elementos celulares del estrato espinoso, con poca participación del germinativo, en aquellos explantes de tejido expuestos a la acción de cualquiera de los tres tipos del virus aftoso. Su método consiste en proceder al cultivo según sus indicaciones, substituyendo el suero normal del líquido de Baker por suero bovino inmune de los tres tipos, 0, A y C; la muestra de virus que se quiere clasificar, se agrega a cada uno de los tres frascos que contienen los diferentes sueros y se puede observar la presencia de las antedichas alteraciones histopatológicas después de 24 horas de incubación o cultivo. La prueba que, por otra parte, nos parece académica- mente exacta y capaz de dar una respuesta total, no creemos que pueda proporcionar datos acerca de la composición antigénica de la muestra en examen; parece igualmente, que su practicabilidad es limitada debido a las múltiples condiciones que rigen el cultivo de tejidos y virus. Por lo demás el tipo de alteraciones que imprime a los tejidos no es característica esencial del virus aftoso en ninguno de sus tres tipos. Quizás sea apropiado citar aquí que el estudio intensivo de las alteraciones histo- patológicas de la fiebre aftosa experimental en el ratón lactante, no nos ha proporcionado ningún elemento patognomónico ni en cuanto al tipo ni en cuanto a la enfermedad misma.
ron en práctica una prueba en la que utiliza- ban cobayos; pudieron observar la falta de neutralización cruzada entre sueros y virus de diferentes tipos, y en el examen de 2 cepas de igual tipo pudieron observar que la neu- tralización era mayor en una de ellas que en la otra.
Los errores de esta prueba son lo suficien- temente grandes como para que haya quedado relegada y no haya sido estudiada cuidadosamente. Entre los factores que deciden el éxito de la prueba podemos mencionar que la inactivación es frecuente- mente un fenómeno reversible; la ruta de inoculación convierte en no inactivada a una muestra que resulta serlo por otra vía; que las relaciones entre el virus y el suero no son de múltiples proporciones, y, final- mente, el punto crítico está dado por el cálculo de la dosis de virus y título de la neutralización. Brooksby ha hecho un detenido estudio (15) de esta prueba con respecto a la medición de anticuerpos de la fiebre aftosa, introduciendo el método de in- oculación múltiple intralingual de Henderson (16). Pudo así estudiar las diferencias entre cepas procedentes de México (17) por medio de pruebas de neutralización cruzada.
Cumplidas las necesidades expresadas no habría inconveniente en usar este método para la caracterización de cepas de virus aftoso, pero creemos que su practicabilidad queda invalidada cuando se considera la necesidad de hacer una rigurosa titulación previa del virus, de seguir una muy cuida- dosa t6cnica y de utilizar animales de labora- torio de reconocida sensibilidad. Su utilidad está probada sólo cuando se la usa en com- binación con pruebas de inmunidad cruzada, fijaciún del complemento y vacunación.
Es en el campo de la pruebas in vitre donde se han producido los más decididos avances en la taxonomía de las muestras de virus aftoso. Se puede decir que en el estudio de las reacciones serológicas se fundan los más recientes conocimientos de los virus filtrables y que sin ellos dicho avance hubiera sido imposible. Las más recientes
investigaciones han mostrado que las características serológicas de los virus filtrables, utilizando esta denominación con las apropiadas limitaciones, son práctica- mente análogas a las de las bacterias y rickettsias, y se ha podido comprobar que muchos fenómenos serológicos bacterianos, tales como la aglutinación, conglutinación, precipitación, neutralizaciijn y fijación del complemento se cumplen asimismo en el campo de los virus y rickettsias. Las téc- nicas en sí mismas, no han sufrido modi- ficaciones capitales, estando éstas en general relacionadas con la preparación del antígeno, el cual por su exigencia de cultivarse ~610 en presencia de células vivas, no se puede obtener puro, sino en forma excepcional o con técnicas refinadas o fuera del alcance común. Los fracasos iniciales de algunas de las pruebas que revisaremos están estrecha- mente ligados a este punto, al cual debe agregarse el hecho de que el virus de la aftosa, por su tamaño de partícula, debe estar presente, en forma del antfgeno apropiado, en gran cantidad o título, para de esta manera poder ofrecer una buena masa antigénica reaccionante, sin cuya presencia la reacción sería negativa 0 muy dudosa. Tiene también gran importancia el hecho de que los virus poseen una organiza- ción o arquitectura qufmica menos compleja que los microorganismos bacterianos. Otro punto que ha influído con no menos intensi- dad fué la concentración de anticuerpos, la especie de la cual proviene el antisuero y la especificidad del mismo, vale decir su total integración por proteínas séricas absoluta y totalmente especfficas hacia un tipo de virus aftoso dado.
Sichert Modrow, en 1929 (18), durante el curso de experimentos de ultrafiltración con membranas de colodion, pudo observar que el tipo 0 tenfa 20 milimicras de tamaño de partícula, mientras que los tipos A y C, eran de diámetro netamente superior, diferencia que, según el autor, permitiría distinguirlos. Sin embargo, investigaciones posteriores dirigidas por Calloway y Elford en 1931 (19) con membranas ultrafiltrantes
perfectamente reconocibles en cuanto al tamaño del poro, mostraron que el tamaño de la partfcula es igual en los tres tipos de virus, observaciones que fueron posterior- mente confirmadas. Los resultados de Modrow no pudieron, pues, ser corroborados de manera que el método no pasó de un ensayo infructuoso; de haberlo sido tendría el inconveniente de ser un delicado proceso de laboratorio y que requeriría además, la ultización de animales indicadores, de preferencia inmunizados previamente.
En 1910, Ascoli (20), es decir mucho antes del conocimiento de la pluralidad del virus aftoso, anunció la posibilidad de deferenciar sueros bovinos normales de sueros bovinos convalecientes por medio de la reacción meiostágmica, la que se basa en el descenso de la tensión superficial de una mezcla suero inmune-virus de otra de suero normal-virus. Esta prueba no se difundió y no aparecen comunicaciones acerca de su confirmación; por lo demás se comprende que no estaba dirigida a la diferenciación de tipos ya que no se sospechaba la existen- cia de éstos en aquella época.
Frenkel en 1937 (21) anunció la aglutina- bilidad del virus de la fiebre aftosa, adsor- bido a partículas de colodion, caohn, alu- minio y carbón, pero consignaba, al mismo tiempo, la inhabilidad de esta prueba para la diferenciación de tipos; ~610 serviría para el diagnóstico de fiebre aftosa. Sin embargo, la prueba no tuvo mayor trascendencia.
Doronin y Kindyakov comunicaron en 1940 (22) la precipitación del virus aftoso por medio de un suero preparado en el conejo, que contema precipitinas espec@cas y obtenido a partir de suspensiones virulen- tas purificadas, pero que retenían su carácter antigénico. A pesar de su anuncio de la preparación de un suero precipitante especí- fico de los tres tipos del virus aftoso y que serviría, por lo tanto, para la determinación, no sabemos hasta ahora que haya comunica- ción de sus resultados; desde un punto de vista eminentemente práctico nos parece que la precipitación podría ser uno de los méto- dos más rápidos y sencillos de identificación.
Es una línea que merece ser estudiada a fondo.
La prueba de la conglutinación fué propuesta en 1943 por Solovieff (23) después del examen de 1329 sueros de bovinos, cerdos, cobayos, caballos, conejos y ovejas, algunos de los cuales eran normales, otros convalecientes y otros hiperinmunizados. El autor indica haber tenido menos reacciones dudosas que con la fijación del complemento. Sin embargo, la prueba no se ha difundido mayormente, quizás porque el complemento de cobayo en la prueba de la fijación del complemento se adsorbe mejor al sistema inmune que el complemento de caballo en la conglutinación. Es interesante citar aquí que Forrest (24), nos informa que trabajando sobre 20 sueros bovinos, inmunes e hiperin- munes, no pudo demostrar la presencia de anticuerpos, los que, sin embargo, fueron comprobados, y a alto título en algunos casos, en pruebas de protección en cobayos. Concluye diciendo que, en sus manos, la reacción de conglutinación no dió resultado alguno y que en todo caso la prueba sería dependiente de un sistema de diagnóstico previo de tipo para los antígenos de prueba.
adaptación o por insuficiencia de virus activo infeccioso en la muestra.
Con respecto a la prueba de la fijación del complemento y a sus antecedentes bibliográficos se debe considerar que las primeras investigaciones estuvieron dirigidas a la búsqueda de la sensibilizatriz específica en el suero de bovinos y cerdos recobrados de un ataque natural de la enfermedad, la que fu6 demostrada por primera vez por Lourens en 1909 (26), confirmándose poste- riormente la posibilidad de la reacción de fijación del complemento por Favero (27), Knapp (28), Tietze (29), Urbain (30), y Sachelaire, Boquet y Urbain (31). Es intere- sante hacer notar aquí que los trabajos de Ascoli (20), Ernst (32), Mezincescu, Baroni y Calinescu (33), Waldmann y Trautwein (34), Olitsky (35), Minett (36), Olitsky, Traum y Schoening (37) y Flaum (38), no consiguieron confirmar los trabajos previamente citados y, en general, negaron cualquier valor diagnóstico a la prueba. Es muy probable que ello se haya debido a las diferentes técnicas seguidas, si se tiene en cuenta la comprobada reproductibilidad de la prueba; es igualmente probable que los antígenos y los antisueros no hayan sido los más apropiados.
En 1929 Ciuca (39), trabajando en el Lister Institute, pudo diferenciar los tipos de virus de la fiebre aftosa trabajando con antígenos y antisueros de cobayo. Sin embargo, estos resultados, puestos a prueba por Trautwein y Reppin (40) y por Flaum (3%) no pudieron ser confirmados, pero fueron sancionados por las investigaciones dirigidas por Sakwarelidse (41), Helm (42), Galea (43), Krag y Schmidt (44), Banyo y Olah (45) y Reyn (46).
Sin embargo, hasta 1943 la fijación del complemento no entra en su verdadera fase práctica, ya que los trabajos de Traub y Mohlmann (47) y de Traub y Manso Rodríguez (48) fijaron con toda exactitud las condiciones de la prueba, permitiendo con ello su uso rutinario en el examen de muestras de virus aftoso, tras abandonar el cobayo y más tarde el bovino como sujetos
proveedores de virus, para el caso de ma- teriales de la campaña que al ser recibidos por el laboratorio eran pasados por dichos animales para la obtención del antígeno de prueba. Los autores citados fijaron una
técnica que aún hoy, salvo modificaciones >’ menores, es la que comúnmente emplean
todos los servicios de tipificación serológica. Las comunicaciones de Traub y Mohlmann (47) fueron ampliamente confirmadas por las de Strozzi (49), Rodríguez, Prado y Palacios (50), Silva Araujo (51), hramburu
(52), Segre (53), Ubertini (54), Michelsen (55), Brooksby (5) y Manso (5G), y hoy la fijación del complemento ha sido ya defini- tivamente incorporada a la investigación y a la industria habiendo recibido su más definitiva sanción en la investigación del tipo en materiales procedentes de focos de la enfermedad. Hoy la adopción de medidas tendientes a controlar una epizootia, sobre todo si ocurre en un pafs hasta ese momento indemne a la plaga, requiere, simultánea- mente con la adopción de las clásicas medi- das de policía veterinaria, una exacta y rápida determinación del tipo, y estas dos condiciones ~610 pueden ser cumplidas por la fijación del complemento.
La técnica de su realización es ya bien conocida y los autores que confirmaron su utilidad y que hemos aludido rápidamente, la han llevado a un alto grado de seguridad. Parece ocioso, por lo tanto, insistir sobre este punto. Nos dedicaremos pues a discutir algunos de sus aspectos, su valor en la determinación de tipos y variantes, sus limitaciones y su utilidad en el diagnóstico diferencial de algunas enfermedades cuya sintomatología clínica las confunde en algunos casos con la fiebre aftosa y cuya significación epizootiológica es muy distinta de ésta.
Las investigaciones de Rodríguez, Prado y Palacios (50), Federer y Aramburu
y que permiten el diagnóstico retrospectivo del tipo de tius cuando no existen apropia- dos epitelios aftosos a disposición, y han puesto a punto una técnica que permite la obtención de antfgenos desprovistos de molestas acciones anticomplementarias, de rápida obtención y que en las investiga- ciones de rutina pueden ser utilizados sin inactivación térmica, lo que acorta el tiempo de investigación y diagnóstico.
Al igual que ocurre con otros sistemas infecciosos, el antígeno fijador del comple- mento es mucho más estable que el causante de la actividad infecciosa, pero no se conoce aun su exacta naturaleza, si bien sabemos ya que la actividad fijadora del complemento no es privativa de dicho antígeno, sino que el infeccioso es copartícipe de dicha función, si bien en mucha menor escala. Muestras de virus conservadas por muchos años, a temperatura y medio apropiados, pierden casi totalmente su poder infeccioso, pero conservan en gran parte su capacidad fijadora (58).
La utilización del suero de bovinos que han pasado la enfermedad ha sido, desde las primeras investigaciones serológicas, el ver- dadero sueño de los investigadores en el campo serológico de la fiebre aftosa, no sólo desde el punto de vista de la determinación del tipo de una infección pasada, sino tam- bién con vistas a la posible medición de los anticuerpos desarrollados a consecuencia de una infección experimental o de un proceso inmunizante. Los resultados de tales pruebas han sido siempre contradictorios debido al alto poder anticomplementario del suero bovino, y ni aún en el caso de sueros bovinos hiperinmunes se pudieron obtener resultados consistentes.
Frederiks en 1949 (62) demostró con sueros bovinos crudos, la presencia de la sensibiliza- triz específica en bovinos convalecientes de un ataque experimental del tipo 0, pero sus resultados no tuvieron confirmación y Brooksby (15), tras ensayos infructuosos, expresó que “era claro que debían solucio- narse considerables dificultades antes de la aplicación de la fijacíon del complemento al
estudio de los anticuerpos en el suero bo- vino”.
Sin embargo, los trabajos de Serra y Gua- rini (63), no sólo informan de la posibilidad de probar la presencia de anticuerpos fijadores, en el suero bovino, lo que ya Brooksby (5) comunicó, sino la de obtener sueros fijadores hiperinmunes de bovino de un excelente título, ya que es de 1/60 en el 0; 1/90 en el A, y 1/70 en el tipo C, todo ello mediante la descomplementación quí- mica de los sueros, trabajando con mayores concentraciones de sal con la solución hipertónica de cloruro de sodio al 1,5 %. Hemos tenido oportunidad de utilizar dicha técnica y nuestros resultados son en un todo concordantes con los de los autores italianos.
Recientemente Rice y Brooksby (64), utilizando la prueba indirecta de la fijación del complemento, demostraron una definida inhibición en 30 de 34 muestras de sueros procedentes de bovinos de una granja donde se supone comenzó el brote canadiense, y en el suero de 4 bovinos infectados experimental- mente con la cepa causante de dicho brote. Los resultados indican que tal tipo de prueba merece ser estudiado, pues se abre un panorama interesante y que ha de permitir, entre otras aplicaciones, la medición de anticuerpos íFn vitre, lo que puede llevar a la valoración de productos inmunizantes y al es- tablecimiento de patrones de comparación.
Entre nosotros Aramendi (65) consiguió obtener del caballo, induciendo en él una verdadera enfermedad humoral, sueros fija- dores del complemento con títulos de 1/20 del 0; de l/lO del A, y de 1/40 del C, los cuales, si bien no son lo suficientemente activos, por su contenido de anticuerpos amplían las posibilidades de obtención de sueros fijadores y nos liberan, siquiera en parte, del cobayo como fuente de dicho elemento fundamental.
lleva a fijaciones inespecfficas. Estamos de acuerdo con ello si los sueros no son estricta- mente específicos para el tipo; todos los investigadores están de acuerdo en la facilidad con que se producen las contamina- ciones de las cepas de virus y la substitución de un tipo por otro, aun trabajando en las más rigurosas condiciones, pero el control minucioso de las cepas durante el curso de los trabajos de inmunización e hiperin- munización, nos podrá asegurar acerca de la pureza de las mismas. Indudablemente los sueros más específicos son los inmunes, y la hiperinmunización hecha generalmente a partir de suspensiones antigénicas groseras puede dar lugar durante el pasaje de las cepas a la exaltación de pequeños componen- tes heterotípicos, que restarán especificidad al suero, pero éstos pueden ser descubiertos por el adecuado control del suero en cuestión. Hasta el momento no se tiene noticia de comunicaciones de que el cobayo sea capaz de producir anticuerpos heterólogos o de grupo al igual que el bovino.
También se ha progresado en lo que respecta al uso del complemento, no sólo por habernos liberado de la necesidad de usarlo recientemente recogido y por muerte de los cobayos productores, lo que pertenece al pasado inmediato, sino porque la técnica de Traub y Mohlmann (47), que usa 4 y hasta 7 dosis distintas de complemento, ha sido superada por la utilización de dos distintas proporciones solamente. Hoy el empleo de dos dosis distintas de comple- mento permite clasificar con seguridad un material infeccioso dado, a condición de que en él exista antígeno fijador suficiente, de que se haya ensayado exactamente la capacidad anticomplementaria del mismo y de que se conozca dicho valor en los an- tisueros de prueba. La investigación sobre fiebre aftosa, y más aún la policía veteri- naria, necesitan procedimientos seguros y rápidos para adoptar las medidas más acertadas en el menor tiempo posible.
En la prueba de fijación del complemento, el complemento no es un reactivo más, ni siquiera el más conveniente, sino es lo que,
por un grado mayor o menor de adsorción al complejo antígeno-anticuerpo, determina el grado de la hemólisis. Dicho grado ha sido corrientemente estimado, desde la iniciación de esta prueba en la fiebre aftosa, por el método de las cruces, o por expresión de porcentajes tomados arbitrariamente de un patrón hemolizado de glóbulos rojos, los que denotan la cantidad mayor o menor de complemento libre en el sistema. Se ha utilizado, pues, un sistema esencialmente cualitativo, que no puede dar mayores in- formes acerca de delicadas diferencias y que puede llevar eventualmente al descubri- miento de variantes del virus aftoso en la comparación de cepas homotípicas.
Brooksby (5), en un estudio minucioso de la reacción de fijación del complemento, introduce la cuantificaci6n de la prueba por medio de la estandarizaci6n del complemento y su apreciación ulterior por lectura foto- calorimétrica del grado de hemólisis al- canzado a una serie de dosis dadas de complemento. De esta manera se subsanan algunos inconvenientes que surgen de sistemas poco fijadores, como el presente, y se ofrecen mejores posibilidades de estudio de las variantes cuantitativas de los sueros, de los antígenos y de las relaciones entre las cepas de virus. Hemos podido observar el funcionamiento de la prueba asf montada en el Instituto Panamericano de la Fiebre Aftosa y no dudamos que su uso ha de incorporarse en breve a todo laboratorio de investigación bien equipado.
Tal vez haya sido en el estudio de las variantes del virus de la fiebre aftosa donde la fijación del complemento ha producido sus mejores resultados.
No es este el momento de considerar cuál es el origen de las variantes, cuál su im- portancia en la inmunización activa, su fijeza o su distribución.
Dicho método de investigación puede ser discutido desde varios puntos de vista tales como la lentitud en la respuesta del ex- perimento, la incapacidad para revelar pequeñas diferencias antigénicas no in- fecciosas, la pérdida de la especificidad de las muestras en examen y de los patrones, y presencia de inmunidad inespecífica o de grupo en los animales de experiencia.
Las investigaciones de Traub y Mohlmann (67) abrieron el camino al estudio de las variantes y permitieron poner de manifiesto su individualidad. Mediante el estudio serológico basado en la confrontación de las muestras con sueros patrón hornotípicos y de acuerdo con su comportamiento frente a su suero homólogo, dieron a conocer la existencia de tres cepas variantes del tipo A. Posteriormente, en 1949, Traub (68), en un amplio estudio de muestras de virus ale- manas y extranjeras, clasificó 2 variantes del tipo 0 y 5 del A utilizando como elemento accessorio de la identificación serológica pruebas de protección cruzada en cobayos a base de vacunas.
A estas investigaciones siguieron los trabajos de Brooksby, Galloway y Hender- son (69), las de Schneider (70), de Peterman (71), de Michelsen (72), de Schneider y Kosch (73), de Michelsen y Schjerning Thiesen (4) y las de Ubertini (74), que no de- jan duda alguna acerca de la utilidad de la prueba de la fijación del complemento para la determinación de variantes y la apre- ciación de fmas diferencias serológicas en el comportamiento de las mismas. Resulta claro de las investigaciones mencionadas que la prueba in vitre debe ser seguida de pruebas de inmunización en bovinos y cobayos, y de pruebas de seroneutralización, las que han de completar el cuadro de la verdadera estructura antigénica de las variantes, en- tendiendo por tales aquellas muestras que conservan su individualidad a través del
pasaje seriado en los animales de experi- mento.
El problema de la clasificación de las variantes debe tratarse con las mayores precauciones. Es necesario tener en cuenta la variabilidad del virus aftoso, no solo in natura, sino también la ocasionada por los manejos de laboratorio, así como el peligro que esta variabilidad entraña en la clasificación serológica posterior por la obtención de antígenos y antisueros fijadores del complemento que se van alejando cada vez más de su tipo original. A este respecto sería interesante conocer el comporta- miento de las cepas originales aisladas por Vallée y Garré, y por Waldmann y Traut- wein, en comparación con las cepas actuales del mismo tipo y con las directamente derivadas de ellas y sus antisueros re- spectivos; si bien esto no deja de ser una especulación, se quiere significar con ello que la mutabilidad y/o la variación del virus de la fiebre aftosa es aparentemente tan marcada que se encuentra siempre un poco más adelante de nuestro conocimiento de la misma y de su control; las recientes epizootias nos indican que esta sería una de las causas fundamentales de las fallas de la vacunación.
La excepcional contagiosidad y difusibili- dad de la fiebre aftosa no sólo exige una rápida y correcta determinación del tipo, sino también el diagnostico diferencial de la misma de otras enfermedades vesiculares del ganado que, en ciertas circunstancias, y por la similitud de lesiones se pueden confundir con la aftosa, si bien son menos difusibles y contagiosas que ella, aunque atacan 8 al- gunas de las especies sensibles a la fiebre aftosa.
Dichas enfermedades son la estomatitis vesicular equina y bovina, clfnicamente casi idénticas a las lesiones primarias aftosas linguales; el exantema vesicular del cerdo, con vesículas similares en el hocico, y el ectima del bovino que, en ciertas circuns- tancias, puede ser materia de controversia,
al comienzo, se basaba hasta hace poco en la reactividad de distintas especies animales por distintas vías de inoculación, y decimos que se basaba en ellas, porque los distintos procedimientos descansaban esencialmente en la sensibilidad de los animales de ex- perimento y en la actividad infecciosa del material de prueba. No es necesario discutir el tiempo, ni su excepcional valor en este caso, que demandan dichas investigaciones. Los distintos métodos que se han usado y su relativo valor, han sido ya revistados por Galloway (75) en 1936 y por Garcia Piraszi y Aramburu (76) en 1951.
En 1948, Brooksby (77), trabajando con cepas de laboratorio, informó sobre la posibilidad de diferenciar ambos virus mediante la reacción de fijación del comple- mento, comunicación que fué ampliada por otra del mismo autor (78) con materiales recogidos directamente del campo. Pos- teriormente García Pirazzi y Aramburu (76)) Nagel (79) y Strozzi y Wakeham (80) confirman la utilidad de la prueba en di- cho diagnóstico diferencial, si bien Nagel (79) informa ya de las limitaciones de la misma en la detección de mezclas arti- ficiales de ambos virus, y Brooksby com- prueba (81) la posibilidad de solucionar el problema de una infección mixta por medio de la inoculación de bovinos, aun con mezclas que tengan solamente 1,3 dosis infecciosas (50) de virus aftoso y que sería no reac- cionante en una prueba de fijación del complemento.
Los experimentos de Bankowski, Wich- mann y Kummer (82) indican que han logrado la fijación del complemento en el exantema vesicular del cerdo, pero aún no se tienen noticias de que sea especifica frente a los antfgenos y antisueros de la fiebre aftosa. Dada la contagiosidad de esta enfermedad en el cerdo, su s61a presencia hasta el momento en Estados Unidos de Norte América, país indemne de aftosa, y su similitud clinica, es de esperar que muy pronto se tengan informes a este respecto y estamos seguros de que los investigadores del
Norte han de atacar el problema con toda energía.
En el ectima contagioso del ovino, una enfermedad bastante difundida en el mundo, no siempre las lesiones que se observan en el labio, tienen el aspecto varioloide, y muchas veces se manifiestan en la mucosa labial interna; es importante hacer una diferen- ciación exacta y rápida entre ambas con- diciones, y aquí la prueba de la fijación del complemento prueba una vez más su utilidad. Glover (83) demostró la posibilidad de la prueba, obteniendo reacciones netas de fijación, y Rottgardt, Aramburu y García Pirazzi (84), demostraron que no habia fijación cruzada frente a los tres tipos de antígenos y antisueros de la fiebre aftosa,
Hemos pasado revista hasta ahora a al- gunas de las características de la reacción de fijación del complemento, juntamente con las ventajas que se han derivado de su empleo; parece, pues, apropiado considerar sus limitaciones actuales.
La primera que se nos ocurre considerar es la que resulta de materiales, generalmente procedentes de la campaña, con un contenido muy pobre de antígeno fijador; ello se debe por lo común a la destrucción o transforma- ción del mismo por fenómenos de necrosis y necrobiosis en los colgajos epiteliales to- davía presentes, los que, pese a la utilización de sueros fijadores de buen título, dan pobres y a veces incompletas reacciones de fijación. Este inconveniente puede obviarse con la investigación de anticuerpos en el suero de los animales recobrados por cualquiera de los sistemas conocidos.
las que, a su vez, fueron claramente compro- badas por inoculación al cobayo; concluye que, en sus condiciones experimentales, solo sirvió para el diagnóstico del tipo predominante.
La discusión de una correlación entre componente infeccioso y componente fijador, y de los múltiples factores implícitos está, por el momento, fuera de nuestro objeto.
Otro factor limitante en ciertas circuns- tancias es el pH de las soluciones regula- doras, en las que son enviados los materiales de la campaña, y a este respecto es intere- sante hacer notar que los trabajos de Otárola (59) informan que, a concentraciones de hidrogeniones inferiores a 7 y superiores a 8,5, mantenidas durante 12 dfas con epitelios linguales frescos, no es posible el diagnóstico del tipo; es, pues, necesario trabajar dentro de los límites bastante estrictos conocidos del pH.
Otro aspecto que limita parcialmente la prueba es el estrecho parentesco de ciertas variantes, las que reaccionan casi total- mente con los antisueros de prueba, y de las cuales no se poseen, en el momento de su ensayo, los antisueros homólogos; sin em- bargo, estos antfgenos que no pueden ser diferenciados serológicamente se puede mos- trar que son diferentes en pruebas de in- munidad cruzada.
Este aspecto está bien ilustrado por las investigaciones de Michelsen y Schjerning Thiesen (86) ; desde luego es continuación de otras anteriores de los mismos autores en igual sentido y que ya mencionamos (4) ; en ellas los autores daneses estudian 5 cepas de tipo 0 y 9 de tipo A, con 8 y 4 variantes, respectivamente, por medio de la fijación del complemento; surge de ellas la imposi- bilidad de clasificar con seguridad ciertas muestras fundándose solamente en la prueba in h-0, quedando probada una vez más la utilidad de las pruebas de inmunidad cruzada para el diagnóstico.
Experimentalmente el virus Lindholm A es casi idéntico a la variante A 4; un tipo Av es idéntico a la variante A 5; el antisuero A 3 fija diferentes cepas de tipo A; las va-
riantes A 2 y A 3 serían idénticas y el virus Lindholm 0 sería igual al 0 Venezuela frente al antisuero del primero.
Sus resultados son dignos del mayor estudio y fuente de abundantes sugestiones; nos revelan que la fijación del complemento es útil en medida extraordinaria en la detección del tipo, pero en muchos casos, puede ser incapaz de apreciar finas diferen- cias de composición antigénica.
Se puede decir también, en apoyo de lo dicho, que la prueba in vitre, especialmente la fijación del complemento, nos propor- ciona sólo una visión ‘Lplana” de la muestra en examen, y que el aspecto “estereos- cópico”, por así decirlo, sólo puede ser obtenido con una combinación de métodos, in vivo e in vitro, que darán exactos informes acerca de las características de invasibilidad, agresividad y parentesco inmunológico, tres nociones de la mayor importancia y funda- mentales tanto en el estudio de la fiebre aftosa, como en la lucha contra ella.
En 1952, Téllez Girón (87) propuso la prueba de la inhibición del complemento, la cual, según el autor, permitió la demostra- ción de anticuerpos específicos, en forma regular, en el suero de 10 bovinos conva- lecientes de fiebre aftosa tipo A y de 19 de estomatitis vesicular que habían pasado cualquiera de dichas enfermedades hacía por lo menos dos meses, haciéndose luego los resultados menos precisos. La prueba se basa en la capacidad del suero bovino de prueba de inhibir específicamente la facultad del antígeno de fijar el complemento en presencia de los antisueros homólogos de cobayo, observación que ya habían hecho Palacios y Rodríguez (88).
Una comunicación de Rice y Brooksby (64), corrobora los mismos resultados al controlar 34 muestras de sueros bovinos procedentes de una granja en la cual se supone se originó el foco de fiebre aftosa de Canadá, y en las cuales se observó que 30 inhibieron la fijación del complemento en forma especifica; lo mismo pudo observarse
las pruebas indirectas de fijación del com- plemento indicaron un efecto inhibitorio de tipo específico.
Los resultados sugieren que la prueba indirecta de la fijación del complemento, no sólo sería útil para poner de manifiesto la presencia de anticuerpos de cualquiera de los tres tipos de virus aftoso y de los dos de la estomatitis vesicular de bovinos que hace ya tiempo han pasado la infección, o que se sospecha la han pasado, sino también, lo que es más importante, permite, de acuerdo con los autores citados, la determinación es- pecífica del tipo. Queda abierta, asimismo, una vía para la eventual valoración y com- paración de productos inmunizantes.
Tratando de sintetizar todo cuanto hemos expuesto con relación a la prueba de la fijación del complemento, podemos decir que nos sirve, siempre que contemos con reactivos cuidadosamente controlados en todos sus aspectos y que se siga una técnica escrupulosa, no ~610 para determinar un tipo serológico dado del virus, sino también, al observar una reacción incompleta, para ponernos en la pista de una variante del mismo, si bien teniendo en cuenta las limita- ciones enunciadas; podemos asimismo, seguir el curso, dentro de ciertos límites, de una serie de pasajes en cuanto respecta a la con- servación del tipo. Es posible hacer un diagnóstico retrospectivo, no sólo de fiebre aftosa, sino también de tipo, basándose en el comportamiento del suero bovino y es igualmente posible hacerlo a partir de materiales de necropsia, tales como el corazón. Por último, podemos, no ~610
seguir el desarrollo de una epizootia en cuanto al tipo, sino, lo que es de la mayor importancia, hacer un exacto y rápido diag- nóstico diferencial con otras enfermedades clínicamente similares.
Contamos, pues, con un arma de primera categoría de la cual no ~610 conocemos su alcance, sino también, lo que es muy im- portante, algunas de sus limitaciones.
Su utilidad ha quedado probada más allá de toda duda, y hoy ningún país puede tener éxito en una campaña de control y erradica- ción de la fiebre aftosa sin la ayuda de tan precioso auxiliar de laboratorio.
Hemos revistado, hasta donde nos ha sido posible, t’odos los métodos propuestos para la tipificación del virus aftoso que ofrecían al- gunas posibilidades, y sólo cabe ahora reco- mendar que cualquiera que sea el usado, lo sea con pleno conocimiento de sus limita- ciones para valorizar así sus resultados cor- rectamente.
No creemos que la tipificación, por cual- quiera de los métodos, deba consistir en la monótona o rutinaria tarea de clasificar brotes de la enfermedad de acuerdo con su tipo. El virus aftoso tiene presumiblemente una complicada y no estable estructura in- munobiológica que se manifiesta en su fuerte tendencia a variar. Debemos, pues, estar atentos a dichos cambios para poder oponerles los más acertados y efectivos medios de lucha; ~610 el estudio metódico y profundo de los tipos y variantes, efectuado en el laboratorio de investigación, puede darnos los fundamentos necesarios para controlar y eventualmente erradicar la enfermedad. REFERENCIAS
(1) Loeffler, F. A. y Frosch, P.: Zblt. Bakt., I, (6) Galloway, 1. A.: Brit. Ag&. Bull., 5 (20) :67-
Orig., 22 :257, 1897. 74, 1952.
(2) Trautwein, K.: Arch. Prakt. Tierheilk, 56:505, (7) ValIBe, H. y Carré, H.: Comp. Rend. Atad. 1931.
(3) Trautwein, K. y Reppin, K.: Seitscher. Sc., Paris, 174:1498-1500, 1922.
Immjorsch., 73:347, 1932. (8) Waldmann, 0. y Trautwein, K.: Berl. Tz’er- (4) Michelsen, E. y Schjerning Thiesen, K.: arztZ. Wchschr., 36:569, 1926.
Bull. Oj. Int. Ep., 35 (11-12) : 748,195l. (9) Waldmann, 0. y Pape, A.: BerZ. Tierarztl. (5) Brooksby, J. B.: The Technique of Comple- Wchschr., 36:519, 1920.
ment Fixation in Foot and Mouth Disease (10) Frenkel, H. S.: Am. Jour. Vet. Res., 10
Research, Agr. Res. Counc. Series No. 12, (35) :142-145, 1949.
w (13)
: (14)
(15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) WI (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41)
1. M.: 2nd Prog. Rep. F. & M. Dis. Com.,
Londres, 1927.
Trautwein, K.: Arch. Wiss. u Prakt. Tier- heilk., 56:505, 1927.
Negri, R.: Rev. Mil. Med. Vet., 2:560-567,
1939.
Michelsen, E. y Johnson, M.: Act. Path.
Microbiol. Scand., 28 (3) :228-233, 1951. Brooksby, J. B.: The Antibodies in Foot-
and Mouth Disease, Agr. Res. Counc. Series No. 9, H.M.S.O., Londres, 1949. Henderson, W. M. : The Quantitative Study
of Foot-and-Mouth Disease Virus, Agr. Res. Counc. Series No. 8, H.M.S.O., Lon- dres, 1949.
Brooksby, J. B.; Galloway, 1. A. y Hender- son, W. IM.: Proceed. Soc. Exp. Biol.,
69 :57-84, 1948.
Schert Modrow, H.: Zeitschr. f. Hyg.,
110:1618, 1929.
Galloway, 1. A. y Elford, W. J.: Brit. Jour. Exp. Path., 12:407, 1931.
Ascoli, A.: CZin. Vet., 206, 1910.
Frenkel, H. S.: Tijdsch. v. Diergeneesk.,
64:14, 1937.
Doro&, N. N. y Kindyakov, V. 1.: Z. Micro- biol., Moscow, 8~86-87, 1940.
Solovieff, P.: Rev. Zootec., 251:19-26, 1943. Forest, G. E.: Com. Personal, 1954. Michelsen, E.: Nord. Med. Vet., 1:905, 1949. Lourens, L. F. D. E.: IX Cong. Int. Vet.,
S. I., 4,3:1-8, La Haya, 1909. Favero, F.: Clin. Vet., 327, 1914. Knapp, F.: Inaug. Diss., Munich, 1921. Tietze, C.: Berl. Tierarztl. Wchschr., 37:532,
1921.
Urbain, A. : “La reaction de fixation du com- plement,” Masson, París, 1927.
Sachelaire, Boquet y Urbain: Rep. Of. Int.
Ep., 1~5, 1928.
Ernts, W. E.: Munch. Tierarztl. Wchschr.,
550, 1922.
Mezincescu, D.; Baroni, V. y Calineseu, 1.:
Ann. Inst. Pasteur, 37:1057, 1923. Waldmann, 0. y Trautwein, K.: Berl. Tier-
arztl. Wchschr., 42:569, 1926.
Olitsky, P. K.: Jour. Am. Vet. Med. Assn.,
70:926, 1927.
Mine& F. C.: Bnd Prog. Rep. F. & M. Dis.
Comm., Londres, 1927.
Traum, J. y Schoening, H. W.: Rep. U. S. A. F & M Dis. Comm., 1928.
Flaum, A.: Act. Path. Microbiol. Stand., 8:316-320, 1931.
Ciuca, A. : Jour. Hyg., 28 (4) :325338, 1929. Trautwein, K. y Reppin, K.: Arch. Prakt.
Tierheilk, 31 (62) :463482, 1930. Sakwarelidse: Sov. Vet., 1:14, 1933.
(42) Helm, R.: Zblt. Bakf., 1, Orig., 130:305-312, 1933.
(43) Calea, M. : Arch. Roum. Path. Exp., 8:87,1935.
(44) Krag. P. y Schmidt, S.: Zeitschr. Immforsch.,
91:409412, 1937.
(45) Kanyo, B. y Olah, G.: Zeitschr. Immforsch.,
92:20, 1938.
(46) Reyn, A.: Act. Path. Microbiol. Stand., 17, 2:145-170, 1940.
(47) Traub, E. y Mohlmann, H.: Zblf. Bakt., 1. Orig., 150:289 y 300, 1943.
(48) Traub, E. y Manso Rodríguez, F.: Zblt. Bakt. 1, Orig., 151:380, 1944.
(49) Strozzi, P.: CZZn. Vet., 67:53, 1944.
(50) Rodríguez, T. R.; Prado, L. M. y Palacios, H. R. : Bol. Soc. Paul. Med. Veet., 7:94-99,
1945.
(51) Silva Araujo, J.: Rev. Med. Vet., Lisboa, 41:318, 1946.
(52) Aramburu, H. G.: Rev. Med. Vet., Bs. As.,
29 :793-801, 1947.
(53) Segre, D.: Cl%. Vet., sept.-oct., 132143, 1947.
(54) Ubertini, B. : Bull. Of. Int. Ep., 31:84,1949. (55) Michelsen, E.: Mund og Kiovesyge Virus,
Carl. Fr. Mortense, Joebenhaven, 1949. (56) Manso Rodrfguez, F.: Bull. Of. Int. Ep.,
35 (11-12) : 651, 1951.
(57) Federer, K. y Aramburu, H. G.: Gaceta Vet.,
59 :102-110, 1949.
(58) Federer, K. : Gaceta Vet., 12 (65) :105-117,195O. (59) Otárola, G.: Gaceta Vet., 12 (66) :158-175,195O. (60) Schmidt Funes, E. : Gaceta Vet., 14 (78) :154-
168, 1952.
(61) Cunha, R.; Martins Abreu, 1.; Monteiro de Carvalho, 1. y Da Silva Passos, W.: Arp. Inst. BioZ. Animal, Río, I:3148, 1950. (62) Frederiks, H. H. J.: Tijdsch. v. Diergeneesk,
21:839 > 1949.
(63) Serra, A. y Guarini, G.: CZZn. Vet., 74:
321358, 1951.
(64) Rice, C. E. y Brooksby, J. B.: ImmunoZ:,
71 (5) :300-310, 1953.
(65) Aramendi, M. C.: Gaceta Vet., 12 (66) :176-178, 1950.
(66) Mohlmann, H.: Zeitschr. Immforsch., 103, 1943.
(67) Traub, E. y Mohhnann, H.: Berl. y Munch. Tierarztl. Wchschr., 1, 1946.
(68) Traub, E.: Zooprojilassi, 7, 1949.
(69) Brooksby, J. B.; Galloway, 1. A. y Hender- son, W. M.: Proceed. Soc. Exp. Biot.,
69 :57-84, 1948.
(70) Schneider, B.: Berl. y Munch. Tierarztl.
Wchschr., 47, 1950.
(71) Peterman, H. G.: Rev. Med. Vet., BS. As.,
(72) Michelsen, E.: Act. Path. Microbiol. Stand., (81) Brooksby, J. B.: Jour. Hyg., 50 (3) :394-404,
27 (1) :79-85, 1950. 1952.
(73) Schneider, B. y Kosch: Berl. u Much. Tier-
arztl. Wchschr., 2, 36, 1951.
(74) Ubertini, B.: Clin. Vet., 75 (10) :289-300,
1952.
(75) Galloway, 1. A.: Vet. Rec., 48,709, 1936.
(76) Garcfa Pirazzi, A. J. y Aramburu, H. G.: Gaceta Vet., 13 (73) :196-202, 1951. (77) Brooksby, J. B.: Proceed. Soc. Exp. Biol.,
67 :254-258, 1948.
(78) Brooksby, J. B.: Jour. Hyg., 47: 385, 1949. (79) Nagel, H. C.: Gaceta Vet., 13 (72):147-162,
1951.
(82) Bankowski, R. A.; Wichmann, R. y Kummer, M.: Am. Jour. Vet. Res., 19: 51,1953.
(83) Glover, R. E.: Rep. Direcf. Inst. Anim. Path.,
Cambridge, 1932-1933.
(84) Rottgardt, A. A.; Aramburu, H. G. y Garcfa Pirazzi, A. J.: Nature, 168:219, 1948. (85) Sehmidt Funes, E.: Rev. Med. Vet., Bs. As.,
34 (2) :69-74, 1952.
(86) Michelsen, E. y Schjerning Thiesen, K.:
Bull. Of. Int. Ep., 39, (9-10) :626-635, 1953. (87) Tellez Girón, A.: Gaceta Vet., 14 (75) :8-25,
1952. (80) Strozzi, P. y Wakeham, A.: CZin. Vet., 4,
1952.
