FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARINA DAL’BÓ PELEGRINI CAMPIONI
ESTUDO DA EXPRESSÃO DE FERROPORTINA NAS HEMOCROMATOSES HEREDITÁRIAS POR CITOMETRIA DE FLUXO
CAMPINAS 2019
ESTUDO DA EXPRESSÃO DE FERROPORTINA NAS HEMOCROMATOSES HEREDITÁRIAS POR CITOMETRIA DE FLUXO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de concentração de Patologia Clínica.
ORIENTADOR: PROF. DR. KLEBER YOTSUMOTO FERTRIN
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA
MARINA DAL’BÓ PELEGRINI CAMPIONI, E ORIENTADA PELO PROF. DR. KLEBER YOTSUMOTO FERTRIN.
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
MARINA DAL’BÓ PELEGRINI CAMPIONI
ORIENTADOR: KLEBER YOTSUMOTO FERTRIN
MEMBROS:
1. PROF. DR. KLEBER YOTSUMOTO FERTRIN
2. PROFª. DRª. MÁRCIA TORRESAN DELAMAIN
3. PROFª. DRª. MARIA STELLA FIGUEIREDO
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM. Data de Defesa: 22/11/2019
Dedico este trabalho à minha família, em especial meus pais, meu irmão e meu marido, por todo seu apoio incondicional, e a Deus, por ter me permitido completar mais esta etapa.
projeto. Essa é a realização de um grande sonho. E também a Nossa Senhora por me permitir sentir seu amor de Mãe sempre ao meu lado.
Agradeço aos meus pais, Isabel e Jair, por sempre terem acreditado em mim, por terem plantado em meu coração os valores que eu levo para a vida, por terem me incentivado a estudar sempre, por terem me ensinado através do exemplo a dar sempre o melhor de mim e buscar a excelência no meu trabalho (porque eu sei que vocês são os melhores nos trabalhos de vocês). Agradeço por terem me permitido nascer numa família tão linda, e assim terem me ensinado a acreditar na força que vem do amor. Agradeço por terem trabalhado e se dedicado tanto para permitir que eu e meu irmão estudássemos, por terem aberto mão de seus próprios sonhos para que nós pudéssemos realizar os nossos. Vocês são minha grande inspiração e meu porto seguro. Não tenho como expressar meu amor e gratidão por vocês.
Agradeço ao Gustavo, meu irmão, por estar sempre comigo, por ser meu grande amigo, por me preencher com seu conhecimento de assuntos gerais (geralmente futebol), por me incentivar a crescer e me apoiar em todos os meus projetos, por me dar a certeza de que posso contar com você sempre que precisar. Meu amor por você é incondicional.
Agradeço ao Henrique, meu marido, meu Anjo, por estar a tantos anos comigo e, em 2017, ter escolhido passar o resto da vida ao meu lado. Por ser meu companheiro, me apoiar, sonhar meus sonhos comigo, acreditar no meu potencial e me estimular a ir além. E, claro, nessas fases finais do projeto, por assistir em casa meus ensaios de qualificação e defesa com toda a paciência. Eu te amo e não imagino minha vida sem você, meu amor.
Agradeço aos meus avós Laura, Pedro, Clarice e José, por serem as raízes firmes da família onde eu nasci, e assim me mostrarem que não há bem maior nesse mundo do que a família, e que por ela todos os esforços valem a pena.
Agradeço à família do meu marido, dona Geralda, seu Pedro, Anderson e James, por se tornarem minha família também e me receberem com tanto carinho.
para o meu coração.
Agradeço às amigas da graduação Isabella, Carol e Lara, por estarem comigo desde o começo dessa vida acadêmica. Sem vocês, acho que eu não teria vencido a graduação.
Agradeço às meninas do Lab. Marcadores Celulares, Rosângela, Sueli e Camila, pela ajuda na bancada, por aliviarem minhas tarefas nos momentos em que eu tinha coleta de pacientes do estudo, por me ajudarem a encontrar controles pelos corredores do Hemocentro e fora dele, por me guiarem na complexa logística da coleta dos pacientes. Mais do que isso, pela amizade, apoio, risadas, lanches, por me entenderem quando eu não estava nos meus melhores dias, por não me deixarem desistir quando parecia que as possibilidades tinham se esgotado.
Agradeço à Dra. Gislaine Borba Oliveira pelo apoio e estímulo e por ter permitido que eu desenvolvesse este trabalho simultaneamente às minhas atividades funcionais, e à Dra. Irene Lorand-Metze, por ser um grande exemplo para mim, pela sua dedicação à citometria, e por toda sua luta e empenho de anos para o crescimento do nosso laboratório e da citometria de fluxo em âmbito nacional. Tenho muito orgulho de trabalhar com vocês.
Agradeço à toda a equipe do Ambulatório de Hematologia, enfermagem, recepção, médicos, residentes, por me ajudarem com tanta disponibilidade na triagem, convocação e coleta de pacientes e controles. Vocês nos dão a certeza de que nossos pacientes estão em ótimas mãos.
Agradeço à equipe do Lab. Rotinas Hematológicas, Bruna, Janet, Bete, Lili, Mônica, Lilian, pela realização dos hemogramas e pela separação das amostras dos pacientes, e ao Lab. Patologia Clínica, especialmente à Dra Fernanda Orsi, pela realização dos exames bioquímicos.
Agradeço à equipe do Lab. Hemoglobina e Genoma, especialmente Daniela, Carolina Lanaro, Flávia e Dulcineia, por me ajudarem com técnicas, ensinamentos, reagentes e, principalmente, amizade, e ao Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa, pela oportunidade de desenvolver meu projeto em colaboração com o seu laboratório.
alegrias. Sem você, esse trabalho não teria sido possível.
Agradeço a todos os alunos do Prof. Kleber, Marina Borges, Marina Erê, Letícia, Isabela, Felipe, Álvaro, que contribuíram muito para a realização deste trabalho, inclusive dividindo o desespero de ver o orientador indo embora. Foi uma honra participar desse grupo com vocês.
Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Kleber Yotsumoto Fertrin, por ter acreditado em mim, por ter me dado essa oportunidade de realizar um sonho, de fazer parte desse grupo de pesquisa. Pela ajuda com as infinitas estatísticas, por todas as discussões e reflexões tão brilhantes e, principalmente, por não ter me abandonado, mesmo estando tão longe.
Agradeço aos pacientes do Ambulatório de Hematologia, que gentilmente se dispuseram a participar deste trabalho. Espero que os resultados vindos deste projeto sejam mais um tijolinho na construção do conhecimento e, um dia, vocês sejam beneficiados por esses frutos.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro através do processo nº 2014/00984-3, e ao apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Ainda que eu tivesse o dom da profecia, o conhecimento de todos os mistérios e de toda a ciência; ainda que eu tivesse toda a fé, a ponto de transportar montanhas, se não tivesse o amor, eu não seria nada.
São Paulo Apóstolo 1Cor 13, 2
receptor ferroportina (Fpn), a única proteína exportadora de ferro de mamíferos. Pacientes com Hemocromatoses Hereditárias (HH) são caracterizados por apresentarem sobrecarga de ferro e deficiência de hepcidina e normalmente toleram sangrias terapêuticas sem desenvolver anemia. Considerando que a deficiência de hepcidina causa superexpressão de Fpn, nosso objetivo foi caracterizar a expressão de Fpn no sangue periférico de controles saudáveis e pacientes com fenótipo HH. Amostras de sangue periférico venoso foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um anticorpo anti-Fpn humana não conjugado, seguido por um anticorpo fluorescente secundário e co-incubado com anti-CD45, CD33, CD3, CD19 e HLA-DR fluorescentes para identificar os tipos de células presentes na amostra. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo FACS Canto II. Recrutamos 31 pacientes com fenótipo HH e sobrecarga de ferro (SF) - sete homozigotos HFE C282Y, três heterozigotos duplos HFE C282Y / H63D, quatro homozigotos HFE H63D e o restante com suspeita de HH baseada em estudos de ferro e/ou tolerância a mais que 10 sangrias, aguardando teste para outras mutações, e 15 controles saudáveis (CS). A ferritina mediana foi de 163 ng/mL (faixa 34 - 1430) no grupo SF e 110 ng/mL (faixa 34 - 333) no CS. A saturação média de transferrina (TSAT) foi de 29 ± 6% no CS e de 45 ± 13% no SF. A expressão de Fpn foi maior na população de monócitos (CD45+ CD33+ HLA-DR+) e de linfócitos B (CD45hi CD19+ HLA-DR+). As
intensidades médias de fluorescência (IMF) absolutas de Fpn, bem como a relação de IMF de Fpn de monócitos / linfócitos T (IMFr) não diferiram significativamente entre os grupos CS e SF em nenhuma das linhagens de células, mas uma análise de subgrupo revelou que pacientes SF com TSAT> 50% tinham um IMFr de Fpn significativamente maior que o CS. Descobrimos que a IMF absoluta e a IMFr de Fpn não foram significativamente maiores em SF com HFE mutado, provavelmente devido ao pequeno número de pacientes. Nossos dados sugerem que a expressão de Fpn em monócitos de sangue periférico pode variar com a TSAT. Estudos prospectivos em pacientes com HH confirmados durante o tratamento são necessários para determinar se a expressão de Fpn no sangue periférico pode ser útil para diagnóstico e monitoramento terapêutico.
receptor ferroportin (Fpn), the only mammalian iron exporting protein. Patients with hereditary hemochromatoses (HH) are characterized by iron overload and hepcidin deficiency and typically tolerate phlebotomies without developing anemia. Considering that hepcidin deficiency causes Fpn overexpression, we aimed to characterize Fpn expression in peripheral blood of healthy controls and patients with a HH phenotype. Peripheral blood was analyzed by flow cytometry using an unconjugated anti-human Fpn antibody, followed by a secondary fluorescent antibody, and co-incubated with fluorescent anti-CD45, CD33, CD3, CD19, and HLA-DR to identify cell types. Samples were analyzed on a FACS Canto device. We recruited 31 patients with a HH phenotype and iron overload (IO) - seven HFE C282Y homozygotes, three HFE C282Y/H63D double heterozygotes, four HFE H63D homozygotes, and the remainder with suspected HH based on iron studies, tolerance to >10 phlebotomies, awaiting test for other mutations, and 15 healthy controls (HC). Median ferritin was 163 ng/mL (range 34 - 1430) in the IO group and 110 ng/mL (range 34 - 333) in HC. Mean transferrin saturation (TSAT) was 29 ± 6% in HC and 45 ± 13% in IO. Fpn expression was higher in monocytes (CD45+ CD64+ HLA-DR+)
and B-cells (CD45hi CD19+ HLA-DR+). Absolute Fpn mean fluorescence intensities
(MFI) as well as monocyte/T-cell Fpn MFI ratio (MFIr) did not differ significantly between HC and IO groups in any of the cell types, but a subgroup analysis revealed that IO patients with a TSAT>50% had a significantly higher Fpn MFIr than HC. We found Fpn absolute MIF and MFIr were not significantly higher in IO with mutated HFE, probably due to the small number of patients. Our data suggest that Fpn expression in peripheral monocytes may vary with TSAT. Prospective studies in confirmed HH patients during treatment are warranted to determine whether Fpn expression in peripheral blood may be useful for diagnosis and therapeutic monitoring.
Figura 1. Processos de obtenção de ferro pelo organismo. Absorção intestinal pelo enterócito (à esquerda)4 e reciclagem de hemácias senescentes pelo macrófago (à
direita)13 – adaptado. Dcytb: Ferroredutase; DMT-1: Proteína Transportadora de Metal
Divalente 1; HCP-1: Proteína Transportadora do Heme 1; Nu: núcleo da célula; HFE: Proteína da Hemocromatose Humana; TfR: Receptor da Transferrina...19 Figura 2. Estrutura tridimensional da hepcidina obtida por ressonância magnética nuclear. Azul: resíduos carregados positivamente; vermelho: resíduos carregados negativamente; amarelo: ligações dissulfeto12...21
Figura 3. Modelo da regulação da transcrição de Hepcidina pelo nível de ferro circulante. HoloTf: holotransferrina; TfR1 e TfR2: Receptores 1 e 2 da Transferrina; HFE: Proteína da Hemocromatose Humana; HJV: Hemojuvelina; BMPs: Proteínas Morfogenéticas Ósseas; Smads: proteínas homólogas a Sma e Mad; HAMP: gene da hepcidina...22 Figura 4. Comparação entre a absorção e distribuição de ferro no enterócito de um indivíduo saudável (à esquerda) e de um paciente com HH (à direita) 34-adaptado...24
Figura 5. Estratégia de gates utilizada para a análise da citometria de fluxo. A. Leucócitos presentes no sangue total, distribuídos num dot plot CD45 x SSC, onde foram selecionadas as regiões (gates) de monócitos e de linfócitos. B. Definição da população de monócitos através dos marcadores específicos da linhagem monocítica CD33 e HLA-DR. C. Definição das populações de linfócitos B e T através dos marcadores específicos das linhagens linfocíticas, sendo CD19 para linfócitos B e CD3 para linfócitos T. D. Exemplo do padrão de expressão de ferroportina (Fpn) encontrado em monócitos (verde), linfócitos T (azul) e linfócitos B (rosa)...36 Figura 6. Fluxograma representando o processo de triagem, convocação e coleta dos pacientes do estudo...38 Figura 7. Fluxograma representando o processo de coleta e triagem dos controles do estudo...39
mutação HFE p.C282Y, 63 = alelo com mutação HFE p.H63D, 65 = alelo com mutação HFE p.S65C...41 Figura 9. Exemplo de histogramas de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) encontrada em células de um paciente com fenótipo de hemocromatose (A) e de um indivíduo controle (B). Os linfócitos T (curva azul) atuam como controle negativo nesses histogramas e tem o pico de intensidade pouco acima de 102 unidades arbitrárias (U.A.) de fluorescência. Nota-se que a IMF
dos monócitos (curva verde) na Figura 9A tem o pico acima de 104 U.A., enquanto
na Figura 9B, no controle, os monócitos tem o pico pouco acima de 103 U.A., ou
seja, da ordem de 10 vezes menor...42 Figura 10. Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) absolutas de ferroportina (Fpn) na superfície de monócitos do grupo de controles e do grupo de pacientes. As barras representam média ± desvio padrão, valores em unidades arbitrárias. P>0.05...43 Figura 11. Razões entre Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) e controle endógeno CD45 em monócitos de controles e de pacientes. As barras representam média ± desvio padrão. P>0.05...43 Figura 12. Razões entre as Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) em pacientes e controles. As barras representam média ± desvio padrão. P>0.05...44 Figura 13. Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) absolutas em monócitos encontradas em cada grupo de acordo com genótipo para o gene HFE no grupo de pacientes. WT = alelo não mutado (“wild type”) para o gene HFE, 282 = alelo com mutação HFE p.C282Y, 63 = alelo com mutação HFE p.H63D, 65 = alelo com mutação HFE p.S65C. As barras representam a média ± desvio padrão. P>0.05...45 Figura 14. Intensidades Médias de Fluorescência relativas (IMFr) de ferroportina (Fpn) de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) encontradas em cada grupo em função do genótipo para o gene HFE no grupo de pacientes. WT = alelo não mutado (“wild type”) para o gene HFE, 282 = alelo com mutação HFE p.C282Y, 63 = alelo com
Figura 15. Razões entre Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) de Monócitos e Linfócitos T (IMFr) em controles, pacientes com saturação de transferrina (TSAT) >50%, e pacientes com TSAT<50%. As barras representam média ± desvio padrão. P>0.05 para controles vs. TSAT<50%, P=0.0162 para controles vs. TSAT>50%... 47 Figura 16. Curvas de Característica de Operação do Receptor (curva ROC) para predição da presença de saturação de transferrina acima de 50% (TSAT>50%) utilizando valores de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) absoluta em monócitos (linha preta), em linfócitos T (linha azul) e a relação de IMF de Fpn de Monócitos / Linfócitos T (IMFr, linha verde). A maior Área Sob a Curva (ASC) foi encontrada em IMFr, ASC=0.7623, P=0.0074; ASC de Linfócitos T=0.5735, ASC de Monócitos=0.7230...48 Figura 17. Dot plot da expressão de CD45 x SSC de amostras de indivíduos controles, comparando o método de lise de hemácias antes (A) e depois (B) da marcação com os anticorpos...61 Figura 18. Leucócitos de sangue total de indivíduo saudável incubados com CD45 conjugado com V500 (A), ou com anticorpo primário anti-CD45 e posteriormente marcado com anticorpos secundários Alexa Fluor 633 (B), Zenon Alexa Fluor 647 (C), Zenon Alexa Fluor 488 (D). Pela comparação, pode-se observar que os reagentes Zenon Alexa Fluor 674 e Alexa Fluor 488 não apresentaram marcação satisfatória da amostra, principalmente quando observada a população de linfócitos, que apresentou marcação negativa de CD45, enquanto o Alexa Fluor 633 marcou as populações de leucócitos de acordo com o padrão esperado...63
1.1. Metabolismo do ferro...18
1.2. Regulação do metabolismo do ferro...20
1.3. Hepcidina...21
1.4. Ferroportina...22
1.5. Hemocromatoses Hereditárias...23
1.5.1. Hemocromatose associada ao gene HFE...24
1.5.2. Hemocromatoses não associadas ao gene HFE...25
1.6. Diagnóstico e tratamento atual das HHs...27
1.7. Desafios e dificuldades no diagnóstico laboratorial de HHs...28
1.8. Inovações no diagnóstico laboratorial de HHs...28
1.9. Imunofenotipagem por citometria de fluxo em hematologia laboratorial...29
1.10. Justificativa do estudo...30 2. OBJETIVOS...31 2.1. Objetivo Geral...31 2.2. Objetivos Específicos...31 3. MATERIAIS E MÉTODOS...32 3.1. Casuística...32 3.1.1. Grupo de Pacientes...32 3.1.2. Grupo Controle...33 3.2. Coleta de amostras...33
3.3. Testes laboratoriais hematológicos e bioquímicos...34
3.4. Determinação da expressão de ferroportina em células de sangue periférico através de imunofenotipagem por citometria de fluxo...34
4.2. Genótipo para mutações do gene HFE...40
4.3. Expressão de ferroportina na superfície de células do sangue periférico em controles e pacientes com sobrecarga de ferro...41
4.4. Expressão relativa de ferroportina de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) do sangue periférico em controles e pacientes...44
4.5. Expressão de ferroportina de Monócitos de acordo com o genótipo para HFE apresentado pelos pacientes...45
4.6. Expressão relativa de ferroportina de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) de acordo com a saturação de transferrina (TSAT)...47
4.7. Análise da Curva Característica de Operação do Receptor (curva ROC)...48
5. DISCUSSÃO...49
6. CONCLUSÕES...53
7. REFERÊNCIAS...54
8. APÊNDICES...60
8.1. Desenvolvimento da técnica de imunofenotipagem por citometria de fluxo utilizada no estudo...60
9. ANEXOS...65
1. INTRODUÇÃO
1.1. Metabolismo do ferro
O ferro é um micronutriente essencial que tem papel chave em numerosos processos bioquímicos envolvidos na homeostase celular, agindo como cofator de enzimas catalisadoras no metabolismo oxidativo, na síntese de DNA, participando da formação de hemoglobina, mioglobina, e citocromos entre outros, sendo isso possível devido às suas propriedades químicas como um metal de transição, podendo doar e receber elétrons (reações de oxi-redução)1,2,3. Tanto a
deficiência quanto o excesso de ferro são extremamente nocivos para o organismo4,5. Assim, a homeostase do ferro no organismo é controlada por
mecanismos muito precisos que garantem o equilíbrio entre sua absorção, distribuição e utilização, sendo tais processos mediados por diversos tipos celulares, hormônios e proteínas transportadoras6.
Existem dois processos através dos quais o ferro pode ser obtido pelos tecidos: a absorção intestinal (alimentação) ou a reciclagem de hemoglobina proveniente de hemácias senescentes pelos macrófagos7. No processo de absorção
intestinal, cerca de 1 a 2 mg de ferro são absorvidos diariamente pelo epitélio duodenal, que apresenta microvilosidades para aumentar a superfície de absorção4.
O ferro inorgânico é reduzido do estado férrico (Fe3+) para o ferroso (Fe2+) e então é
internalizado para o citoplasma das células do epitélio duodenal superior pela Proteína Transportadora de Metal Divalente 1 (DMT-1)8. Já o ferro orgânico (ferro
heme), proveniente da quebra de hemoglobina, é internalizado pela Proteína Transportadora do Heme 1 (HCP-1)9 e liberado da molécula de protoporfirina pela
heme oxigenasse10.
Nesse ponto, se a necessidade de ferro pelo organismo for baixa, ele permanecerá armazenado no citoplasma da célula ligado à ferritina (proteína em forma de concha que armazena até 4.500 átomos de ferro), e se a necessidade for alta, ele será liberado do enterócito para o sangue e será transportado na circulação pela transferrina (gricoproteína que transporta dois átomos de Fe3+ através do
O segundo processo responsável pela obtenção de ferro é a reciclagem a partir da degradação de hemácias senescentes pelos macrófagos do baço, da medula óssea e do fígado (eriptose). Através deste processo, os macrófagos reconhecem modificações bioquímicas na superfície da membrana das hemácias senescentes, o que desencadeia a fagocitose e degradação dessas células. A molécula heme é então catabolizada por enzimas como a NADPH-citocromo C redutase e a biliverdina redutase, presentes na membrana do complexo endoplasmático, e o ferro é liberado no estado ferroso (Fe2+), podendo então se ligar
à ferritina e permanecer no interior da célula ou ser exportado para o meio extracelular pela ferroportina (proteína transmembrana responsável pelo efluxo de ferro das células) e transportado através da circulação pela transferrina no estado férrico (Fe3+) para os sítios onde será utilizado4 (Figura 1). Através desse processo
de reciclagem, o organismo adquire a maior parte do ferro necessário ao seu correto funcionamento, sendo seu principal destino a medula óssea, onde participa da eritropoiese12.
Figura 1. Processos de obtenção de ferro pelo organismo. Absorção intestinal pelo enterócito (à esquerda)4 e reciclagem de hemácias senescentes pelo macrófago (à
direita)13 - adaptado. Dcytb: Ferroredutase; DMT-1: Proteína Transportadora de Metal
Divalente 1; HCP-1: Proteína Transportadora do Heme 1; Nu: núcleo da célula; HFE: Proteína da Hemocromatose Humana; TfR: Receptor da Transferrina
Uma vez que a molécula de transferrina, complexada ao íon de ferro, chega à membrana das células dos tecidos-alvo (neste caso, os eritroblastos), ela se liga ao seu receptor e à proteína do gene HFE e este complexo é internalizado por endocitose, formando um endossoma. Dentro do endossoma, o ferro é liberado da transferrina como Fe3+, passa para o citosol na forma Fe2+ através da DMT-1 e então
entrará no processo de formação do grupamento heme, que ocorre na mitocôndria e é regulado pela proteína frataxina e finalizado pela ferroquelatase através da incorporação do ferro ao anel pirrólico11.
1.2. Regulação do metabolismo do ferro
Esse complexo processo que disponibiliza o ferro ao organismo é precisamente regulado por mecanismos intracelulares e sistêmicos, de forma a garantir sua homeostase.
A regulação intracelular consiste no controle da expressão pós-transcricional dos genes reguladores da aquisição e estoque de ferro por meio das Proteínas Reguladoras de Ferro 1 e 2 (IRP1 e IRP2). Esses processos são desencadeados de acordo com a concentração de ferro intracitoplasmático e ocorrem em nível de RNA mensageiro (mRNA), estimulando ou inibindo sua tradução12. As IRPs se ligam aos Elementos Responsivos ao Ferro (IREs)
localizados nos mRNAs que codificam as proteínas envolvidas na aquisição, estoque, utilização e exportação do ferro. Como exemplo de tais proteínas, podemos citar o receptor de transferrina, a ferritina, a DMT-1 e a ferroportina. Quando a concentração citoplasmática de ferro está baixa, as IRPs se ligam às IREs de mRNAs de proteínas reguladas por ferro. Dependendo da posição da IRE no mRNA (região não-codificante 5’ ou 3’), a ligação das IRPs tem um efeito diferente na síntese de tais proteínas, podendo estabilizar o mRNA e, assim, estimular a síntese proteica, ou bloquear a tradução do mRNA, diminuindo a síntese proteica12.
Já a regulação sistêmica se baseia na coordenação dos processos de absorção, utilização e estoque do ferro nos diversos tecidos onde eles ocorrem, sendo a hepcidina o hormônio chave na modulação deste equilíbrio, juntamente com a ferroportina, que age como seu receptor14.
1.3. Hepcidina
A hepcidina foi descoberta de forma independente por Kruase et al.15 e
Park et al.16, que demonstraram sua significativa atividade antibactericida e
antifúngica. Trata-se de um hormônio peptídico formado por 25 aminoácidos produzido pelo fígado e secretado na circulação, e é identificada como regulador sistêmico do ferro no organismo17,18 (Figura 2).
Figura 2. Estrutura tridimensional da hepcidina obtida por ressonância magnética nuclear. Azul: resíduos carregados positivamente; vermelho: resíduos carregados negativamente; amarelo: ligações dissulfeto12.
Sua expressão é regulada, entre outros aspectos, pelo nível de ferro circulante (ligado à transferrina) que ativa uma via de sinalização chamada BMP-SMAD. Para o correto funcionamento dessa via, participam diversas proteínas, tais como HFE, Receptor 2 da Transferrina (TFR2), BMPs (proteínas morfogenéticas ósseas, do inglês Bone Morphogenetic Protein) e hemojuvelina (HJV)19 (Figura 3). Quando a saturação da transferrina aumenta, há elevados níveis
de ferro ligado a transferrina, a HFE se liga ao TfR2, ativando uma via de sinalização intracelular que resulta na transdução do sinal das BMPs, pela formação de um complexo proteico BMP-receptor de BMP-HJV que migra para o núcleo da célula, se liga à região promotora do gene da hepcidina e estimula sua expressão. Assim, na presença de altos níveis de ferro, ocorre aumento da produção de hepcidina4,20,21,22.
Figura 3. Modelo da regulação da transcrição de Hepcidina pelo nível de ferro circulante. HoloTf: holotransferrina; TfR1 e TfR2: Receptores 1 e 2 da Transferrina; HFE: Proteína da Hemocromatose Humana; HJV: Hemojuvelina; BMPs: Proteínas Morfogenéticas Ósseas; Smads: proteínas homólogas a Sma e Mad; HAMP: gene da hepcidina.
1.4. Ferroportina
A ferroportina, também chamada de Ireg1 ou MTP1, é uma proteína transmembrana que foi primeiramente identificada por três estudos independentes, Abboud e Haile23, Donovan et al24 e McKie et al.25. É codificada pelo gene
FPN1 (SLC40A1), sendo a única proteína exportadora de ferro conhecida em mamíferos. Ela é altamente expressa na membrana basolateral de enterócitos duodenais, onde transporta o ferro proveniente da dieta para a corrente sanguínea, na membrana plasmática de macrófagos e monócitos, onde ela medeia a liberação do ferro reciclado dos eritrócitos senescentes, e na superfície sinusoidal de hepatócitos, onde ela transporta o ferro armazenado no fígado para o plasma26,27.
Através da circulação, a hepcidina chega à superfície dos macrófagos, monócitos, enterócitos e hepatócitos, se liga à ferroportina, que age como seu receptor, e o complexo hepcidina-ferroportina formado é internalizado, sofrendo ubiquitinização e degradação no endossoma. Sendo a ferroportina o principal exportador do ferro da célula para o plasma, sua degradação resulta na inibição do efluxo de ferro da célula, e consequentemente no acúmulo do ferro no interior celular, sendo este então estocado na molécula de ferritina, inibindo sua absorção por estas células. Assim, em condições de elevados níveis de ferro, a produção de hepcidina é alta, a ferroportina é internalizada, diminuindo a absorção de ferro intestinal, bloqueando a exportação de ferro dos macrófagos para a circulação e inibindo então a liberação dos estoques de ferro dos hepatócitos11,28,29.
1.5. Hemocromatoses hereditárias
A perda dessa regulação hepcidina-ferroportina é a chave da fisiopatologia das hemocromatoses hereditárias (HHs). As HHs são doenças genéticas autossômicas cuja característica principal é o excesso de ferro em associação à falta de hepcidina. A deficiência de hepcidina causa hiperfunção da ferroportina, gerando absorção descontrolada de ferro e seu acúmulo30,31,32 (Figura
4). São doenças mais comumente identificadas nas populações caucasianas, especialmente nas de descendência norte-europeia. Elas se caracterizam pelo acúmulo inapropriado de ferro em diversos tecidos do organismo, causando danos especialmente no fígado, coração, pâncreas, glândulas endócrinas e articulações, e têm sido associadas como desencadeamento de cirrose hepática, diabetes, artrite, cardiomiopatia, falha testicular e carcinoma hepatocelular33.
Figura 4. Comparação entre a absorção e distribuição de ferro no enterócito de um indivíduo saudável (à esquerda) e de um paciente com HH (à direita)34 – adaptado.
As HHs podem ser classificadas em dois grandes grupos, de acordo com a mutação ocorrida: hemocromatoses associadas ao gene HFE e hemocromatoses não associadas ao HFE22.
1.5.1. Hemocromatose associada ao gene HFE
A hemocromatose associada ao gene HFE também é conhecida como clássica ou tipo 1, e é responsável por cerca de 80%-85% dos casos da doença em pessoas com ancestralidade norte-europeia. Ela é causada por diferentes mutações no gene HFE que resultam em substituições de aminoácidos na proteína. Há três mutações principais: na mutação C282Y, ocorre substituição da cisteína por tirosina na posição do aminoácido 282; na H63D, a histidina é substituída pelo ácido aspártico na posição 63; e na S65C, há substituição da serina por cisteína na posição 65. Essas substituições de aminoácidos podem ocorrer em homozigose ou
heterozigose dupla, com herança autossômica recessiva, e tem diferentes graus de penetrância da manifestação clínica em relação ao genótipo20, 32. Elas alteram a
função da HFE na regulação da transcrição do gene da hepcidina.
Assim, a síntese de hepcidina diminui, deixando a ferroportina livre de regulação, o que causa o aumento da absorção de ferro intestinal e o aumento do efluxo de ferro dos macrófagos e enterócitos para a circulação sanguínea, levando consequentemente a um acúmulo de ferro nos tecidos e ao surgimento de espécies reativas de oxigênio que levam a danos teciduais diretos22.
1.5.2. Hemocromatoses não associadas ao gene HFE
As hemocromatoses não associadas ao gene HFE se dividem em três grupos principais que, juntas, correspondem a menos de 5% das HH22:
- Hemocromatoses tipo 2: doenças autossômicas recessivas que ocorrem por mutação no gene da hemojuvelina (HJV), chamadas 2a, ou no gene da hepcidina (HAMP), chamadas 2b, sendo também conhecidas como hemocromatoses juvenis35. Caracterizam-se pelo acúmulo de ferro no
organismo, principalmente nos hepatócitos, sendo o quadro laboratorial muito semelhante à hemocromatose associada ao HFE, com aumento do ferro sérico e da saturação da transferrina, porém todas as manifestações clínicas se desenvolvem mais cedo devido à maior absorção intestinal de ferro e ao seu acúmulo mais rápido em comparação ao encontrado na forma clássica. A gravidade do quadro clínico gerado pelas mutações nesses genes sugere que esses genes produzem um efeito inibitório sobre a absorção intestinal de ferro mais forte que o HFE36.
- Hemocromatose tipo 3: doença autossômica recessiva causada pela mutação no gene no receptor 2 da transferrina (TFR2). A apresentação clínica e laboratorial também é semelhante à encontrada na hemocromatose clássica, com sobrecarga de ferro primariamente no fígado. O TFR2 age como um sensor do status de ferro no organismo através da saturação da transferrina. Ele promove um movimento intracelular de transferrina, modulando sua concentração sérica e, então, influenciando a quantidade de ferro disponível para a eritropoiese36. Mutação no
TFR2 resulta em detecção anormal dos estoques de ferro pelos hepatócitos, os quais armazenam esse excesso de ferro, causando a chamada HH tipo 322.
- Hemocromatose tipo 4: doença autossômica dominante resultante de mutação no gene da ferroportina (SLC40A1). Pode ser dividida em dois tipos, 4a e 4b, de acordo com o impacto molecular da mutação: no tipo 4a, ocorre perda de função da ferroportina, acarretando no acúmulo de ferro na forma de ferritina dentro dos macrófagos e, consequente, diminuição da saturação das moléculas de transferrina circulantes, causando uma sobrecarga de ferro predominantemente retículo-endotelial. No tipo 4b, ocorre o ganho de função da ferroportina, ou seja, a ela se torna resistente à ação regulatória da hepcidina, tornando desequilibrado o efluxo de ferro da célula, o que resulta no aumento da saturação da transferrina circulante, hiperabsorção de ferro nos enterócitos e depósito de ferro no fígado20,37.
Na tabela 1 é apresentada a comparação dos vários tipos de Hemocromatoses Hereditárias.
Tabela 1. Classificação das hemocromatoses hereditárias quanto ao gene, proteína, cromossomo e tipo de herança envolvidos32, 36.
Tipo de HH Gene Proteína Cromossomo Herança
1 HFE HFE 6 Autossômica Recessiva
2a HJV Hemojuvelina 1 Autossômica Recessiva
2b HAMP Hepcidina 19 Autossômica Recessiva
3 TFR2 Receptor 2 de
Transferrina
7 Autossômica Recessiva
1.6. Diagnóstico e tratamento atual das HHs
Levando-se em consideração os variados mecanismos moleculares envolvidos e a gama de fatores intrínsecos e extrínsecos que podem interferir no curso da doença, o diagnóstico das HHs requer cuidadosa investigação fenotípica do paciente. Este processo se inicia com a detecção de evidências de sobrecarga de ferro, com ou sem sintomas. A quantificação de ferritina sérica é utilizada na prática clínica como triagem, mas tem baixa especificidade, já que se trata de uma proteína de fase aguda, cujos níveis se elevam em situações de alcoolismo, síndrome metabólica, inflamação, infecção, e doenças reumatológicas, hematológicas e neoplásicas, sem que isso envolva sobrecarga de ferro38,39,40. Assim, é necessária
confirmação com medida do índice de saturação da transferrina elevado, que é calculado dividindo-se a concentração de ferro sérico pela capacidade total de ligação de ferro (ambos medidos em mg/dL) e multiplicando-se por 100%, sendo considerada elevada uma saturação de transferrina acima de 45%41. As sobrecargas
de ferro cardíaca ou hepática também podem ser avaliadas por ressonância magnética ou, muito raramente na atualidade, por biópsia do fígado ou de miocárdio.
É fundamental o cuidadoso diagnóstico diferencial com outras doenças que causam sobrecarga de ferro secundária, como hepatites virais B e C, doença hepática alcoólica e doença hepática gordurosa não alcoólica42,43. Uma vez
constatada a presença de sobrecarga de ferro real no organismo e feita a hipótese diagnóstica de HH, solicita-se investigação de mutações para o gene HFE para confirmar HH tipo 132,43,44. Na ausência de mutações do HFE, o diagnóstico
não-invasivo e presuntivo de HH não-associada a HFE pode utilizar, por exemplo, sangria terapêutica quantitativa: a realização de sangrias sucessivas que correspondam a perda de aproximadamente 4g de ferro elementar, equivalente a todo o ferro corporal de um indivíduo normal, sem queda dos níveis de hemoglobina configura evidência de sobrecarga real de ferro45. Excepcionalmente, em alguns
serviços, é possível investigar os demais genes em busca de mutações que confirmem o diagnóstico de HH tipo 2, 3, ou 4, porém essa estratégia não é disponível na prática clínica diária da maioria dos hospitais do Brasil, pois demanda o estudo de múltiplos genes com dezenas de mutações gênicas diferentes em plataformas de sequenciamento genético que ainda implicam em alto custo.
O tratamento das HHs é baseado em sangrias terapêuticas regulares, de acordo com a gravidade do caso, com o objetivo de atingir valores de ferritina abaixo de 50μg/L e de saturação de transferrina abaixo de 30%46. Depois de atingido esse
objetivo, o paciente é colocado em manutenção com sangrias na melhor frequência para cada caso para se manter dentro desses parâmetros. Para pacientes mais sensíveis ou intolerantes a sangria, pode-se utilizar também quelantes de ferro32. É
importante ressaltar que, quanto antes o diagnóstico for feito e o tratamento for iniciado, melhor é o prognóstico e a qualidade de vida do paciente, pois os danos aos tecidos terão sido menores.
1.7. Desafios e dificuldades no diagnóstico laboratorial de HHs
Os sintomas apresentados pelos pacientes com HH geralmente são inespecíficos, sutis e de início gradual, dificultando o diagnóstico. Da mesma forma, os testes laboratoriais de sobrecarga de ferro utilizados no diagnóstico podem apresentar alterações provenientes de outras causas, como doenças hepáticas inflamatórias (como hepatite viral crônica, esteato-hepatite não alcoólica, doença hepática alcoólica), câncer, doenças inflamatórias sistêmicas (como artrite reumatoide, linfo-histiocitose hemofagocítica) ou obesidade44.
1.8. Inovações no diagnóstico laboratorial de HHs
Mediante a importância de um diagnóstico preciso com a menor complexidade possível e dos desafios encontrados neste processo, vários testes já foram propostos com o objetivo de validar um método específico para a identificação da hemocromatose, principalmente por meio da dosagem de hepcidina, que detectaria a deficiência desse hormônio (com exceção da HH tipo 4b, em que a produção de hepcidina está aumentada)47. Foram desenvolvidos testes de
cromatografia de troca iônica e espectrometria de massa, porém seu custo é elevado e não disponíveis em grande parte dos serviços de saúde. Também foram desenvolvidos testes de ELISA para quantificação de hepcidina sérica, mas ainda não há um padrão-ouro para padronização desse ensaio nem harmonização
interlaboratorial que permita sua utilização em laboratório de rotina48, 49. Assim,
ainda não há um exame prontamente acessível que permita estabelecer de forma adequada e específica o diagnóstico das HHs e que não dependa da análise molecular de todos os possíveis genes cujas mutações causam HH.
1.9. Imunofenotipagem por citometria de fluxo em hematologia laboratorial
A citometria de fluxo é uma técnica laboratorial em que células são marcadas com anticorpos ligados a fluorocromos, de acordo com os antígenos a serem pesquisados e são interceptadas por lasers de diversos comprimentos de onda. A reflexão e refração da luz dos lasers sobre as células geram dados de dispersão de luz (que não dependem da marcação com anticorpos), e a interação entre a luz dos lasers e os fluorocromos geram dados de intensidade de fluorescência dos anticorpos contra as proteínas de interesse. As informações são então captadas por detectores e transformadas em sinais eletrônicos, que são quantificados e analisados em softwares específicos. Assim, obtém-se as informações de tamanho relativo, complexidade da célula e expressão de antígenos, que compõem a imunofenotipagem celular50.
Essa técnica tem a vantagem de ser rápida, de fácil execução e com custo acessível a grande parte dos serviços de saúde de referência em Hematologia. Ela já é utilizada no auxílio do diagnóstico de diversas doenças hematológicas, tais como leucemias agudas, linfomas51 e hemoglobinúria paroxística noturna52. Também
já foi padronizada para monitoramento de linfócitos T CD4+ em pacientes com HIV53,
na quantificação de células-tronco CD34+ em uso nos transplantes de medula óssea54, além das inúmeras aplicações que a citometria de fluxo tem no campo da
1.10. Justificativa do estudo
Considerando que a fisiopatologia da maioria das Hemocromatoses Hereditárias tem como denominador comum a deficiência da hepcidina, seria natural que a dosagem sérica de hepcidina circulante se tornasse o padrão-ouro para esse diagnóstico. No entanto, com a indisponibilidade desse teste laboratorial para uso clínico, e o fato de que a hemocromatose tipo 4b cursa com ganho de função da ferroportina apesar da produção normal de hepcidina, há espaço para o estudo de novas alternativas. Além disso, o custo ainda alto das investigações de todas mutações genéticas e o tempo necessário para a realização desses exames impedem que seja feito diagnóstico de forma mais ágil. Na impossibilidade de realizar estudos genéticos além do gene HFE, que é a realidade da maioria dos serviços, pacientes com suspeita de HH que não sejam realmente portadores da doença podem ser expostos a realização de teste terapêutico desnecessário com sangrias terapêuticas e anemia iatrogênica.
O diagnóstico das HHs pode, portanto, se basear na detecção da hiperexpressão de ferroportina na superfície celular. Entre os tipos celulares circulantes no sangue periférico, sabe-se que os monócitos são os precursores dos macrófagos e expressam ferroportina, cuja expressão é potencialmente detectável e quantificável com uso de citometria de fluxo. Assim, o primeiro passo seria determinar o padrão de expressão da ferroportina nos monócitos em indivíduos saudáveis e em pacientes com HH, para, então, utilizarmos esse conhecimento no diagnóstico diferencial dos estados de sobrecarga de ferro, o que pode permitir o desenvolvimento de um novo teste diagnóstico para identificar as HHs.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar a expressão de ferroportina (Fpn) por citometria de fluxo em células de sangue periférico venoso de controles saudáveis, pacientes com Hemocromatoses Hereditárias (HHs) e pacientes com suspeita clínica de HH, e investigar sua possível aplicação como ferramenta diagnóstica.
2.2. Objetivos Específicos
- Desenvolver um ensaio de detecção da expressão de Fpn em células de sangue periférico por citometria de fluxo utilizando anticorpos anti-Fpn humana marcados com fluorocromos;
- Comparar qualitativa e quantitativamente a expressão de Fpn em células de sangue periférico de indivíduos normais e de pacientes diagnosticados com ou com suspeita clínica de HHs;
- Determinar parâmetros de expressão de Fpn que possam ser utilizados para detectar HHs dentre pacientes com suspeita de sobrecarga de ferro ou outros distúrbios do metabolismo do ferro.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Casuística
O presente estudo foi um estudo transversal realizado no Centro de Hematologia e Hemoterapia de Campinas (Hemocentro), Universidade de Campinas, Brasil.
3.1.1. Grupo de Pacientes
Foram selecionados pacientes com suspeita ou diagnóstico de HHs, atendidos no Ambulatório de Hematologia do Hemocentro da Unicamp, satisfazendo obrigatoriamente os critérios de inclusão (a) e (b), e um dentre os critérios (c) ou (d):
a) Ter idade maior que 18 anos; E
b) Assinar termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE); E
c) Ter diagnóstico clínico com ou sem confirmação molecular de mutação do gene HFE; OU
d) Ter suspeita clínica de HH (ferritina aumentada e/ou saturação de transferrina elevada, com tolerância a sangria terapêutica).
Foram considerados como critérios de exclusão:
a) Ter idade abaixo de 18 anos; OU
b) Não assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE); OU c) Possuir neoplasia hematológica ativa; OU
e) Possuir histórico de transfusão sanguínea.
3.1.2. Grupo Controle
Foram selecionados indivíduos saudáveis, satisfazendo obrigatoriamente os critérios (a) e (b):
a) Ter idade maior que 18 anos; E
b) Assinar termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE);
Foram considerados como critérios de exclusão:
a) Ter idade abaixo de 18 anos; OU
b) Não assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE); OU c) Estar em uso de compostos contendo ferro; OU
d) Possuir histórico de transfusão sanguínea; OU e) Possuir história familiar de HHs; OU
f) Apresentar anormalidades nos testes laboratoriais realizados.
3.2. Coleta de amostras
De cada participante (paciente ou controle), foram coletados por punção venosa dois tubos de 4mL de sangue periférico, sendo um tubo contendo anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetracético) e o outro tubo sem anticoagulantes (tubo seco). As amostras coletadas em EDTA foram cuidadosamente homogeneizadas por inversão, e ambos os tubos foram mantidos na posição vertical a temperatura ambiente até seu processamento.
3.3. Testes laboratoriais hematológicos e bioquímicos
Para todos os voluntários, foram realizados um hemograma completo com a amostra coletada em tubo de EDTA (Analisador Hematológico Advia 2120, Siemens) e os testes bioquímicos relevantes para o metabolismo do ferro com as amostras coletadas em tubo seco: quantificação de Ferritina Sérica (plataforma Cobas E601, Roche – método de eletroquimioluminescência), Ferro Sérico (Plataforma AU5800, Beckman Coulter – método colorimétrico), Capacidade Total de Ligação ao Ferro (TIBC - Total Iron Binding Capacity) (Plataforma AU5800, Beckman Coulter – método BC TPTZ) e Índice de Saturação da Transferrina (TSAT) (resultado calculado). Esses exames complementares foram utilizados para análise e possível exclusão de voluntários do grupo controle que não apresentassem esses parâmetros dentro dos valores de referência utilizados pelo laboratório clínico, além de embasar a interpretação dos resultados obtidos na citometria de fluxo.
3.4. Determinação da expressão de ferroportina em células de sangue periférico através de imunofenotipagem por citometria de fluxo
A imunofenotipagem por citometria de fluxo foi realizada utilizando-se um anticorpo primário para ferroportina-1 humana, policlonal, produzido em coelho, não-conjugado com fluorocromos (LifeSpan BioSciences).
Uma alíquota de 25µL do sangue periférico venoso coletado em tubo contendo anticoagulante EDTA foi incubada com 0,7µL de anticorpo primário anti-Fpn-1 humana não-conjugado (LifeSpan BioSciences), homogeneizado e incubado por 30 minutos, protegido da luz e em temperatura ambiente. Após esse período, a amostra foi lavada com 2 mL de PBS 0,1M + 0,5% BSA e centrifugada por 5 minutos a 540 g a temperatura ambiente.
Após a lavagem, foi adicionado 0,5µL do anticorpo secundário IgG anti-coelho Alexa Fluor 633 (Invitrogen), homogeneizado e incubado por 30 minutos, protegido da luz e em temperatura ambiente, e então nova lavagem foi realizada nas mesmas condições da anterior. Seguiu-se então a incubação por 30 minutos com os anticorpos conjugados anti-CD3 PerCP Cy5.5 (BD Biosciences), anti-CD19 PE Cy7
(BD Biosciences), anti-CD33 PE (BD Biosciences), anti-CD45 V500 (BD Biosciences) e anti-HLA-DR V450 (BD Biosciences), utilizados para a identificação das linhagens celulares.
A seguir, foi adicionada a solução lisante de hemácias BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences) diluída na proporção 1:10 em água destilada por 10 minutos, à temperatura ambiente, protegido da luz e centrifugado por 5 minutos a 540 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet de células foi lavado com 2 mL de PBS 0,1M + 0,5% BSA nas mesmas condições anteriores. O pellet resultante foi ressuspendido em 200µL de PBS 0,1M + 0,5% BSA e analisado no citômetro de fluxo BD FACSCanto II (BD Biosciences) através do software FACSDiva versão 6.1.3 (BD Biosciences), sendo adquiridas 5000 células dentro da região (gate) de monócitos. Paralelamente a esse tubo, para cada voluntário (paciente ou controle), também foi incubado um tubo sem anticorpos (tubo branco) e um tubo sem o anticorpo primário anti-Fpn-1 (tubo negativo), para podermos identificar e avaliar possíveis backgrounds presentes na análise.
A estratégia de análise foi realizada conforme representado na Figura 5. Num dot plot de CD45 x SSC, os leucócitos presentes no sangue total foram distribuídos em populações de acordo com a Intensidade Média de Fluorescência (IMF) para CD45 e a complexidade interna (SSC). Assim, foram selecionadas as populações das regiões de monócitos e linfócitos. A população da região de monócitos foi então analisada por CD33 e HLA-DR, antígenos mais específicos para essa linhagem, dos quais os monócitos apresentam forte expressão, eliminando assim possíveis células contaminantes. As células da região de linfócitos foram separadas em linfócitos B, pela marcação de CD19, e linfócitos T, pela marcação de CD3. Essas três populações definidas, monócitos, linfócitos B e linfócitos T, foram analisadas quanto à IMF de Fpn.
Figura 5. Estratégia de gates utilizada para a análise da citometria de fluxo. A. Leucócitos presentes no sangue total, distribuídos num dot plot CD45 x SSC, onde foram selecionadas as regiões (gates) de monócitos e de linfócitos. B. Definição da população de monócitos através dos marcadores específicos da linhagem monocítica CD33 e HLA-DR. C. Definição das populações de linfócitos B e T através dos marcadores específicos das linhagens linfocíticas, sendo CD19 para linfócitos B e CD3 para linfócitos T. D. Exemplo do padrão de expressão de ferroportina (Fpn) encontrado em monócitos (verde), linfócitos T (azul) e linfócitos B (rosa).
LINFÓCITOS T LINFÓCITOS B D C MONÓCITOS B REGIÃO DE MONÓCITOS REGIÃO DE LINFÓCITOS A
3.5. Análise estatística
Todos os dados obtidos foram consolidados em planilhas utilizando Microsoft Excel (Microsoft, EUA) e analisados utilizando o software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, EUA). Diferenças foram consideradas significativas utilizando valor de P menor que 0.05.
4. RESULTADOS
4.1. Casuística e dados clínico-laboratoriais
No Sistema Informatizado da Hematologia do Hemocentro da Unicamp foram encontrados 57 pacientes cadastrados como sobrecarga de ferro ou HH. Destes, 6 não compareceram para as coletas, 17 perderam seguimento ou receberam alta médica, e 3 não se enquadravam nos critérios de inclusão do estudo (2 portadores de porfiria cutânea tarda e 1 com histórico de transfusão sanguínea). Assim, ao final da triagem, foram coletados 31 pacientes (Figura 6).
Figura 6. Fluxograma representando o processo de triagem, convocação e coleta dos pacientes do estudo.
O grupo controle foi formado por voluntários dentre funcionários e alunos do Hemocentro de Campinas, observando os critérios de inclusão e exclusão do estudo, incluindo a análise dos resultados obtidos de exames laboratoriais (bioquímicos e hemograma) realizados após a coleta. No total, foram coletados 27 indivíduos controles, sendo 12 excluídos por apresentarem os exames bioquímicos e/ou hemoglobina fora dos valores de referência recomendados pelo laboratório clínico (Figura 7).
Figura 7. Fluxograma representando o processo de coleta e triagem dos controles do estudo.
Assim, de julho/2018 a outubro/2019, foram coletadas 58 amostras totais, sendo 31 pacientes e 27 controles, sendo 12 controles excluídos. Ao final, a população de estudo resultante contou com 46 participantes, sendo 31 pacientes e 15 controles. Os dados demográficos se encontram descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Dados demográficos e populacionais da população de estudo. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
4.2. Genótipo para mutações do gene HFE
Os pacientes incluídos neste estudo foram selecionados por terem ou diagnóstico confirmado de Hemocromatose Hereditária tipo 1, ou por fenótipo clínico de sobrecarga de ferro, nos quais as mutações implicadas no diagnóstico de HH tipo 1 foram pesquisadas como parte da rotina ambulatorial do Ambulatório de Hematologia. O maior grupo correspondeu a pacientes com apenas heterozigose para HFE H63D, 8/31 (25.8%), genótipo que não caracteriza hemocromatose. Quase um terço dos pacientes incluídos (10/31) apresentaram genótipos associados a HH tipo 1, sendo que a homozigose para HFE C282Y era o diagnóstico de base de 7/31 (22.6%) dos pacientes.
Na Figura 8, está representada a distribuição dos pacientes de HHs participantes deste estudo em função do genótipo identificado para mutações no gene HFE, associadas a HH tipo 1.
Controles (N=15)
Pacientes (N=31)
P
Idade, anos (variação) 33 ± 13 (21-60) 57 ± 11 (31-80) <0.0001
Gênero feminino, N (%) 8 (53) 5 (16) 0.0086
Hemoglobina, g/dL 14,8 ± 1,3 14,9 ± 1,9 0.9173 Ferritina, ng/mL 110 (34-333) 163 (34-1430) 0.0353 Ferro Sérico, ng/mL 100 ± 19 147 ± 52 <0.0001 Saturação de Transferrina, % 29 ± 6 45 ± 13 <0.0001
Figura 8. Distribuição dos pacientes deste estudo de acordo com os genótipos para o gene HFE. WT = alelo não mutado (“wild type”) para o gene HFE, 282 = alelo com mutação HFE p.C282Y, 63 = alelo com mutação HFE p.H63D, 65 = alelo com mutação HFE p.S65C
4.3. Expressão de ferroportina na superfície de células do sangue periférico em controles e pacientes com sobrecarga de ferro
O estudo da expressão de Fpn por citometria de fluxo demonstrou que essa proteína é expressa nas populações de monócitos e linfócitos B, e não em linfócitos T, sendo este padrão representado pela Figura 5. Observou-se também que os monócitos de algumas amostras de pacientes (Figura 9A) apresentam uma Intensidade Média de Fluorescência (IMF) de ferroportina mais intensa que a observada em monócitos de amostras de controle (Figura 9B).
Figura 9. Exemplo de histogramas de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) encontrada em células de um paciente com fenótipo de hemocromatose (A) e de um indivíduo controle (B). Os linfócitos T (curva azul) atuam como controle negativo nesses histogramas e tem o pico de intensidade pouco acima de 102 unidades arbitrárias (U.A.) de fluorescência. Nota-se que a IMF
dos monócitos (curva verde) na Figura 9A tem o pico acima de 104 U.A., enquanto
na Figura 9B, no controle, os monócitos tem o pico pouco acima de 103 U.A., ou
seja, da ordem de 10 vezes menor.
Assim, através das análises estatísticas, buscamos encontrar evidências de que a expressão de Fpn é maior em pacientes de HH do que em controles saudáveis, utilizando para isso o valor de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) de Fpn.
Não encontramos diferenças estatisticamente significativas entre pacientes e controles em relação a IMF absoluta de Fpn, nem a IMF de Fpn corrigida com a IMF de outras proteínas com expressão endógena mais estável, tais como o CD45 (razão IMF Fpn / IMF CD45) (Figuras 10 e 11).
A B
Figura 10. Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) absolutas de ferroportina (Fpn) na superfície de monócitos do grupo de controles e do grupo de pacientes. As barras representam média ± desvio padrão, valores em unidades arbitrárias. P>0.05
Figura 11. Razões entre Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) e controle endógeno CD45 em monócitos de controles e de pacientes. As barras representam média ± desvio padrão. P>0.05
4.4. Expressão relativa de ferroportina de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) do sangue periférico em controle e pacientes
Considerando que os linfócitos T não apresentam expressão de Fpn, podemos então considerá-los como um controle negativo intra-amostra para esta proteína, e cuja autofluorescência basal detectada seria uma base adequada de comparação. Assim, analisamos a relação entre a IMF de Fpn dos Monócitos / Linfócitos T (IMFr), pois assim estaríamos corrigindo possíveis backgrounds resultantes da técnica e minimizando os efeitos da autofluorescência celular. Também não encontramos diferenças estatisticamente significativas entre controles e pacientes nesta análise. No entanto, a distribuição de pontos sugere que há um subgrupo de pacientes com uma hiperexpressão relativa de Fpn, com maiores níveis de IMFr (Figura 12).
Figura 12. Razões entre as Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) em pacientes e controles. As barras representam média ± desvio padrão. P>0.05
4.5. Expressão de ferroportina de Monócitos de acordo com o genótipo para HFE apresentado pelos pacientes
Testamos então a hipótese de que a IMF de Fpn poderia variar conforme o genótipo para HFE, sendo maior em pacientes com genótipos definidos de HH tipo 1 (homozigose C282Y e heterozigose dupla C282Y/H63D).
Analisando a IMF de Fpn absoluta de monócitos em cada grupo para o genótipo HFE, observamos que não houve diferença estatisticamente significativa de nenhum genótipo em relação ao grupo controle, porém o grupo de genótipo homozigoto H63D teve uma média de 16278.8 U.A., enquanto nos controles a média foi de 7595.2 (Figura 13).
Figura 13. Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) absolutas em monócitos encontradas em cada grupo de acordo com genótipo para o gene HFE no grupo de pacientes. WT = alelo não mutado (“wild type”) para o gene HFE, 282 = alelo com mutação HFE p.C282Y, 63 = alelo com mutação HFE p.H63D, 65 = alelo com mutação HFE p.S65C. As barras representam a média ± desvio padrão. P>0.05.
Também na análise de IMF de Fpn de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas que indicassem variações de IMFr em função do genótipo (Figura 14). Apesar disso, a população com fenótipo de homozigose C282Y parece ter uma tendência a ter uma IMFr de Fpn mais alta que as demais, com uma média de 38.36, maior que a do controle, que foi de 22.65, porém não foi atingida significância estatística, provavelmente devido ao baixo número de pacientes em cada grupo.
Figura 14. Intensidades Médias de Fluorescências relativas (IMFr) de ferroportina (Fpn) de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) encontradas em cada grupo em função do genótipo para o gene HFE no grupo de pacientes. WT = alelo não mutado (“wild type”) para o gene HFE, 282 = alelo com mutação HFE p.C282Y, 63 = alelo com mutação HFE p.H63D, 65 = alelo com mutação HFE p.S65C. Os dados são representados como média ± desvio padrão. P>0.05
4.6. Expressão relativa de ferroportina de Monócitos / Linfócitos T (IMFr) de acordo com a saturação de transferrina (TSAT)
Apesar de não termos encontrados diferenças estatisticamente significativas na IMFr de Fpn, quando comparados os grupos de controles e pacientes, a análise de subgrupos de pacientes revelou que pacientes com uma saturação de transferrina (TSAT) elevada, acima de 50%, no momento da coleta da amostra, apresentam uma IMFr de Fpn significativamente maior em relação aos controles e aos indivíduos com TSAT abaixo de 50% (Figura 15).
Figura 15. Razões entre Intensidades Médias de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) de Monócitos e Linfócitos T (IMFr) em controles, pacientes com saturação de transferrina (TSAT) >50%, e pacientes com TSAT<50%. As barras representam média ± desvio padrão. P>0.05 para controles vs. TSAT<50%, P=0.0162 para controles vs. TSAT>50%
4.7. Análise da Curva de Característica de Operação do Receptor (curva ROC)
A análise da Curva de Característica de Operação do Receptor (curva ROC) confirmou que uma IMFr>39.07 tem sensibilidade de 50.00% e especificidade de 91.18% para detectar uma TSAT>50% (Figura 16).
Figura 16. Curvas de Característica de Operação do Receptor (curva ROC) para predição da presença de saturação de transferrina acima de 50% (TSAT>50%) utilizando valores de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) de ferroportina (Fpn) absoluta em monócitos (linha preta), em linfócitos T (linha azul) e a relação de IMF de Fpn de Monócitos / Linfócitos T (IMFr, linha verde). A maior Área Sob a Curva (ASC) foi encontrada em IMFr, ASC=0.7623, P=0.0074; ASC de Linfócitos T=0.5735, ASC de Monócitos=0.7230
5. DISCUSSÃO
Neste estudo, enfocamos a fisiopatologia das hemocromatoses hereditárias à luz do conhecimento atual de que a deficiência de hepcidina causada pelas mutações genéticas implicadas nessas doenças leva a hiperexpressão de ferroportina em determinados tipos celulares, favorecendo, por exemplo, a absorção descontrolada de ferro da dieta, que é um dos aspectos fundamentais da fisiopatologia da sobrecarga de ferro nas HH30,31,32. Assim, foi de nosso interesse
avaliar a expressão de ferroportina em células do sangue periférico em amostras humanas.
Apresentamos aqui, pela primeira vez, um teste utilizando citometria de fluxo, que permitiu avaliação da expressão da proteína Fpn na superfície de células circulantes no sangue periférico. A Fpn é o único exportador de ferro em mamíferos e o receptor da principal proteína controladora do tráfego de ferro através das membranas das células envolvidas no uso, estocagem e reciclagem de ferro, e sua expressão é regulada de forma pós-transcricional26, 27, de modo que a avaliação da
expressão proteica é mais indicativa da atividade exportadora de ferro celular do que, por exemplo, a quantificação da transcrição do gene por reação em cadeia da polimerase em tempo real (real time PCR) para quantificação relativa de RNA mensageiro.
A expressão de Fpn é sabidamente maior em células como enterócitos duodenais e hepatócitos, mas ela já foi relatada em células de outros órgãos, tais como baço, ovários e placenta24,56. Sua expressão em células do sangue periférico
já havia sido notada através de técnicas como real time PCR e Western blotting, 57, 58, e em nosso estudo, pudemos demonstrar sua expressão particularmente em
monócitos e nos linfócitos B com o uso de citometria de fluxo.
Foi investigada a hipótese de que a expressão de Fpn é significativamente maior em células de pacientes com diagnóstico clínico e/ou laboratorial de hemocromatoses, uma vez que a base fisiopatológica dessas doenças é o aumento descontrolado da absorção de ferro por falta do bloqueio da Fpn pela hepcidina. A expressão de Fpn monocítica, quando medida através de valores absolutos de fluorescência (IMF) não demonstrou diferenças significativas entre os grupos de pacientes e controles, embora fosse claro que uma parte dos
