Influência da composição de carreador biodegradável na viabilidade do implante de células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano

Texto

(1)ISA DIETRICH. Influência da composição de carreador biodegradável na viabilidade do implante de células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano. Tese apresentada ao Departamento de CárdioPneumologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Cardiologia Orientadora: Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues. SÃO PAULO 2004.

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(3) A meus amados pais, Ivo e Rosa;. abrigo de dedicação incansável, sábios mestres na arte de enfrentar desafios..

(4) Agradecimentos. À Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues, dedicada orientadora, pelos ensinamentos e pela condução sempre segura e precisa. Agradeço sua solicitude, compreensão e generosidade.. Aos Professores Aldo Junqueira Rodrigues Jr. e José Antonio Franchini Ramires, cujo incentivo e apoio foram determinantes para a realização deste projeto.. Ao Dr. Christian Dani, pela carinhosa acolhida em Nice, pelos ensinamentos e pelo suporte irrestrito ao nosso trabalho.. Ao Dr. Gerard Ailhaud, pela orientação e receptividade.. Aos doutores EZ-Zoubir Amri e Pascal Peraldi, pela disponibilidade infatigável e pelos ensinamentos.. A Anne Spadafora, pela contribuição inestimável e genuína dedicação no processamento dos implantes para análise.. A Genevieve Oillaux, pelo carinho e ajuda incansáveis.. A Olivia Cochet, Phi Villageois, Anne Marie Rodrigues, Frederic Delteil, WendyCousin, Anissa Abderrahin, Olivier Bezy, Christian Erlabd, Valerie Navarro, Cecile Vernochet, Brigitte Wdziekonski e Laure-Emmanuelle Zaragosi, por toda ajuda, ensinamentos e carinho nos caminhos percorridos nos laboratórios em Nice.. Aos Doutores Yves Laudoyer, Evelyne Bourgeon, Jorge Delas e Maria Cláudia Sanchez Giometti, por terem permitido o acesso a seus pacientes..

(5) Às pacientes que doaram o tecido para a realização da pesquisa.. Ao Dr. José Eduardo Krieger, pela ajuda e receptividade no Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.. Ao Dr. Durvanei Augusto Maria, pelo auxílio na interpretação dos resultados e pelas sugestões.. Aos Doutores Célia Maria Cassaro Struntz e Roberto Rocha Corrêa Veiga Giraldez, pelas valiosas sugestões.. A Alexandre Queiroz Silva, Gina Camilo Rocha Silvestre, Maria das Graças Ribeiro Batista e Leide Santos, integrantes do Laboratório de Investigação Médica 02 da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pela importante contribuição.. Aos amigos Yves Laudoyer e Giuliana Sampogna, pela amizade e apoio em Nice..

(6) À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pela concessão de bolsa do Programa de Doutorado no País com Estágio no Exterior.. À Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pela contribuição na análise das células por meio da citometria de fluxo..

(7) “Nem tudo que se enfrenta pode ser modificado, mas nada pode ser modificado até que seja enfrentado.”. Albert Einstein.

(8) Este projeto foi agraciado com a concessão de bolsa da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), sob processo BEX1125/02-8, junto ao Programa de Doutorado no País com Estágio no Exterior (PDEE).. Na França, o trabalho esteve sob a supervisão do Dr. Christian Dani, diretor do Laboratório de Células Tronco e Diferenciação do Centro de Bioquímica da Universidade de Nice-Sophia-Antipolis..

(9) Esta tese está de acordo com:. Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors(Vancouver).. Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Annelise Carneiro da Cunha, Maria Júlia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2004.. Abreviatura dos títulos de periódico de acordo com List of Journals Indexed in Índex Medicus..

(10) SUMÁRIO. Lista de siglas e abreviaturas Lista de símbolos Lista de figuras Lista de tabelas Resumo Summary 1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 1 2. OBJETIVO ............................................................................................... 17 3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................... 19 3.1 Obtenção das células mesenquimais indiferenciadas humanas ....... 20 3.2 Preparação dos carreadores biodegradáveis e incorporação das células ............................................................................................... 22 3.3 Implante dos carreadores.................................................................. 24 3.4 Sacrifício dos animais e recuperação dos implantes........................ 26 3.5. Análise dos implantes ....................................................................... 27 3.5.1 Análise macroscópica a fresco ............................................... 27 3.5.2 Análise histológica e por imunofluroescência indireta ........... 27 3.5.3 Extração, quantificação e amplificação do DNA genômico.... 30 4. RESULTADOS......................................................................................... 35 4.1 Caracterização citológica das células mesenquimais indiferenciadas humanas ............................................................................................ 36 4.2 Análise macroscópica dos implantes a fresco.................................. 37 4.2.1 Carreador 1: membrana de ácido glicólico e carbonato de trimetileno ............................................................................... 37 4.2.2 Carreador 2 - Gel de Ácido Hialurônico ................................. 38 4.3 Análise histológica e por imunofluorescência indireta ....................... 40 4.3.1 Carreador 1 : membrana de ácido glicólico e carbonato de trimetileno ............................................................................... 40 4.3.2 Carreador 2: Gel de ácido hialurônico reticulado.................... 44 4.4 Verificação da presença de DNA humano nos Implantes ................ 48 5. DISCUSSÃO............................................................................................ 51 6. CONCLUSÕES........................................................................................ 62 7. REFERÊNCIAS ....................................................................................... 64 Apêndice ...................................................................................................... 84.

(11) LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. BDIS. Bencton Dickinson Immunodiagnostic Systems. BEAT. BioEngineered Autologus Tissue. bFGF. fator básico de crescimento de fibroblasto. CD. grupo de diferenciação. CNRS. Centre National de la Recherche Scientifique. CPH. complexo principal de histocompatibilidade. DAPI. 4’-6’-Diamino-2-phenylindole. DMEM. meio de Dubelcco modificado por Eagle. DNA. ácido deoxirribonucleico. dNTPs. deoxinucleotídeos trifosfato. dATP. deoxiadenosina 5’trifosfato. dCTP. deoxicitosina 5’trifosfato. dGTP. deoxiguanosina 5’trifosfato. dTTP. deoxitimidina 5’trifosfato. DO. densidade ótica. FACS. classificador de células por ativação da fluorescência. FDA. US Food and Drug Adminstration. FITC. isotiocianato de fluoresceína. FSC. dispersão frontal. HLA. antígeno leucocitário humano. VEGF. fator de crescimento de endotélio vascular. IgG. imunoglobulina G.

(12) INCOR. Instituto do Coração. INSERM. Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale. KDR. receptor de domínio para quinase. LIM. Laboratório de Investigação Médica. MOM. camundongo sobre camundongo. NK. citotóxicas naturais. PBS. solução tampão fosfato. PC. computador pessoal. PCR. reação em cadeia da polimerase. PDGF. fator de crescimento derivado de plaquetas. PE. ficoeriterina. SIDA. síndrome do vírus da imunodeficiência adquirida. SSC. dispersão lateral. U. unidade. UMR. Unidade Mista de Pesquisa. UV. ultravioleta.

(13) LISTA DE SÍMBOLOS. 0. C. grau Celsius. cm. centímetro. cm2. centímetro quadrado. CO2. gás carbônico. g. unidade de força centrífuga relativa. gr. grama. kg. kilograma. ml. mililitro. mm. milímetro. µm. micrômetro. m2. metro quadrado. µg. micrograma. ng. nanograma. pmol. picomol. %. por cento. :. para. V. volt.

(14) LISTA DE FIGURAS. Figura 1.. Representação esquemática das células tronco quanto à origem.. .........................................................................................7. Figura 2.. Representação esquemática das linhagens celulares derivadas da célula tronco mesenquimal do organismo adulto...10. Figura 3.. Aspectos macro e microcóspico da membrana biodegradável. ..23. Figura 4.. Células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano em cultura. ....................................................................37. Figura 5.. Aspecto macroscópico do implante do Carreador 1....................38. Figura 6.. Aspecto macroscópico do implante do carreador 2. ...................39. Figura 7.. Aspecto histológico do implante do carreador 1 com 3 semanas......................................................................................41. Figura 8.. Aspecto histológico do implante do carreador 1..........................41. Figura 9.. Imunofluorescêcncia indireta + DAPI do implante do carreador 1, com 3 semanas.......................................................43. Figura 10. Aspecto histológico do implante do carreador 2 com 3 semanas......................................................................................45 Figura 11. Aspecto histológico do implante do carreador 2, com 8 semanas......................................................................................45 Figura 12. Imunofluorescência indireta + DAPI do implante do carreador 2, com 8 semanas.......................................................................47 Figura 13. Eletroforese em gel de agarose do produto da PCR do DNA extraído dos implantes, com 3 semanas ......................................49 Figura 14. Eletroforese em gel de agarose do produto da PCR do DNA extraído dos implantes de membrana biodegradável, com 8 semanas......................................................................................50.

(15) LISTA LDE TABELAS. TABELA 1 - Filtro empregado para cada marcador fluorescente e cor resultante na imunofluorescência. ...........................................30 TABELA 2 - Programa dos ciclos utilizados no termociclador para PCR ....33 TABELA 3 - Número dos implantes analisados segundo os grupos experimentais. c/ cels hu - implantados com células humanas. .................................................................................36.

(16) RESUMO. Dietrich,I. Influência da composição de carreador biodegradável na viabilidade do implante de células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2004. 83p. Perda de tecidos e falência de órgãos constituem, universalmente, os mais freqüentes, devastadores e custosos problemas de saúde pública. O advento da engenharia de tecidos, alicerçada no tripé células de reservacarreador biodegradável-fatores bioativos, trouxe nova perspectiva para reparação e regeneração tecidual. O objetivo deste estudo foi comparar dois materiais biodegradáveis, já de uso corrente na prática clínica, quanto à propriedade de servirem como carreadores para assegurar a viabilidade do implante de células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano no tecido subcutâneo de camundongos atímicos. Três pacientes submetidas à lipoaspiração doaram, cada uma, 100ml de tecido adiposo, após consentimento informado. As células mesenquimais indiferenciadas foram obtidas por digestão enzimática do tecido adiposo e expandidas em cultura. Células da segunda passagem foram utilizadas nos implantes. Vinte e quatro fêmeas de camundongos atímicos de 10 semanas de vida foram divididas em dois grupos: o grupo I (12 animais) recebeu no tecido subcutâneo da região subescapular direita, implante de membrana de 0,25cm2 de ácido glicólico e carbonato de trimetileno semeada com 1 x 106 células; e o grupo II (12 animais) recebeu injeção de 0,2ml de gel de ácido hialurônico reticulado contendo a mesma quantidade de células mesenquimais humanas. Como controle, cada animal recebeu na região contralateral o implante do carreador sem células. Duas horas antes do implante, todos os carreadores, com e sem células, receberam a adição 10ng/ml de fator básico de crescimento fibroblasto (bFGF) .Metade de cada grupo de animais foi aleatoriamente escolhida para o sacrifício após 3 semanas de implante, sendo a outra metade sacrificada após 8 semanas. Cinco animais morreram antes da data prevista para o sacrifício e seus implantes foram excluídos do estudo. Após o sacrifício, os implantes foram recuperados e analisados nos seus aspectos macroscócpico e histológico. A pesquisa de células humanas com anticorpo anti vimentina humana, e de vasos, com anti corpo anti fator de von Willebrant, foi realizada por meio da imunofluorescência indireta e a pesquisa do DNA genômico pela reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificando um fragmento específico do cromossomo humano 17. Com três semanas de implante, os dois carreadores apresentaram intensa vascularização e a presença de células mesenquimais humanas, foi confirmada pela imunofluorescência e pela PCR. Com 8 semanas, somente no carreador de gel de ácido hialurônico foi possível identificar a presença de células humanas que se encontravam organizadas em cordões, formando um bloco de tecido com rico suprimento vascular. Todos os implantes controles mostraram-se avasculares. No modelo experimental estudado, verificamos que a composição do carreador.

(17) influiu na viabilidade do implante de células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano, sendo que o gel de ácido hialurônico mostrou ser melhor carreador do que a membrana de ácido glicólico e carbonato de trimetileno..

(18) SUMMARY. Dietrich, I. Influence of scaffold composition in the viability of implantation of human adipose derived undifferentiated mesenchymal cells. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2004. 83p.. Loss of tissues and organs failure are worldwide the most common, devastating and expensive problems in public health. The advent of tissue engineering, based upon the three-component system reserve cellsbiodegradable scaffold-bioactive factors, has brought new prospects to tissue repairing and regeneration. The aim of this study was to compare two biodegradable materials, which have currently been used in clinical practice, to serve as carrier in order to assure the viability of adipose derived undifferentiated mesenchymal cells implanted subcutaneously in athimic mice. Three patients who had undergone liposuction donated,each one,100ml of adipose tissue, after informed consent. Cells were obtained through enzymatic digestion and tissue centrifugation and then expanded in culture. Cells from the second passage were trypsinized for the implant preparation. Twenty-four ten-weeks old female athymic mice were divided into two groups. In group one, twelve animals received an implant of a 0,25 cm2 glycolic acid and trimethylene carbonate membrane which was seeded with 1 X 106 cells. In group two, other twelve animals received an injection of cross-linked hyaluronic acid gel containing the same amount of cells. After anesthesia implants were performed in the subcutaneous tissue of the right subscapular area and, as a control, each animal received the scaffold alone, with no cells, in the contralateral area. Two hours before implant, all scaffolds, including the control ones, received the addition of 10 ng/ml of basic Fibroblast Growth Factor (bFGF). Half of each animal group was randomized for sacrifice after three weeks and the other half after eight weeks. Five animals died before the settled date for the sacrifice and were excluded. Retaken after sacrifice, implants were studied through macroscopic observation, histological study (hematoxylin-eosin), immunofluorescence (using human antivimentine antibody to identify human cells and anti von Willebrant factor antibody to visualize vessels) and through genomic DNA extraction, amplifying a specific fragment of the 17 human chromosome by polimerase chain reaction (PCR). All the controls showed themselves avascular and negative for human cells identification. After three weeks of implantation the two scaffolds presented intense vascularization and the identification of human cells, not only through immunofluorescence but also by PCR, was positive in both of them. After eight weeks, however, only in the hyaluronic acid gel scaffold human cells could be identified, organized in cords, making up a tissue mass with rich vascular supply. In this model, the scaffold composition influenced the viability of adipose derived undifferentiated mesenchymal cells and hyaluronic acid gel proved to be a better carrier than poliglycolic acid and trimethylene carbonate membrane..

(19) 1. INTRODUÇÃO.

(20) Introdução. 2. 1. INTRODUÇÃO. Perda de tecidos e falência de órgãos decorrentes de trauma, ressecções oncológicas, mal formações congênitas, doenças metabólicas, doenças cardiovasculares ou doenças infecciosas, são os mais freqüentes, devastadores e custosos problemas para a administração da saúde pública. Segundo Langer e Vacanti1, a cada ano, aproximadamente 8 milhões de procedimentos cirúrgicos são realizados nos Estados Unidos para tratar estas afecções, demandando 40 a 90 milhões de diárias hospitalares. No. Brasil,. no. ano. de. 2000,. as. doenças. cardiovasculares. representaram a primeira causa de óbito2 e a terceira de permanência hospitalar prolongada, tendo sido responsáveis pela principal alocação de recursos públicos em hospitalizações, demandando aproximadamente 821 milhões de dólares3. As doenças cardiovasculares representam, universalmente, um grave problema de saúde pública e estima-se que, em 2001, um terço dos óbitos no mundo, ou seja, 16,6 milhões de mortes, resultaram das várias formas dessa doença. Embora pelo menos 20 milhões de pessoas, felizmente, sobrevivam a infartos e acidentes vasculares cerebrais, a cada ano, muitas delas continuam a depender de atenção clínica dispendiosa, resultante das seqüelas decorrentes da perda tecidual4. A morbi-mortalidade devida a causas externas (quedas, agressões, lesões autoprovocadas, eventos relacionados com transportes e demais.

(21) Introdução. 3. causas) também vem se tornando significativo ônus para as populações de todo o mundo. No Brasil, em 2000, foram realizadas 652.249 internações por causas externas, que representaram 5,2% do total de internações do SUS. No mesmo ano, a reparação das seqüelas e o tratamento das complicações dos acidentes foram responsáveis por 32.855 destas internações5. De acordo com Vacanti e Vacanti6, em sua revisão histórica dos avanços da medicina, que culminam com o advento da engenharia de tecidos, a prioridade no tratamento da lesão ou perda tecidual fundamentouse, inicialmente, na criação de técnicas para salvar a vida. Com o advento da anestesia, em meados do século XIX, passaram a ser realizadas intervenções extirpativas para ressecção de tumores, de segmentos intestinais e amputação de extremidades infectadas, visando a salvar a vida em situações extremas. Contudo, a manutenção da vida sem considerar o impacto psicossocial causado pelo comprometimento da imagem corporal, decorrente de ressecções e amputações, não contempla o conceito abrangente de saúde, como bem estar físico e mental. Assim sendo, como bem observam estes autores, técnicas visando à restauração da função e a reparação tecidual passaram a ser parte integrante da medicina moderna. As ressecções de tumores da face, pescoço, mamas, ossos, bem como a perda de tecidos por traumas, anomalias congênitas ou alterações decorrentes do envelhecimento levam à deformidades, que alteram o contorno corporal. A reparação destes defeitos ainda constitui grande desafio para os cirurgiões plásticos7. As reconstruções com tecido autólogo, utilizando enxertos de pele, retalhos pediculados ou livres, podem implicar.

(22) Introdução. em seqüela estética e/ou. 4. funcional da área doadora8. Além disso, a. viabilidade dos retalhos pode ser afetada por fatores como diabetes e tabagismo, que comprometem o suprimento vascular, podendo levar ao insucesso do procedimento9. Os aloenxertos têm como desvantagem o potencial de desencadear reações imunogênicas e alergênicas e, juntamente com os homoenxertos, representam risco de transmissão viral10. Ao longo da história da cirurgia plástica11-14, com o advento da lipoaspiração, a enxertia de tecido adiposo vem sendo tentada para o preenchimento de depressões e o aumento de partes moles. Todavia, os enxertos de gordura autóloga produzem resultados imprevisíveis, dada a alta taxa de absorção do tecido enxertado e a formação de cistos oleosos. Isto ocorre porque os adipócitos são facilmente danificados pelo trauma da lipoaspiração, liberando o conteúdo de seu citoplasma, que é constituído em 80 a 90% por lípides. Assim sendo, o produto da lipoaspiração contém adipócitos danificados, inviabilizando o método para aplicação clínica15. Alternativamente, materiais sintéticos têm sido empregados, a exemplo das próteses de silicone para reconstrução mamária. Entretanto, estes podem promover reação do tipo corpo estranho, infecção, extrusão, ruptura e contratura capsular, causando dor e deformidade, obrigando, às vezes, à remoção do implante16-18. Outras substâncias inabsorvíveis como politetrafluoretileno, polietileno e polimetilmetacrilato vêm sendo utilizadas para preencher pequenos volumes, com incidência variável de migração e de complicações acima citadas19,. 20. . Substâncias absorvíveis, como ácido.

(23) Introdução. 5. hialurônico e colágeno bovino são apenas temporárias, requerendo a repetição periódica do procedimento para a manutenção do resultado. As substâncias alogênicas, como a última citada, podem causar reação alérgica21, 22. Os. avanços. da. biologia. molecular. e. celular. trouxeram. conhecimentos sobre o processo de diferenciação celular, a interação entre diferentes tipos celulares, a conexão entre estas e a matriz extracelular e a atuação de fatores bioativos. Estas conquistas permitiram o advento da Engenharia de Tecidos, uma especialidade interdisciplinar, que aplica princípios da engenharia e da biologia para criar substitutos biológicos com a finalidade de restaurar, manter, substituir ou melhorar tecidos ou órgãos danificados1. Basicamente, a estratégia consiste em implantar uma estrutura constituída por um carreador biodegradável tridimensional contendo células específicas, com capacidade de reconstruir, in vivo, o tecido em questão. O primeiro relato a vislumbrar a aplicação terapêutica da engenharia de tecidos, data de 1975, quando Chick et al23 reportaram seus resultados com implantes de ilhotas pancreáticas encapsuladas em membranas semipermeáveis,. visando. a. melhorar. o. controle. da. glicemia. em. camundongos diabéticos. Yannas et al24, em 1980, criaram matriz de colágeno e glicosaminogicanos para auxiliar na regeneração da derme de pacientes queimados. Bell et al25, um ano após, semearam fibroblastos em gel de colágeno para a mesma finalidade..

(24) Introdução. 6. Young e Lucas26 propuseram um modelo para engenharia de tecidos. Este modelo é baseado num sistema de três componentes estruturais e interdependentes, a saber : 1- células de reserva, 2- fatores bioativos e 3- matrizes ou carreadores biocompatíveis.. Neste modelo, as células e os fatores bioativos podem ser recrutados do próprio receptor, in vivo, ou podem ser fornecidos exogenamente. As células podem ainda ser pré-tratadas, ex vivo, com fatores bioativos ou modificadas geneticamente. Exemplos de fatores bioativos incluem: - agentes proliferativos: fator de crescimento derivado de plaquetas; - agentes que induzem o comprometimento da célula com determinada linhagem: proteína morfogenética de osso, proteína morfogenética de cartilagem, fator de crescimento de queratinócito, fator de crescimento de hepatócito; - fatores angiogênicos: VEGF (fator de crescimento de endotélio vascular), bFGF (fator básico de crescimento de fibroblasto); - fatores indutores da diferenciação celular: insulina, fator de crescimento insulina-like (IGF); - fatores inibidores da diferenciação celular: fator inibidor de leucemia, fator inibidor de cicatriz.. As células e os fatores bioativos devem ser incorporados à matriz protetora ou carreadora, especialmente se o implante for destinado a um.

(25) Introdução. 7. local com processo inflamatório ativo. O carreador é necessário para evitar que as células e os fatores bioativos sejam destruídos e eliminados da área do implante, antes de exercerem sua ação na reparação tecidual26, 27. A célula tronco, dada sua pluripotencialidade e ilimitada capacidade de autorenovação, surge como candidata ideal à estratégia da engenharia de tecidos28, 29. Quanto à origem, as células tronco podem ser embrionárias ou provir de tecidos adultos, aqui definidos como pós nascimento (Figura 1).. CÉLULAS TRONCO - ORIGEM. - EMBRIOLÓGICA MEDULA ÓSSEA - DE TECIDOS ADULTOS OUTROS: tecido muscular, nervoso, adiposo, etc.. Figura 1. Representação esquemática das células tronco quanto à origem. No organismo adulto, outros tecidos além da medula óssea possuem um reservatório de células tronco.. Segundo Rosenthal et al30, a célula tronco, para assim ser considerada, deve atender aos seguintes critérios: - exibir ilimitada capacidade de renovação por divisão simétrica;.

(26) Introdução. 8. - possuir capacidade de divisão assimétrica, ou seja, uma das células filhas deve ser capaz de originar células representativas dos três folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma e endoderma); - ser originária de outra célula tronco, seja embrionária ou do organismo adulto.. Células tronco embrionárias, de indubitável pluripotencialidade atestada por vários estudos31-33, estão sujeitas a regulamentações éticas que inviabilizam ou em muito dificultam sua obtenção e aplicação clínica. Células tronco provenientes de organismo adulto, não estão sujeitas a esta restrição e, portanto, permitem estudos de seu potencial terapêutico. Células tronco da medula óssea de organismo adulto tiveram sua pluripotencialidade demonstrada in vitro34-36 e in vivo. Orlic et al37 sugeriram que, células tronco derivadas da medula óssea, eram capazes de substituir células do músculo cardíaco lesadas após infarto, demonstrando, em camundongos, a melhora da função cardíaca com este procedimento. Embora estes resultados preliminares sejam encorajadores, a aplicação clínica das células tronco da medula óssea apresenta limitações.. O. processo de obtenção destas células é um método doloroso, com certo grau de morbidade, resultando, a punção medular, em baixo rendimento de células tronco38. Estas limitações levaram à busca de fontes alternativas de células tronco. Williams et al39 demonstraram que células indiferenciadas isoladas do músculo esquelético também possuem capacidade de diferenciação em osteócitos, condrócitos, adipócitos, além da linhagem muscular. A primeira.

(27) Introdução. 9. tentativa de implante de mioblastos data de 1978, para o tratamento de distrofia muscular de Duchene e, embora os resultados tenham sido promissores,. o. sucesso. da. terapêutica. foi. limitado. pela. exígua. disponibilidade de mioblastos saudáveis40-42. Rodbell43 foi o primeiro a relatar, em 1964, a separação de células indiferenciadas do tecido adiposo dos adipócitos maduros, utilizando o método enzimático. Em 2001, Zuk et al38 publicaram importante trabalho demonstrando que, in vitro, células indiferenciadas provenientes do produto de lipoaspiração eram capazes de se diferenciar na linhagem condrogênica, osteogênica, adipogênica e miogênica, identificando o tecido adiposo como um reservatório de células tronco mesenquimais. Os autores observaram, ainda, que em comparação às células tronco da medula óssea, cujo potencial adipogênico decresce após a terceira passagem, as células pluripotentes do tecido adiposo mantêm seu potencial adipogênico por longo tempo em cultura, ou seja, 15 passagens, o que equivale a 175 dias de cultura. Planat-Bernard44 et al, em recente estudo, demonstraram a diferenciação espontânea destas células em cardiomiócitos, expressando marcadores específicos do músculo cardíaco. Safford et al45 mostraram a capacidade de diferenciação neurogênica destas células. Rodriguez46 et al relataram a diferenciação adipocitária destas células, in vitro. A figura 2 ilustra esquematicamente as linhagens celulares derivadas da célula tronco mesenquimal do organismo adulto..

(28) Introdução. 10. CÉLULA TRONCO MESENQUIMAL. MIOBLASTO. CONDROBLASTO. PRECURSORES. CARDIOMIÓCITO. HEMATOPOÉTICOS. OSTEOBLASTO. NEUROBLASTO. ADIPOBLASTO PRECURSOR ENDOTELIAL. Figura 2. Representação esquemática das linhagens celulares derivadas da célula tronco mesenquimal do organismo adulto.. Embora outros tecidos também contenham células tronco47-49, o tecido adiposo apresenta indiscutíveis vantagens como fonte destas células, pela facilidade de obtenção, baixa morbidade e elevado rendimento38,50. A lipoaspiração de depósitos de gordura subcutânea é técnica largamente utilizada e em pequenos volumes pode ser realizada ambulatoriamente com anestesia local. Mostra-se um procedimento de risco e custo baixos, sendo que a aspiração de pequenos volumes de tecido adiposo subcutâneo, com.

(29) Introdução. 11. técnica adequada, tem baixa morbidade, podendo acrescer beneficio estético. Para obtenção de células indiferenciadas do tecido adiposo, o produto da lipoaspiração é submetido a digestão enzimática e posterior centrifugação, permitindo a separação de uma fração adipocitária sobrenadante e de um precipitado correspondente à fração estroma vascular do tecido adiposo, de acordo com metodologia estabelecida em estudos prévios51-52. Esta fração estroma vascular é constituída por uma população heterogênea de células que inclui células endoteliais, células sanguíneas circulantes, células de músculo liso e uma população de células, semelhantes ao fibroblasto, com capacidade pluripotente45,53-55. Enquanto na medula óssea o rendimento é de uma célula tronco para cada 105 células estromais56, no tecido adiposo é possível se obter de 2 a 3x108 células pluripotentes a partir de 300 ml de produto de lipoaspiração, segundo Zuk et al38. Estudos in vivo têm demonstrado a funcionalidade do implante de células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo, revertendo diabetes em camundongos lipoatróficos57, melhorando déficits neurológicos quando implantadas no cérebro de ratos com isquemia cerebral58 e promovendo a reparação óssea de defeitos da calota craniana de camundongos59. O trabalho de Planat-Bernard60, publicado este ano, demonstrou a capacidade destas células de se diferenciarem em célula endotelial, melhorando a perfusão tecidual, quando implantadas em área isquêmica de modelo experimental animal. Estes estudos acenam com a perspectiva. da. aplicação. terapêutica. indiferenciadas do tecido adiposo, no futuro.. destas. células. mesenquimais.

(30) Introdução. 12. Apesar dos resultados encorajadores, o exato mecanismo pelo qual estas células, in vivo, promovem a reparação tecidual ainda é controverso. A suposta diferenciação destas células tronco mesenquimais, no tipo celular especifico do tecido que se pretende regenerar, foi questionada em dois recentes trabalhos. Murry et al61 injetaram células tronco da medula óssea de camundongo, portando marcador genético, diretamente no músculo cardíaco lesado do camundongo, não sendo capazes de detectar este marcador após este procedimento. Balsan et al62 utilizaram células tronco da medula óssea de camundongo transgênicos, que expressavam proteína fluorescente verde. Os autores observaram raras células fluorescentes 30 dias após a injeção das mesmas no músculo cardíaco lesado de camundongos. Estes dois trabalhos, empregando marcadores genéticos, puderam facilmente rastrear as células injetadas, dispensando a marcação com anticorpos. A utilização de anticorpos para identificação das células injetadas está sujeita à ligação inespecífica dos anticorpos, como sugere Chien63. Este método de identificação gera erro na interpretação dos resultados, apontando a transformação das células tronco da medula óssea em cardiomiócitos, como referido por e Orlic et al37. Chien. 63. atribuiu a. indiscutível melhora na função cardíaca observada após injeção de células tronco no músculo cardíaco lesado, não à diferenciação destas células em cardiomiócitos, mas à capacidade destas células de promoverem a formação de novos vasos na área lesada. Ao pretendermos reconstruir ou reparar tecidos a partir de células isoladas e expandidas in vitro, seria aconselhável implantar estas células.

(31) Introdução. numa estrutura. 13. carreadora tridimensional, como propuseram Young e. Lucas26. Nesta estrutura as células podem se ancorar e, ao mesmo tempo, se expandir, migrar, interagir e secretar componentes da matriz celular e fatores angiogênicos, que propiciem a organização tecidual e formação de rede vascular. Vários materiais vêm sendo testados como carreadores para promoção da diferenciação celular e organização tridimensional de tecidos. Entre eles: politerafluoretileno64, colágeno65-67, fibrina68, polímeros de ácido glicólico69,. 70. , co-polímeros de ácido polilático e ácido glicólico71, ácido. hialurônico72,73 e Matrigel74,75. Os três últimos, brevemente descritos a seguir, são largamente estudados na engenharia de tecidos, sendo o ácido hialurônico e os polímeros ácido glicólico de particular interesse, porque já são empregados cotidianamente na prática médica76-78. De acordo com Midleton e Tipton79, polímeros derivados dos ácidos glicólico e láctico são utilizados em materiais biodegradáveis de uso médico desde a década de 60. Poliglicolídeo é um polímero sintético e constituinte da primeira sutura sintética totalmente biodegradável (Dexon). A fabricação de co-polímeros, utilizando diferentes proporções entre eles permite a manipulação do tempo de absorção, resistência, porosidade e flexibilidade do material. Co-polímeros de glicolídeo e carbonato de trimetileno têm maior flexibilidade e são absorvidos em aproximadamente 7 meses. Ácido hialurônico é um glicosaminoglicano constituído de unidades alternantes de ácido glicurônico e N-acetilglucosamina. É abundante em todos os tecidos mesodérmicos, no humor vítreo e na gelatina de Wharton do.

(32) Introdução. 14. cordão umbilical. O ácido hialurônico tende a ocupar um volume grande devido à repulsão eletrostática entre os grupos carboxila, formando malhas que retêm uma grande quantidade de água80. Na sua forma natural, as longas cadeias de dissacarídeo são altamente solúveis e rapidamente metabolizadas por ação enzimática. A fim de possibilitar a utilização em forma de gel, para preenchimento temporário de sulcos e depressões, as longas moléculas de ácido hiaurônico são interligadas, originando o ácido hialurônico reticulado (cross-linked), que possui maior viscosidade e estabilidade76. Matrigel é. uma. mistura. de. proteínas. de. matriz. extracelular. comercialmente disponível. É obtida de um extrato de membrana basal de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm de rato e inclui tanto colágeno tipo IV como laminina74. Estudos demonstram que Matrigel levou à diferenciação celular81, induziu a angiogênese82 e permitiu a organização tecidual83. Kawagucchi et al74, mostraram que a injeção de Matrigel, sem pré adipócitos, suplementado com fator básico de crescimento de fibroblasto (bFGF), que é um potente angiogênico, levou a neoformação vascular e subseqüente recrutamento de pré adipócitos do animal receptor, gerando blocos de tecido adiposo, que se mantiveram por 10 semanas, no subcutâneo do abdome, tórax e cabeça, na cartilagem auricular e no músculo da perna de ratos. Embora estas propriedades tornem atraente as pesquisas com Matrigel, este produto é um concentrado de proteínas de camundongo, sem possibilidade de aplicação clínica como observam Kimura et al84 . Dentre os fatores bioativos, destaca-se o bFGF, objeto de vários estudos que investigam sua participação nos processos de reparação tecidual e de.

(33) Introdução. 15. proliferação, migração e diferenciação celular85-87. A atividade biológica do bFGF é mediada pelo proteoglicano heparam sulfato localizado na superfície das células. A ligação de bFGF aos heparam sulfatos estabiliza este componente e impede a sua degradação88. Pieper et al89 associaram heparam sulfato a matrizes de colágeno que foram supridas com bFGF e demonstraram que quando implantadas no subcutâneo de ratos, estas matrizes mostraram maior vascularização em relação a matrizes contendo apenas heparam sulfato ou apenas bFGF. As matrizes contendo heparam sulfato e bFGF atraíram outras células, gerando novo tecido no local do implante. Esta reação tecidual aos implantes, entretanto, decaiu após 10 semanas. Akimoto e Hammermam90 demonstraram a que adição de bFGF ao meio de cultura, levou a formação de microvasos a partir da aorta de embrião de camundongos, mantida em cultura em condição de hipóxia. A neorganogênese, definida por Matapurkar et al91 como a formação de um órgão a partir da proliferação e diferenciação de células tronco mantidas em cultura, representa ainda um enorme desafio para engenharia de tecidos. A reconstrução integral de órgãos complexos como o coração, por exemplo, é limitada pela intrincada arquitetura tridimensional e alta especialização. dos. diferentes. tipos. celulares. que. o. compõem.. A. reconstrução de segmentos lesados deste órgão, entretanto, poderia se beneficiar da estratégia da engenharia de tecidos, apresentando vantagens sobre a terapia celular, como pontua Yannas92. Os implantes celulares em carreadores tridimensionais nas áreas do músculo cardíaco lesado poderiam fornecer suporte temporário tanto aos eventuais progenitores locais como às.

(34) Introdução. 16. células implantadas. Além disso, através da engenharia é possível controlar o tamanho, forma,composição e resistência do implante preparado in vitro. Por meio da engenharia de tecidos seria possível corrigir defeitos congênitos ou adquiridos, construindo ou reparando partes defeituosas como valvas e grandes vasos da base, como sugerem Leor e Cohen93. A despeito das atuais limitações, de acordo com Zandonella94, a engenharia de tecidos tem um futuro promissor na aplicação clínica. Substitutos dermoepidérmicos concebidos pela engenharia de tecidos (Dermagraft e Allograft) obtiveram a aprovação do FDA (Food and Drug Administration). e são hoje comercializados e cartilagem construída em. laboratório esta em fase de testes em ensaios clínicos. Fauza95 relata que mais de 70 companhias estão desenvolvendo produtos que aplicam os princípios da engenharia de tecidos. Na área da cardiologia, um dos maiores projetos é o BEAT (BioEngineered Autologous Tissue), desenvolvido. na. Universidade de Washington, que receberá 10 milhões de dólares durante cinco anos,. a partir de 2000, do Instituto Nacional de Saúde, para. desenvolver, em laboratório, “patchs” de músculo cardíaco para o tratamento da lesão causada no miocárdio pela doença coronariana94. As pesquisas que, eventualmente, levarão ao sucesso desta empreitada estarão fundadas na combinação ideal do trinômio que embasa a engenharia de tecidos: células de reserva-carreador biodegradável-fatores bioativos. A pluripotencialidade das células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo, nos levou a estudar a capacidade de fixação e manutenção destas células no sítio do implante utilizando carreador biodegradável..

(35) 2. OBJETIVO.

(36) Objetivo. 18. 2. OBJETIVO. O objetivo do presente estudo foi analisar e comparar dois diferentes carreadores biodegradáveis: - a membrana de polímero de ácido poliglicólico e carbonato de trimetileno e - o gel de ácido hialurônico reticulado; quanto a capacidade de assegurar a viabilidade de células mesenquimais indiferenciadas. do. tecido. adiposo. subcutâneo de camundongos atímicos.. humano,. implantadas. no. tecido.

(37) 3. MATERIAIS E MÉTODOS.

(38) Materiais e Métodos. 20. 3. MATERIAIS E MÉTODOS. 3.1 Obtenção das células mesenquimais indiferenciadas humanas. O procedimento foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa da Diretoria Clínica do. Hospital das Clínicas da. Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, sob. protocolo. número 537/01. As células mesenquimais foram extraídas do tecido adiposo de três pacientes do sexo feminino com idades respectivamente de 43, 33 e 30 anos, todas com índice massa corpórea normal (18,5 a 25 kg/m2), submetidas a lipoaspiração na Clínica Meyerbeer, na cidade de Nice, na França. Todas as doadoras apresentavam provas sorológicas negativas para hepatite tipo B, C e para o vírus da síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA). Foram informadas sobre a metodologia e as finalidades do presente estudo, tendo sido assegurados seus direitos à obtenção, a qualquer momento,. de informações pertinentes ao mesmo. Estando. esclarecidas e de acordo, as pacientes doaram, cada uma, 100ml do tecido adiposo aspirado. A lipoaspiração do tecido subcutâneo foi realizada a vácuo, com auxílio de lipoaspirador ou de seringa, após anestesia local, com infiltração de solução de 1:200.000.. lidocaína a 33% e adrenalina. na concentração. de.

(39) Materiais e Métodos. O tecido aspirado foi assepticamente transferido para. 21. recipiente. contendo 400ml de solução tampão fosfato refrigerada a 4oC. Imediatamente após, o tecido foi transportado para o Centro de Bioquímica da Universidade de Nice e processado de acordo com método empregado neste Centro Unité Mixte de Recherche (UMR) 654396. Na câmera de fluxo laminar, em condições assépticas, o tecido foi, exaustivamente, lavado com solução tampão fosfato até a eliminação do conteúdo sanguíneo visível. O tecido foi, então, submetido à digestão enzimática, em agitação constante, durante 50 minutos, a 37oC, em solução contendo 2ml por grama de tecido de meio de Dubelcco modificado por Eagle (DMEM- Gibco- Cergy Pontoise, França), 2mg/ml de colagenase tipo A (Boerhinger), 20mg/ml de albumina sérica bovina, fração 5 (Sigma), penicilina 124µg/ml e streptomcina 100µg/ml (Gibco). Decorrido o tempo de digestão, esta foi interrompida pela adição de volume igual a 10% do total de Soro Fetal Bovino (PAN Biotech Dominique Dutscher Distribution. -. Brumath, França) previamente inativado por aquecimento em banho-maria a 56 o C, durante 20 minutos. A suspensão de células foi centrifugada por 5 minutos a 200g. O sobrenadante contendo a fração adipocitária foi desprezado e o precipitado contendo a fração estroma vascular foi ressuspenso em DMEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino. As. células presentes na suspensão foram. contadas sob microscopio de luz invertido com auxílio de câmara de Thoma. As células foram, então, e semeadas em placas de cultura de 100 mm de diâmetro (CellStar), à razão de 2,5 X 105 células por placa e cultivadas em.

(40) Materiais e Métodos. 22. meio DMEM contendo 10 % de Soro Fetal Bovino, suplementado com penicilina 62µg/ml e estreptomicina 50µg/ml e 2,5ng/ml de bFGF recombinante humano (Sigma). Nos dois dias subseqüentes, cada placa foi cuidadosamente lavada várias vezes com solução tampão fosfato para remover hemácias e outras células não aderentes, antes da substituição do meio. A partir destas primeiras 48 horas, o meio foi trocado a cada dois dias até que as células alcançassem. aproximadamente. 70%. de. confluência,. quando. foram. submetidas a tripsinização com 1 ml de solução de tripsina a 0,2% (Gibco). As placas foram mantidas a 37oC por 2 a 3 minutos até que as células se soltassem completamente. A ação da tripsina foi neutralizada pela adição de 10 ml de meio DMEN contendo 10% de Soro Fetal Bovino. As células das placas, re-suspensas e contadas, foram novamente semeadas à razão de 2,5 X 105 células por placa de 100 mm de diâmetro.. 3.2 Preparação dos carreadores biodegradáveis e incorporação das células. Ao alcançarem 70% de confluência, células da segunda passagem foram novamente tripsinizadas, contadas na câmara de Thoma, e incorporadas aos carreadores biodegradáveis, preparados como segue:.

(41) Materiais e Métodos. Carreador 1 –. 23. (Figura 3). Membrana estéril de ácido poliglicólico e. carbonato de trimetileno (Gore Resolut Adapt RA 2530).. A. B. Figura 3. Aspectos macro e microcóspico da membrana biodegradável. A - Macroscopia .B - Microscopia. A seta, correspondente a 250µm, marca a distância entre duas fibras.. Em condições estéreis, uma membrana foi cortada em 16 peças de 0,25 cm2 cada, que foram embebidas em soro fetal bovino e mantidas por 24 hs em compartimentos individuais de placas de cultura (CellStar). Após 24 horas, o soro fetal bovino foi aspirado de cada compartimento contendo as membranas. A metade delas recebeu 1X106 células mesenquimais da segunda passagem, conforme descrito, suspensas em meio DMEM suplementado com Soro Fetal Bovino, antibióticos e bFGF nas mesmas concentrações utilizadas para o cultivo. A outra metade, a servir de controle, recebeu apenas o meio de cultura suplementado, sem as células humanas. As membranas foram mantidas a 37oC em atmosfera de 10% de CO2 por 24 horas e, 2 horas antes do implante, todas, inclusive as membranas controles, receberam a adição de 10ng/ml de bFGF..

(42) Materiais e Métodos. 24. Carreador 2 – O gel de ácido hialurônico reticulado (Juvederm 30 – Lea Derm Laboratories), rotineiramente utilizado para o preenchimento de rugas e depressões83, é fornecido em seringas de 1ml, contendo 0,6 ml do produto estéril, pronto para injeção subdérmica. Na própria seringa, fornecida pelo fabricante, sob condições estéreis, foi adicionado ao gel, uma suspensão de 0,2ml do meio de cultura suplementado como descrito acima, contendo 4 X 106 de células mesenquimais humanas, de forma que cada 0,2 ml do produto contivesse aproximadamente 1X 106. células. Noutra seringa. contendo 0,6 ml do mesmo gel foi adicionado 0,2ml do meio de cultura, sem células humanas, para servir de controle. Ambas as seringas foram mantidas por 24 horas a 37o C em atmosfera de 10% de CO2 e, 2 horas antes do implante, as duas receberam a adição de 10ng/ml de bFGF.. 3.3 Implante dos carreadores. Os experimentos animais foram conduzidos nos Laboratórios do Centro de. Bioquímica – CNRS (Centre National de la Recherche. Scientifique) UMR (Unité Mixte de Recherche) 6543- da Universidade de Nice Sophia-Antipolis, na França, atendendo às. normas de segurança. vigentes no laboratório e às regulamentações da lei francesa de proteção aos animais..

(43) Materiais e Métodos. 25. Para o implante dos carreadores utilizamos camundongos atímicos que, dada esta característica, sabidamente não rejeitam xenoimplantes. Três séries de implantes foram realizadas, condicionadas à disponibilidade de doadores para. obtenção e preparação das células. humanas. A cada série, foram utilizadas oito fêmeas de camundongos atímicos (Swiss nu/nu) de 10 semanas de vida, perfazendo um total de 24 camundongos. Em cada série de oito, os camundongos foram divididos em dois grupos e anestesiados, através da injeção intraperitoneal de uma solução contendo. ketamina. (Imalgene, Merial; 90mg/kg) e. xylazina (Rompum,. Bayer; 4,5mg/kg). Em condições assépticas, 30 minutos após anestesia, quatro camundongos receberam o implante subcutâneo da membrana contendo as células humanas na região subescapular direita e o controle, ou seja a membrana sem células, no subcutâneo da região sub escapular esquerda. As membranas foram implantadas através de incisão de 1 cm, interessando pele e subcutâneo, na região subescapular. Após a incisão com bisturi de lâmina 15, foi descolada uma loja subcutânea em direção caudal, através da divulsão com tesoura, suficiente para acomodar o implante. Após inserido o implante, as bordas da incisão foram suturadas com pontos separados, de Vicryl 4-0(Ethicon). Ainda em condições assépticas, os outros quatro camundongos receberam a injeção de 0,2 ml de gel contendo células humanas no.

(44) Materiais e Métodos. 26. subcutâneo da região escapular direita e 0,2ml de gel contendo apenas meio de cultura sem células humanas, na região subescapular esquerda. Após o procedimento, os animais foram mantidos aquecidos até que recuperassem plenamente a mobilidade. Até a data do sacrifício, os animais foram mantidos em alojamentos individuais, em ciclos dia/noite de 12 hs recebendo dieta e água ad libitum .. 3.4 Sacrifício dos animais e recuperação dos implantes. Aleatoriamente, a metade de cada grupo de animais foi prédeterminada ao sacrifício três semanas após a data do implante e a outra metade foi sacrificada 8 semanas após . Os animais foram sacrificados por deslocamento vertebral. Na região do dorso foi realiazada uma incisão, interessando pele e o tecido subcutâneo, desde a emergência dos membros inferiores até a região cervical. A elevação deste amplo retalho retangular com base inferior permitiu a identificação, dissecção e recuperação dos implantes..

(45) Materiais e Métodos. 27. 3.5. Análise dos implantes. 3.5.1 Análise macroscópica a fresco Os implantes recuperados foram observados macroscopicamente quanto a coloração, consistência e presença, ou não, de vasos . Após observação macroscópica, os implantes foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e conservados a -80o C para posterior análise.. 3.5.2 Análise histológica e por imunofluroescência indireta O processamento dos implantes para estudo por meio da histologia e da imunofluorescência indireta e a análise dos mesmos foram realizados no laboratório de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da Universidade de Nice – Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Unité (U) 597 e no Laboratório de Anatomia MédicoCirúrgica da Disciplina de Topografia Estrutural Humana da Faculdade de Medicina Universidade de São Paulo - Laboratório de Investigação Médica (LIM) 02. Os implantes, conservados a -80o C,. foram incluídos em tissueTek. (Bayer Corporation) e submetidos a cortes de congelação de espessura de 6µm. Cortes representativos dos implantes foram submetidos a : 1- coloração por hematoxilina-eosina e 2- imunofluorescência indireta, utilizando como anticorpos primários:.

(46) Materiais e Métodos. 28. - anticorpo anti vimentina humana para identificar a presença de células humanas nos implantes; - anticorpo anti fator de von Willlebrandt para identificar células endoteliais, avaliando a neovascularização dos implantes.. Para imunofluorescência indireta com anti vimentina humana utilizouse o anticorpo anti vimentina humana monoclonal de camundongo, clone V9 (Novo Castra Laboratories), porque ele não reage com vimentina de células de camundongo97, embora exiba reatividade com várias espécies de mamíferos. Os cortes foram fixados com acetona por 10 minutos a temperatura ambiente e depois incubados por 1 hora, a temperatura ambiente, com bloqueador de IgG do Kit Mouse on Mouse (Kit Vector MOM AbCys), para atenuar a ligação inespecífica do anticorpo, visto que este e o animal utilizado para os implantes pertenciam à mesma espécie. Na seqüência, os cortes foram incubados por 5 minutos no diluente do Kit MOM por 5 minutos e depois incubados com o anticorpo anti vimentina humana por 30 minutos, na diluição de 1 : 100 . Após lavagem com PBS, os cortes foram incubados com anti mouse IgG ligado a biotina, do kit MOM, por 10 minutos. Lavados novamente, os cortes foram incubados com fluoresceína Avidina DCS (FITC- Vector ), na diluição. de 1:100, por 15 minutos à. temperatura ambiente. Finalmente, após lavagem, os cortes foram montados com gel (Biomeda) e DAPI (4’-6- Diamino-2-phenylindole – Vectashield, Vector), sendo, o último, utilizado para identificação dos núcleos celulares. Como controle positivo e negativo. da especificidade do anticorpo. anti-vimentina humana submetemos, respectivamente, cortes de prepúcio.

(47) Materiais e Métodos. 29. humano e pele de camundongo ao mesmo processo acima descrito. Ainda, como controle negativo, cortes destes dois tecidos foram sumetidos ao protocolo descrito, excluindo o anticorpo primário. Para Imunofluerescência indireta com anti fator de von Willebrant, utilizamos o anticorpo policlonal de. coelho anti fator de von Willebrant. humano (Clotimmun – Boehring Institute). na diluição de 1:100. Os cortes. foram fixados com acetona e depois de lavados com PBS, incubados por 1 hora à temperatura ambiente, com o anticorpo anti fator de von Willebrant. Depois de lavados, os cortes foram incubados por 1 hora com anticorpo secundário, policlonal de porco anti- coelho,conjugado ao FITC (Polyclonal Swein Anti Rabbit Immunoglobulins/FITC - Dako), na diluição de 1:30, a temperatura ambiente. Seguidos de nova lavagem, os cortes foram, finalmente, montados com gel e DAPI. Como controle positivo, submetemos cortes de prepúcio humano e pele de camundongo ao protocolo descrito acima e como controle negativo, realizamos o mesmo procedimento excluindo o anticorpo primário. Nos implantes de gel de ácido hialurônico, por 8 semanas, contendo células humanas, assim como no respectivo controle, realizamos ainda, dupla marcação dos cortes para identificação, concomitante, de células humanas e vasos. Para tanto, seguimos os passos já. descritos para. marcação com anti vimentina humana e, antes da montagem, realizamos a mesma seqüência descrita para incorporação do anticorpo anti fator de von Willebrant, apenas substituindo o anticorpo secundário por outro, ligado a.

(48) Materiais e Métodos. um. marcador fluorescente. vermelho,. 30. o Texas Red ( Goat Anti Rabbit. Immunoglobulin-Texas Red – Molecular Probes), na diluição de 1: 1000. Os cortes foram examinados sob microscópio Zeiss Axiophot, equipado com. lâmpada de mercúrio, com filtros para diferentes. comprimentos de onda, câmera de vídeo. para. aquisição da imagem e. processador de imagem LEICA Q55CW Cytogenetics Workstation. A tabela 1 enumera os filtros utilizados para os respectivos marcadores fluorescentes.. TABELA 1 - Filtro empregado para. cada. marcador fluorescente e cor resultante na. imunofluorescência. FLUORÓFORO. FILTRO. BANDA DE EXCITAÇÃO. COR. DAPI. A. 340-380 UV. Azul. FITC. L4. 450-490 Azul. Verde. TEXAS RED. TX. 530-595 vermelho. Vermelho. 3.5.3 Extração, quantificação e amplificação do DNA genômico Exemplares da segunda série foram destinados a extração do DNA genômico, utilizando o kit TRI-REAGENT (Euromedex, França), de acordo com o protocolo especificado no produto, descrito a seguir. Os implantes foram homogeneizados, utilizando a proporção de um 1ml de TRI reagente para 50 a 100 mg de tecido, com o auxilio de homogeneizador elétrico. O homogeneizado foi mantido, por 5 minutos, à.

(49) Materiais e Métodos. 31. temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos complexos núcleo protéicos. A seguir foram adicionados 0.2ml de clorofórmio para cada ml de TRI Reagent e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos. A mistura resultante ficou em repouso por 15 minutos centrifugada a mistura. e a seguir foi. 12000g, por 15 minutos, a 4oC. Após a centrifugação, a. encontrou-se. separada. numa. fase. inferior. avermelhada,. correspondente ao fenol–clorofórmio, numa fase intermediária e numa fase aquosa, superior e incolor. O DNA e proteínas estavam contidos nas duas fases inferiores. A fase aquosa foi removida e o DNA das fases intermediária e inferior foi precipitado pela adição de 0,3ml de etanol a 100%, para cada 1 ml de TRI REAGENT usado na fase inicial de homogeneização. Após 3 minutos a temperatura ambiente, o DNA foi sedimentado por centrifugação a 2000 g por 5 minutos, a 4oC. O sobrenadante correspondente ao etanol-fenol contendo as proteínas foi removido e o DNA foi lavado, por 30 minutos, em uma solução 0,1M de citrato de sódio em etanol a 10%, em agitação periódica, seguido de centrifugação a 2000g, por 5 minutos, a 25ºC. O procedimento de lavagem e centrifugação foi repetido uma segunda vez. O DNA precipitado resultante foi ressuspenso em etanol a 75% (2ml de etanol 75% para cada ml de TRI REAGENT), mantido por 20 minutos à temperatura ambiente, com agitação periódica e finalmente centrifugado a 2000g, por 5 minutos, a 25oC. Este processo de lavagem removeu a coloração rosada do DNA precipitado..

(50) Materiais e Métodos. 32. O etanol sobrenadante foi removido e os tubos com DNA precipitado foram mantidos abertos por 5 minutos, à temperatura ambiente, para permitir a secagem. O DNA precipitado foi então dissolvido em uma solução 8mM de NaOH (0.6ml para cada 50 a 70 gr de tecido inicial). A utilização desta solução alcalina garantiu a total solubilização do DNA obtido. Para remover o material insolúvel ainda contido na preparação (fragmentos de membrana, por exemplo), o material foi centrifugado novamente e o sobrenadante, contendo o DNA, foi transferido para novos tubos e guardado em geladeira a 8 – 10 oC. Células humanas mantidas em cultura e tecido de camundongo serviram como controle positivo e negativo, respectivamente, e foram submetidos a extração do DNA genômico, com o mesmo kit TRI REAGENT, seguindo o protocolo recomendado pelo produto, descrito acima. Após a extração, alíquotas do material genômico foram diluídas em água ultrapura na razão de 1:1000 e quantificadas através de Densidade Ótica(OD) em espectofotômetro BIO-TEK (Scientific Instruments), sob comprimento de onda de 260nm a 280nm. A razão entre os valores obtidos da leitura nos comprimentos 260nm e 280nm (OD260 / OD280) forneceu uma estimativa da pureza do DNA, variando entre 1,8 e 2,0. A seguir, foi realizada a amplificação de um fragmento de 850 pares de bases. da região alfa, satélite do centrômero do cromossomo 17,. específico humano, através da Reação em Cadeia da Polimerase. Para tanto, utilizou-se os seguintes Iniciadores (Invitrogen) : - Senso(Forward) : GGA TAA TTT CAG CTG ACT AAA CAG; - Anti-Senso (Reverse): T TCC GTT TAG TTA GGT GCA GTT GTT ATC..

(51) Materiais e Métodos. As. posições. destes. nucleotídeos. correspondem. à. 33. seqüência. HSSATA17 (Gen Bank No. M13882). Para cada reação da PCR preparamos, sobre gelo, a seguinte solução de dNTPs (deoxirribonucleotídeos trifosfato - Invitrogen): 0,4U dATP(deoxiadenosina 5’trifosfato); 0,4U dCTP (deoxicitosina 5’trifosfato); 0,4U. dGTP. (deoxiguanosina. 5’trifosfato);. 0,4U. 5’trifosfato); tampão (Invitrogen) 10X, iniciador. dTTP. (deoxitimidina. sense (forward) 10pmol,. iniciador anti sense (reverse) 10pmol, 5U de Taq polimerase (DNA polimerase da bactéria aquática Thermus aquaticus), 100ng/ml de DNA template (DNA a ser amplificado) e água destilada ultra pura completar 25µl. A seguir, o microtubo contendo a mistura foi inserido no aparelho termociclador BIOMETRA T3 THERMOCYCLER (BIOLABO Scientific Instruments), programado de acordo com a tabela 2.. TABELA 2 - Programa dos ciclos utilizados no termociclador para PCR. TEMPERATURA. TEMPO. NÚMERO DE CICLOS. 94°C. 10 MINUTOS. 1. 94°C. 20 SEGUNDOS. 35. 60°C. 30 SEGUNDOS. 35. 72°C. 50 SEGUNDOS. 35. 72°C. 10 MINUTOS. 1.

(52) Materiais e Métodos. 34. Após os ciclos seriados, o termociclador foi resfriado e mantido a 4o C. Em seguida o produto da amplificação pela PCR foi armazenado em geladeira entre 8o e 10o C. A efetividade da PCR foi avaliada visualmente pela técnica de eletroforese em gel de agarose. Para tanto, uma amostra do produto de PCR de DNA obtido de controles, ou seja, células humanas e tecido de camundongo, foi aplicado em gel de agarose a 2% e submetida a eletroforese por 40 minutos em corrente de 80V. Após o tempo de corrida eletroforética, o gel foi corado com brometo de etídeo e as bandas foram evidenciadas sob luz ultravioleta, através do transiluminador (EDAS 290 – Kodak), visando a verificar o sucesso da reação. Uma vez constatado o padrão técnico necessário, as demais amostras foram submetidas ao mesmo método..

(53) 4. RESULTADOS.

(54) Resultados. 36. 4 RESULTADOS. Do total de 24 animais, 5 morreram. Esta mortalidade foi atribuída a maior suscetibilidade desta espécie não só a infecções, mas também a variações de temperatura, o que reduz a sua sobrevida98. Estes animais foram excluídos do estudo, resultando num total de 19 implantes e seus respectivos controles analisados, pertencentes aos grupos experimentais, conforme indicado na Tabela 3.. TABELA 3 - Número dos implantes analisados segundo os grupos experimentais. c/ cels hu - implantados com células humanas.. TIPO DE CARREADOR. MEMBRANA DE ÁCIDO GLICÓLICO E. GEL DE ÁCIDO HIALURÔNICO. CARBONATO DE TRIMETILENO. RETICULADO. TEMPO DE IMPLANTE. 3 SEMANAS. 8 SEMANAS. 3 SEMANAS. 8 SEMANAS. NÚMERO DE IMPLANTES. 5 c/cels hu. 5 c/ cels hu. 5 c/ cels hu. 4 c/cels hu. 5 controles. 5 controles. 5 controles. 4 controles. ANALISADOS. 4.1. Caracterização citológica das células mesenquimais indiferenciadas humanas. Obtivemos. 15 a 20 X 106 células a partir da digestão enzimática. seguida de centrifugação de 100 ml de tecido adiposo.. As células.

(55) Resultados. 37. apresentaram, em cultura, morfologia semelhante a do fibroblasto, característica de célula mesenquimal.(Figura 4). Figura 4. Células mesenquimais indiferenciadas do tecido adiposo humano em cultura. Microscopia de contraste de fase. Magnificação 200 X. Observar o aspecto alongado das células, característico das células mesenquimais.. 4.2 Análise macroscópica dos implantes a fresco. 4.2.1 Carreador 1: membrana de ácido glicólico e carbonato de trimetileno Com três semanas de implante, as membranas de ácido glicólico e carbonato de trimetileno semeadas com as células humanas mostraram-se ricamente vascularizadas (Figuras 5A e 5B), enquanto que os controles, tanto com 3 como com 8 semanas, mostraram-se avasculares (Figura 5C). Com 8 semanas, os implantes contendo células humanas não mais exibiram a exuberante neovascularização e apenas alguns vasos na periferia foram observados (Figura 5D). Estes implantes apresentaram aspecto semelhante aos implantes controles..

(56) Resultados. A. 38. B. C D. Figura 5. Aspecto macroscópico do implante do Carreador 1. A. Carreador com células humanas. com 3 semanas de implante. B. Detalhe da. vascularização do carreador 1 com células humanas com 3 semanas de implante. Magnificação 20X. C. Carreador 1 com células humanas com 8 semanas de implante. Notar ausência de vascularização. D. Controle: Carreador 1 sem células humanas, com 3 semanas de implante.. 4.2.2 Carreador 2 - Gel de Ácido Hialurônico Os implantes de gel contendo células humanas, tanto após 3 (Figura 6A). como após 8 semanas, mostraram-se vascularizados, enquanto os. controles permaneceram transparentes e avasculares (Figuras 6B e 6D). Com 8 semanas, os implantes de ácido hialurônico puderam ser facilmente identificados como um tumor sob o tecido subcutâneo dos camundongos,.

(57) Resultados. 39. apresentando consistência fibroelástica, enquanto os controles não eram palpáveis nem tão pouco visíveis (Figura 6C).. A. B. C. D. Figura 6. Aspecto macroscópico do implante do carreador 2. A. Gel de ácido hialurônico com células humanas com 3 semanas de implante.Observar vasos no centro do implante(seta). B. Gel de ácido hialurônico sem células humanas, transparente e avascular com 3 semanas de implante.C. A seta indica tumor subcutâneo correspondente ao gel de ácido hialurônico com células humanas com 8 semanas de implante. D. Implantes com 8 semanas. A direita o gel de ácido hialurônico com células humanas, mostrando-se mais denso e opacificado e à esquerda o controle, gel sem células humanas, totalmente transparente..