UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
ALBERT ROCHA DE OLIVEIRA
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO
ANTINEOPLÁSICA DE DERIVADOS
5-BENZILIDENO-3-BENZIL-TIAZOLIDINA-2,4-DIONA
ALBERT ROCHA DE OLIVEIRA
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO ANTINEOPLÁSICA DE DERIVADOS 5-BENZILIDENO-3-BENZIL-TIAZOLIDINA-2,4-DIONA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Inovação Terapêutica da
Universidade Federal de Pernambuco, para a obtenção do Título de Mestre em Inovação Terapêutica
Orientador: Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta
Co-orientadora: Profª Drª Maira Galdino da Rocha Pitta
Catalogação na fonte Elaine Barroso
CRB 1728
Oliveira, Albert Rocha de
Síntese, caracterização estrutural e avaliação antineoplásica de derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona/ Albert Rocha de Oliveira– Recife: O Autor, 2015.
74 folhas : il., fig., tab.
Orientador: Ivan da Rocha Pitta
Coorientadora: Maira Galdino da Rocha Pitta
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Inovação Terapêutica, 2015.
Inclui bibliografia, apêndices e anexo
1. Agentes antineoplásicos 2. Tiazois 3. Toxicidade- testes I. Pitta, Ivan Rocha da (orientador) II. Pitta, Maira Galdino da Rocha (coorientadora) III. Título
615.1 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2015- 176
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica
REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITOR
Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos
DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Profª Drª Maria Eduarda Lacerda de Larrazabal
VICE- DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Profª Drª Oliane Maria Correia Magalhães
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Prof. Dr. César Augusto Souza de Andrade
VICE- COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares
0000000000
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Recife, 27 de fevereiro de 2015
Dissertação de Mestrado defendida e APROVADA, por decisão unânime, em 27de fevereiro de 2015, cuja Banca Examinadora foi constituída pelos seguintes professores:
PRESIDENTE EEXAMINADORA INTERNA: Profa. Dra.Maira Galdino da Rocha Pitta
(Departamento de Bioquímica – Universidade Federal de Pernambuco)
Assinatura:_______________________________________
SEGUNDO EXAMINADOR INTERNO: Prof. Dr.Moacyr Jesus Barreto de Melo Rêgo
(Departamento de Bioquímica – Universidade Federal de Pernambuco)
Assinatura:_______________________________________
EXAMINADOR EXTERNO:Prof. Dr.Marcos Veríssimo de Oliveira Cardoso
(Departamento de Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal de Pernambuco)
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Ivan da Rocha Pitta e à Professora Maira Galdino da Rocha Pitta, pelas contribuições na orientação de todo esse trabalho.
À Professora Maria do Carmo Alves de Lima (Nena), com quem sempre pude contar desde os tempos da graduação. Sua grande amizade e palavras de incentivo foram as verdadeiras responsáveis por minha chegada até aqui.
Ao Professor Moacyr Jesus Barreto de Melo Rêgo e a Valécia de Cassia Mendonça da Costa, pela grande contribuição nos ensaios biológicos.
Aos meus pais José Rocha de Oliveira e Rosane Santana de Oliveira, por sempre estarem ao meu lado, na alegria e na tristeza, na saúde e na doença.
À minha namorada Jessica Cristina da Silva, pelo amor e companheirismo.
A Alan Lucena de Vasconecelos, Antônio Sérgio Alves de Almeida Jr e Marina Galdino da Rocha Pitta, pelas palavras de perseverança que me ajudaram no início do mestrado.
A Cezar Amorim, Iris Trindade e Jamerson Oliveira, pela imensa colaboração nas atividades de laboratório.
A Paulo Germano, pela sua grande disposição em ajudar todos os mestrandos e doutorandos do PPGIT.
A todos os membros do LPSF e do LINAT, pela grande colaboração no desenvolvimento de todo esse trabalho.
A todos aqueles não mencionados, cuja colaboração mostrou-se essencial na realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
Câncer é o nome dado a uma grande variedade de doenças que possuem como principal característica um crescimento celular contínuo e desordenado. A quimioterapia é uma das alternativas terapêuticas no combate ao câncer, entretanto as atuais opções terapêuticas são frequentemente acompanhadas de fortes efeitos colaterais. Inúmeros trabalhos vêm sendo desenvolvidos nos últimos anos, relacionando as moléculas tiazolidínicas com atividades antineoplásicas. No presente trabalho, foram realizadas a síntese e a caracterização estrutural de cinco derivados da série 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona, seguidas da avaliação da citotoxicidade de dois desses compostos sobre células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e sobre as linhagens de células neoplásicas DUO-145, HepG2, K562 e RAJI, utilizando ensaios de MTT. Inicialmente, realizou-se a síntese da tiazolidina-2,4-diona, a partir da reação entre ácido monocloroacético e tiouréia. Em seguida, realizaram-se N-alquilações, em uma solução equimolar de hidróxido de sódio, utilizando a tiazolidina-2,4-diona e diferentes haletos de benzila substituídos, obtendo-se intermediários 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona substituídos. Os compostos finais foram sintetizados a partir de reações de condensação na posição 5 do anel tiazolidínico, reagindo-se os intermediários, anteriormente sintetizados, com benzaldeídos, obtendo-se os compostos tiazolidínicos finais, com rendimentos entre 52 e 70%. A estrutura química dos compostos sintetizados foi determinada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e de 13C, espectroscopia de infravermelho e por espectrometria de massas. A avaliação da seletividade citotóxica dos compostos 5-(3-cloro-benzilideno)-3-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103) e 5 - (2,4-dimetóxi-benzilideno) - 3 - (2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-106) foi realizada sobre PBMC’s, através de ensaios MTT, apresentando resultados com viabilidade acima de 90%. Nos ensaios de citotoxicidade tumoral, a linhagem DUO-145 apresentou melhor suceptibilidade aos compostos testados, com valores de IC50 18,18 µM para o
LPSF/GQ-103 e IC50 24,13 µM para o LPSF/GQ-106.
ABSTRACT
Cancer is the name given to a variety of diseases that have a major feature a continuous and disorderly cell growth. Chemotherapy is one of therapeutic alternatives to fight cancer, but the current therapeutic options are often accompanied by severe side effects. Numerous studies have been developed in recent years talking about the thiazolidine molecules with antineoplastic activities. In this study, we realized the synthesis and structural characterization of five derivatives of the series 5-benzylidene-3-benzyl-thiazolidine-2,4-dione, followed by evaluation of cytotoxicity of two such compounds on peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) and on the tumor cell lines DUO-145, HepG2, K562 and RAJI, using MTT assays. Initially we realized the synthesis of thiazolidine-2,4-dione, from the reaction between monochloroacetic acid and thiourea. Then, it were realized N-alkylations using thiazolidine-2,4-dione and various substituted benzyl halides obtaining the intermediates 3-benzyl-thiazolidine-2,4-dione substituted. The final compounds were synthesized from condensation reaction in position 5 of the thiazolidine ring, by reacting intermediates previously synthesized with benzaldehydes obtaining tiazolidínicos final compounds in yields between 52 and 70%. The chemical structure of the synthesized compounds was determined by 1H and 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy, by infrared spectroscopy and by mass spectrometry. The evaluation of selective cytotoxicity of the compounds 5-(3-chloro-benzylidene)-3-(2-chloro-6-fluoro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione (LPSF/GQ-103) and 5-(2,4-dimethoxy-benzylidene)-3-(2-chloro-6-fluoro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione (LPSF/GQ-106) was performed on PBMC’s by MTT assay, presenting results viability above 90%. In the tumor cytotoxicity assays, the tumor cell line DUO-145 had better cytotoxic susceptibility to the tested compounds, with 18.18 µM IC50 value for the compound LPSF/GQ-103 and 24.13 µM IC50 value for the LPSF/GQ-106.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Anel tiazolidínico... 17
Figura 02: Tiazolidinas dissubstituídas utilizadas em linhagens de células HL-60 e UP37... 23
Figura 03: Tiazolidina N-alquilada inibidoras de HDAC... 24
Figura 04: Tiazolidina testada sobre linhagens U937, M12 e DU145... 24
Figura 05: Tiazacridinas citotóxicas sobre diferentes linhagens de células tumorais... 24
Figura 06: Tiazolidina testada sobre linhagens Huh7 e Mahalavu... 25
Figura 07: Células HCT-8 antes (A) e depois (B) de serem submetidas às ATZDs... 25
Figura 08: Tiazolidinas avaliadas quanto à atividade antiproliferativa... 26
Figura 09: Moléculas de pioglitazona (A) e rosiglitazona (B)... 26
Figura 10: Estrutura química geral das penicilinas... 27
Figura 11: Tiazolidinedionas relatadas como agentes antimicrobianos... 27
Figura 12: Tiazolidinedionas testadas quanto à inibição da migração leucocitária... 28
Figura 13: Tiazolidinedionas condensadas na posição 5 com pirazóis substituídos... 28
Figura 14: Tiazolidinas avaliadas quanto à inibição do crescimento de Candida albicans... 29
Figura 15: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir do ácido cloroacético e da tioureia... 29
Figura 16: Síntese de Monforte... 30
Figura 17: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir da tiouréia, do ácido cloroacético e da anilina... 30
Figura 18: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona do oxissulfeto de carbono com amônia... 30
Figura 19: Obtenção de derivados da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona... 31
Figura 20: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir do cloroacetato de etila e tiocianato de potássio... 31
Figura 21: Obtenção da 3-(dimetil-amino-metil)-tiazolidina-2,4-diona a partir do formaldeído e da dimetilamina... 31
Figura 22: Condensação de Knoevenagel de derivados tiazolidínicos
N-substituidos... 32
Figura 23: Condensação na posição 5 da tiazolidina, utilizando ésteres
cianocinâmicos... 32
Figura 24: Síntese do Éster de Cope... 32
Figura 25: Reação de tionação da tiazolidina-2,4-diona... 33
Figura 26: Viabilidade de PBMCs expostas ao LPSF/GQ-103 e
LPSF/GQ-106... 47
Figura 27: Viabilidade de células tumorais, expostas aos compostos GQ-103
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes,
em 2014, no sexo masculino, depois do câncer de pele
não-melanoma... 20
Tabela 02: Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes, em 2014, no sexo feminino, depois do câncer de pele não-melanoma... 21
Tabela 03: Características físico-químicas da tiazolidina-2,4-diona... 38
Tabela 04: Características físico-químicas dos compostos N-alquilados... 39
Tabela 05: Características físico-químicas dos compostos finais... 39
Tabela 06: Valores de IC50 de células tumorais, expostas aos compostos GQ-103 e GQ-106... 48
LISTAS DE ESQUEMAS
Esquema 01: Esquema geral de reação dos derivados da série
5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona... 34
Esquema 02: Mecanismo reacional da síntese da tiazolidina-2,4-diona... 40
Esquema 03: Mecanismo reacional de N-alquilação... 41
Esquema 04: Mecanismo de condensação na posição 5 da
ABREVIATURAS
ATZD - Acridinotiazolidinas
DUO-145 - Linhagem de células de câncer de próstata HepG2 - Linhagem de células de hepatocarcinoma INCA - Instituto Nacional do Câncer
IV - Infravermelho
K562 - Linhagem de células de Leucemia
KLF4-Fator de transcrição relacionado com a regulação da proliferação celular
LINAT - Laboratório de Imunomodulação e Novas Abordagens Terapêu LPSF - Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos
PBMC - Células mononucleares de sangue periférico
PPAR - Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma RAJI - Linhagem de células de Linfoma
RMN - Ressonância magnética nuclear WHO - Organização Mundial da Saúde
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 14 2 OBJETIVOS... 16 2.1 Geral... 16 2.2 Específicos... 16 3 REVISÃO DE LITERATURA... 17 3.1 Tiazolidinas e PPAR... 17 3.2 Câncer... 19 3.2.1 Considerações gerais... 19 3.2.2 Epidemiologia do câncer... 20 3.2.3 Tratamento do câncer... 21
3.3 Atividades antineoplásicas relacionadas às tiazolidinas... 23
3.4 Atividades anti-diabéticas relacionadas às tiazolidinas... 26
3.5 Outras atividades biológicas relacionadas às tiazolidinas... 27
3.6 Reações químicas relacionadas ao núcleo tiazolidínico ... 29
4 METODOLOGIA ... 33 4.1 Estudo químico ... 33 4.1.1 Materiais... 34 4.1.1.1 Equipamentos... 34 4.1.1.2 Reagentes e Solventes... 35 4.1.2 Metodologia de síntese... 35 4.1.2.1 Síntese da tiazolidina-2,4-diona ... 35
4.1.2.2 Reações de N-alquilação da tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-52)... 36
4.1.2.3 Reações de condensação na posição 5 das 3-benzil-tiazolidina-2,4- diona substituídas... 36
4.2 Estudo biológico... 36
4.2.1 Materiais e métodos ... 36
4.2.1.1 Cultivo de Células ... 36
4.2.1.2 Ensaios de citotoxicidade seletiva, utilizando PBMCs... 37
4.2.1.3 Ensaios de citotoxicidade sobre células neoplásicas... 37
4.2.1.4 Análises Estatísticas... 38
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES... 38
5.1.1 Mecanismos reacionais... 40
5.1.1.1 Tiazolidina-2,4-diona... 40
5.1.1.2 Derivados tiazolidínicos N-alquilados... 41
5.1.1.3 Derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103, LPSF/GQ-106, LPSF/GQ-117, LPSF/GQ-263, LPSF/GQ-264)... 41
5.1.1.4 Avaliação Espectroscópica... 42
5.2 Estudo biológico... 47
5.2.1 Ensaios de viabilidade sobre PBMC’s... 47
5.2.2 Ensaios de citotoxicidade sobre células tumorais... 47
6 CONCLUSÕES... 49
7 PERSPECTIVAS ... 50
8 REFERÊNCIAS... 51
9 ANEXO: Parecer do comitê de ética... 58
14
1 INTRODUÇÃO
Em 2012, cerca de 14,1 milhões de novos casos de câncer surgiram no mundo e 8,2 milhões de pessoas morreram em decorrência dessa doença, segundo dados da Organização Mundial da Saúde. Estima-se que em 2030, a carga global será de 21,4 milhões de novos casos de câncer, com cerca de 13,2 milhões de mortes, por ano (WHO, 2015).
A carcinogênese é a transformação de uma célula saudável em uma célula cancerígena, durante um processo geralmente lento que ocorre em várias etapas, podendo levar anos até a formação de um tumor visível. Conforme as células cancerígenas vão substituindo as células saudáveis, os tecidos invadidos vão perdendo as suas funções, podendo resultar numa disfunção orgânica gradual que pode levar a falência do órgão e até a morte do paciente (INCA, 2014).
A quimioterapia é utilizada como uma das principais alternativas terapêuticas no combate ao câncer, tendo como objetivo destruir as células tumorais, preservando as saudáveis; No entanto, as atuais opções terapêuticas são frequentemente acompanhadas de fortes efeitos colaterais, em consequência dos fármacos não atuarem de maneira totalmente seletiva sobre as células neoplásicas (Gudgeon, 2014).
A identificação de reguladores da proliferação celular e de moléculas que interfiram em mecanismos associados à apoptose de células cancerígenas, à metástase e à angiogênese representa uma importante estratégia para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes potencialmente anticancerígenos (Browne et al., 2009).
As tiazolidinas são moléculas que vêm demonstrando um amplo espetro de atividades antineoplásicas, sendo ativas contra linhagens de células associadas a diferentes tipos de câncer, como leucemia, linfoma, hepatocarcinoma e glioblastoma, dentre outros (Rêgo et al., 2014).
Os receptores nucleares PPARγ, quando ativados por moléculas tiazolidínicas, formam dímeros com o receptor do ácido x retinóico e interagem com regiões responsivas do DNA, contribuindo, dentre outras ações, com estímulos apoptóticos em células cancerígenas (Belfiore et al., 2009).
15
Numerosos compostos, contendo um anel tiazolidínico em sua estrutura, têm sido desenvolvidos como agentes potencialmente anticancerígenos, inibindo as vias de sinalização PI3K/Akt e NF-kB. Enquanto que algumas tiazolidinas, como a troglitazona, mostram-se como detentoras de propriedades anticancerígenas, através da inibição da via Ralf/MEK/ERK (Liu et al., 2012).
Considerando a vasta gama de efeitos colaterais dos medicamentos antineoplásicos e a necessidade de novas alternativas de tratamento mais eficazes e seletivas no combate ao câncer, o Grupo de Pesquisa e Inovação Terapêutica da Universidade Federal de Pernambuco (GPIT/UFPE) vem enfatizando seus projetos na busca de novas moléculas com atividade antitumoral.
Nesse presente trabalho serão apresentadas as metodologias e os resultados da síntese, caracterização estrutural e avaliação biológica de derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona, candidatos a novos fármacos antitumorais, desenvolvidos sob a parceria do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos (LPSF-UFPE) e do Laboratório de Imunomodulação e Novas Abordagens Terapêuticas (LINAT-UFPE).
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2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Sintetizar, caracterizar estruturalmente e avaliar o potencial da atividade antineoplásica de derivados tiazolidínicos 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona.
2.2 Específicos
Realizar a síntese dos compostos 103, 106, LPSF/GQ-117, LPSF/GQ-263 e LPSF/GQ-264.
Caracterizar os compostos sintetizados, através de análises espectroscópicas no infravermelho, ressonância magnética nuclear de 1H e 13C e por espectrometria de massas;
Avaliar a atividade citotóxica dos compostos LPSF/GQ-103 e LPSF/GQ-106 em PBMCs e nas linhagens de células tumorais DUO-145,
17
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Tiazolidinas e PPAR
As tiazolidinas representam uma classe de moléculas, caracterizadas, quimicamente, pela presença de um anel heterocíclico de cinco membros, contendo três átomos de carbono, um átomo de enxofre na posição 1 e um átomo de nitrogênio na posição 3 (Figura 01). São estruturas reconhecidas na literatura, a partir de trabalhos que as relacionam a uma série de atividades biológicas, como antidiabética, antimicrobiana, anti-inflamatória, antitumoral e anti-aterogência, dentre outras (Asati et al., 2014).
Figura 01: Anel tiazolidínico (Asati et al., 2014)
S N
H
As tiazolidinas atuam em receptores nucleares, denominados PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptors) do tipo γ, permitindo que se liguem a receptores do ácido x-retinóico (RXR – Retinoid-X Receptors), dando origem a um complexo heterodímero que interage com regiões responsivas do DNA, regulando a transcrição gênica (Tavares et al., 2007).
Os receptores PPAR desempenham um importante papel fisiológico no organismo, participando da regulação do metabolismo lipídico, glicídico e da diferenciação e proliferação celular. Três tipos de receptores PPAR são reconhecidos: PPARα, PPARβ e PPARγ (Yki-Jarvinen, 2004).
A ativação dos receptores PPARα resulta no aumento dos níveis de HDL e na redução dos níveis de triglicerídeos plasmáticos, por meio da regulação na transcrição de genes de lipoproteínas, envolvidas no metabolismo lipídico (Wilson et al., 2000).
18
A atividade do receptor PPARβ está relacionada ao metabolismo lipídico, acentuando a oxidação de ácidos graxos, e na modulação da sensibilidade insulínica, sendo considerado um alvo promissor para drogas utilizadas no tratamento e prevenção da síndrome metabólica (Grimaldi, 2007).
Os PPARγ são considerados componentes importantes para a diferenciação dos adipócitos, estando expressos em altas concentrações no tecido adiposo. Os PPARγ também são expressos em uma grande variedade de tumores e a ativação desses receptores pode levar a inibição da proliferação de células cancerígenas, resultando em apoptose nesses tecidos (Allred e Kilgore, 2005).
A apoptose é um processo de morte celular que ocorre em resposta a uma variedade de estímulos, através do qual a célula participa da sua própria destruição. Normalmente, como não há perda da integridade membranar, a apoptose não é acompanhada de reações inflamatórias. A indução seletiva da apoptose em células malignas constitui umas das estratégias para combater o câncer. (Reed e Pellecchia, 2005).
As moléculas tiazolidínicas inibem o crescimento neoplásico, por interferirem em vias que promovem a sobrevivência das células tumorais, como a vias PI3K/Akt, Wnt/β-catenina e do fator de transcrição kappa (NF-kB). A ação das tiazolidinas também está associada a respostas anti-proliferativas sobre linhagens de células associadas ao câncer no pâncreas, por aumento da expressão de Kruppel-like factor 4 (KLF4), independente da ligação das tiazolidinas com o PPARγ (Jain et al., 2004).
Alternativas quimioterápicas, cada vez mais seletivas sobre as células cancerígenas e isentas de fortes efeitos colaterais, permanece com um dos maiores desafios durante o desenvolvimento de novas opções farmacológicas no combate ao câncer. Algumas pesquisas têm avaliado o papel das tiazolidinas no tratamento do câncer, trazendo resultados que revelam que essas moléculas são realmente capazes de inibir o crescimento tumoral.
19 3.2 Câncer
3.2.1 Considerações gerais
O câncer é o nome dado a uma grande variedade de doenças que possuem como principal característica um crescimento celular contínuo e desordenado, acompanhado da resistência à apoptose, manutenção dos sinais proliferativos, indução da angiogênese, desregulação de mecanismos energéticos e mutação genética (Hanahan e Weinberg, 2011).
As células tumorais se comportam de forma anormal, perdendo gradualmente a sua especificidade funcional e estimulando a formação de novos vasos sanguíneo, garantindo a manutenção do seu crescimento. Essas células cancerígenas se multiplicam de forma mais rápida do que a comumente observada nas células do tecido à qual pertencem, resultando num maior crescimento celular local, dando origem a formação tumoral (Almeida et al., 2005)
O crescimento do câncer pode apresentar diferentes graus de evolução, podendo se desenvolver lentamente, formando uma massa localizada de células, como pode crescer de forma rápida e agressiva, invadindo diferentes tecidos, constituindo os chamados tumores malignos.
Quando as células neoplásicas se desprendem do seu tecido de origem e migram para os diferentes tecidos do corpo, através da circulação sanguínea, fenômeno conhecido como metástase, a gravidade clínica e a dificuldade de recuperação tornam-se muito maiores (Meohas et al., 2005).
Observa-se um aumento na taxa de doenças crônico-degenerativas, especialmente de doenças cardiovasculares e do câncer, em consequência do aumento na expectativa de vida e do envelhecimento populacional, provocados pela mudança no perfil de mortalidade, em todo o mundo, com a redução da taxa de doenças infecciosas (Guerra et al., 2005).
Apesar do progresso da ciência e tecnologia em relação aos procedimentos realizados para o diagnóstico e tratamento das doenças crônicas, o negativismo em torno do câncer permanece elevado, pois o mesmo ainda é visto, por vezes, como um processo irreversível e seu nome quase sempre é associado a sofrimento e morte (Dóro et al., 2004).
20
A confirmação do diagnóstico do câncer gera um grande impacto no estado emocional dos pacientes, visto que a partir de então, torna-se necessário passar por diferentes tipos de tratamento para combater a doença, tais como cirurgias e seções de radioterapia e de quimioterapia, frequentemente associados a intensos efeitos colaterais (Mansano-Schlosser e Ceolim, 2012).
Apesar de muitas estratégias quimioterápicas para o tratamento do câncer terem sido propostas, testadas e implantadas nas últimas décadas, essa doença ainda permanece muito difícil de ser combatida. Portanto, existe uma necessidade urgente de se desenvolver opções terapêuticas com respostas mais seletivas e eficazes contra o desenvolvimento do câncer.
As questões que fundamentam a consquista desse objetivo são complexas, pois envolvem o entendimento farmacológico de como o crescimento do tecido cancerígeno pode ser controlado, as metodologias empregadas na síntese e na avaliação biológica das drogas desenvolvidas e de inúmeras variáveis multifatoriais, presentes na pesquisa clínica.
3.2.2 Epidemiologia do câncer
Dentre os diferentes tipos de câncer, o de maior incidência no Brasil é o câncer de pele não-melanoma, com 182.130 novos casos no ano de 2014, o que corresponde a 31,6% do total de novos casos no país. Em seguida, temos o câncer de próstata e o câncer de mama, responsáveis por 68.800 (12%) e 57.120 (10%) novos casos, respectivamente (INCA, 2014).
Os tipos de câncer com as maiores inciências, em 2014, depois do câncer de pele não-melanoma, estão distribuídos de acordo com a Tabela 01 e a Tabela 02, entre as pessoas do sexo masculino e do sexo feminino, respectivamente.
Tabela 01: Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes, em 2014, no sexo
masculino, depois do câncer de pele não-melanoma (INCA, 2014)
Localização primária Casos novos Percentual
Próstata 68.800 22,8%
Traqueia, Brônquio e Pulmão 16.400 5,4%
Cólon e Reto 15.070 5,0% Estômago 12.870 4,3% Cavidade Oral 11.280 3,7% Esôfago 8.010 2,6% Laringe 6.870 2,3% Bexiga 6.750 2,2%
21 Tabela 02: Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes, em 2014, no sexo feminino,
depois do câncer de pele não-melanoma (INCA, 2014)
3.2.3 Tratamento do câncer
As principais opções terapêuticas utilizadas no combate ao câncer são a quimioterapia, radioterapia e cirurgia, alternativas que podem ser utilizadas isoladamente ou mesmo em conjunto, dependendo da susceptibilidade dos tumores a cada uma delas (Luqmani, 2005).
A opção escolhida para o tratamento do câncer depende do seu diagnóstico clínico e histológico, pois auxilia na elucidação das suas características e extensão, fornecendo informações essenciais para que seja possível concluir qual é a melhor opção terapêutica (Vieira et al., 2012).
Um terço dos pacientes consegue ser curado do câncer através da cirurgia ou da radioterapia, que são eficazes quando o tumor ainda não sofreu metástase. Por outro lado, nos demais casos, a neoplasia caracteriza-se pelo desenvolvimento precoce de micrometástases, indicando a necessidade de uma abordagem de tratamento com alcances sistêmicos, por meio da quimioterapia (Almeida et al., 2005).
O câncer em sua fase inicial pode ser tratado e até mesmo curado, por meio 0de procedimento cirúrgico, quando é possível a remoção total do tumor, com relativa margem de segurança. Nos tratamentos cirúrgicos paliativos, a finalidade é reduzir a população de células tumorais e reduzir os sintomas que põe em risco a vida do paciente (INCA, 2014).
Localização primária Casos novos Percentual
Mama 57.120 20,8%
Cólon e Reto 17.530 6,4%
Colo do Útero 15.590 5,7%
Traqueia, Brônquio e Pulmão 10.930 4,0%
Glândula Tireoide 8.050 2,9%
Estômago 7.520 2,7%
Corpo do Útero 5.900 2,2%
22
A radioterapia é uma alternativa no combate a células tumorais, empregando feixes de radiação em áreas cancerígenas previamente demarcadas, levando à morte celular por meio da inativação de mecanismos vitais para a célula ou por alterações que modifiquem a sua capacidade de reprodução (Barboza e Oliveira, 2006).
Em relação à quimioterapia, há uma grande variedade de fármacos disponíveis para o uso clínico, detentores de mecanismos que impedem a proliferação das células cancerígenas (Giglio, 2004). Os principais efeitos adversos durante os tratamentos quimioterápicos do câncer são alterações hematológicas, gastrointestinais, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade, toxicidade pulmonar, disfunção reprodutiva, toxicidade renal, alterações metabólicas e reações alérgicas (Machado e Sawada, 2008).
A quimioterapia adjuvante, terapia realizada após o procedimento cirúrgico, diminui as chances de recidiva do câncer e aumenta a sobrevida dos pacientes, visto que, uma vez retirado o tumor, cirurgicamente, o câncer pode reaparecer a partir de micro metástases ocultas. Portanto, a finalidade do tratamento através da quimioterapia adjuvante é justamente, erradicar as micro-metástases, diminuindo a chance de recidiva e aumentando a sobrevida dos pacientes (Filho et al., 2006)
Quando a administração dos agentes terapêuticos ocorre antes do tratamento principal, temos a chamada quimioterapia neoadjuvante, que tem como objetivo de reduzir do tamanho ou a extensão do câncer antes do tratamento com intervenção radical, como a cirurgia ou a radioterapia.
Infelizmente, a maioria dos fármacos utilizados na quimioterapia induz à depressão da medula óssea em graus variáveis, dependendo do agente e da dose utilizada. São frequentes também a alopécia e as alterações gastrointestinais nos paciente, em tratamento. (Santos e Cruz, 2001).
Durante o acompanhamento de um paciente com câncer, conhecer o impacto da doença e do tratamento na vida dos portadores de câncer é essencial para o planejamento de ações que visem o melhor atendimento a suas necessidades. A implementação de medidas que estimulem o diagnóstico precoce e favoreçam o tratamento são estratégias necessárias para diminuir o risco de sequelas e oferecer meios para a reabilitação física, psíquica e social dos pacientes (Gomes et al., 2013)
23
No Brasil, a Política Nacional de Prevenção e Controle do Câncer, garante o atendimento integral a qualquer doente com câncer, por meio das Unidades de Assistência de Alta Complexidade em Oncologia (Unacon) e dos Centros de Assistência de Alta Complexidade em Oncologia (Cacon), espalhados no país, que correspondem a soma de 276 hospitais habilitados no tratamento do câncer, espalhados por todo o país (Portaria nº 874/GM, 2013)
3.3 Atividades antineoplásicas relacionadas às tiazolidinas
Em trabalhos realizados por Romagnoli et al. (2013), 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas apresentaram boa atividade contra a proliferação de linhagens de células HL-60 e UP37, derivadas de leucemia mielóide humana (Figura 02). Nos ensaios, observaram-se fragmentações do DNA, característicos de processo apoptótico.
Figura 02: Tiazolidinas dissubstituídas utilizadas em linhagens de células HL-60 e UP37 (Romagnoli
et al., 2013) S N O O N H O H2C Br
Derivados tiazolidínicos causaram citotoxicidade sobre linhagens de células cancerígenas HepG2 e inibição da atividade da histona desacetilase (HDAC), em experimentos realizados por Mohan et al. (2012) (Figura 03). Os inibidores das histonas desacetilases (iHDAC) são alvos no desenvolvimento de moléculas antitumorais, pois têm demonstrado notáveis efeitos regulatórios sobre a proliferação de células cancerígenas, a apoptose e angiogênese tumoral (Menditi e Kang, 2007)
24 Figura 03: Tiazolidina N-alquilada inibidoras de HDAC (Menditi e Kang, 2007)
N H O N S O O
Em 2012, Liu et al. sintetizaram uma série de tiazolidinas substituídas que apresentaram atividades antitumorais, através da inibição da cascatas de sinalização Ralf/MEK/ERK e PI3K/Akt. Entre as moléculas estudadas, uma delas foi identificada como portadora de atividades anti-proliferativas sobre linhagens de células U937, associadas a leucemia e também sobre células M12 e DU145, associadas ao câncer de próstata (Figura 04).
Figura 04: Tiazolidina testada sobre linhagens U937, M12 e DU145 (Liu et al., 2012)
S
N O
O
NH2
Em trabalhos realizados por Barros et al. (2012), compostos tiazolidínicos, quando combinados com núcleos acridínicos apresentaram alta toxicidade sobre diferentes linhagens de células tumorais, associadas a carcinoma de cólon e glioblastomas (Figura 05).
Figura 05: Tiazacridinas citotóxicas sobre diferentes linhagens de células tumorais (Barros et
al., 2012) S N N O O R
25
Compostos tiazolidínicos causaram interrupção do ciclo celular e fragmentação de DNA, quando testados sobre linhagens de células tumorais Huh7 e Mahlavu, associadas a hepatocarcinoma (Figura 06). Sugere-se estímulos apoptóticos atribuídos à ação das tiazolidinas, estejam relacionados à ativação da caspase-9 que, uma vez ativada, participa ativamente como elemento pró-apoptótico (Onen-Bayram, 2012).
Figura 06: Tiazolidina testada sobre linhagens Huh7 e Mahalavu (Onen-Bayram, 2012)
S N O
O O
Algumas acridinotiazolidinas (ATZDs) demonstraram grande potencial de atividade antitumoral, em experimentos realizados por Barros et al. (2013). Durante os ensaios, utilizando as ATZDs, observou-se a indução da apoptose em células HCT-8, associadas ao carcinoma do colon humano (Figura 07).
Figura 07: Células HCT-8 antes (A) e depois (B) de serem submetidas
às ATZDs (Barros et al., 2013)
Em ensaios realizados por Li et al. (2007), compostos tiazolidínicos mostraram-se eficazes quanto à atividade antiproliferativa sobre células de melanoma humano (Figura 08). Utilizando duas linhagens de células de meloma, os resultados dos experimentos apontaram que as tiazolidinas avaliadas possuíam grande atividade inibitória, chegando a superar os resultados do sorafenibe, fármaco utilizado como referência.
26 Figura 08: Tiazolidinas avaliadas quanto à atividade antiproliferativa (Li et al., 2007)
N S CONHR HN H O
3.4 Atividades anti-diabéticas relacionadas às tiazolidinas
Os derivados tiazolidínicos atuam como potentes sensibilizadores da ação insulínica sobre tecidos, favorecendo o controle dos níveis glicêmicos, em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. Em trabalho realizado por Araújo et al. (2000), a pioglitazona e a rosiglitazona (Figura 09), duas tiazolidedionas de uso clínico (Actos® e Avandia®), chegaram a diminuir a glicemia em torno de 20%, além de não
estimularem a secreção da insulina pelas células beta, prevenindo os pacientes de picos hipoglicêmicos.
Figura 09: Moléculas de pioglitazona (A) e rosiglitazona (B) (Araújo et al., 2000)
N S N O O O H A N S N O O O H N CH3 B
Segundo trabalho realizado por Strowig e Raskin (2005), o uso da rosiglitazona demonstrou ser importante no controle do diabetes mellitus do tipo 1, quando seu uso é realizado concomitantemente ao da insulina. Em adultos com diabetes mellitus do tipo 1, com Indice de Massa Corporal (IMC) superior a 30, a rosiglitazona associada à insulina melhorou o controle na redução da hiperglicemia, com resultados que correspondem a um aumento de 11% da dose da insulina administrada, caso não houvesse o uso concomitante da rosiglitazona.
27 3.5 Outras atividades biológicas relacionadas às tiazolidinas
O anel tiazolidínico está presente na estrutura de diversos antibióticos beta-lactâmicos, disponíveis para o uso clínico, que agem inibindo a síntese do peptídeo glicano, responsável pela integridade parede bacteriana. Quando essa classe de antibióticos apresenta em sua estrutura química um anel beta-lactâmico ligado a um anel tiazolidínico, são classificados como penicilinas (Silva, 2006) (Figura 10).
Figura 10: Estrutura química geral das penicilinas (Silva, 2006)
N S N O COOH O R H
Em trabalhos desenvolvidos por Dündar et. al (2007), derivados tiazolidínicos apresentaram-se eficazes na inibição, in vitro, do crescimento de Staphylococcus
aureus, incluindo cepas resistentes à ação da meticilina(Figura 11).
Figura 11: Tiazolidinedionas relatadas como agentes antimicrobianos (Dündar et. al., 2007)
N S N S Cl Cl O O R1 R
Segundo trabalho de Barros et al. (2010), durante a avaliação da atividade anti-inflamatória, utilizando modelo experimental de inflamação em bolsa de ar (air pouch model), derivados tiazolidínicos foram responsáveis por inibir a migração leucocitária, em tecidos submetidos a estímulos inflamatórios (Figura 12).
28 Figura 12: Tiazolidinedionas testadas quanto à inibição da migração
leucocitária (Barros et al., 2010)
S N O R2 H O R
Segundo trabalho publicado Youssef et al. (2010), a administração de determinados compostos tiazolidínicos (Figura 13) resultou em considerável grau de inibição das duas isoformas da cicloxigenase (COX-1 e COX-2) e na redução de edema induzido por formalina a 2%, em patas de ratos, demonstrando considerável atividade anti-inflamatória.
Figura 13: Tiazolidinedionas condensadas na posição 5 com pirazóis
substituídos (Youssef et al., 2010)
N N S N O H O R R
A atividade antifúngica de algumas tiazolidinedionas foi demonstrada em ensaios realizados por Nastasa et al. (2013), nos quais foi possível observar significativos graus de inibição do crescimento de Candida albicans, por derivados 5-arilideno-tiazolidina-2,4-diona N-substituídos (Figura 14).
29 Figura 14: Tiazolidinas avaliadas quanto à inibição do crescimento de Candida albicans
(Nastasa et al., 2013) N S N S O O R
Em trabalho de Medeiros et al. (2006), o uso da tiazolidina-2,4-diona inibiu do crescimento da Monosporascus cannonballlus, apresentando-se como importante agente biológico, no controle de infecções vegetais, causadas por este fungo. No referido trabalho também foi possível observar que a tiazolidina-2,4-diona não interfere no desenvolvimento do Thichoderma spp., agente utilizado como biocontrolador de fitopatógenos, contribuindo, dessa forma, na avaliação da sua seletividade biológica.
3.6 Reações químicas relacionadas ao núcleo tiazolidina-2,4-diona:
A tiazolidina-2,4-diona, presente na estrutura de uma variedade de compostos que agem como agonistas de PPARgama, pode ser obtida por diferentes vias sintéticas. Algumas metodologias de obtenção da tiazolidina-2,4-diona e de seus derivados, encontradas na literatura, são apresentadas a seguir:
Em trabalho realizado por Jain et al. (2013), obteve-se a molécula tiazolidina-2,4-diona a partir do aquecimento de ácido cloroacético e tioureia, utilizando água como solvente, numa reação com duração de12h (Figura 15).
Figura 15: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir do ácido cloroacético
e da tioureia (Jain et al., 2013)
S N H O O H2O Cl OH O N N S H H H H
30
A tiazolidina-2,4-diona foi obtida por Monforte et al. (1979), através da reação de ciclização obtida a partir do ácido mercaptopropanóico e carbodiimidas (Figura
16).
Figura 16: Síntese de Monforte (Monforte et al., 1979)
CH3 CH OH O SH C N N R R S N R O O H CH3
Pelo aquecimento de misturas equimolares de ácido cloroacético, tioureia e anilina, numa temperatura de 115°, por 20min, seguida de adição de ácido clorídrico, logo após o resfriamento da amostra, Kochkanyan et al.(1978) conseguiram sintetizar a tiazolidina-2,4-diona (Figura 17).
Figura 17: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir da tiouréia, do ácido cloroacético
e da anilina (Kochkanyan et al., 1978)
Cl O OH S N O O NH2 N N S H H H H S N O O H HCl
Em ensaio realizado por Brown (1961), a tiazoldina-2,4-diona foi sintetizada a partir da reação entre amônia e oxissulfeto de carbono, em meio contendo hidróxido de potássio (Figura 18).
Figura 18: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona do oxissulfeto de carbono
com amônia (Brown, 1961)
NH3 KOH NH2COS -ClCH2COO -NH2COSCH2COO- H + C O S S N H O O
31
A tiazolidina-2,4-diona sofre reação de N-alquilação, quando reage com haletos de benzila substituídos, em meio contendo hidróxido de sódio, como catalizador, e etanol, como solvente (Junior et al., 2013) (Figura 19).
Figura 19: Obtenção de derivados da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (Junior et al., 2013)
S N O H O Cl S N O O NaOH EtOH R
A partir da reação entre tiocianato de potássio e cloroacetato de etila, em presença de ácido clorídrico e água destilada, a molécula tiazolidina-2,4-diona pode ser sintetizada, segundo trabalhos desenvolvidos por Heintz (1865), apud Lima (1998) (Figura 20).
Figura 20: Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir do cloroacetato de etila e tiocianato
dePotássio (Heintz, 1985, apud Lima, 1998)
Cl O O C2H5 N S O O C2H5 HCl KSCN S N O H O
Bombardieri e Taurins (1955), apud Brown (1961) realizaram a síntese da 3-(dimetil-amino-metil)-diona, a partir da reação entre tiazolidina-2,4-diona e formaldeído em presença de dimetilamina (Figura 21).
Figura 21: Obtenção da 3-(dimetil-amino-metil)-tiazolidina-2,4-diona a partir do formaldeído e da
dimetilamina (Bombardieri e Taurins, 1955, apud Brown,1961)
S N O H O S N O O H H O N CH3 CH3 N CH3 CH3 H
32
Derivados tiazolidínicos sofrem condensação de Knoevenagel, na posição 5 do anel, quando reagem com aldeídos aromáticos, em meio reacional com ácido acético e acetato de sódio (Ibrahim et al., 2011) (Figura 22).
Figura 22: Condensação de Knoevenagel de derivados tiazolidínicos
N-substituidos (Ibrahim et al., 2011)
S N O O R O H R1 S N O O R R1
Rêgo et al. (2014) conseguiram sintetizar derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas, condensando 3-(4-nitrobenzil)-tiazolidina-2,4-diona com 2-ciano-3-fenilacrilatos de etila substituídos, em meio reacional contendo etanol e piperidina (Figura 23).
Figura 23: Condensação na posição 5 da tiazolidina, utilizando
ésteres cianocinâmicos (Rêgo et al., 214)
A metodologia escolhida no trabalho acima descrita é uma aplicação do que foi abordado por Cope et al., em 1941, onde foi demonstrado que a condensação na posição 5 da tiazolidina-2,4-diona com aldeídos poderia ser realizada, utilizando ésteres cianocinâmicos (Ésteres de Cope), como intermediários. A síntese desses ésteres envolve reação entre cianoacetato de etila e aldeído, em solução benzênica, na presença de acetato de amônio e ácido acético (Figura 24).
Figura 24: Síntese do Éster de Cope (Cope et al., 1941)
O H CN C O O R CN O O CH3CO2NH4 CH3CO2H R Benzeno
33
A tionação da tiazolidina-2,4-diona, com substituição do átomo de oxigênio da carbonila da posição 4 por um átomo de enxofre, foi realizada por Andrade et al. (2002), a partir de reação entre a tiazolidina-2,4-diona e Reagente de Lawesson, em meio contendo dioxano anidro. Em 1967, Grishchuk et al. realizaram essa tionação, utilizando meio reacional contendo pentassulfeto de fósforo e dioxano anidro (Figura
25).
Figura 25: Reação de tionação da tiazolidina-2,4-diona
(Grishchuk et al., 1967; Andrade et al., 2002)
S N H O O S N H S O P2S5 ou Reagente de Lawesson 4 METODOLOGIA 4.1 Estudo químico
A síntese dos derivados da série LPSF/GQ teve início com a preparação da tiazolidina-2,4-diona, por meio da reação do ácido monocloroacético e tiouréia. Em seguida, reagiu-se a tiazolidina-2,4-diona com os 3 diferentes haletos de benzila substituídos, obtendo-se as 3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas substituídas: 3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-52), 3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-53) e 3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-54).
Os compostos finais foram sintetizados a partir de reações de condensação entre os derivados 3-benzil-tiazolidínicos substituídos e benzaldeídos, conduzindo aos derivados finais: 5-(3-cloro-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103), 5-(2,4-dimetóxi-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-106), 5-(3-bromo-4-metóxi-benzilideno)-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-117), 5-(4-benziloxi-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-263), 5-(5-bromo-2-metóxi-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-264) (Esquema 01).
34 Esquema 01: Esquema geral de reação dos derivados da série 5-benzilideno-
3-benzil-tiazolidina-2,4-diona
4.1.1 Materiais
4.1.1.1 Equipamentos
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H): Espectrômetro Varian Modelo Unit Plus 300 MHz e 400 MHz com o solvente DMSO-d6. As multiplicidades dos sinais são indicadas pelas seguintes abreviações: singleto (s), dubleto (d), duplo dubleto (dd), tripleto (t), duplo tripleto (dt), quadrupleto (q), multipleto (m). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm e os acoplamentos em Hz;
Espectroscopia de absorção no infravermelho (IV): Espectrofotômetro FTIR Bruker Modelo IFS 66, em pastilhas de KBr, onde as bandas de absorção serão expressas em cm-1;
Pontos de fusão: aparelho Quimis Modelo 340.27;
Cromatografia em camada delgada (CCD): placas de sílica gel Merck 60 F254,
35 4.1.1.2 Reagentes e Solventes
Os reagentes e os solventes utilizados foram das marcas Acros Organics, Aldrich, Merck, Riedel-De Haën, Sigma e Vetec: cloreto de 2-cloro-6-flúor-benzil, cloreto de dicloro-benzil, brometo de 2-bromo-benzil, 3-cloro-benzaldeído, 2,4-dimetóxi-benzaldeído, 3-bromo-4-metóxi-benzaldeído, 4-benzilóxi-benzaldeído, 5-bromo-2-metóxi-benzaldeído, etanol, hexano e acetato de etila.
4.1.2 Metodologia de síntese:
A seguir, serão descritas as metodologias utilizada para preparação dos compostos: tiazolidina-2,4-diona; 3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-52); 3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-53); 3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-54); 5-(3-cloro-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103); 5-(2,4-dimetóxi-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-106); 5-(3-bromo-4-metóxi-benzilideno)-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-117); 5-(4-benziloxi-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-263); 5-(5-bromo-2-metóxi-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-264) 4.1.2.1 Síntese da tiazolidina-2,4-diona
Em um balão de fundo redondo, adiciona-se tiouréia (10 g – 0,13 mol) e ácido monocloroacético (12,7 g – 0,13 mol), como reagentes, e utiliza-se água destilada, como solvente. Após 16h, sob agitação magnética, mantém-se a mistura em repouso por 24 horas, sob refrigeração. Em seguida, formam-se cristais brancos, cuja purificação é realizada através de recristalização, utilizando água destilada.
36 4.1.2.2 Reações de N-alquilação da tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-52)
Em um balão de fundo redondo, adiciona-se tiazolidina-2,4-diona e uma solução equimolar de hidróxido de sódio previamente dissolvido em uma mistura etanol/água (6:4). Submete-se a mistura à agitação magnética, por 30min, utilizando etanol como solvente. Após a formação do sal, adiciona-se uma quantidade equimolar do haleto de benzila. Em seguida, aquece-se lentamente a reação até 70 ̊ C e após 24 horas, realiza-se uma placa cromatográfica, onde é possível verificar a formação do produto desejado. Purifica-se o precipitado obtido através de lavagem com etanol a frio, recristalização e coluna cromatográfica, quando necessário.
4.1.2.3 Reações de condensação na posição 5 das 3-benzil-tiazolidina-2,4-dionas substituídas
Em um balão de fundo redondo, adiciona-se a 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona substiutída e o benzaldeído, em proporções equimolares, juntamente com 1 mL de morfolina, catalisador da reação, e 30 mL de etanol, utilizado como solvente. Aquece-se a mistura reacional a 60ºC, sob agitação magnética, e após 1h, realiza-se uma placa cromatográfica, onde é possível verifica a formação do produto desejado. Filtra-se o produto a quente e lava-se com etanol, para purificação.
4.2 Estudo biológico 4.2.1 Materiais e Métodos 4.2.1.1 Cultivos das Células
As células foram cultivadas em meio RPMI 1640, pH 6,9 (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab), 25 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfonico (HEPES) e 24 mM de bicarbonato de sódio em estufa de atmosfera úmida a 37⁰C, com 5% de CO2. A deadesão da célula da
garrafa de cultivo, nas culturas de células aderentes, foi realizada com Tripsina-EDTA 0,05% (v/v), onde inicialmente o meio antigo era descartado, a garrafa era lavada com PBS gelado e posteriormente a solução de Tripsina-EDTA era adicionada. Após, em média, dois minutos de ação da enzima a mesma era
37
inativada com adição de meio completo contendo 10% de SFB. As células foram, então, transferidas para tubos tipo Falcon de 15 mL, centrifugadas e então ressuspendidas em volume definido. Todas as linhagens foram obtidas do banco de células do Rio de Janeiro e mantidas no Laboratório de Imunomodulação e Novas Abordagens Terapêuticas (LINAT-UFPE).
A contagem das células foi realizada em um microscópio invertido, utilizando câmara de Neubauer através da fórmula (A+B+C+D) /4 X 104, onde cada letra representa o número de células por campo da câmara analisado. Todos os experimentos foram realizados com confluência (porcentagem de células que ocupam a área da garrafa da cultivo) entre 60 e 80%.
4.2.1.2 Ensaios de citotoxicidade seletiva, utilizando PBMCs
As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas a partir do sangue de doadores sadios que não faziam uso de medicamentos nem fumavam, por centrifugação com Ficoll PaqueTM Plus (GE Healthcare Bio-Sciences). As PBMCs isoladas foram cultivadas (106 células/100 µL) em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado. Após estabelecimento da cultura as células foram cultivadas por 48h com os compostos testados nas concentrações de 1, 10 e 100
M e submetidas ao método de MTT como descrito no item acima.
4.2.1.3 Ensaio de citotoxicidade sobre células neoplásicas
Os testes de citotoxicidade foram realizado in vitro, utilizando as linhagens de células neoplásicas DUO-145, HepG2, K562 e RAJI. Foram utilizadas diferentes concentrações dos compostos sintetizados e a citotoxicidade foi quantificada pelo método MTT.
Descrita por Mosman, em 1983, a análise de citotoxicidade pelo método do MTT é um método rápido, sensível e barato que tem a capacidade de analisar a viabilidade celular. É uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente
38
ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação.
As células foram plaqueadas na concentração de 1 x 104 céls./100µL e, posteriormente, as placas foram incubadas por 24 horas a 37°C em estufa úmida e 5% de CO2. Após esse período, os compostos foram acrescidos em diferentes
concentrações (1, 10, 25, 50 e 100µM) e as placas, novamente incubadas por 72 horas. Em seguida, adicionou-se 20µL da solução de MTT (sal de tetrazolium) e incuba-se as placas por 3h. Passado esse tempo, foram adicionados 130µL de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) a 20% para dissolução do precipitado. A absorbância foi lida após 24h em espectrofotômetro de placa a 570nm. No estudo, as amostras foram testadas em triplicata e a amsacrina foi utilizada como fármaco de referência.
4.2.1.4 Análises Estatísticas
O percentual de morte celular foi determinado de maneira relativa ao controle negativo e os dados foram analisados a partir da média de 3 experimentos independentes utilizando o software estatístico GraphPad Prism .
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Estudo químico
As características físico-químicas dos compostos obtidos, tais como massa molecular, ponto de fusão, rendimento e a razão de frente (Rf), estão representadas nas tabelas 3, 4 e 5.
Tabela 03: Características físico-químicas da tiazolidina-2,4-diona
S NH O O Composto Fórmula Molecular Massa Molar Rend. P.F. (C) Rf / Sistema de eluição TZD-2,4-diona C3H3NO2S 117 g / mol 86% 122-123 0,69 / CHCl3:MeOH 95:5
39 Tabela 04: Características físico-químicas dos compostos N-alquilados
S N O O R Composto R Fórmula Molecular Massa
Molar Rend. P.F. (C) Rf / Sistema de eluição LPSF/GQ-52 2-Cl, 6-F C10H7O2NSFCl 259,5 g/mol 37,7% 93-95 0,56 / Hex/Acet 8:2 LPSF/GQ-53 2,4-Cl, C10H7O2NSCl2 276 g/mol 47,5% 65-66 0,60 / Hex/Acet 8:2 LPSF/GQ-54 2-Br C10H8O2NSBr 286 g/mol 28,5% 65-66 0,60 / Hex/Acet 8:2
Tabela 05: Características físico-químicas dos compostos finais
S N O O R1 R2 Composto R1 R2 Fórmula Molecular Massa Molar Rend. PF (C) Rf / Sistema de eluição LPSF/GQ-103 2-Cl, 6- F 3-Cl C17H10O2NSFCl2 382 g/mol 51,9% 121-122̊ 0,50 / Hex/Acet 8:2 LPSF/GQ-106 2-Cl, 6-F 2,4-OCH3 C19H15O4NSFCl 407,5 g/mol 67,8% 149-150 0,52 / Hex/Acet 7:3 LPSF/GQ-117 2-Br 3-Br, 4-OCH3 C18H13O3NSBr2 483 g/mol 70,3% 200-202 0,6 / Hex/Acet 7:3 LPSF/GQ-263 2,4-Cl 5- Ph-OCH2-Ph- C24H17O3NSCl2 470 g/mol 87% 161-163 0,55 / Hex/Acet 8:2 LPSF/GQ-264 2,4-Cl 2-OCH3, 5-Br C18H12O3NSBrCl2 473 g/mol 80% 167-169 0,65 / Hex/Acet 8:2
40 5.1.1 Mecanismos reacionais
A seguir, serão apresentados os mecanismos reacionais propostos para cada etapa de síntese realizada.
5.1.1.1 Tiazolidina-2,4-diona
O mecanismo reacional para obtenção da tiazolidina-2,4-diona é explicado pelo ataque nucleofílico do par de elétrons livres do átomo de enxofre ao carbono 2 do ácido cloroacético, eliminando ácido clorídrico e levando à formação de um intermediário. Por ataque nucleofílico intramolecular do par de elétrons livres do nitrogênio do grupo amino ao carbono carbonílico, ocorre a ciclização, com eliminação de água. O grupo imino em posição 2 do ciclo sofre hidrólise, liberando amônia, conduzindo à tiazolidina-2,4-diona (Liesen et al., 2008) (Esquema 02).
41 5.1.1.2 Derivados tiazolidínicos N-alquilados
O mecanismo reacional da síntese dos compostos N-alquilados ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, o átomo de hidrogênio ligado ao nitrogênio presente na posição três do anel heterocíclico, o qual se apresenta suficientemente ácido para ser capturado por uma base, permite a formação de um sal de sódio, em presença de hidróxido de sódio. Na segunda etapa, o sal de sódio obtido ataca o haleto de benzila substituído, dando origem aos compostos tiazolidínicos N-alquilados (Liesen et al., 2008) (Esquema 03).
Esquema 03: Mecanismo reacional de N-alquilação da tiazolidina-2,4-diona
5.1.1.3 Derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103, LPSF/GQ-106, LPSF/GQ-117, LPSF/GQ-263, LPSF/GQ-264)
Oo grupo metileno na posição 5 do anel tiazolidínico, devido à sua acidez, possui reatividade característica, e condensa com aldeídos ou cetonas em reação do tipo Knoevenagel. De acordo com este mecanismo, a reação ocorre em três etapas: desprotonação do composto com metileno ativo, adição do carbânion ao composto carbonílico e eliminação de água, com formação de uma dupla ligação (Cunha e Santana, 2012) (Esquema 04).
42 Esquema 04: Mecanismo de condensação da tiazolidina na posição 5
5.1.1.4 Avaliação Espectroscópica
A caracterização dos derivados tiazolidínicos foi realizada através da análise espectroscópica de ressonância magnética nuclear (RMN H1 e RMN C13) e infravermelho (IV). Na espectroscopia de infravermelho foram observadas as bandas de absorção características dos grupos funcionais presentes nas estruturas. Na espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, foi possível verificar os picos característicos das absorções referentes aos hidrogênios presentes nas estruturas das moléculas em estudo. Na espectroscopia de ressonância magnética nuclear de carbono, foi verificado o número de carbonos e o deslocamento químico para cada estrutura. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm e os acoplamentos em Hz. Por fim, abaixo podem ser encontrados os resultados espectroscópicos do infravermelho, RMN 1H e RMN 13C dos produtos finais.
a) 3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-52) - (CAS 524030-95-3, Barros et al., 2010): S N O O F Cl RMN 1H: 4.22 (s, 2H, -SCH2); 4.81(s, 2H, -NCH2); 7.22 (t, 1H, Ar, J= 8.32); 7.31 (d, 1H, Ar, J= 8.32); 7.38 (d, 1H, Ar, J= 8.32).
43 RMN 13C: (33.50); (36.90); (114.42); (114.64); (120.65); (125.57); (130.56);
(134.22); (171.18); (171.40).
b) 3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-53) - (CAS 102653-72-5, Ezer et al., 2012; Mentese et al., 2009; Bozdag et al., 2008):
S N O O Cl Cl RMN 1H: 4.30 (s, 2H, -SCH2); 4.72 (s, 2H, -NCH2); 7.25 (d, 1H, Ar, J= 8.00); 7.39 (d, 1H, Ar, J= 8.00); 7.62 (s, 1H, Ar). RMN 13C: (34.18); (41.72); (127.43); (128.86); (129.82); (131.62); (132.74); (132.97); (171.75); (172.14). c) 3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-54) - (CAS 918131-31-4, Barros et al., 2010; Bozdag et al., 2006):
S N O O Br RMN 1H: 4.33 (s, 2H, -SCH2); 4.69 (s, 2H, -NCH2); 7.12 (d, 1H, Ar, J= 6.86);
7.25 (t, 1H, Ar, J= 7.71); 7.36 (t, 1H, Ar, J= 6.86); 7.65 (d, 1H, Ar, J= 6.86).
RMN 13C: (34.30); (44.58); (121.72); (127.61); (127.99); (129.51); (132.71);
44 d) 5-(3-cloro-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-103) - (CAS 1244751-08-3): S N O O F Cl Cl
IV: C=O (1741.25); C=O (1686.29); -CH= (1603.59)
RMN 1H: 4.98 (s, 2H, -NCH2); 7.24 (t, 1H, Ar, J= 7.99 Hz); 7.34 (d, 1H, Ar, J=
7.99 Hz); 7.44-7.38 (m, 1H, Ar); 7.55-7.53 (m, 3H, Ar); 7.69 (s, 1H, Ar); 7.91 (s, 1H, -CH=). RMN 13C: (37.30); (114.48); (120.44); (122.53); (125.63); (127.79); (130.04); (130.68); (131.15); (131.71); (133.95); (134.23); (134.99); (160.19); (162.67); (164.63); (166.12). MS: 381 m/z [M+H]+; 404 m/z [M+Na]+. e) 5-(2,4-dimetóxi-benzilideno)-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4- diona (LPSF/GQ-106) - (CAS 591729-76-9): S N O O F Cl H3CO H3CO
45 RMN 1H: 3.84 (s, 3H, -OCH3); 3.88 (s, 3H, -OCH3); 4.96 (s, 2H, -NCH2); 6.69 (d,
1H, Ar, J=9.59 Hz); 6.71 (s, 1H, Ar); 7.23 (t, 1H, Ar, J=8.39 Hz); 7.33 (d, 1H, Ar, J=8.39 Hz); 7.36 (d, 1H, Ar, J=7.99 Hz); 7.43-7.39 (m, 1H, Ar); 8.00 (s, 1H, -CH=). RMN 13C: (37.10); (55.67); (55.92); (114.09); (114.46); (114.69); (117.09); (120.53); (120.69); (125.58); (128.17); (130.65); (134.18); (159.86); (160.17); (162.65); (163.36); (165.16); (166.83). MS: 408 m/z [M+H]+; 431 m/z [M+Na]+. f) 5-(3-bromo-4-metóxi-benzilideno)-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4- diona (LPSF/GQ-117) - (CAS 640700-37-4): S N O O Br H3CO Br
IV: C=O (1735.63); C=O (1682.00); -CH= (1591.28).
RMN 1H: 3.93 (s, 3H, -OCH3); 4.85 (s, 2H, -NCH2); 7.17 (d, 1H, Ar, J=6.79 Hz);
7.21 (d, 1H, Ar, J=8.79 Hz); 7.26 (t, 1H, Ar, J=7.59 Hz); 7.31 (d, 1H, Ar, J=8.79 Hz); 7.36 (t, 1H, Ar, J=7.59 Hz); 7.66 (d, 1H, Ar, J=8.39 Hz); 7.76 (s, 1H, Ar); 7.94 (s, 1H, -CH=).
RMN 13C: (38.88); (56.65); (111.45); (111.45); (113.31); (119.50); (119.50);
(126.85); (126.85); (128.00); (129.56); (130.79); (130.79); (132.06); (132.06); (132.71); (132.71); (135.09); (135.09); (157.12); (157.12).
46 g) 5-(4-benzilóxi-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-263) - (CAS 1244561-51-0): S N O O Cl O Cl
IV: C=O (1740.53); C=O (1676.56); -CH= (1597.62).
RMN 1H: 4.88 (s, 2H, -OCH2); 5.20 (s, 2H, -NCH2); 7.20 (d, 2H, Ar, J=9.19 Hz);
7.30 (d, 1H, Ar, J=7.99 Hz); 7.35 (d, 2H, Ar, J=6.79 Hz); 7.42-7.38 (m, 3H, Ar); 7.46 (d, 1H, Ar, J=7.59 Hz); 7.62 (d, 2H, Ar, J=8.79 Hz); 7.67 (s, 1H, Ar); 7.93 (s, 1H, -CH=). RMN 13C: (38.87); (69.52); (115.80); (117.82); (125.52); (125.52); (127.60); (127.60); (127.81); (127.81); (128.02); (128.02); (128.48); (128.94); (130.18); (131.62); 132.33); (132.33); (133.51); (133.51); (136.43); (136.43). h) 5-(5-bromo-2-metóxi-benzilideno)-3-(2,4-dicloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-264) - (CAS 640693-43-2): S N O O Cl Cl H3CO Br
IV: C=O (1729.04); C=O (1679.23); -CH= (1592.99).
RMN 1H: 3.90 (s, 3H, -OCH3); 4.87 (s, 2H, -NCH2); 7.15 (d, 1H, Ar, J=8.79 Hz);
7.33 (d, 1H, Ar, J=8.39 Hz); 7.41 (d, 1H, Ar, J=8.39 Hz); 7.56 (s, 1H, Ar); 7.68 (s, 2H, Ar); 7.96 (s, 1H, -CH=).
RMN 13C: (42.28); (56.16); (112.21); (114.37); (123.13); (123.57); (127.30);
(127.61); (128.98); (130.35); (131.24); (131.51); (132.83); (133.15); (134.90); (157.04); (165.27); (167.10).
47 5.2 Estudo biológico
5.2.1 Ensaios de viabilidade sobre PBMC’s
A viabilidade de células humanas saudáveis, quando expostas às novas moléculas tiazolidínicas sintetizadas, foi verificada por meio de ensaios de MTT. Foram utilizadas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab), HEPES 25 mM (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfonico) e bicarbonato de sódio 24 mM.
Os compostos tiazolidínicos LPSF/GQ-103 e LPSF/GQ-106 foram avaliados nas concentrações de 1 a 100 µM, durante os ensaios de MTT, e os resultando obtidos nos experimentos foram satisfatórios, com viabilidade celular acima de 90%, para ambos os compostos (Figura 26).
Figura 26: Viabilidade de PBMCs expostas ao LPSF/GQ-103 e LPSF/GQ-106
5.2.2 Ensaios de citotoxicidade sobre células tumorais
Realizaram-se ensaios de citotoxicidade tumoral dos compostos LPSF/GQ-103 e LPSF/GQ-106, utilizando as seguintes linhagens de células tumorais:
DUO-145 – Câncer de próstata
HepG2 - Hepatocarcinoma
K562 - Leucemia
48
Foram utilizadas diferentes concentrações dos compostos sintetizados e a citotoxicidade foi quantificada pelo método de MTT.
Os resultados dos ensaios revelaram que dentre as 4 linhagens de células utilizadas, apenas na linhagem DUO-145 foi verificada uma atividade citotóxica considerável desses 2 compostos tiazolidínico. O valor de IC50 do LPSF/GQ-103
sobre a linhagem DUO-145 foi de 18,18 µM, enquanto que o valor de IC50 do
LPSF/GQ-106 foi de 24,13 µM. Nos experimentos com as demais linhagens de células tumorais, os resultados da citotoxicidade ficaram insatisfatórios, com valores de IC50 acima de 100 µM (Figura 27 e Tabela 6).
Figura 27: Viabilidade de células tumorais, expostas aos compostos GQ-103 e GQ-106
Tabela 06: Valores de IC50 de células tumorais, expostas aos compostos GQ-103 e GQ-106
IC50 (µM)
Linhagens
Compostos DUO-145 HEPG2 K562 RAJI PBMC
LPSF/GQ103 18,18 ± 4,38 >100 >100 >100 >100
