Síntese e avaliação preliminar da atividade antinoceptiva e toxicidade de novas isoxazolil-aril-hidrazonas

Texto

(1)UIVERSIDADE FEDERAL DE PERAMBUCO CETRO DE CIÊCIAS DA SAÚDE DEPARTAMETO DE CIÊCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊCIAS FARMACÊUTICAS. Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Reis. SÍTESE E AVALIAÇÃO PRELIMIAR DA ATIVIDADE ATIOCEPTIVA E TOXICIDADE DE OVAS ISOXAZOLIL-ARIL-HIDRAZOAS. Dissertação de Mestrado. Recife, PE 2008.

(2) Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Reis. SÍTESE E AVALIAÇÃO PRELIMIAR DA ATIVIDADE ATIOCEPTIVA E TOXICIDADE DE OVAS ISOXAZOLIL-ARIL-HIDRAZOAS. Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da UFPE, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.. Orientador: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria Co-orientadora: Profa. Dra.Teresinha Gonçalves da Silva. +. Bolsista da Facepe. Recife, PE 2008.

(3) Reis, Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Síntese e avaliação preliminar da atividade antinoceptiva e toxicidade de novas isoxazolil-arilhidrazonas / Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Reis. – Recife : O Autor, 2008. 92 folhas. Il: fig., graf ., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008. Inclui bibliografia e anexo. 1. Química farmacêutica. 2. Química médica. 3. Síntese química. 4. Isoxazolil-aril-hidrazonas. I. Título. 542.057 615.19. CDU (2. ed) CDD (22.ed.). UFPE CCS2008-133.

(4) UIVERSIDADE FEDERAL DE PERAMBUCO CETRO DE CIÊCIAS DA SAÚDE DEPARTAMETO DE CIÊCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊCIAS FARMACÊUTICAS LASOF – LABORATÓRIO DE SÍTESE ORGÂICA APLICADA A FÁRMACOS. SÍTESE E AVALIAÇÃO PRELIMIAR DA ATIVIDADE ATIOCEPTIVA E TOXICIDADE DE OVAS ISOXAZOLIL-ARIL-HIDRAZOAS. BACA EXAMIADORA: Presidente: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria - UFPE Membro Interno Titular: Profa.Dra. Maria do Carmo Alves de Lima - UFPE Membro Externo Titular: Profa. Dra. Maria Bernadete de Sousa Maia - UFPE (Departamento de Farmacologia) Membros Suplentes: Prof. Dr.Dalci José Brondani – UFPE Prof. Dr.Francisco Jaime Bezerra Mendonça Junior - UEPB.

(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CrENCIAS DA SAUDE DEPARTAMENTO DE CrENCIAS FARMACEUTICAS PROGRAMA DE POS-GRADUA<;AO EM CIENCIAS FARMACEUTICAS. Dissertayao de Mestrado defendida e APROV ADA, por decisao unanime, em 29 de agosto de 2008 e cuja Banca Examinadora foi constituida pelos seguintes professores:. PRESIDENTE E EXAMINADOR INTERNO: Prof. D . tonio Rodolfo de Faria (DeptO de Ciencias Farmaceuticas da niver idade Federal de Pernambuco - UFPE).. EXAMINADOR INTERNO: Profa. Dra. Maria do Carmo Alves de Lima (DeptOde Antibi6ticos da Universidade Federal de Pernambuco UFPE). Assinatura:. EXAMINADOR. EXTERNO:. ~. Jji?/~. Profa. Dra. Maria Bernadete. de. Sousa Maia (DeptOFisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE)..

(6) UIVERSIDADE FEDERAL DE PERAMBUCO. REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins. VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva. PRÓ-REITOR PARA ASSUTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado. DIRETOR DO CETRO DE CIÊCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro. CHEFE DO DEPARTAMETO DE CIÊCIAS FARMACÊUTICAS Profa. Dra. Jane Sheila Higino. COORDEADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Pedro José Rolim eto. VICE-COORDEADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊCIAS FARMACÊUTICAS Profa. Dra. Beate Saegesser Santos.

(7) DEDICATÓRIA. Dedico à Débora minha noiva e a minha família, pela paciência e compreensão nos momentos difíceis desta trajetória, minha sincera gratidão! Este trabalho não é só meu. É, acima de tudo, de vocês!.

(8) AGRADECIMENTOS. A Deus pelo dom da vida e pelo fato de ser tão generoso comigo nesta caminhada. Ao orientador e grande amigo prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria pela oportunidade concedida, pelos ensinamentos, pela compreensão e pelo apoio nos momentos mais difíceis desta trajetória. À profa. Dra. Terezinha Gonçalves da Silva e Laudelina Magalhães do Laboratório Bioensaios para Pesquisa de Fármacos (LBPF) do Departamento de Antibióticos, da Universidade Federal de Pernambuco pela realização dos testes biológicos. Aos amigos do laboratório Gleybson, Karina, Leilane, Rafaela, Hugo, Ronmilson, Keila, Mônica e Keila pelo convívio agradável e momentos de amizade e descontração, em especial a Valderes pela sinsera amizade, apoio nos momentos difíceis e grande colaboração para a realização deste trabalho. Aos amigos da turma de pós-graduação Cleiton, Diogo, Marcos e Fred pelos momentos divertidos e sofrimento conjunto durante a realização das disciplinas. Aos técnicos da central analítica do DQF, em especial Ricardo e Eliete. À Conceição, da secretaria da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo seu apoio e paciência com nossas agonias. A todos os professores que fazem parte do programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. A minha família e a minha noiva Débora, que são o que eu tenho de mais preciosos nesta vida, pela paciência, compreensão e apoio nos momentos difíceis desta trajetória. A FACEPE pelo suporte financeiro..

(9) A VIDA A vida é uma oportunidade, aproveite-a... A vida é beleza, admire-a... A vida é felicidade, deguste-a... A vida é um sonho, torne-o realidade... A vida é um desafio, enfrente-o... A vida é um dever, cumpra-o... A vida é um jogo, jogue-o... A vida é preciosa, cuide dela... A vida é uma riqueza, conserve-a... A vida é amor, goze-o... A vida é um mistério, descubra-o... A vida é promessa, cumpra-a... A vida é tristeza, supere-a... A vida é um hino, cante-o... A vida é uma luta, aceite-a... A vida é aventura, arrisque-a... A vida é alegria, mereça-a... A vida é vida, defenda-a.... (Madre Teresa de Calcutá).

(10) SUMÁRIO. PARTE 1 – INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS 1 - Introdução.............................................................................................................2 2 - Revisão da literatura.............................................................................................6 2.1 – isoxazolinas................................................................................................. 6 2.2 – Derivados de hidrazonas ...........................................................................12 3 – Objetivos ............................................................................................................20 3.1 – Objetivos gerais .........................................................................................20 3.2 – Objetivos específicos..................................................................................20. PARTE 2 – ESTUDO QUíMICO 4 – Metodologia .......................................................................................................22 5 – Resultados e discussão .....................................................................................25 5.1 – Obtenção do éster isoxazolínico bicíclico 49.............................................25 5.1.2 – Preparação do trímero da 1-pirrolina 47..........................................25 5.1.3 – síntese do enecarbamato endocíclico N-(benziloxicarbonil)-2pirrolina 48...................................................................................................26 5.1.4 – Síntese do clorooximidoacetato de etila – precusor do N-óxido de nitrila – CEFNO 56..................................................................................26 5.1.5 – Sintese do éster isoxazolínico, via reação de cicloadição 1,3-dipo lar 49................................................................................................27 5.2 – Desproteção da amina secundária em N6................................................28 5.3 – N-benzoilação da isoxazolina 50 desprotegida com cloretos de benzoila para substituídos .......................................................................................28 5.4 – Síntese dos álcoois isoxazolínicos 52.......................................................29 5.5 – Obtenção dos aldeídos isoxazolínicos 53 através da oxidação de Swern dos álcoois isoxazolínicos 52....................................................................30 5.6 – Obtenção das isoxazolil-hidrazonas de 5 membros 54.............................31 6 – Procedimentos experimentais...........................................................................34 PARATE 3 – ESTUDO BIOLÓGICO 7 – Revisão da literaratura........................................................................................54 7.1 – Fisiopatologia da dor ................................................................................54.

(11) 7.2 – Toxicidade aguda .....................................................................................58 8 – Avaliação da atividade biológica .......................................................................58 8.1 – Materiais ...................................................................................................59 8.2 – Animais .....................................................................................................59 8.3 – Metodologia ..............................................................................................59 8.3.1 – Nocicepção induzida por ácido acético.........................................59 8.3.2 – Toxicidade aguda..........................................................................60 9 – Resultados e discussão .....................................................................................60 9.1 – Nocicepção induzida por ácido acético ....................................................60 9.2 – toxicidade aguda........................................................................................63. PARTE 5 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 10 - Conclusões........................................................................................................65 11 - Pespectivas Futuras..........................................................................................66. PARTE 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS E ANEXOS 12 - Referências bibliográficas..................................................................................68 13 – Anexos..............................................................................................................76 13.1 – Espectros selecionados.......................................................................... 76.

(12) LISTA DE ESQUEMAS. Esquema 01. Obtenção do éster isoxazolínico bicíclico 49............................................25 Esquema 02. Preparação do trímero da 1-pirrolina 47 .......................................................25 Esquema 03. Síntese do enecarbamato endocíclico N-(benziloxicarbonil)-2pirrolina48....26 Esquema 04. Síntese do clorooximidoacetato de etila 56, precursor do N-óxido de nitrila –CEFNO............................................................................................................26. Esquema 05. Síntese do éster isoxasoliníco 49, via reação de cicloadição 1,3-dipolar.....27 Esquema 06. Desproteção da amina secundária em N6....................................................28 Esquema 07. N-benzoilação da isoxazolina desprotegida 50 com cloretos de benzoila para substituídos...................................................................................................................28. Esquema 08. Síntese dos álcoois isoxazolínicos 52...........................................................29 Esquema 09. Obtenção dos aldeídos isoxazolínicos 53, através da oxidação de swern dos álcoois isoxazolínicos 52...............................................................................................30. Esquema 10. Obtenção de isoxazolil-hidrazonas de 5 membros 54..................................31.

(13) LISTA DE FIGURAS. Figura 01. Núcleos isoxazolínicos.....................................................................................03 Figura 02. Função hidrazona......................................................................................03 Figura 03. Isoxazóis, isoxazolinas e isoxazolidinas......................................................06 Figura 04. Fusão do biciclo isoxazolínico com a porção hidrazônica..............................18 Figura 05. Isoxazolil-aril-hidrazonas...................................................................................22 Figura 06. Esquema sintético utilizado na preparação das isoxazoil-aril-hidrazonas........23 Figura 07.Estrutura geral das isoxazolil-aril-hidrazonas.................................................... 61 Figura 08. Gráfico do efeito das hidrazonas 54 sobre a nocicepção, induzida por ácido acético (1%), em camundongos................................................................................................... 62. Figura 09. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 52a.........................................................76 Figura 10. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 53a.........................................................77 Figura 11. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 53a...............78 Figura 12. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 52b..........................................................79 Figura 13. Espectro de infravermelho (janela de KBr, cm-1) do composto 52b...................80 Figura 14. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 53b...........................................................81 Figura 15. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 53b................82 Figura 16. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54a..........................................................83 Figura 17. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54a.................84 Figura 18. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54b..........................................................85 Figura 19. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54b................86 Figura 20. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54c..........................................................87 Figura 21. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54c................88 Figura 22. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54d..........................................................89.

(14) Figura 23. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54d................90 Figura 24. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54e..........................................................91 Figura 25. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54e................92.

(15) LISTA DE TABELA. Tabela 01. Substituintes e rendimentos das N-benzoil-isoxazolinas 51............................28 Tabela 02. Substituintes e rendimentos dos álcoois isoxazolínicos 52.....................................29 Tabela 03. Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos..............................30 Tabela 04. Substituintes e rendimentos das isoxazolil-hidrazonas..................................32 Tabela 05. Percentual de inibição das hidrazonas no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético (1%) em camundongos.........................................61.

(16) Título: Síntese e Avaliação Preliminar da Atividade Antinoceptiva e Toxicidade de Novas Isoxazolil-aril-hidrazonas.. RESUMO. A Química Medicinal, através de estratégias específicas, vem para estudar as razões moleculares da ação dos fármacos, descrevendo a relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica, com objetivo de planejar, sintetizar e produzir moléculas com potenciais farmacológicos. Neste trabalho, utilizando a estratégia de hibridização molecular, através da fusão de dois grupos farmacofóricos, chegamos a novos compostos com atividades analgésicas potencializadas. Foi realizada a condensação do núcleo isoxazolínico com uma porção hidrazona, pois segundo a literatura, derivados hidrazonas híbridos de vários heterociclos têm apresentado interessantes atividades biológicas como antimicrobiana, anticonvulsivante, antiinflamatória e analgésica. Diante dessas considerações, nosso interesse foi voltado para a obtenção de isoxazolinas bicícliclas pirrolidínicas com modificação molecular no radical éster do biciclo, obtendo então novos derivados híbridos (isoxazolil-arilhidrazonas). Este estudo possibilitou a expansão da aplicação sintética e biológica de nossa metodologia. Em nosso trabalho, o enecarbamato -(benzoiloxicarbonil)-2-pirrolina 48, nosso material de partida, foi obtido a partir do trímero da 1-pirrolina. Reações de cicloadição 1,3dipolar do enecarbamato com o -óxido de nitrila CEFNO resultaram no cicloaduto isoxazolínico bicíclico 49. Após hidrogenólise do cicloaduto 49 e -benzoilação do mesmo, derivados isoxazolínicos, -benzoilados 51, com função éster em C3 foram obtidos. Os ésteres isoxazolínicos -benzoilados 51 foram reduzidos aos respectivos álcoois 52, com NaBH4, onde posteriormente foram oxidados aos aldeídos isoxazolínicos 53, em C3, através do método de Swern. Por último, realizamos as reações de condensação dos aldeídos isoxazolínicos 53 com diversas fenil-hidrazinas p-substituídas, obtendo-se assim as isoxazolilaril-hidrazonas puras 54 e apresentando rendimentos entre 50% e 60%. Estes novos compostos foram submetidos a testes biológicos, onde apresentaram excelentes resultados para testes preliminares de atividade analgésica, além de baixa toxicidade. Os Compostos 54a e 54f apresentaram, respectivamente, 85,8% e 76% de inibição das contorções abdominais induzidas por ácido acético sendo superior ao fármaco padrão (dipirona), o qual apresentou 59%.. Palavras-chaves: 2-isoxazolina, hidrazonas, atividade antinoceptiva.

(17) Title: Syntheses and Preliminary Evaluation of antinoceptiva activity and toxicity of novel isoxazolyl-aryl-hydrazones.. ABSTRACT. The Medicinal Chemistry, through specific strategies, comes up with explanations for the action of drugs, describing the relation between chemical structure and pharmacologic activity, aiming to plan, synthesize and produce molecules with pharmacologic potential. In this work, utilizing molecular hybridization strategy, through the combination of two pharmacophores, we obtained novel compounds with potentiated analgesic activity. It was realized the condensation of isoxazolinic nucleus with an hydrazone moiety, since, according to literature, hydrazone hybrids derivative from various heterocyclic compounds have presented interesting biological activities such as, antimicrobial, anticonvulsant, antiinflammatory and analgesic. Facing these considerations, our interest was the obtainment of bicyclic pyrrolidinic isoxazolines with molecular modification on ester radical of the bicycle, obtaining novel hybrid derivatives (isoxazolyl-aryl-hydrazones). This study allowed the expansion of biological and synthetic application of our methodology. In our work, the enecarbamate -(benzyloxicarbonyl)-2-pyrroline 48, our starting material, was obtained from 1-pyrroline trimer. 1,3-dipolar cycloaddition of enecarbamate with nitrile oxide CEFNO resulted on the aza-bicylic isoxazoline cycloaduct 49. After hydrogenolisis and benzoylation of the cycloaduct 49, isoxazolinic -benzoylated derivatives 51, with an ester function on C3 were obtained. The isoxazolinic -benzoylated esters 51 were reduced to the respective alcohols 52, with NaBH4, then posteriorly were oxidized to isoxazolinic aldehydes 53, on C3, through Swern oxidation. Finally, it was realized condensation reactions of isoxazolinic aldehydes 53 with several phenylhydrazines p-substituted, obtaining pure isoxazolyl-aryl-hydrazones 54, presenting a yield between 50% and 60%. These novel compounds were submitted to biological tests, in which presented excellent results for preliminary test of analgesic activity, besides showing low toxicity. The analgesic activity of isoxazolyl-aryl-hydrazones was performed using the acetic-induced mice abdominal constrictions test. The compounds 54a e 54f presented, respectively, 85,8% e 76% of inhibition on the abdominal contortions induced by acetic acid, being superior to the standard drug (dipyrone), which presented 59%.. Keywords: 2-isoxazoline, hydrazones, antinoceptive activity.

(18) ITRODUÇÃO.

(19) 1- ITRODUÇÃO. A Química Medicinal estuda as razões moleculares da ação dos fármacos de maneira a descrever a relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica, hierarquizando as diferentes contribuições funcionais. 1 Com isso têm-se como objetivo o desenvolvimento, síntese e produção de moléculas com potencial uso terapêutico. 2 No contexto inverso, inclui-se o planejamento e o desenho estrutural de novas substâncias que possuam propriedades farmacoterapêuticas úteis, capazes de representarem novas entidades químicas, candidatas a protótipos de novos fármacos, de uso seguro. De forma heurística, para a identificação de um novo composto-protótipo ou uma nova entidade química que possa representar novo candidato a fármaco, elege-se o melhor alvo farmacológico para aquela aplicação terapêutica e, em função do conhecimento da estrutura disponível sobre este receptor, identifica-se a melhor estratégia que possa construir a arquitetura molecular do novo ligante desejado. Diversas estratégias modernas de desenho molecular de novos protótipos são conhecidas em função do mecanismo de ação pretendido, seja inibição enzimática, reversível ou não, ou agonismo/antagonismo, competitivo ou não, do receptor, que dependem do nível de conhecimento de sua topografia. 3 Quando não se conhece a estrutura do biorreceptor-alvo, a estratégia mais empregada fundamenta-se na variação da similaridade molecular do agonista natural, de forma que se identifique um análogo ativo, reflexo de suas propriedades farmacodinâmicas, que governam seu reconhecimento molecular pelo biorreceptor. Uma vez comprovada a atividade farmacológica desejada do novo análogo-ativo, por meio de protocolos farmacológicos in vivo, têm-se um novo composto-protótipo, candidato ao novo fármaco pretendido. 4 Um dos métodos para obtenção de novos fármacos, a hibridação molecular, propicia inúmeras vantagens, como por exemplo, obtenção de moléculas com propriedades farmacológicas superiores; possibilidade de elucidar a relação estruturaatividade da molécula e emprego dos mesmos métodos de ensaios biológicos utilizados para o protótipo dos novos derivados híbridos. Dessa forma, através da modificação molecular é possível descobrir o grupamento farmacofórico essencial e obter fármacos que apresentem propriedades mais desejáveis que o protótipo, em potência, especificidade, duração de ação, menor toxicidade e maior estabilidade 5,6. 2.

(20) O. NH2. H N. 4 5. O N. R1. H. 3. H. O. 6. N. 2N 1. H. 4 3 5 2 1. N. O. R2. O R. 2. 1. 3. Figura 01 - Núcleos isoxazolínicos. Existem relatos que muitas substâncias que possuem em suas estruturas o núcleo 2-isoxazolina 3, apresentam inúmeras e importantes atividades biológicas, como por exemplo, a ação antiinflamatória e analgésica. 7,8 Derivados amidas 1 (figura 1) contendo o núcleo 2-isoxazolínico aza-bicíclica, foram obtidos em nosso laboratório e submetidos à avaliações biológicas. Excelentes resultados foram observados, como atividade anti-inflamatória comparável à indometacina (fármaco padrão), assim como indícios ação no Sistema Nervoso Central, evidenciada através dos ensaios de toxicidade aguda e com provável ação analgésica. 9 Em relação à função hidrazona (figura 2), ela também tem sido bastante relatada na literatura em processos que envolvem a hibridação molecular. Derivados híbridos de hidrazonas, com vários heterociclos, têm apresentado interessante atividade analgésica.10 R1. N. H R2. H. Figura 02 – Função hidrazona. 3.

(21) Diante dessas considerações, nosso interesse tem se voltado para a obtenção de isoxazolinas bicícliclas pirrolidínicas, com modificação molecular na posição “3” do biciclo 2, visando a obtenção de novos derivados híbridos, contendo o. novo. heterobiciclo 2 e a função hidrazona, com o objetivo de uma possível potencialização da atividade analgésica ou até descoberta de novas atividades farmacológicas desses novos compostos. .. 4.

(22) REVISÃO DA LITERATURA.

(23) 2- REVISÃO DA LITERATURA. 2.1- ISOXAZOLINAS. Heterociclos de 5 membros, contendo átomos de oxigênio e nitrogênio ligados entre si, tem despertado grande interesse, devido ao grande potencial biológico que estas substâncias apresentam. Estes heterociclos são classificados de acordo com o grau de oxidação do anel heterocíclico e apresentam propriedades químicas distintas, inerentes às suas estruturas: Isoxazóis 4, totalmente oxidados e aromáticos, Isoxazolinas 3, parcialmente oxidadas e Isoxazolidinas 5, totalmente reduzidas (fig. 3).. 4. 4. 3. N2. 5. O 1. 3. 4. N2. 5. O. 3. 4. N2. 5. O. 4. 3. N2. 5. 3. N2. 5. O. O 1. 1. 1. 1. 2-Isoxazolina. 3-Isoxazolina. 4-Isoxazolina. 3a. 3b. 3c. 4. 5. Figura 03 - Isoxazóis, isoxazolinas e isoxazolidinas. Dos heterociclos descritos acima, particularmente as isoxazolinas 3a despertam grande interesse em estratégias sintéticas, visando a obtenção de substâncias com potenciais atividades biológicas. A seguir serão descritos e discutidos de forma representativa relatos da literatura, sobre isoxazolinas, como por exemplo, ocorrência natural, atividades biológicas e aplicações terapêuticas, métodos de obtenção e aplicação sintética, ilustrando a grande importância químico-biológica das mesmas.. 6.

(24) 2.1.2 - OCORRÊNCIA NATURAL. A incidência natural de 2-isoxazolinas é bem restrita, sendo encontrado basicamente em algumas espécies de esponjas marinhas, como espiro-compostos. Alcalóides isoxazolínicos 6 e 7 foram isolados da esponja Aplisina aerophoba e estão envolvidos no mecanismo de defesa da esponja contra peixes predadores. Estas isoxazolinas são precursoras de substancias tóxicas formadas por catálise enzimática. 11. H3CO. H3CO. Br. Br. Br. Br HO. O. H. H. N. N. O N HO. N. N O. NH(CH2)4N. O. O. O. N. OH Br. 7. 6. Br. OCH3. Uma espiroisoxazolina natural 8, um alcalóide isolado da esponja Aplisina gerardogreeni. apresentou-se biologicamente ativa, com ação efetiva contra. Mycobacterium tuberculosis.12, 13 OCH3 Br. Br. NH2. HO. HN O. N OH. H. O. N. N OH. O 8. HO. N H. 2.1.3 - ATIVIDADE BIOLÓGICA E APLICAÇÃO TERAPÊUTICA A literatura relata vários exemplos de compostos bioativos, contendo o núcleo 2isoxazolina, que tem apresentado os mais diversos tipos de atividade biológica, compreendendo. desde. atividade. herbicida. e. antimicrobiana. até. atividade. neurotransmissora.. 7.

(25) A 2-isoxazolina 9, apresentou excelente seletividade e potente atividade herbicida contra diversas espécies de ervas daninhas, principalmente em culturas de arroz. Os estudos de toxicidade em camundongos revelaram que 9 apresenta baixa toxicidade, com DL50 acima de 5000 mg/Kg.14. CH3 F N O. S. O F H3 C. 9. Penicilinas semi-sintéticas comerciais, tais como Oxacilina e Cloxacilina 10, possuem em sua cadeia lateral o radical isoxazolila. Carbapenens 11 contendo isoxazolinas como radical, tem apresentado potente atividade antibacteriana.15 O. CO 2Et. OH. N H. H. R1. N. N. S. O. S N. O. N. O. H. CO 2 H. N O. 10. 11. COOH. R 1 = H - OXACILINA R 1 = Cl - CLOXACILINA. Recentemente foi relatada uma série de heterociclos inibidores da biossíntese de lipídios, que apresentam atividade contra bactérias Gram negativas. Estes heterociclos tem como núcleo base uma 2-isoxazolina. O derivado mais potente desta série, a isoxazolina 12 teve excelente atividade contra Escherichia coli. 16 O NHOH MeO N. O. 12. Excelentes resultados foram relatados quando derivados de 2-isoxazolinas 13 e 14, tendo o anel imidazol como substituinte na posição 3 do núcleo isoxazolínico, foram. 8.

(26) submetidos a testes antifúngicos, apresentando Concentração Mínima Inibitória – CMI contra Aspergillus flavus e Fusarium moniliforme bem superior à droga antifúngica Nistatina, usada atualmente na terapêutica17, mostrando assim o incremento da atividade anti-fúngica, devido à introdução do núcleo da 2-isoxazolina. O O N. O. OH. N. Cl. O. Cl N. NH. N. NH. 13. 14. Bu. Bu. A 2-isoxazolina dissubistituída 15 apresentou atividade espermicida e anti HIV com mais de 95% de redução do vírus. 18 Br. O. N. Br O 15. Potente atividade antiviral contra o vírus da influenza humana foi apresentada para uma série de derivados de 2-isoxazolinas. Das substâncias estudadas, o protótipo 16 apresentou a maior atividade antiviral e uma baixa citotoxicidade. 19 O tBu. CN. N O. N. H 16. N O. Um dos protótipos da série apresentou excelente controle do vírus H1N1 para uma dose de 3ug/mL, com atividade bastante superior à Amantadina, uma droga antiviral comercial. Atualmente tem se pesquisado muito sobre doenças que envolvem o processo de adesão celular, tais como trombose, metástases e osteoporose. 20 Substâncias contendo 2-isoxazolinas em suas estruturas são relatadas como antagonistas dos receptores da superfície celular, glicoproteína IIb/IIIa, impedindo a. 9.

(27) ligação do fibrinogênio e conseqüentemente a agregação plaquetária, sendo portanto, um atrativo representante do arsenal terapêutico no tratamento de aterosclerose e trombose. Entre essas, estão as 2-isoxazolinas-3,5-dissubstituídas 17 e 18. 21. O H HN. H. N CO2H. H2N. N. O. HN. HN. O. N CO2CH3. O N. H2N. 17. O. O. 18. Também com relação à atividade antitrombótica, recentes estudos mostraram 2isoxazolinas, exemplificada pela molécula 19, como potentes inibidores do fator Xa, responsável pela catálise na produção de trombina a partir de protrombina, um dos mecanismos envolvidos na cascata da coagulação sanguínea.22 A inibição do fator Xa tem surgido como um alvo atrativo para aplicação terapêutica potencial no tratamento de trombose venosa e arterial. 23. N. N. H. O N. N SO2NH 2 O. HN. NH 2. 19. Na literatura há também muitos relatos de atividade antiinflamatória e analgésica para sustâncias que apresentam o núcleo 2-isoxazolina. Relatou-se recentemente drogas esteroidais, contendo o núcleo 2-isoxazolina em sua estrutura, que apresentaram excelente atividade antiinflamatória e alta afinidade com os glicoreceptores. As drogas esteroidais 20 e 21 apresentaram-se 5 e 5,3 vezes respectivamante mais potente que a prednisolona, um corticosteróide usado na terapêutica.24 Nestes exemplos, percebe-se claramente que a introdução do núcleo 2isoxazolina foi responsável pelo incremento da atividade antiinflamatória apresentada pelo núcleo esteroidal. 10.

(28) O OH. O O O. EtO. O N. O. EtO. F. N. F. O. 20. 21. O. A fosfolipase A2 consiste em uma classe de enzimas que catalisa a hidrólise de fosfolipídios da membrana celular no Ácido Araquidônico, este é metabolizado pelas Ciclooxigenases 1 e 2 (COX) e Lipoxigenases, na produção dos mediadores inflamatórios, tais como prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos etc. Substâncias capazes de inibir o desencadeamento dos processos inflamatórios são conhecidas como Agentes Antiinflamatórios. Novos derivados de 2-isoxazolinas apresentaram ação inibitória da fosfolipase A2, impedindo assim a formação do processo inflamatório. Alguns protótipos, representados pelas substâncias 22 e 23, tiveram ação antiinflamatória bastante superior ao padrão Ácido Ursólico. 25 O. Ph. O. N. CN. N. Cl. Cl N. N. N. N 22. 23. Bu. Bu. Derivados de 2-isoxazolinas, representados pela substância 24, apresentaram atividades inibidoras de enzimas proteolíticas, envolvidas em processos inflamatórios crônicos, como artrite reumática, enfisema pulmonar, entre outros, relatados por Groutas et all. 26 O. N. OSO2Me O 24. O. 11.

(29) 2.2 – DERIVADOS DE HIDRAZONAS. Diante de relatos da literatura derivados de hidrazonas têm mostrado que apresentam diversos potenciais farmacológicos; como atividade antimicrobiana, antifúngica, antiagregante, antitumoral, antiturbeculose, antiinflamatória e analgésica. 27 Nas últimas décadas a crescente prevalência de várias drogas resistentes infecções microbianas tornou-se um grave problema de saúde. A busca de novos agentes antimicrobianos permanecerá como uma importante e difícil tarefa para química medicinal.. 5. Uma série de compostos hidrazônicos 25 e 26 derivadas da hidrazida 1,2benzotiazol, foram sintetizadas por Vicini et all e a avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica revelou uma potente ação antimicrobiana, expressa pelos valores da Concentração Mínima Inibitória (CMI), comprovando a importância do grupo hidrazona para atividade. 28 NO2. O O N. N. HC. NH. Cl. N. HC. S N 25. S. 26. Atividade antibacteriana de hidrazidas e hidrazonas é também relatada por vários outros autores. 29, 30 Güniz et all relatam em vários trabalhos, atividade antituberculose para várias hidrazonas. A hidrazona 27 apresenta percentual de inibição da Mycobacterium tuberculosis semelhante ao antibiótico rifampicina. 31. O N N. O N H3C. O. H N H. H3C. O. 27. 12.

(30) O Composto 28 é um anti-séptico intestinal, enquanto que o 29 apresentou uma alta atividade inibitória em ratos infectados com diferentes cepas de Mycobacterium tuberculosis H37Rv. 32 O. O N. N. HO. O. H. N. N. NO2. H. H. 28. N NO2. O H. 29. Uma série da arilhidrazona foi sintetizada, a fim de determinar as suas propriedades antimicrobianas. O Composto 30 apresentou uma significativa atividade contra o Estafilococos aureus, enquanto que 31 apresentou uma boa atividade contra o Micobacterium fortuitum.33 Comprova com isso da importância da estrutura hidrazônica para o incremento do potencial biológico. O. O H S. H. . . . . . . O O. H O. . O H O. 31. 30. Seis Análogos do composto 32 foram sintetizados através da variação do substituinte na posição para do grupamento benzoíla e do heteroátomo do anel heterocíclico. Foram feitos vários testes microbiológicos e os compostos apresentaram atividade antimicrobiana contra o Estafilococos aureus ATCC 25923, na concentração de 0.16-63.00 µ g / mL. 34. O R N. N. X. NO2. H H 32. 13.

(31) A hidrazona 33 foi testada em diversos microorganismos e apresentou atividade, contra o Estafilococus aureus, semelhante à ceftriaxona que é uma cefalosporina de terceira geração, muito utilizada em infecções por microrganismos gram positivo e negativo. 35 O F. NO2. O. N. N H. H 33. Uma série de derivados de hidrazona, sintetizada a partir de derivados do colesterol 34, foi avaliada quanto à atividade contra diversos microorganismos patógenos. Os derivados do Tosil-hidrazona colesterol foram os compostos que apresentaram melhores resultados contra a Candida albicans. 36. N NH. 34. R. Uma variedade de drogas antitumorais está atualmente em uso clínico. A procura de novas drogas conduziu à descoberta de novas hidrazonas com esse potencial biológico, como a hidrazona 35. Alguns desses novos compostos mostraram inibição máxima de até 70% do crescimento tumoral. 37 HO. H N. NO2. N NO2 35. 14.

(32) Outras substâncias, sintetizadas recentemente, também apresentaram atividades antitumorais. O mais ativo dos compostos da série foi a hidrazona heterocíclica 36a, que apresentou uma excelente inibição do crescimento tumoral, contra todas as linhagens de células utilizadas. 38. N. H. N. CH3. H. N. N. N. N. S. N. S. N 36a. 36b. CH3. A hidrazona 37 foi testada para averiguar a atividade antitumoral. Esse composto apresentou uma potente ação de inibição proliferativa contra diversas linhagens celulares, apresentando uma potencia semelhante à Mercaptopurina contra os tumores hematológicos. 39 HO. O. S. N. N H. N. H 37. Um novo composto bioativo da série -aci-lhidrazona 38 apresentou um excelente potencial biológico para atividade cardiovascular. Esse composto 38a apresentou-se sete vezes mais potente do que algumas drogas comerciais utilizadas para atividades ionotrópicas e vasodilatadoras. 40. O O N O. CH3. N S. H 38a. 15.

(33) Os antiinflamatórios não esteróidais (AINES) têm uma ampla utilização clínica para o tratamento de diversos tipos de patologia. Existem duas isoformas de ciclooxigenase (COX) que é a COX1 e a COX2. Estas enzimas são responsáveis por processos biológicos e inflamatórios do nosso organismo. Portanto, com a inibição das COX teríamos um bloqueio na produção de mediadores da inflamação. A -(2-piridinil)-hidrazona 39 apresentou uma inibição do processo inflamatório de 79 % na dose de 80,1 µ mol / kg. Algumas evidências sugerem que o grupamento hidrazona presentes nestes compostos possuem um caráter farmacofórico para a inibição da COX. Os autores também descreveram resultados relativos ao mecanismo de ação dessa série e seus derivados na agregação plaquetária. Foi sugerido o mecanismo de complexação ao cálcio. Por fim o composto 39 foi capaz de se complexar ao Ca+2, in vitro, na concentração de 100 µ M. Isso é um indicativo de que a série destes compostos pode apresentar uma atividade antiagregante plaquetária. 41. N N. O. N H. H 39. Uma nova série de compostos, que pertencem à classe das -acil-aril-hidrazonas 40, foram sintetizadas a partir do composto natural safrol e submetida a testes de analgesia. Os resultados foram excelentes, apresentando potencial analgésico superior à dipirona e indometacina, que são drogas utilizadas como padrão, para testes de analgesia e inflamação respectivamente. 42. O N. O. H. N H. O 40. N CH3. CH3. 16.

(34) A atividade anti-plaquetária de derivados tricíclicos acil-hidrazona 41 foi avaliada pela sua capacidade de inibir a agregação plaquetária do plasma de coelhos, rico em plaquetas induzidas pelo FAP (fator de agregação plaquetária), na concentração de 50 nM. Foi evidenciado, com os resultados, que dois derivados do composto 41, que foram avaliados na concentraçao 10 µ M, apresentaram, respectivamente, 10,4 e 13,6% de potencial na inibição. 43 Ar. H. H N. N. S. H3C. O N. N. N. OH. H 41. Barrreiro et all relataram a síntese de novas aril-hidrazonas hidrazonas. 45. 44. e acil-aril-. , sendo observados excelentes resultados para atividade analgésica. A. analgesia proporcionada pela arilhidrazona 42 foi muito próxima da obtida com a dipirona. Já a analgesia observada com a acil-arilhidrazona 43 foi superior ao efeito da dipirona. OCH 3 N H 3C. HN. O. O. H 3C. N. H. N. O. N. N N Ph. N. N. 42. H N. Ph. 43. A atividade anticonvulsivante também tem sido relatada para compostos híbridos de hidrazonas. Dimmock et all sintetizaram uma série -acetil-hidrazonas, onde o composto 44 apresentou uma excelente atividade anticovusivante, sendo assim um possível candidato a um novo fármaco. Os resultados obtidos revelaram que acetil-hidrazonas são mais promissoras para esta atividade. 46. 17.

(35) H H3C. N. C N. O Cl. 44. A hidrazona 45, obtida por Çakir et all, também apresentou atividade anticonvulsivante significativa, sendo evidenciada a importância da porção hidrazona para esta atividade. 47 O CH3. NH N. N. O 45. S. Sendo conhecidas as atividades farmacológicos das isoxazolinas pirrolidínicas biciclas, sintetizadas em nosso laboratório 9, como discutido anteriormente, acreditamos que a junção da funcionalidade hidrazona, no qual foi relatada na literatura como grupo farmacofórico, à porção éster da isoxazolina bicíclica em C3, seja de grande importância farmacológica para estes inéditos heterociclos.. H. R1. N. Porção hidrazônica. N H. H. Pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina (núcleo base das novas drogas). N O N. H. R2. Figura 04 – Fusão do biciclo isoxazolínico com a porção hidrazônica. 18.

(36) OBJETIVOS.

(37) 3- OBJETIVOS. 3.1 - Objetivos Gerais. Exploração química e biológica do heterociclo 2-isoxazolina aza-bicíclica, introduzindo o grupamento hidrazona, conhecido farmacóforo para atividade analgésica, através da modificação molecular (hibridação).. 3.2 - Objetivos específicos. •. Síntese do material de partida, o enecarbamato -(benziloxicarbonil)-2-pirrolina 48.. •. Síntese do éster isoxazolínico 49, através de reação de cicloadição 1,3-dipolar do enecarbamato 48 com óxido de nitrila CEFNO.. •. Redução da função éster em C3 da isoxazolina 49, ao respectivo aldeído isoxazolínico 53.. •. Condensação dos aldeídos isoxazolínicos 53 com hidrazinas aromáticas, para produção das isoxazolil-aril-hidrazonas 54.. •. Purificação e determinação de algumas propriedades físico-químicas (ponto de fusão e Rf) e elucidação estrutural de todas as substâncias acima por espectrometria de RMN, e IV.. •. Avaliação da atividade analgésica e toxicidade dos novos híbridos isoxazolilaril-hidrazonas 54 sintetizados.. 20.

(38) ESTUDO QUÍMICO.

(39) 4 – METODOLOGIA. Como mencionado anteriormente, segundo a literatura, derivados hidrazonas apresentam inúmeras atividades biológicas, entre elas antiinflamatória e analgésica. A introdução dessa funcionalidade em derivados do novo heterociclo pirrolidina[3,2-d]-2isoxazolina, obtido em nossos estudos prévios, poderá possivelmente incrementar ou induzir novas atividades biológicas, visto que as novas amidas isoxazolínicas 1, contendo o novo heterociclo, se mostraram intensamente ativas no organismo vivo (testes de atividades antiinflamatória e analgésica). Vale salientar que a função hidrazona dos derivados descritos na literatura se apresenta como farmacóforo dos mesmos, tendo anéis aromáticos como núcleos base. Nossos derivados obtidos, anteriormente, não possuem núcleo aromático, mas sim uma isoxazolina bicíclica, além de dois diferentes sítios de susbtituição (porção benzoila e porção fenílica da hidrazona). Diante disso, foi feita a junção do nosso núcleo (isoxazolínico) -benzoilado com a funcionalidade hidrazona (farmacóforo), e avaliado se houve a manutenção ou incremento das atividades anti-inflamatória e analgésica (figura 04).. H. R1. N N. H. H. pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina (núcleo base das novas drogas). hidrazona farmacóforo (analgesia). N O N. H. O R2. benzoila. Figura 05 - Isoxazolil-aril-hidrazonas. 22.

(40) Foram utilizados os derivados isoxazolínicos já estudados em nosso grupo, com o grupamento R2 variando em posição para (Cl, F) e também hidrazinas parasubstituídas, variando-se o grupamento R1 (Cl, F, OMe). Os substituintes “R“ variam, desde grupamentos elétron-atratores a elétrondoadores, para averiguarmos possíveis diferenças reacionais na formação das hidrazonas, assim como diferenças nas atividades biológicas das mesmas, devido aos efeitos eletrônicos.. N. N b. a N. N. N. O. O. H 48. 47. 46. c O. O. O. O H. O. O. H. N N. N. H. O. d. N. e. H. O N. O N. O. H. R2. 51. H. H O. O. 50. 49. f R1 H. N. H N. g. H N. h. O. O. N. H. O N. H. O. O. H. O R2. R2 52. N N. H. H. N. H. O. OH. R2. 53 54. Figura 06 - Esquema sintético utilizado na preparação das isoxazoil-aril-hidrazonas.. 23.

(41) O enecarbamato 48, material de partida de nosso trabalho, foi obtido a partir da pirrolidina 46. 48, 49 Após a cicloadição 1,3-dipolar do enecarbamato 48 com óxido de nitrila, o cicloaduto isoxazolínico 49 foi obtido. 50 Para a introdução dos grupamentos benzoíla em N6, fez-se necessária primeiramente, uma hidrogenólise do grupo Cbz. Os derivados -benzoilados 51 obtidos tiveram a funcionalidade éster em C3 reduzida aos respectivos álcoois 52. 51 A oxidação de Swern, dos álcoois 52, propiciou a obtenção dos aldeídos 53, que após condensação com algumas fenil-hidrazinas para-substituídas, levou à formação dos compostos híbridos 54, as isoxazolil-aril-hidrazonas. 1. 52,53,54. Seis hidrazonas 54. 2. foram obtidas, variando-se os grupamentos R e R .. 24.

(42) 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO. 5.1 - OBTENÇÃO DO ÉSTER ISOXAZOLÍNICO BICÍCLICO 49 :. O. N. a N. 84%. N b. N. N. N. c. O. N. 67% O. O. 71%. H. O. 46. O. 47. 48. O. 49. Esquema 01. Para obtenção do éster 49, material de partida de nosso trabalho, foi utilizada a metodologia desenvolvida e amplamente dominada por nosso grupo, já relatada em trabalhos anteriores. O éster isoxazolínico 49 foi obtido em quantidades multi-gramas a partir do enecarbamato endociclico 48, através de reação de cicloadição 1,3-dipolar (reação c).. 5.1.2 - PREPARAÇÃO DO TRÍMERO DA 1-PIRROLIA 47. 55. N N. N. 47. A ∆1-pirrolina 46a, intermediário chave na síntese dos enecarbamatos e enamidas endocíclicas de 5 membros, foi obtida através da oxidação catalítica da pirrolidina, pelo perssulfato de sódio, em meio básico e AgNO3 como catalisador.. 25.

(43) Devido à sua grande reatividade e instabilidade, o monômero 46a trimeriza no meio reacional, formando o respectivo trímero 47, que é isolado convenientemente. 56. Na2S2O8 25% NaOH(aq) AgNO3 cat.. N. 00C H2O. N. N. N. 84%. N. H 46a. 46. 47. Esquema 02 5.1.3 - SÍNTESE DO ENECARBAMATO ENDOCÍCLICO N- (benziloxicarbonil)-2pirrolina 48 48, 49. N. Cloroformato de benzila. N. N. 0. N. - 78 C TEA 67%. O. O. 48. 47. Esquema 03 O Enecarbamato endocíclico de 5 membros 48, utilizado neste trabalho, foi obtido através da -acilação da ∆1-pirrolina 46a , à -78°C. De início, foi feita a oxidação da pirrolidina 46 comercial, em seguida, devido à intabilidade da 1-pirrolina, seu trímero 47 foi utilizado prontamente para a obtenção do enecarbamato 48. 5.1.4 - SÍNTESE DO CLOROOXIMIDOACETATO DE ETILA 56, PRECURSOR DO N56 ÓXIDO DE NITRILA – CEFNO. 1) HCl conc. 2) NaNO2. O Cl. H3N. 55. OEt. O Cl EtO. 0. 0 C Agitação 55 %. N OH 56. Esquema 04. 26.

(44) O óxido de carboetoxiformonitrila (CEFNO), utilizado na reação de cicloadição 1,3-dipolar, foi obtido in situ, através do seu precursor clorooximidoacetato de etila 56. O precursor do -óxido de nitrila, clorooximidoacetato de etila 56, foi preparado através da oxidação da glicina esterificada 55, por nitrito de sódio, em meio ácido (HCl conc..). Devido a sua grande estabilidade, ele pode ser armazenado em grandes quantidades por longo período e utilizado conforme necessidade. O precursor do dipolo foi obtido como cristais brancos por cristalização em hexano, com um rendimento de 55%, conforme a literatura.. 5.1.5 - SÍNTESE DO ÉSTER ISOXASOLINÍCO 49, VIA REAÇÃO DE CICLOADIÇÃO 1,3-DIPOLAR 50 CO2Et. O. C. O. N O. N O. N 60a. O. O. N. Clorooximidoacetato de etila. TEA. 48. O. O. Clorofórmio t.a. 71%. 49. Esquema 05. A síntese do éster isoxazolínico 49 procedeu-se através da reação de cicloadição 1,3-dipolar do enecarbamato 48 com o óxido de nitrila CEFNO 55a, esta reação foi desenvolvida por nosso grupo de pesquisa e relatada em trabalhos anteriores. O cicladuto 49 foi sintetizado de forma régio e diasteroespecífica, obtendo-se o racemato do mesmo. O -óxido de nitrila, CEFNO 55a, é formado in situ a partir de seu precursor clorooximidoacetato de etila.. 27.

(45) 5.2 - DESPROTEÇÃO DA AMINA SECUNDÁRIA EM N6. O. O O H2 Pdº/C. N O. N O. O. N. MeOH . t.a. Quantitativo. O. N. O. H 50. 49. Esquema 06. Esta desproteção foi realizada com intuito de não termos a necessidade de realizarmos várias reações de cicloadição, com diversas -benzoil-enamidas. Desta forma, as -benzoil-isoxazolinas poderiam ser obtidas através da -benzoilação da amina secundária desprotegida 50 com os respectivos cloretos de benzoila parasubstituídos. As reações de -benzoilação são menos dispediosas e menos trabalhosas do que as reações de síntese de diferentes enamidas. A hidrogenólise, do grupo Cbz de 49, ocorreu de forma quantitativa, sendo o produto 50 utilizado sem prévia purificação. . 5.3 - N-BENZOILAÇÃO DA ISOXAZOLINA DESPROTEGIDA 50 COM CLORETOS DE BENZOILA PARA SUBSTITUÍDOS. O O. O. O. O. Cl N TEA(seco). N. CHCl3(seco). O. N. N. t.a.. O. R2. H. O. 51. 50. R2. Esquema 07 COMPOSTO. SUBSTITUITE 2. REDIMETO (%). 51a. R =Cl. 85 %. 51b. R2 = F. 78 %. Tabela 01 – Substituintes e rendimentos das N-benzoil-isoxazolinas 51. 28.

(46) As -benzoil-isoxazolinas 51a e 51b poderiam ser obtidas a partir das respectivas -benzoil-enamidas, através de reações de cicloadição 1,3-dipolar. No entanto, duas enamidas deveriam ser sintetizadas, uma para cada -benzoil-isoxazolina, de acordo com o grupamento R2. As reações de -benzoilação são simples, rápidas e apresentam excelentes rendimentos. 5.4 - SÍNTESE DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 52.. O. 51. O. OH. N. N. NaBH4. O. N. O. N. MeOH 0 0 C. O. O. R1. R1 52. 51. Esquema 08 COMPOSTO 52a 52b. SUBSTITUITE. REDIMETO (%). 2. 77 %. 2. 86 %. R =Cl R =F. Tabela 02 - Substituintes e rendimentos dos álcoois isoxazolínicos 52. Como mencionado na metodologia deste trabalho, a tentativa de redução direta do éster em C3 ao respectivo aldeído foi infrutífera. Utilizando-se DIBAL-H ou superhidreto [(Et3AlH)Li], o éster 51 permaneceu intacto no meio reacional. Uma possibilidade para contornar este problema, seria a redução do éster ao respectivo álcool 52 em C3. A utilização de um redutor forte tipo LiAlH4, seria incoveniente, pois, além do éster em C3, a amida em C7 também seria reduzida. Tentou-se a redução com NaBH4, no qual ocorreu a redução seletiva do éster em C3. No entanto, dependendo da qualidade do NaBH4 utilizado, ocorria uma transesterificação, formando o éster metílico em C3 (metanol foi utilizado como solvente). O éster metílico, ligeiramente mais polar que o éster etílico, foi caracterizado. 29.

(47) por 1H RMN. Portanto, ao utililizarmos o redutor NaBH4 de melhor procedência, o álcool em C3 foi produzido sem maiores empecilhos. A transesterificação, provavelmente ocorreu com NaBH4 de baixa qualidade, devido à presença de ácido de Lewis BH3, ou alguns de seus derivados. Apesar da redução de éster com NaBH4 ao respectivo álcool não ser tão trivial, temos verificado em outros trabalhos de nosso grupo de pesquisa, uma reatividade bem peculiar deste “imino-éster”, inclusive amonólise seletiva do éster em C3, quando outra funcionalidade éster está presente na estrutura. Durante o processo de otimização da redução, evidenciou-se a necessidade de elevação da temperatura até a temperatura ambiente, verificando-se que após alguns minutos de agitação nessas condições, todo o material de partida havia sido consumido. Os hidrogênios diasteroisotópicos do grupamento hidroximetila dos álcoois 52 apresentaram-se como dubletos em 1H RMN, em 4,35 e 4,45 ppm respectivamente, com uma constante de acoplamento de 14 Hz. Os álcoois 52 também apresentaram nos espectros de IVFT, bandas características em torno de 3505 cm-1, relativamente finas e intensas, caracterizando o estiramento da ligação O-H do grupamento hidroximetila em C3, além do desaparecimento da banda intensa em 1715 cm-1, referente à carbonila do éster em C3. 5.5 - OBTENÇÃO DOS ALDEÍDOS ISOXAZOLÍNICOS 53, ATRAVÉS DA OXIDAÇÃO DE SWERN DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 52 OH. O. N N. H. TEA DMSO. O. 52. N. cloreto de oxalila. N. O. CH2Cl2. O. 0. -60 C. O. R2. R2. 52. 53. Esquema 09 COMPOSTO 53a 53b. SUBSTITUITE. REDIMETO (%). 2. 74 %. 2. 82 %. R =Cl R =F. Tabela 03 - Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos. 30.

(48) A primeira tentativa de obtenção dos aldeídos isoxazolínicos, foi realizada através da redução direta dos ésteres 51, aos aldeídos 53, utilizando-se DIBAL ou super hidreto. Porém, nenhum desses dois redutores levou aos aldeídos desejados, o que nos forçou a tentarmos reduzir os ésteres 51 aos respectivos álcoois 52, para uma posterior oxidação aos aldeídos isoxazolínicos 53. A oxidação de Swern de 52 é uma oxidação branda, que nos permitiu chegarmos aos aldeídos isoxazolínicos 53 com ótimos rendimentos, sem a possibilidade de formar o ácido carboxílico, o que poderia acontecer se utilizássemos outros oxidantes. Diante do sucesso da oxidação de Swern, do álcool em C3, optou-se definitivamente por essa rota sintética, que propiciou a obtenção dos aldeídos, imprescindíveis para as condensações posteriores. Utilizou-se o procedimento experimental padrão da oxidação de Swern. Foram sintetizados dois novos aldeídos isoxazolínicos, em C3, o que propiciou, posteriormente, nas reações de condensações com diferentes fenil-hidrazinas parasubstituídas, a obtenção das isoxazolil-hidrazonas com dois sítios distintos de substituição. A oxidação de Swern dos álcoois 52 foi muito bem sucedida e os respectivos aldeídos 53 foram caracterizados, principalmente pelos sinais em 9,8 ppm e 185 ppm nos espectros de 1H e 13C RMN, respectivamente. Em relação aos espectros no IVFT, os aldeídos 53 apresentaram uma banda intensa em 1710 cm-1, característica do estiramento da carbonila do aldeído, que não havia no álcool de partida. 5.6 - OBTENÇÃO DE ISOXAZOLIL-HIDRAZONAS DE 5 MEMBROS 54.. 53, 54. R1 H N O. H. H. N. H2N. O. N. N H. R1. N. N. HCl. O. EtOH t.a.. O. N O. R2. R2. 53. 54. Esquema 10. 31.

(49) COMPOSTO. SUBSTITUITES. REDIMETO (%). 54a. (R1 =Cl, R2 = Cl). 54. 54b. (R1 =F, R2 = Cl). 52. 54c. (R1 = OMe, R2 = Cl ). 49. 54d. (R1 = Cl, R2 = F ). 56. 54e. (R1 =F, R2 =F). 53. 54f. (R1 = OMe, R2 = F ). 40. Tabela 04 - Substituintes e rendimentos das isoxazolil-hidrazonas. As isoxazolil-hidrazonas 54 foram obtidas a partir da condensação dos aldeídos isoxazolínicos 53 com as fenil-hidrazinas p-substituídas. A reação se processou rapidamente, ocorrendo precipitação da hidrazona no meio reacional em cerca de 40 minutos. Após a filtração e lavagem do precipitado, as isoxazolil-hidrazonas 54 foram obtidas como sólidos (bege à amarelo), que foi purificado e devidamente identificado por espectrometria de RMN e I.V. Os rendimentos das reações de condensação apresentaram-se dentro da faixa que é relatada na literatura. 53, 54. , para outras hidrazonas em torno de 50%-60%, para. condensações similares com outros aldeídos, no entanto, o composto 54f apresentou 40%, considerado um pouco abaixo do esperado. Mas isso se deve, provavelmente, ao processo de purificação, pois durante o procedimento ocorreram algumas perdas do produto. Esses compostos ainda podem apresentar melhores rendimentos, ao ser feito um aprimoramento do processo de purificação. Houve formação de um único produto de condensação, conforme CCD e análise dos espectros de RMN. Muito provavelmente, apenas a hidrazona diasteroisomérica de configuração “E” tenha sido formada, devido a questões cinético-termodinâmicas. Como isoxazolil-hidrazonas ainda não foram descritas na literatura, não temos como fazer analogia de deslocamentos químicos dos hidrogênios HC=N de outras hidrazonas, que porventura já possuíssem sua estereoquímica relativa determinada, visto que temos uma peculiaridade estrutural, pois a função hidrazona em nossas estruturas pertence a uma espécie de heterodieno associado à isoxazolina. Outro fato, é que, os hidrogênios HC=N têm seus sinais geralmente coincidentes com os sinais dos hidrogênios aromáticos, sendo detectada a presença dos mesmos pela integração dos sinais. Diante desses fatos, estamos tentando obter cristais das hidrazonas, para a obtenção da difração de raio-X das mesmas, visando a confirmação da estereoquímica relativa. No entanto,. 32.

(50) todas as hidrazonas isoxazolínicas 54 apresentaram um singleto próximo à 11 ppm em 1. H RMN, correspondendo ao hidrogênio NN-H da função hidrazona, conforme. deslocamentos químicos descritos na literatura para NN-H, de outras hidrazonas. Com relação aos espectros de IVFT, bandas finas e relativamente intensas, correspondentes ao estiramento NN-H, estão presentes entre 3240-3270 cm-1, confirmando assim, a função hidrazona nas estruturas dos híbridos 54. A caracterização do biciclo pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina, presente no cicloaduto 49 e também em 50, 51, 52, 53 e 54, se faz facilmente através de espectrometria de RMN, nas quais, sinais diagnósticos da formação do cicloaduto são evidentes, como um dubleto próximo a 6,5 ppm em 1H RMN, referente ao H6a e um sinal próximo a 95 ppm em. 13. C RMN, referente ao C6a. Com exceção da isoxazolina. desprotegida 50, todos os derivados isoxazolínicos 49, 51, 52, 53 e 54 possuem uma função amida ou carbamato em N6. Este fato fez com que os mesmos apresentassem sinais de rotâmeros em 1H e 13C RMN. A presença de rotâmeros, devido à alta barreira rotacional energética das ligações amídicas e carbamídicas, deixa os espectros de RMN complexos.16 No entanto, quando os espectros foram obtidos à 60oC, ocorreu total coalescência dos sinais de rotâmeros. Outra peculiaridade dos espectros de RMN, foi a deformação do sinal do H6, assim como de outros hidrogênios exocíclicos do biciclo e também baixa resolução dos sinais dos carbonos do anel bicíclico.. 33.

(51) 6 - PROCEDIMETOS EXPERIMETAIS. 6.1. - MATERIAS E MÉTODOS. As reações de síntese de enecarbamatos, as de cicloadição, as de formação dos álcoois e as de formação dos aldeídos são extremamente sensíveis à umidade e foram realizadas sob atmosfera de argônio, em aparato previamente seco em estufa por 4h (120°C). As reações de síntese das hidrazonas não tiveram essas precauções em relação à umidade. Clorofórmio e trietilamina foram tratados com hidreto de cálcio e destilados antes do uso. Metanol foi seco com Mg°/I2. O THF foi tratado com sódio/benzofenona e destilado imediatamente antes do uso. O DMSO foi seco sob peneira molecular 4 angstron, previamente seca em estufa por 24 h. Nas reações de condensação dos aldeídos com as fenilhidrazinas foi utilizado o etanol absoluto como solvente, sem necessidade de uma pré-secagem. As reações de hidrogenólise foram realizadas sob pressão positiva de hidrogênio, borbulhando-se o gás no meio reacional por cerca de 1 hora. Acetato de etila e Hexano, utilizados nas colunas cromatográficas, foram bidestilados. A análise por cromatografia em camada fina (CCF) foi efetuada em cromatofolhas de alumínio (gel de sílica 60), com espessura de 0,2 mm, contendo indicador para 254 nm. A visualização das manchas foi efetuada com lâmpada de U.V. ENF – 2400 C/F, ácido fosfomolíbdico 7% em etanol, seguido de aquecimento ou por absorção de iodo. As colunas cromatográficas foram empacotadas com gel de sílica 60 (230 – 400 mesh) e eluidas sob pressão (Flash). Os produtos sólidos tiveram seu ponto de fusão aferidos em aparelhos POLAX WRS – 1, e não foram corrigidos. Os espectros no infravermelho (I.V.) foram obtidos em aparelhos Bruker IFS 66 (transformada de Fourier), com as freqüências de absorção sendo expressas em cm-1, utilizando-se pastilhas ou janelas de KBr. Os espectros de 1H RMN e. 13. C RMN foram obtidos em aparelhos Varia Unity. 300 MHz. Os deslocamentos químicos (δ) são expressos em ppm, tendo como padrão interno o tetrametilsilano ou clorofórmio para 1H RMN e DMSO ou CHCl3 para. 13. C. 34.

(52) RMN. Os sinais dos espectros de 1H RMN são designados da seguinte forma: deslocamento químico (ppm), multiplicidade (s = singleto, d = dubleto, dl = dubleto largo, t = tripleto, tl = tripleto largo, q = quarteto, dd = duplo dubleto, dt = duplo tripleto, ddl = duplo dubleto largo, m = multipleto, ml = multipleto largo, sl = sinal largo), constante de acoplamento (Hz) e números de hidrogênios 6.2 - TRÍMERO DA ∆1-PIRROLIA (ISÔMERO α) 47. . . . H 46. 47. 6.2.1 - Preparação do trímero da ∆1-pirrolina.. Uma solução aquosa de perssulfato de sódio 25% (33,82g; 144 mmols; 90 mL água) foi adicionada lentamente e sob forte agitação, sobre uma solução de pirrolidina (11,6 mL; 144 mmols), hidróxido de sódio (11,50 g; 288 mmols) e nitrato de prata (0,118 g; 0,65 mmols) em 90 mL de água à 0°C. Ao término da adição, a solução foi deixada em agitação por mais 1 hora a 0°C e em seguida por mais 1 hora à temperatura ambiente. A solução escura resultante foi extraída com diclorometano (3x40 mL). Secouse a fase orgânica sob sulfato de sódio anidro e após remoção do solvente obteve-se 8,1g de um líquido amarelado viscoso, correspondendo a um rendimento de 84 % do trímero 47. O trímero 47 é utilizado, o mais rápido possível, sem qualquer purificação adicional, na preparação do enecarbamato -(benziloxicarbonil)-2-pirrolina, devido a sua instabilidade.. Propriedades Físicas de 47 - Óleo amarelo viscoso; - Sensível a solventes próticos.. 35.

(53) DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1. H RM (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.).. (parte do monômero está presente, devido ao equilíbrio). 1,75 (m); 2,28 (m); 2,50 (m); 2,99 (m); 3,82(m); 7,59 (s).. 6.3 - -(BEZILOXICARBOIL)-2-PIRROLIA 48. N N N. N O. 47. O 48. A solução do trímero da 1-pirrolina 47 foi codestilada (8,1 g; 39,1 mmols; 237 mL de THF seco), recolhendo-se o destilado em um recipiente pré-resfriado à -78°C, contendo trietilamina (10,9 mL; 78,2 mmols). Após o término da destilação, adicionouse lentamente, via seringa, sobre o destilado ainda à -78°C, a solução 50% cloroformato de benzila em tolueno (26,7 mL; 78,2 mmols). Deixou-se a suspensão resultante em agitação durante toda noite, aquecendo gradualmente à temperatura ambiente. A suspensão foi filtrada em funil sinterizado e após remoção do solvente, obteve-se um óleo amarelado. O cloreto de benzila, presente como subproduto, foi removido por filtração simples em coluna cromatográfica, utilizando-se apenas hexano. Logo após, o produto residual foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/hexano 1: 9). Obteve-se 5,32 g de um líquido incolor correspondendo a um rendimento de 67% do enecarbamato 48.. Propriedades Físicas de 48 - Óleo incolor - Rf = 0,26 (AcOEt/hexano 1: 9). 36.

(54) DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1. H RM (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.. 2,64 (ql; J = 9,7 Hz; 2H); 3,77 (q; J = 9,1 Hz; 2H); 5,02 e 5,07 (m, 1H, rotâmeros); 5,17 (s; 2H); 6,54 e 6,63 (m, 1H, rotâmeros); 7,35 (m; 5H).. I.V. (filme, cm-1), principais sinais. 3.032, 2.956, 1.706, 1.618, 1.422, 1.342, 1.214, 1.128, 756, 698.. 6.4 - CLOROOXIMIDOACETATO DE ETILA 56 O O Cl. H 3N. Cl E tO OEt. 55. N 56. OH. Em um balão de 250 mL foi adicionado o cloridrato do éster etílico da glicina 55 (10,2g; 73 mmols), água destilada (15 mL) e ácido clorídrico concentrado (6,3 mL; 73 mmols). Em seguida resfriou-se essa solução em banho de gelo/NH4Cl. Sob forte agitação e mantendo-se a temperatura do banho nunca acima de 0° C, adicionou-se lentamente, via funil de adição, a solução de nitrito de sódio (5,1g; 73 mmols; 9 mL de água). Ao término desta adição repetiu-se o processo, adicionando-se mais um equivalente de HCl concentrado e de nitrito de sódio. Deixou-se a solução resultante em agitação por mais 15 min à mesma temperatura. Em seguida o produto foi extraído com clorofórmio (4 x 40 mL) e seco sob sulfato de sódio anidro. Após remoção do solvente, ocorreu intensa precipitação de cristais brancos, após a adição de hexano, onde esses foram lavados com hexano e secos sob vácuo. Obteve-se 5g do produto identificado como 56, correspondendo a um rendimento de 45%.. Propriedades Físicas de 56 - Ponto de Fusão 80° C, conforme literatura.. 37.

(55) 6.5 - ÉSTER 6-BEZIL-3-ETIL DO ÁCIDO 3a,4,5,6a-TETRAHIDROPIRROLO [3,2d]ISOXAZOL-3,6-DICARBOXÍLICO 49 O. O. N N. O. N O. O O 48. O 49. A um balão de 250 ml, acoplado com funil de adição com equalizador de pressão e agitador magnético, foi adicionado o enecarbamato 48 (4,94g; 24,33 mmols), trietilamina (6,2 ml; 44,16 mmols, 10% de excesso em relação ao precursor do dipolo) e clorofórmio seco (104 ml). A esta solução, sob forte agitação, foi adicionada lentamente, durante 2h, a solução clorofórmica do clorooximidoacetato de etila 56, precursor do dipolo 56a, (6,08g; 40,15 mmols; 34 ml de CHCl3 seco). A reação foi acompanhada através de CCD, onde se percebeu a formação do produto, cicloaduto, desde o início da adição do precursor 56a do -óxido de nitrila. Após 2 horas de reação e total consumo do material de partida, removeu-se o solvente. O sal formado, cloreto de trietilamônio, foi filtrado em funil sinterizado, utilizando-se uma mistura de acetato de etila/hexano a 40%. Após remoção do solvente, obteve-se um óleo amarelo escuro e bastante viscoso. O produto bruto foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 2:3). Obteve-se 5,44g do cicloaduto 49, correspondendo a um rendimento de 71%.. Propriedades Físicas de 49 - Óleo amarelo claro viscoso - Rf = 0,47 (AcOEt/hexano 1:1) DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1. H RM (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.. 7,36 (m; 5H); 6,53 e 6,42 (d; J=7,5Hz; 1H; rotâmeros); 5,2 (m; 2H); 4,36 (m; 2H); 4,08 (m; 1H); 3,84 (m; 1H); 3,18 (dt; J= 11,1Hz; J= 11,1Hz; J=6,3; 1H); 2,23 (m; 2H); 1,37 (t; J=7,2Hz; 3H).. 38.