Associação do polimorfismo MnSOD ALA16VAL com os biomarcadores inflamatórios, apoptóticos e BDNF em pacientes após acidente vascular encefálico tardio

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA. Ariane Ethur Flores. ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO MnSOD ALA16VAL COM OS BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS, APOPTÓTICOS E BDNF EM PACIENTES APÓS ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO TARDIO. Santa Maria, RS 2017.

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(3) Ariane Ethur Flores. ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO MnSOD ALA16VAL COM OS BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS, APOPTÓTICOS E BDNF EM PACIENTES APÓS ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO TARDIO. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Farmacologia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM-RS) como requisito para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.. Orientadora: Prof. Dr. Michele Rechia Fighera Co-orientador: Prof. Dr. Marta Maria Medeiros Frescura Duarte. Santa Maria, RS 2017.

(4) © 2017 Todos os direitos autorais reservados a Ariane Ethur Flores. A reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita mediante a citação da fonte. E-mail: arianeflores@uol.com.br.

(5) Ariane Ethur Flores. ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO MnSOD ALA16VAL COM OS BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS, APOPTÓTICOS E BDNF EM PACIENTES APÓS ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO TARDIO. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM-RS) como requisito para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.. Aprovado em 01 de julho de 2017:. Michele Rechia Fighera, Profa. Dra. (UFSM) (Orientadora). Daniela de Almeida Cabrini, Profa. Dra. (UFPR). Gabriela Trevisan dos Santos, Profa. Dra. (UFSM). Patricia Severo do Nascimento, Profa. Dra. (UFSM). Juliano Ferreira, Prof. Dr. (UFSC). Santa Maria, RS 2017.

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(7) Dedico este trabalho à minha família!.

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(9) “Eu não tenho ídolos. Tenho admiração por trabalho, dedicação e competência”. (Ayrton Senna).

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(11) AGRADECIMENTOS Gratidão é a melhor palavra que define esse momento… Sou grata ao universo, a Deus, a energia universal pela força e fé na minha vida. Aos meus pais e minha família que sempre me apoiaram e não me deixaram desistir… Essa tese é para vocês! A minha orientadora e amiga Michele Rechia Fighera, obrigada por compartilhar tanto conhecimento e bondade, pela força nos períodos críticos e sem dúvida nenhuma és um exemplo de orientadora. Sou eternamente grata! A Marta Duarte grande amiga, parceira, colega e co-orientadora muito obrigada pelo carinho, apoio, tempo e todos kits… és um exemplo a ser seguido. Ao Duda meu braço direito, esquerdo e muitas vezes as pernas também, teu apoio foi crucial… gratidão eterna. Gratidão aos colegas do Bioex pela parceria e apoio durante esses anos… em especial a Aline e Pati por auxiliar nas coletas. Aos colegas do Laboratório de Biogenômica Thiago e Fernanda e ao apoio da Profa Ivana Cruz. Ao pessoal do grupo de hemiplegia do HUSM pelo apoio, principalmente à professora Ana Lúcia. Agradeço a direção da ULBRA Santa Maria, professores, funcionarios e alunos, os quais me incentivaram, confiaram nesse desafio, oportunizando o meu crescimento profissional. Aos pacientes e seus familiares, que aceitaram participar deste projeto de pesquisa e compartilharam suas histórias de vida; meu muito obrigado. Aos professores que tive ao longo de toda minha formação acadêmica pelas instruções e ensinamentos, certamente nunca os esquecerei. Aos grandes amigos cujo apoio e palavras de incentivo, me auxiliaram a manter forte o desejo de conquistar meus objetivos e realizar os meus sonhos, a minha eterna gratidão..

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(13) RESUMO. ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO MnSOD ALA16VAL COM OS BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS, APOPTÓTICOS E BDNF EM PACIENTES APÓS ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO TARDIO. AUTOR: Ariane Ethur Flores ORIENTADORA: Michele Rechia Fighera CO-ORIENTADOR: Marta Maria Medeiros Frescura Duarte. O acidente vascular encefálico (AVE) é uma das doenças neurológicas mais frequentes e apresenta vários fatores de risco como a aterosclerose, dislipidemia e diabetes melitus. Além disso, os mecanismos de ação associados a fisiopatologia do AVE envolvem várias vias de interação, tais como inflamação, estresse oxidativo, apoptose, fatores genéticos e modulação de fatores neurotróficos, como o fator neurotrófico cerebral (BDNF). Estudos tem mostrado que as mutações genéticas, como o polimorfismo do nucleotídeo único da superóxido dismutase manganês (MnSOD Ala16Val SNP) está associado a fatores de risco de algumas doenças cardiovasculares, assim como, a modulação das vias inflamatórias e oxidativas. Entretanto, pouco se sabe sobre a relação do polimorfismo da MnSOD Ala16Val com o AVE e com os níveis de BDNF plasmáticos, bem como, a influência da mutação genética nos parâmetros inflamatórios, de estresse oxidativo e marcadores apoptóticos nessa patologia. Dessa forma, inicialmente foram recrutados indivíduos com AVE crônico (44) e indivíduos saudáveis (44) para análise da associação do polimorfismo da MnSOD Ala16Val e o AVE. O perfil glicolipídico, níveis plasmáticos de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e IFN-γ), caspases (1 e 3), BDNF, dano ao DNA, TBARS, níveis de nitrito e nitrato (NOx), atividades da SOD e catalase também foram avaliados nos pacientes com AVE comparando com indivíduos saudáveis (controle). Os resultados mostraram uma maior proporção do genótipo VV no grupo AVE em comparação com indivíduos saudáveis. Além disso, observamos maiores níveis de colesterol (CHO) e glicose (GLU) nos pacientes após AVE quando comparados com os indivíduos saudáveis. Interessantemente, os pacientes que apresentaram o alelo V mostraram maiores níveis de CHO e GLU quando comparados ao genótipo AA do grupo AVE e os genótipos do grupo controle. Os resultados ainda mostram que os parâmetros de estresse oxidativo (TBARS, níveis de NOx e atividades da SOD e catalase) e dano ao DNA estão aumentados no grupo AVE em relação aos indíviduos saudáveis, mesmo após 6 meses do evento isquêmico cerebral. A análise estatística mostrou, que os valores de colesterol total, LDL, IL-1β, IL-6, e os níveis de IFN- foram mais elevados nos pacientes AVE com genótipo VV em comparação com os AA e AV e com os genótipos dos indivíduos controles. Os níveis dos triglicerídeos, glicose e caspases (1 e 3) foram significativamente maiores no genótipo VV e AV no grupo AVE em comparação com o genótipo AA e com os genótipos dos indivíduos controles. Os níveis de BDNF foram menores nos genótipos VV e AV em relação ao AA dos pacientes com AVE e com os genótipos dos indivíduos controles. Os resultados também mostraram uma correlação entre IL-1β e espasticidade no genótipo VV quando comparado com AA e AV dos pacientes pós AVE. Nossos resultados sugerem que o polimorfismo na MnSOD Ala16Val pode contribuir para a hipercolesterolemia e níveis mais elevados de GLU, levando a alteração na homeostase neurovascular. Estes eventos colaboram com um aumento dos marcadores inflamatórios, oxidativos, apoptóticos e na redução de BDNF, contribuindo para a fisiopatologia da doença neurovasular. Palavras-Chave: Polimorfismo. Estresse Oxidativo. Citocinas Inflamatórias. Caspase. Dano ao DNA. Dislipidemia..

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(15) ABSTRACT. ASSOCIATION OF MnSOD ALA16VAL POLYMORPHISM WITH THE INFLAMMATORY, APOPTOTICS BIOMARKERS AND BDNF IN PATIENTS AFTER STROKE LATE. AUTHOR: ARIANE ETHUR FLORES ADVISOR: MICHELE RECHIA FIGHERA CO-ADIVISOR: MARTA MARIA MEDEIROS FRESCURA DUARTE. Stroke is one of the most frequent neurologic diseases and involves various risk factors such as atherosclerosis, dyslipidemia and diabetes mellitus. Furthermore, the mechanisms of action associated with the pathophysiology of stroke involve multiple interaction pathways such as inflammation, oxidative stress, apoptosis, genetic factors and modulation of neurotrophic factors such as brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Studies has showed that genetics mutation as MnSOD Ala16Val single nucleotide polymorphism (SNP) to be associated to risk factors of vascular diseases, as well as with modulation of inflammation and oxidative pathways. However, little is known about the relationship between MnSOD Ala16Val SNP with stroke and plasmatic BDNF levels and also its influence on inflammatory, oxidative stress, apoptosis and glycolipid parameters on stroke. For this purpose, stroke patients and healthy subjects were recruited to biochemistry analysis. We analyzed glycolipid profile, IL-1, IL-6, IFN-γ and BDNF levels, as well as caspases (1 and 3) activation, oxidative stress, apoptosis, DNA damage and spasticity of stroke patients comparated whith healthy subjects. Results showed a higher proportion of VV genotype in post-stroke as compared to healthy subjects. The results also indicated that stroke patients had higher cholesterol (CHO) and glucose (GLU) levels when compared to healthy counterparts. Interestingly, V allele carriers with stroke showed higher levels of CHO and GLU levels when compared to AA stroke and healthy counterparts. Furthermore, results show that oxidative stress parameters (TBARS, levels of nitrite and nitrate (NOx), SOD and catalase activities) and DNA damage are increased in stroke group compared to healthy individuals, even after 6 months of stroke. The values of total cholesterol, LDL, IL-1, IL- 6, and INF- levels also were higher in VV post-stroke as compared to AA, AV post-stroke and control group. The triglycerides and glucose levels and caspases (1 and 3) activation were significantly higher in VV and AV post-stroke patients as compared to AA post-stroke and control group. The BDNF levels were lower in VV and AV post-stroke patients as compared to AA post-stroke and control group. The DNA damage was higher in stroke group when compared to control group. The results also showed a correlation between IL-1 and spasticity in VV post-stroke as compared to others groups. Our results suggest that polymorphism in MnSOD Ala16Val may contribute to hypercholesterolemia and higher levels of GLU, leading to alteration in neurovascular homeostasis. These events contribute to an increase in inflammatory markers, oxidative, apoptotic and in reducing BDNF, contributing to the pathophysiology of neurovascular disease. Keywords: Polimorphysm. Oxidative Stress. Inflammatory cytokines. Caspase. DNA damage. Hypercholesterolemia..

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(17) LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Figura 2 – Figura 3 – Figura 4 – Figura 5 –. AVE Isquêmico ....................................................................................... 28 Mecanismo de produção e liberação do BDNF ...................................... 40 Fisiopatologia do AVE ............................................................................ 46 Atividade da MnSOD Ala16Val............................................................... 48 Esquema representativo da conclusão da presente Tese .................... 118.

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(19) LISTA DE ABREVIATURAS ATP. Adenosina trifosfato. AGEs. Produtos de glicação avançada. AVDs. Atividades de vida diárias. AVE. Acidente vascular encefálico. AVEh. Acidente vascular encefálico hemorrágico. AVEi. Acidente vascular encefálico isquêmico. BDNF. Fator neurotrófico derivado do encéfalo. BHE. Barreira hemato encefálica. CASP 1. Caspase 1. CASP 3. Caspase 3. CAT. Catalase. CHO. Colesterol total. DM. Diabetes mellitus. DC. Doenças cardiacas. dAVE. Grupo AVE dislipidêmico. ERNs. Espécies reativas de nitrogênio. GLU. Glicose. EROs. Espécies reativas de oxigênio. ERs. Espécies reativas. GPx. Glutationa peroxidase. GSH. Glutationa redutase. H2O2. Peróxido de hidrogênio. HBA1C. Hemoglobina glicada 1ª. IL-1β. Interleucina 1-Beta. IL-1RA. Antagonista receptor IL-1. IL-6. Interleucina – 6. IFN-. Interferon gama. IMC. Índice de massa corporal. LDLox. LDL oxidado. LPO. Peroxidação lipídica. MnSOD. Superóxido dismutase manganês.

(20) ndAVE. Grupo AVE não dislipidêmico. DMStroke. Grupo AVE com diabetes mellitus. nDNStroke. Grupo AVE sem diabetes mellitus. NMDA. N-metil-D-aspartato. NO. Óxido nítrico. NOS. Óxido nítrico sintase. NOx. Nitrito/nitrato. O2-. Ânion superóxido. O2. Oxigênio. OH-. Radical hidroxil. PCR. Proteina C reativa. ONOO-. Peroxinitrito. PG. Picogreen. QV. Qualidade de vida. RLs. Radicais livres. r-tPA. Ativador do plasminogênio tecidual recombinante. SNC. Sistema nervoso central. SNP. Polimorfismo de nucleotídeo simples. SOD. Superóxido dismutase. TG. Triglicerídeos. TNF-α. Fator de necrose tumoral alfa.

(21) SUMÁRIO APRESENTAÇÃO ................................................................................... 21 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 23. 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3. REVISAO BIBLIOGRAFICA .................................................................... 27 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO ................................................... 27 Quadro Clínico ........................................................................................ 29 Patofisiologia .......................................................................................... 30 Biomarcadores envolvidos no AVEi ..................................................... 34. 2.1.3.1 2.1.3.2 2.1.3.3 2.1.3.3 2.1.3.4. Inflamação ............................................................................. 34 Apoptose ................................................................................ 36 Dano ao DNA ......................................................................... 37 Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo (BDNF) .................. 38 Estresse Oxidativo ................................................................. 41. 2.2 2.3. POLIMORFISMO MNSOD ALA16VAL SNP ............................................ 46 TRATAMENTO ......................................................................................... 50. 3 3.1 3.2. OBJETIVOS ............................................................................................. 53 OBJETIVO GERAL................................................................................... 53 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 53. 4 4.1 4.2. MANUSCRITOS ....................................................................................... 55 MANUSCRITO 1 ...................................................................................... 55 MANUSCRITO 2 ...................................................................................... 79. 5. DISCUSSÃO .......................................................................................... 105. 6. CONCLUSÃO ........................................................................................ 117 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ...................................................... 119 ANEXOS ................................................................................................ 139 ANEXO A – QUESTIONÁRIO AVALIAÇÃO CLÍNICA .......................... 141 ANEXO B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ..................................................................................... 142 ANEXO C – TERMO DE CONFIDENCIALIDADE ................................. 144.

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(23) APRESENTAÇÃO No item INTRODUÇÃO está descrita uma revisão de literatura sobre os temas abordados nesta tese. Os resultados que fazem parte desta tese estão sob a forma de manuscrito, os quais se encontram no item ARTIGO CIENTÍFICO (manuscrito 1 e 2). As seções Materiais e Métodos, Resultados, Discussão e Referências Bibliográficas encontramse nos respectivos manuscritos e representam a íntegra deste trabalho. Os itens DISCUSSÃO e CONCLUSÃO da tese apresentam interpretações e comentários gerais sobre os manuscritos científicos contidos no final neste trabalho. O item REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS refere-se somente as citações que aparecem nos itens. INTRODUÇÃO, REVISÃO. DE. LITERATURA E. DISCUSSÃO desta tese. O item ANEXOS refere-se ao questionário clínico utilizado neste estudo, assim como o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e o Termo de Confidencialidade..

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(25) 23. 1 INTRODUÇÃO Nos últimos anos, os países do terceiro mundo apresentaram um grande aumento na expectativa de vida, principalmente devido a uma melhora nas condições econômicas (GARRITANO et al., 2012). Entretanto, vem se observando um crescente aumento de pacientes com doenças crônicas, causando um impacto importante sobre o sistema de saúde e previdenciário (GARRITANO et al., 2012). Dessa forma, as doenças crônicas tornaram-se um problema para os sistemas de saúde, devido aos altos custos investidos no cuidado terapêutico desta população e por serem uma das principais causas de incapacidade (BELDA-LOIS et al., 2011). Uma dessas doenças crônicas é o acidente vascular encefálico (AVE), uma patologia que se tornou um dos maiores problemas de saúde pública mundial, devido ao impacto na qualidade de vida, ao incremento nos fatores de risco, bem como, as complicações sistêmicas apresentadas pelos pacientes após o evento (FRANCISCO et al., 2006). Entre os fatores de risco, as alterações neurovasculares, mais especificamente a aterosclerose, é um dos mais importantes, e tem sido foco de estudos em tratamentos preventivos e intervenções terapêuticas (BOS et al., 2014). Vários fatores estão relacionados a aterosclerose, entre eles podemos citar a diabetes e a dislipidemia, os quais podem favorecer a formação de embôlos e placas ateroscleróticas, resultando em uma isquemia transitória ou em um AVE (HOLM et al., 2011). O. déficit. neurológico. decorrente do AVE. caracteriza-se. por várias. manifestações clínicas e estágios de recuperação, onde cada paciente pode atingir um platô em qualquer fase, dependendo das características individuais e da lesão, tais como o tipo, a extensão, a localização e o tempo de evolução (MOORE et al., 2010). De uma forma geral, as manifestações clínicas envolvem comumente alterações motoras e sensitivas (WU et al., 2012). Essas alterações clínicas estão relacionadas com o dano cerebral, o qual pode ser causado por vários mecanismos, entre os principais podemos citar a falha energética celular, a excitoxicidade, o estresse oxidativo, a sinalização apoptótica, assim como, os processos inflamatórios (LO et al., 2003; CECHETTI et al., 2012; SHICHITA et al., 2012). Essa cascata de eventos está potencialmente relacionada com o início e progressão do AVE devido a capacidade de alterar a homeostase celular e neurovascular (ALLEN et al., 2013). Além disso, a resposta inflamatória parece também estar envolvida na liberação e.

(26) 24. regulação de várias moléculas no sistema nervoso central, como fatores de crescimento e neurotrofinas (SAHA et al., 2006). O fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) é um membro da família das neurotrofinas que tem um papel essencial na plasticidade e regeneração neuronal cerebral depois do AVE, mas também é uma molécula com um alto potencial na sinalização celular (BATH et al., 2006). Estudos experimentais sugerem que os neurônios e as células gliais agem como fontes endógenas de BDNF após AVEi. O BDNF causa vasodilatação por aumento da síntese de prostaciclinas, protegendo contra a vasoconstrição relacionada à lesão e à formação de placas ateroscleróticas no vaso cerebral. Além disso, o BDNF pode passar a BHE em condições patológicas, como no AVE, e exercer uma ação protetora no local da lesão durante a fase pós-isquêmica (DI LAZZARO et al., 2007). Dessa forma, o BDNF pode reduzir os riscos do AVE pelos seus efeitos neurotróficos e vasculares (PIKULA et al., 2013; NAVARATNA et al., 2011; LI et al., 2014). Outra interessante ação dessa neurotrofina, é a sua associação com o estresse oxidativo (WU et al., 2004). Estudos sugerem que as espécies reativas podem induzir a uma depleção energética celular e alterar o funcionamento do receptor NMDA (LIGHT et al., 2001; LU et al., 2001), o qual está relacionado com uma redução na expressão do gene do BDNF (HAYASHI et al., 2001; ROCERI et al., 2002). Em relação as espécies reativas, o cérebro é mais suscetível ao dano oxidativo pois é rico em ácidos graxos poliinsaturados sensíveis a oxidação, possui alto consumo de O2 e é relativamente pobre em defesas antioxidantes. Dessa forma, logo após uma redução do fluxo sanguíneo em uma determinada região cerebral, ocorre um aumento na produção e liberação de espécies reativas, assim como, uma redução. nas. defesas. antioxidantes,. resultando. no. comprometimento. da. permeabilidade neuronal e dano celular (LO et al., 2003). Uma das principais defesas celulares ao dano oxidativo é um grupo de oxiredutases conhecido como superoxido dismutases (SODs), que catalizam a dismutação do O2- em O2 e H2O2 (FUKAI, T. et al., 2011). Existem 3 isoformas de SODs, entre elas podemos citar a SOD mitocondrial dependente de manganês (MnSOD). Esta enzima contém um gene com 5 exons e está localizada no cromossoma 6q25 (ROY et al., 2006). Um dos mais comuns polimorfismos da MnSOD é devido `a substituição da alanina 16 (GCT) com a valina (GTT), resultando no polimorfismo Ala16Val. Esta mutação pode refletir em uma.

(27) 25. redução funcional da enzima ao nível mitocondrial, o que implicaria em uma eficiência diminuída da MnSOD (DUARTE, M. et al., 2010). Um estudo realizado por Sutton et al. (2003) mostrou que a Ala-MnSOD teve uma maior efetividade (30%–40%) em relação a mutação Val-MnSOD no controle da geração de O2- mitocondrial. Dessa forma, a mutação poderia interferir na funcionalidade da enzima em controlar o estado redox da célula e assim, afetar a homeostase vascular (KEATING et al., 2006), contribuindo para algumas doenças neurovasculares como o AVE. Embora alguns estudos descreveram a relação do estresse oxidativo e inflamação com fases agudas do AVE, escassos trabalhos enfatizaram seus estudos na fase crônica da doença. Além disso, não se tem descrito na literatura investigações. a. respeito. da. associação. do. polimorfismo. genético. da. Mn OD Ala16Val SNP no AVE. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar se existe uma relação entre o polimorfismo genético da MnSOD Ala16Val SNP com os marcadores de dano oxidativo, inflamatórios, BDNF e dano ao DNA na fase tardia do AVE (maior que 6 meses). Outro interessante objetivo deste trabalho foi investigar se há uma relação entre o polimorfismo genético com os fatores de risco, como a dislipidemia e hiperglicemia, assim como, com uma das principais sequelas motoras, a espasticidade A intenção foi compreender melhor os mecanismos dessa doença e agregar conhecimento para que no futuro novas maneiras de diagnóstico e tratamento possam ser consideradas.

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(29) 27. 2 REVISAO BIBLIOGRAFICA 2.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO O AVE é, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (2006), “Um sinal de rápido desenvolvimento de perturbação focal da função cerebral, de suposta origem vascular e com mais de 24 horas de duração” e a segunda maior causa de mortalidade no mundo e a maior em termos de perda de funcionalidade e capacidade físico-motora. No Brasil, segundo Garritano et al. (2012), os dados apontam que o AVE é a causa mais frequente de óbitos na população de adultos, especialmente acima dos 60 anos. Além disso, em relação aos pacientes que sobrevivem, a maioria necessita de reabilitação para as sequelas motoras, dentre esses 70% não retornam ao seu trabalho e 30% necessitam de auxílio para caminhar e realizar atividades de vida diárias (AVDs) (BELDA-LOUIS et al., 2011). O AVE é caracterizado por uma diminuição do fluxo sanguíneo no cérebro devido a bloqueios vasculares por oclusão trombótica ou aterosclerótica da artéria cerebral (Figura 1), caracterizando o AVE isquêmico (AVEi) que é responsável por 70-90% dos casos (VIJAYAN; REDDY, 2016). Eventos que induzam um rompimento do vaso sanguíneo, resultando em extravasamento de sangue, é definido como AVE hemorrágico (AVEh) (FAN et al., 2013). Estas condições geralmente envolvem uma imediata privação tanto de glicose quanto de oxigênio, os quais são necessários para manutenção das demandas metabólicas do cérebro (GRAHAM; CHEN, 2001)..

(30) 28. Figura 1 – AVE Isquêmico. Desenho ilustrativo mostrando a isquemia cerebral por placa ateromatosa, seja por formação local ou êmbolo, caracterizando o AVE isquêmico. AVE – Acidente Vascular Encefálico. Fonte: Pascotini (2016).. Os fatores de risco (FR) associados ao AVE, podemos dividir em FR modificáveis e os não-modificáveis, sendo o primeiro relacionado aos hábitos de vida e o segundo, a questões genéticas e temporais, sendo que estes fatores podem ser múltiplos e combinados, demonstrando a heterogeneidade da doença (GOLDSTEIN et al., 2011). São fatores não-modificáveis para AVE: a idade, o sexo, a raça e hereditariedade. Enquanto que, os fatores modificaveis são: doenças cardíacas (DC), diabete mellitus (DM), consumo excessivo de álcool, estenose assintomática da carótida (EAC), hipertensão, fumo, sedentarismo, obesidade, fibrilação arterial (FA) e dislipidemia (MOHD ZULKIFLY et al., 2016). A isquemia, propriamente dita, pode se desenvolver em consequência de vários fatores podendo coexistir com outras patologias. Dentre os fatores de risco, a hipercolesterolemia, o DM tipo 1 e tipo 2, bem como o envelhecimento são os.

(31) 29. principais fatores indutores e facilitadores de formação da placa aterosclerótica (ROCHA; LIBBY, 2009). Em relação ao quadro clínico, o déficit neurológico decorrente do AVE caracteriza-se por várias manifestações clínicas, onde cada paciente pode atingir um platô em qualquer fase, dependendo das características individuais e da lesão (MOORE et al., 2010). De forma geral, as manifestações clínicas envolvem comumente alterações motoras e sensitivas (WU et al., 2012). As principais sequelas motoras pós-AVE relacionadas na literatura estão a redução da força muscular, perda do controle muscular volitivo, incoordenação motora e a hipertonia espástica (FRANCISCO et al., 2006). Em função destas sequelas motoras, os indivíduos acabam desenvolvendo a perda da funcionalidade, através de distúrbios da marcha, perda do equilíbrio, incapacidade ou limitação para realização das atividades de vida diárias (AVDs) (MARTINS et al., 2004). 2.1.1 Quadro Clínico O quadro clínico no AVE caracteriza-se por diversas manifestações clínicas e estágios de recuperação, onde cada paciente atinge um nível em qualquer fase, dependendo da lesão, tais como o tipo, a extensão, a localização e o tempo de evolução (MOORE et al., 2009). As alterações motoras e sensitivas observadas nos pacientes após o AVE são originadas nos neurônios motores superiores, e tem como principais sinais e sintomas a diminuição da força muscular, a perda do controle muscular volitivo, a incoordenação motora e a hipertonia espástica no lado hemiplégico (FRANCISCO et al., 2006). Ao longo do tempo, as sequelas motoras decorrentes do AVE geram déficits na capacidade funcional, independência e qualidade de vida (QV) desses indivíduos (TEIXEIRA-SALMELA et al., 2000). Nesse contexto, dados de estudos transversais e longitudinais sugerem que a QV e o bem-estar ficam significativamente prejudicados após um AVE (HOPMAN; VERNER, 2003). Essa complexidade das alterações na QV em pacientes hemiparéticos é um desafio para os profissionais que estudam o movimento humano. A principal causa desta interferência é a espasticidade, fazendo com que haja acometimento da habilidade do paciente em produzir e regular o movimento voluntário (CORRÊA et al., 2005)..

(32) 30. A espasticidade é um dos distúrbios motores mais freqüentes e incapacitantes nos indivíduos com AVEi. Definida por um aumento do tônus muscular e dependente a velocidade, associada à exacerbação do reflexo de estiramento através da hiperexcitabilidade, sendo enquadrada dentro da síndrome do motoneurônio superior (WARD, 2012). Nos quadros espásticos, dependendo da extensão e local da lesão nervosa, observamos uma hiperatividade dos motoneurônios gama, mudanças na atividade de base de neurônios motores alfa e dos interneurônios, que exacerbam a atividade intrafusal e aumentam a resposta do reflexo miotático (SHEEAN et al., 2002). Promove também, a perda ou desestruturação dos mecanismos de controle supraespinhal, que regulam os mecanismos espinhais e os arcos reflexos. Os elementos relacionados. nestes. arcos. recebem. uma. dupla. influência. supra-espinhal. descendente, podendo ser: ativadora ou inibidora, neurônios sensitivos primários, interneurônios excitadores ou inibidores, células de Renshaw e motoneurônios. Consequentemente, ocorre um exagero dos reflexos polissinápticos ou uma redução na atividade das vias de inibição pré e pós-sinápticas e nos mecanismos de inibição, tão importantes para manter os processos e inibição recíproca (WARD, 2012). Clinicamente manifesta-se por hipertonicidade, reflexos osteotendinosos exacerbados, espasmos musculares, sinal do canivete e clônus, trazendo sérias consequências ao paciente, como contraturas, deformidades, limitação da função motora que afetam o desenvolvimento das habilidades funcionais (SAHIN et al., 2012). A espasticidade pode ser diagnosticada clinicamente através da escala modificada de Ashworth que tem como objetivo avaliar o tônus muscular (LEE et al., 2014). 2.1.2 Patofisiologia No evento isquêmico cerebral, quando ocorre a interrupção da circulação arterial, várias alterações estruturais, funcionais e bioquímicas surgirão na área acometida com estabelecimento de uma cascata de fatores complexos que poderão resultar em morte neuronal. Áreas vizinhas com perfusão parcial podem manter um funcionamento ainda que anormal, mas com possibilidade de reversão (FANN et al., 2013)..

(33) 31. A obstrução de uma artéria que irriga o encéfalo promove a formação de duas zonas com diferentes funções metabólicas e com características hemodinâmicas específicas: a zona de penumbra isquêmica e a zona isquêmica central. A zona de penumbra ocorre ao redor da área de isquemia, onde a ausência de oxigênio é suficiente para levar à redução elétrica, sem despolarizar a membrana neuronal. O fluxo e o metabolismo oscilam entre condições adversas e possíveis, ocorrendo a viabilidade do tecido (FANN et al., 2013). A zona isquêmica central é a área mais crítica na qual a cascata isquêmica neuronal ocorre em maior velocidade em função do nível crítico de oferta de O2. Nesta área o fluxo sangüíneo cerebral encontra-se abaixo de 10 ml de sangue por 100 gramas de encéfalo. No AVEi há interrupção do metabolismo oxidativo celular, redução de ATP e da glicólise anaeróbica, liberação de neurotransmissores como o glutamato e redução do nível de pH intracelular (KUMAR et al., 2010). Caso a circulação sanguínea cerebral se mantenha entre 10 e 50 mL/100g/min uma penumbra isquêmica pode ser formada entre o território isquêmico central e o tecido normal saudável (HOSSMAN, 1994). Na região de penumbra, ainda há disponibilidade de glicose e oxigênio dos vasos sanguíneos colaterais, resultando na apoptose que é um diferente tipo de morte celular, dependente de pouca energia (BROUGHTON et al., 2009). Caso não se estabeleçam os níveis de perfusão em tempo suficiente a região de penumbra acaba tornando-se uma região isquêmica central, sem recuperação. A região de penumbra é atualmente considerada a de maior relevância como alvo de terapias pós-AVE (WEINSTEIN et al., 2004). O processo patofisiológico seguido ao AVEi é extenso, e inclui falência bioenergética, redução da homeostase celular, acidose, aumento dos níveis de cálcio intracelular, excitotoxicidade e citotoxidade mediada por espécies reativas (ERs). Além disso, há a ativação de uma cascata inflamatória, com a mobilização de citocinas, geração de produtos do ácido araquidônico, ativação de células gliais e neuronais, ruptura da barreira hemato-encefálica e infiltração de leucócitos (WOODRUFF et al., 2011). Entre os eventos indutores do AVEi, a dislipidemia e o diabetes são fatores associados ao aparecimento da doença, contribuindo para a patofisiologia e as complicações clínicas relacionadas ao quadro isquêmico (FANN et al., 2013). O DM é um fator facilitador para a indução de AVEi devido a microangiopatia que ocorre pela elevada concentração de glicose sanguínea, a qual se liga a.

(34) 32. proteínas endoteliais formando os produtos finais de glicação avançada (AGEs). Os AGEs induzem a síntese de colágeno tipo II e IV, que promovem uma disfunção microcirculatória envolvendo os capilares e arteríolas cerebrais, dos rins e dos nervos periféricos (VEUGEN et al., 2016). Em relação a hipercolesterolemia, ela está epidemiologicamente ligada ao desenvolvimento de doenças isquêmicas devido a indução da aterosclerose. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica que afeta os vasos sanguíneos incluindo as artérias de grande e médio calibre, podendo sofrer ruptura e induzir uma trombose ou embolia e consequente isquemia. A placa aterosclerótica é caracterizada pela presença de dislipidemia, inflamação e disfunção do complexo antioxidante, contribuindo para o estresse oxidativo e alteração na homeostase circulatória (ROCHA; LIBBY, 2009; SCHERER; PSALTIS, 2016). As dislipidemias são classificadas de acordo com os dados laboratoriais (níveis séricos de colesterol e triglicerídeos) e conforme a etiologia. Na classificação laboratorial, pode-se classificar a dislipidemia como: a) hipercolesterolemia isolada, ou seja, o CT acima de 240 mg/dL e/ou do colesterol LDL para níveis maiores que 160 mg/dL; b) hipertrigliceridemia isolada – aumento dos níveis de TG acima de 200 mg/dL; hiperlipidemia mista – aumento dos níveis de CT associado ao aumento dos níveis de TG, a diminuição isolada do colesterol HDL abaixo de 40 mg/dL, ou, por fim, a associação destes fatores. A classificação etiológica subdivide-se em dislipidemias primárias que tem origem genética e as secundárias, que podem ser causadas por outras doenças ou utilização de medicamentos (XAVIER et al., 2013), A dislipidemia está associada a diversas disfunções endoteliais, sendo um fator determinante para o surgimento da aterosclerose, a qual é a principal causa do infarto agudo do miocárdio, acidente vascular encefálico, trombose, angina e demais doenças isquêmicas (SKILTON et al., 2007; DUARTE et al., 2010), aumentando os índices de morbidade ou mortalidade (LIBBY, 2000). Além disso, os níveis elevados de colesterol e triglicerídeos, por exemplo, podem ser responsáveis pela disfunção endotelial, a qual aumenta a permeabilidade da camada íntima a lipoproteínas plasmáticas favorecendo a retenção das mesmas no espaço subendotelial. Esta retenção induz a oxidação das partículas de LDL, formando o LDL oxidado (LDLox), o qual é nocivo ao endotélio e colabora para a produção de espécies reativas (SKILTON et al., 2007)..

(35) 33. As espécies reativas de nitrogênio e oxigênio são produzidas pelos macrófagos, células endoteliais ou células musculares lisas, os quais são responsáveis pela oxidação do colesterol LDL, formando o LDLox (ALBERTINI et al., 2002; GAUTIER et al., 2009). O LDLox provoca a expressão de moléculas de adesão leucocitária na superfície endotelial, e estas são responsáveis pela atração de monócitos e linfócitos para a parede arterial (LEVITAN et al., 2009). Os monócitos migram para o espaço subendotelial onde se diferenciam em macrófagos, que por sua vez captam o LDLox através de receptores específicos, ativando os linfócitos T e promovendo a secreção de citocinas pró-inflamatórias que causam uma maior ativação de macrófagos, ativação vascular e inflamação, estimulam a proliferação das células musculares lisas e a síntese de colágeno, as quais se agregam as células espumosas, completando a formação da placa ateromatosa (CHAKARIDA et al., 2009; BERG et al., 2009; EMMANUEL et al., 2009). Os linfócitos ativados passam a secretar Interleucina 1 (IL-1) a qual ativará os linfócitos T (CD4), os quais passam a secretar as citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 2 (IL-2) e o interferon gama (IFN-), responsáveis por causarem maior ativação de macrófagos, ativação vascular e inflamação (CHARAKIDA et al., 2009). Adicionalmente, também ocorre produção de proteínas de fase aguda como proteína C reativa (PCR), alfa-1-glicoproteína ácida (AGP) e fibrinogênio (F) (HANSSON, 2005). A IL-1 na aterogênese é responsável por aumentar a expressão de moléculas de adesão e estimular a produção de proteínas inflamatórias de fase aguda pelo fígado. Em associação com o IFN- e o TNF-α, promove o crescimento de fibroblastos e a síntese de colagenases, além de estimular linfócitos T e a proliferação de células musculares lisas (CML) na parede endotelial, reduzindo o calibre vascular (CHARAKIDA et al., 2009). O IFN- é uma citocina pró-aterogênica, pois ativa macrófagos, amadurece linfócitos B e estimula a síntese de anticorpos anti LDL (anti-oxLDL). Também promove a apoptose dos macrófagos, induzindo a formação do núcleo necrótico na parede do vaso na placa de ateroma (LI et al., 2011)..

(36) 34. 2.1.3 Biomarcadores envolvidos no AVEi 2.1.3.1 Inflamação Estudos indicam o envolvimento da cascata inflamatória na patogênese do AVE (TARKOWSKI et al., 1995; CLARK, 1997; VILA et al., 2000; PANDYA et al., 2011). A reação inflamatória acionada após o evento vascular cerebral pode desencadear o influxo de leucócitos polimorfonucleares seguidos pelos monócitos e ativação da microglia. Muitas dessas respostas inflamatórias são mediadas por citocinas (TARKOWSKI et al., 1995; CLARK, 1997; VILA et al., 2000; YE et al., 2012). Ocorre aumento dos níveis séricos e liquóricos de interleucina 1-beta (IL-1β) e 6 (IL-6), assim como, o fator de necrose tumoral (TNF-α) e interferon gama (IFN-) após o evento vascular cerebral (FASSBENDER et al., 1994; TARKOWSKI et al., 1995; LODDICK et al., 1998; STROEMER; ROTHWELL, 1998). Algumas evidências indiretas do envolvimento das citocinas nas lesões cerebrais também foram obtidas a partir de estudos que correlacionaram os níveis plasmáticos e liquóricos de IL-6 com o tamanho da lesão e a recuperação funcional do paciente após o AVE (FASSBENDER et al., 1994; TARKOWSKI et al., 1995; FANN et al., 2013). A IL-1β é conhecida como co-fator da reação inflamatória e proliferação astroglial nas lesões do SNC (YAMASAKI et al., 1995). Embora as origens celulares da IL-1β cerebral permaneçam desconhecidas, a microglia, astrócitos e monócitos periféricos são possíveis fontes dessa citocina no cérebro após uma lesão cerebral. Outros tipos celulares podem produzir IL-1β, como células endoteliais, fibroblastos, miócitos, células de Langerhans e linfócitos e T10 (YAMASAKI et al., 1995). A IL-1β exerce suas ações através de receptores específicos cerebrais, apresentando um antagonista conhecido como antagonista do receptor da IL-1 (IL-1RA). De fato, o tratamento com IL-1RA injetado diretamente no cérebro promove a redução da lesão isquêmica em modelos experimentais, sugerindo a participação da IL-1β no dano cerebral após o AVE (BEAMER et al., 1995). A IL-6 também é uma citocina pró-inflamatória e endócrina, sendo o tecido adiposo o principal responsável pela sua produção, em estados não inflamatórios. No hipotálamo, onde também é secretada, desempenha um papel importante no metabolismo de carboidratos e lipídios (KEIBER, 2016)..

(37) 35. Sua produção está aumentada em quadros de obesidade, sendo maior no tecido adiposo visceral comparado ao tecido adiposo subcutâneo. Ela contribui para o aumento da secreção de VLDL e hipertrigliceridemia. Além disso, a IL-6 promove diminuição da ação da lípase lipoproteica e aumento da captação de lipídeos pelos macrófagos (FONSECA-ALANIZ et al., 2007; SANTOS; TORRENT, 2010). No cérebro as IL-1β e IL-6 podem influenciar a função e síntese de outras citocinas, como por exemplo a IL-8, assim como, a ativação e infiltração de leucócitos e a produção de citocinas anti-inflamatórias, como IL-4 e IL-10 (COHEN; COHEN, 1996). Outros fatores também estão envolvidos no dano cerebral induzido pelo evento vascular, como o processo de apoptose celular, desencadeado após a liberação de citocromo c mitocondrial e enzimas líticas do DNA (ZEMKE et al., 2004). Portanto, a morte neuronal que ocorre como conseqüência do AVE pode estar associada a todos estes eventos. Embora toda esta cascata de eventos possa ser desencadeada, inúmeros mecanismos de proteção são iniciados pelo organismo em resposta aos processos danosos causadas pelo evento vascular. Entre esses mecanismos, podemos citar as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas, assim como, a liberação de citocinas com propriedades anti-inflamatórias (COHEN; COHEN, 1996; NAVARRO; BOVERIS, 2008; PANDYA et al., 2011). Diversas evidências também relacionam o dano cerebral à resposta inflamatória, na qual vários mediadores são liberados ou ativados, como as citocinas, entre elas, as IL-1β e IL-6, assim como, o IFN- e moléculas de adesão, estimulando a infiltração de leucócitos no parênquima encefálico (MORO et al., 2005; SHICHITA et al., 2012; GERTZ et al., 2012). O INF-у é produzido por linfócitos T e células NK quando estimulados por interleucina 12 ou 18. É responsável por ativar macrófagos, estimula a expressão do complexo maior de histocompatibilidade, crescimento, maturação e diferenciação de muitos tipos de células, aumenta a atividade de células NK, regula a resposta inflamatória, potencializa outros interferons e modula a atividade dos linfócitos B (FANN, 2013). A atividade do interferon está profundamente relacionada com o desenvolvimento de várias doenças como diabetes mellitus dependente de insulina e aterosclerose, são produzidos na fase (MONTANO, 2012). O TNF-, uma potente molécula pró-inflamatória, produzida por diversos tipos celulares incluindo os macrófagos, monócitos, linfócitos e fibroblastos (BAUND;.

(38) 36. KARIN, 2001). É um mediador inicial da inflamação, que coordena a resposta da fase aguda e, induz a produção das citocinas, como por exemplo, a IL-1β e IL-6, assim como, a proteína-c reativa (PCR), em uma segunda fase. Isto estimula o receptor para o TNF (TNFR) a agir como um inibidor natural (PEREIRA et al., 2012). Entretanto, não está totalmente esclarecido a participação das citocinas nas alterações cerebrais na fase tardia do AVE. 2.1.3.2 Apoptose A morte celular pode ocorrer por necrose ou apoptose. A necrose é caracterizada morfologicamente por edema citoplasmático e mitocondrial, ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo extracelular, em resposta à injúria severa às células provocando a morte celular. A apoptose é um elemento ativo de morte celular por ser uma morte programada, devido aos seus mecanismos regulatórios complexos e morfológicos, mantendo a homeostase tecidual (ZHANG et al., 2004). A apoptose é um processo ativo dependente de ATP, caracterizado por condensação citoplasmática e nuclear e fragmentação do DNA formando corpos apoptóticos, que serão facilmente eliminados por fagocitose (DEGTEREV, 2003). Este tipo de morte celular pode ser desencadeado pela ativação das caspases ou por interferência com proteínas citosólicas reguladoras de apoptose (PEREIRA, 2009). Em modelos animais, a morte neuronal após isquemia é mediada por ativação direta de caspases (LOVE, 2003). As caspases são proteases que possuem cisteína em seu sítio ativo, clivando proteínas em sítios com resíduos de ácido aspártico, são expressas no cérebro e podem ser ativadas por estímulos intrínsecos e extrínsecos (KUNZ et al., 2010). As caspases são divididas em iniciadoras (1, 2, 5, 8, 9, 10, 11 e 12), que promovem a proteólise, e executoras (3, 6 e 7), as quais ativam outras proteases que degradam diferentes substratos da célula, inclusive o DNA (DEGTEREV et al., 2003; AKPAN; TROY, 2012). A enzima executora mais importante no cérebro é a caspase-3 que é ativada após a isquemia nas regiões adjacentes ao infarto que ativa proteases causando lesão ao DNA e morte celular (KUNZ et al., 2010). Na rota apoptótica dependente das caspases, a via extrínseca é iniciada pela ativação dos receptores de morte celular, resultando na formação do complexo.

(39) 37. sinalizador de morte, que possui múltiplas moléculas adaptadoras. A CASP 8 é ativada, recrutando diretamente as caspases-3 e -7, e a rota apoptótica extrínseca prossegue (LIOU et al., 2003; ZHANG et al., 2004; AKPAN; TROY, 2012). Após a clivagem de uma classe de proteínas anti-apoptóticas, a rota mitocondrial é estimulada, ativando a via intrínseca apoptótica. Consequentemente, essa ativação aumenta a permeabilidade mitocondrial externa, promovendo o extravasamento de determinadas proteínas mitocondriais, incluindo o citocromo c. Na sequência, a caspase 9 é ativada, e por sua vez ativa novamente as caspases executoras 3 e 7, resultando na morte celular (GRAHAM, 2002; LIOU et al., 2003). Dessa forma, as análises quantitativas das CASP 8 e CASP 1 e 3 , podem ser importantes indicativos de lesão ou morte celular após AVEi (ZHANG et al., 2004). 2.1.3.3 Dano ao DNA Estudos experimentais de lesão cerebral após eventos isquêmicos, semelhante áqueles processos que ocorrem nos pacientes após AVE, mostram que a redução afeta o suplemento de oxigênio e modificam o metabolismo energético do cérebro (CUI et al., 2000). Esse desbalanço de elétrons provoca um aumento nas espécies. reativas. nas. células. cerebrais. (COYLE;. PUTTFARCKEN,. 1993;. BECKMAN; AMES, 1997). Este estresse oxidativo pode causar vários tipos de dano ao RNA/DNA, como a fragmentação das fitas e perda de bases nitrogenadas. De fato, a célula sofre mudanças em razão dos processos patológicos relacionados ao aumento das ERs, causando a fragmentação do DNA e levando a morte celular (CUI et al., 2000). Quando o DNA é oxidado pelas ERs, ocorre uma modificação das bases nitrogenadas, que estão associadas às mutações e perda da integridade do DNA (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004). A fragmentação do DNA promove a quebra das fitas duplas e a formação de sítios com perda de bases nitrogenadas, resultando na morte celular. Essa fragmentação é causada por proteases ou por NO sintase aparecendo após isquemia (CUI et al., 2000). Essas lesões podem resultar na inativação e/ou na ativação da transcrição do DNA, replicação de erros e instabilidade genômica, podendo estar associadas a doenças como a carcinogênese e isquemia (VALKO et al., 2006)..

(40) 38. 2.1.3.3 Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo (BDNF) O BDNF é um membro da família das neurotrofinas de fatores de crescimento, que é responsável pela modulação da plasticidade do sistema nervoso central durante a aprendizagem e a recuperação das habilidades motoras (HELM et al., 2015). Os. mecanismos. que. permitem. plasticidade. neuronal. pós-AVE. são. semelhantes às que promovem a reorganização neuronal no cérebro durante a aprendizagem saudável. Como tal, os parâmetros de reabilitação neurológica que otimizam a aprendizagem motora e a melhora na plasticidade neural são de grande interesse para os médicos e pesquisadores no campo da reabilitação no AVE (KLEIN et al., 2011; MURPHY; CORBETT, 2009). O papel do BDNF na plasticidade neuronal é dependente da estimulação e liberação da forma madura do BDNF (mBDNF). A forma madura do BDNF se tornou um importante alvo de pesquisas em plasticidade neural relacionados com o aprendizado, secundário ao seu papel na mediação da indução e manutenção da potenciação de longa duração (LTP) (LU et al., 2007). O transporte do BDNF através da barreira hemato-encefálica (BHE) não ocorre em condições normais. No entanto, BDNF pode passar a BHE em condição patológica, como no AVE. Esta migração de BDNF através da BHE pode ser importante durante a fase pós-isquêmica, onde pode exercer uma ação protetora no local da lesão (LAZZARO, 2007). O BDNF é sintetizado como uma pré-pro neurotrofina que é clivada em próBDNF e ainda processado para se tornar maduro (mBDNF). Pro-BDNF é convertido em mBDNF tornando-se biologicamente ativo por furina e proconvertases dentro de vesículas secretoras antes de serem liberados. Os neurônios também liberam próBDNF, que é convertido pelo sistema de tPA/plasmina ativador de plasminogênio de tecido para mBDNF (CHAO, 2006). A expressão e liberação de BDNF são estimulados pela atividade sináptica excitatória e certos neuropeptídeos e hormônios (KOPPEL et al., 2009). O glutamato liberado pelas sinapses excitatórias liga-se a receptores na membrana sináptica, resultando no influxo de Na. +. e Ca2+ via receptores α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-. isoxazole propionico (AMPA), N-metil-D-aspartato (NMDA) e canais de Ca2+ dependentes de voltagem. O Ca2+ ativa as proteínas quinases dependentes de.

(41) 39. calmodulina (CaMK), proteína quinase C (PKC) e proteína quinase ativada por mitogenio (MAPKs), que, por sua vez, ativa a transcrição de fatores como AMPc, CREB e NF-kB para induzir a transcrição do gene BDNF (MARINI et al., 2007). O BDNF está concentrado em vesículas que são transportadas pelos axônios nos terminais pré-sinápticos e dendritos a partir da qual ele é liberado em resposta à ativação do receptor de glutamato (DEAN et al., 2012). O RNA mensageiro (RNAm) do BDNF também está localizado nos dendritos, no qual a tradução da proteína pode ser estimulada pela atividade sináptica. A produção de BDNF local e sua liberação ativa seu receptor de alta afinidade relacionadas com a tirosina quinase B (TrkB) ou o receptor de neurotrofina com baixa afinidade p75, nos neurônios sinápticos em outras células. TrkB é uma tirosina quinase que após ativação envolve vias de sinalização intracelular como, a fosfolipase C gama (PLC-y), fosfatidilinositol-3-quinase (PI3-K) e MAPK que conduzem à ativação de fatores de transcrição que regulam a expressão de proteínas envolvidas na sobrevivência neuronal, plasticidade, balanço energético celular e biogênese mitocondrial (CHAO, 2006; CHENG, 2012) (Figura 2). O BDNF pode impedir a apoptose neuronal por induzir a expressão de antiapoptótica de Bcl2 membros da família e inibidores de caspase, e através da inibição de proteínas pró-apoptóticas, tais como Bax e Bad. Ao promover a sobrevivência neuronal, o crescimento de neurites e sinaptogênese, BDNF desempenha um papel importante na formação de circuitos neuronais em todo o cérebro, incluindo os que regulam a homeostase de energia (FARGALI et al., 2012) e também está envolvido no controle de vários aspectos dos padrões circadianos de comportamentos e processos neuroendócrinos relacionados com a homeostase energética. O BDNF também melhora a reparação do dano de DNA e regula enzimas antioxidantes em neurônios (CHAO, 2006; YANG, 2013), sugerindo o envolvimento dessa neurotrofina com o estresse oxidativo..

(42) 40. Figura 2 – Mecanismo de produção e liberação do BDNF. O BDNF mRNA é traduzido em proteína proBDNF no retículo endoplasmático. ProBDNF é transportado para o Golgi e processado para a forma madura do BDNF (mBDNF) por proteína extracelular convertase 1 (CP1) dentro das vesículas. Os grânulos de secreção são levados para os locais de liberação nos terminais axonais ou dendríticos. Neurônios secretam tanto proBDNF e mBDNF de uma forma ativo –dependente. O ativador de plasminogênio de tecido (tPA) forma mBDNF por ativação de um plasminogenio, que, em seguida, cliva a molécula precursora. Alternativamente, metaloproteinases extracelulares processam proBDNF para gerar mBDNF. Fonte: Pascotini (2016).. Estudos em animais demonstraram que o BDNF é benéfico para a sobrevivência dos neurônios através da ativação de vias anti-apoptóticas (JANTAS et al., 2009; ZHANG et al., 2011). No processo inflamatório, demonstrou-se in vitro que o BDNF promove a proliferação microglial e a atividade fagocítica aumentando o número de microglias ativadas que segregam BDNF (JIANG et al., 2011; ZHANG et al., 2003). Além disso, após a lesão de neurônios do hipocampo de ratos com β amilóide e subseqüente tratamento com BDNF-rAAV, verificou-se que o BDNF foi responsável pela manutenção das concentrações de cálcio intracelular, em comparação com o grupo sem tratamento (LIU et al., 2007). Os resultados globais deste estudo fornecem evidências sugerindo que o BDNF pode reduzir a apoptose.

(43) 41. dos neurónios através da inibição da sobrecarga de cálcio intracelular, assim como a expressão regulada de proteínas anti-apoptóticas tais como Bcl-2. Além disso, o BDNF tem a capacidade de bloquear a ativação da caspase-3, em ratos com idade de 7 dias, um forte estímulo apoptótico, dentro do cérebro em desenvolvimento, reduzindo a lesão associada à isquemia e reperfusão (HAN et al., 2000). Lasek-Bal et al. (2015) realizaram um estudo prospectivo envolvendo 87 pacientes com idade entre 39-99 anos com primeiro AVEi, a fim de investigar a relação entre a concentração do BDNF e o status funcional. O estudo concluiu que tanto o estado neurológico quanto a concentração de BDNF no 1º dia de AVEi são fatores prognósticos independentes durante a observação de médio prazo. Além disso, os doentes com uma concentração mais baixa de BDNF na fase aguda de AVE tiveram um pior prognóstico em termos de estado funcional quando avaliados no 90º dia. Estes resultados, no seu conjunto, sugerem uma relação intrínseca entre a concentração sérica de BDNF e o prognóstico dos doentes após AVEi. Embora outros estudos recentes indicaram que o BDNF no soro pode não refletir com precisão as concentrações de BDNF no cérebro devido à disfunção endotelial (BEJOT et al., 2011; RODIER et al., 2015). Além disso, os níveis de BDNF são influenciados por uma variedade de fatores, incluindo a contagem de plaquetas, sexo, tabagismo, depressão, idade e polimorfismo Val66Met (BUS et al., 2011; FUJIMURA et al., 2002; GOLDEN et al., 2010; LOMMATZSCH et al., 2005; TRAJKOVSKA et al., 2007; YANG et al., 2011). Como a via de sinalização do BDNF é bidirecional, a aplicação do BDNF como neuroprotetor contra o AVEi em humanos continua a ser elucidada. São necessários estudos para investigar melhor o papel do BDNF na fase de reperfusão e na fase tardia do AVE. 2.1.3.4 Estresse Oxidativo A isquemia promove uma depleção energética de adenosina trifosfato (ATP) desencadeando alterações no potencial de membrana e consequentemente na Na+/K+-ATPase, reduzindo o gradiente iônico das membranas e assim, aumentado o influxo de Na+, Cl- e Ca2+ para dentro das células (MORO et al., 2005; PARAVICINI et al., 2004)..

(44) 42. O processo isquêmico acelera a liberação aumentada de glutamato o qual em excesso. provoca. dano. cerebral,. denominado. excitotoxicidade. (CULMSEE;. KRIEGLSTEIN, 2005), que é definida pelo acúmulo de Ca2+ e Na+ intracelular que provocam morte neuronal durante o AVE (MORO et al., 2005). Durante a isquemia os RLs e outras espécies oxidantes podem destruir organelas e a membrana plasmática, lesionando da barreira hemato-encefálica (BHE) e provocando edema cerebral (TUTTOLOMONDO et al., 2009; CECHETTI et al., 2012). Durante o processo isquêmico e reperfusão tecidual são gerados muitos radicais livres (RLs). Os RLs são definidos como átomos ou grupo de átomos capazes de existir de forma independe e que contém um ou mais elétrons desemparelhados (DEL MAESTRO, 1980; SOUTHORN; POWIS, 1988; FANN et al., 2013). Entretanto, existem compostos igualmente reativos aos RLs que não têm necessariamente um desemparelhamento na camada de valência, classificados desta maneira como EROs e ERNs (DROGE, 2002). Estas espécies reativas buscam estabilidade durante a sua breve existência, reagindo com a matéria circundante, desta maneira causando danos às membranas celulares, proteínas e DNA (DROGE, 2002). Durante o metabolismo celular são produzidas EROs, como por exemplo, o radical superóxido (O2-), peroxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (-OH●). Níveis fisiológicos de espécies reativas (ERs) podem ser eliminados por um sistema antioxidante enzimático e não-enzimático (NAVARRO; BOVERIS, 2008). Entretanto, um aumento na produção de ERs, uma diminuição na eficiência dos sistemas antioxidantes ou ambos podem levar ao estresse oxidativo, que é caracterizado por, uma oxidação de biomoléculas com consequente perda de suas funções biológicas (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004). A mitocôndria é a principal produtora de ERs e RLs, sendo que o primeiro radical formado é o O2, sua produção se dá principalmente no complexo I (NADH desidrogenase) e complexo III (ubiquinona citocromo c oxidase) onde a coenzima FMN e o ubiquinol respectivamente, reduzem o oxigênio univalentemente formando o radical, sendo que 70 – 80% deste são liberados na matriz mitocondrial e 20 – 30% no espaço intermembranas (NAVARRO; BOVERIS, 2007). A partir do O2- outras espécies reativas são formadas, como o peroxido de hidrogênio (H2O2), produzido enzimaticamente pela ação da superóxido dismutase (SOD) e o radical mais reativo o -OH●, que pode ser produzido a partir do H2O2 reagindo com o cobre (Cu+1) ou.

(45) 43. ferro ( Fe+2), na reação de Fenton e ainda a partir do O2-• + H2O2 na reação de Haber – Weiss (LIANG et al., 2000). A produção anormal e excessiva de EROs resulta em peroxidação lipídica, ativação leucocitária e elevada produção de citocinas, fatores que contribuem para o dano tecidual em várias patologias, como por exemplo no AVE (DI LISA et al., 2009; PRADEEP et al., 2012). Além disso, as ERs tem uma vida curta e sua recombinação química é quase imediata (RICE-EVANS; BURDON, 1993). Visto isso, torna-se muito difícil a medição imediata dos mesmos, o que torna bem aceito a medição de seus produtos formados. A determinação da formação de grupos carbonil (>C – O) é um método bastante utilizado para avaliar o dano das ERs às proteínas. Particularmente, os aminoácidos histidina, arginina e lisina são os principais alvos das ERs (PRATICO; DELANTY, 2000). Por sua vez, a peroxidação lipídica (LPO) é um processo fisiológico e continuo que ocorre nas membranas celulares. Além de ser um fator de renovação da membrana este processo é essencial para a síntese de prostaglandinas e leucotrienos. No entanto este processo pode se tornar tóxico quando as defesas antioxidantes são insuficientes ou quando há uma produção intensa de ERs (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1995). A LPO produz aldeídos, gases hidrocarbonados e vários resíduos químicos, como o malondialdeído (MDA), dienos conjugados e 4-hidroxinonenal (PUNCHARD; KELLY, 1996). Desta forma, esta reação pode ser estimada pela medida de seus produtos, e é utilizada para medir indiretamente a produção de RLs e ERs. (PUNCHARD; KELLY, 1996). O tecido cerebral por ser altamente lipídico pode sofrer lipoperoxidação devido a sua alta concentração lipídica e por possuir poucos antioxidantes endógenos sendo, alto consumo de oxigênio, alta concentração de ferro, os quais podem funcionar, como pró-oxidantes em condições adversas (SAEED et al., 2007; CHEHAIBI et al., 2016). A baixa oxidação tecidual também pode provocar oxidação das proteínas de membrana e dano de DNA (CHEHAIBI et al., 2016). A hipóxia tecidual compromete a respiração celular aeróbica diminuindo a fosforilação oxidativa e a geração de ATP (TARDINI; YOSHIDA, 2003). Durante a isquemia também ocorre a produção de radicais superóxidos pela quebra de elétrons do sistema de transporte dentro da mitocôndria ou pela via da ciclooxigenase do metabolismo do ácido araquidônico (KUNZ et al., 2010). Ocorre a ativação de proteases e fosfolipases inespecíficas induzida pelo acúmulo de Ca2+.

(46) 44. intracelular no período de reperfusão, que leva à síntese de mediadores próinflamatórios como o fator ativador plaquetário e os compostos eicosanóides (leucotrienos, tromboxanos e prostaglandinas) (CAMPOS; YOSHIDA, 2004). O óxido nítrico (NO) é outro radical envolvido com a lesão de isquemia e reperfusão. Na reperfusão, o NO reage com o radical superóxido dando origem a um radical altamente reativo e citotóxico, o peroxinitrito (ONOO-) (CAMPOS; YOSHIDA, 2004; KUNZ et al., 2010) que por sua vez, forma diversos outros produtos, entre eles o nitrito e o nitrato, metabólitos do NO endógeno acessíveis para análise quantitativa (ROMITELLI et al., 2007). A mensuração dos produtos finais do NO, NO x, são comumente utilizados para mediar a produção do NO (TATSCH, 2011). Os RLs promovem um ciclo vicioso na mitocôndria, inibindo o transporte de elétrons e despolarização da membrana, levando a produção excessiva de superóxido. Além disso, o aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial leva a tumefação dessa organela e à liberação de moléculas pró-apoptóticas, representadas pelas caspases (CASP) (AKPAN; TROY, 2016). As células humanas apresentam um mecanismo de defesa celular para combater a intensa produção das EROs provenientes de diversas fontes. Esse mecanismo é denominado sistema de defesa antioxidante e atua na prevenção e no reparo físico e químico dos diversos sistemas orgânicos (VALKO et al., 2007). Este sistema é composto principalmente pela ação cooperativa de três principais enzimas antioxidantes: a SOD, o sistema glutationa GSHPx/GSHR e catalase (CAT) além de um sistema de antioxidantes não-enzimaticos (vitaminas A, C, E e D, e glutationa reduzida) (HALLWELL; GUTTERIDGE, 1999). Em relação a localização dessas enzimas antioxidantes, a SOD é encontrada no citosol ou no meio extracelular (Cu/ZnSOD) e na mitocôndria (MnSOD), enquanto o sistema glutationa GSHPx/GSHR e CAT estão presentes no citosol e peroxissomos, respectivamente (BOVERIS; CADENAS, 1997; NELSON et al., 2006; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). A CAT (EC1.11.1.6) é uma enzima tetramérica, formada por quatro subunidades idênticas de 60.000 Da, contendo um único grupo ferroprotoporfirina por unidade, e tem uma massa molecular de aproximadamente 240.000 Da (MATÉS et al., 1999). Encontra-se enclausurada no peroxissoma que é a principal organela responsável pela desintoxicação celular e pela oxidação de ácidos graxos de cadeia longa, fonte inesgotável de peróxidos orgânicos, produtos carbonílicos e oxigênio..