Estresse Oxidativo

A isquemia promove uma depleção energética de adenosina trifosfato (ATP) desencadeando alterações no potencial de membrana e consequentemente na Na+/K+-ATPase, reduzindo o gradiente iônico das membranas e assim, aumentado o influxo de Na+, Cl- e Ca2+ para dentro das células (MORO et al., 2005; PARAVICINI et al., 2004).

O processo isquêmico acelera a liberação aumentada de glutamato o qual em excesso provoca dano cerebral, denominado excitotoxicidade (CULMSEE; KRIEGLSTEIN, 2005), que é definida pelo acúmulo de Ca2+ e Na+ intracelular que provocam morte neuronal durante o AVE (MORO et al., 2005). Durante a isquemia os RLs e outras espécies oxidantes podem destruir organelas e a membrana plasmática, lesionando da barreira hemato-encefálica (BHE) e provocando edema cerebral (TUTTOLOMONDO et al., 2009; CECHETTI et al., 2012).

Durante o processo isquêmico e reperfusão tecidual são gerados muitos radicais livres (RLs). Os RLs são definidos como átomos ou grupo de átomos capazes de existir de forma independe e que contém um ou mais elétrons desemparelhados (DEL MAESTRO, 1980; SOUTHORN; POWIS, 1988; FANN et al., 2013). Entretanto, existem compostos igualmente reativos aos RLs que não têm necessariamente um desemparelhamento na camada de valência, classificados desta maneira como EROs e ERNs (DROGE, 2002). Estas espécies reativas buscam estabilidade durante a sua breve existência, reagindo com a matéria circundante, desta maneira causando danos às membranas celulares, proteínas e DNA (DROGE, 2002). Durante o metabolismo celular são produzidas EROs, como por exemplo, o radical superóxido (O2-), peroxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (-OH●). Níveis fisiológicos de espécies reativas (ERs) podem ser eliminados por um sistema antioxidante enzimático e não-enzimático (NAVARRO; BOVERIS, 2008).

Entretanto, um aumento na produção de ERs, uma diminuição na eficiência dos sistemas antioxidantes ou ambos podem levar ao estresse oxidativo, que é caracterizado por, uma oxidação de biomoléculas com consequente perda de suas funções biológicas (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004). A mitocôndria é a principal produtora de ERs e RLs, sendo que o primeiro radical formado é o O2, sua produção se dá principalmente no complexo I (NADH desidrogenase) e complexo III (ubiquinona citocromo c oxidase) onde a coenzima FMN e o ubiquinol respectivamente, reduzem o oxigênio univalentemente formando o radical, sendo que 70 – 80% deste são liberados na matriz mitocondrial e 20 – 30% no espaço intermembranas (NAVARRO; BOVERIS, 2007). A partir do O2- outras espécies reativas são formadas, como o peroxido de hidrogênio (H2O2), produzido enzimaticamente pela ação da superóxido dismutase (SOD) e o radical mais reativo o -OH●, que pode ser produzido a partir do H2O2 reagindo com o cobre (Cu+1) ou

ferro ( Fe+2), na reação de Fenton e ainda a partir do O2-• + H2O2 na reação de Haber – Weiss (LIANG et al., 2000).

A produção anormal e excessiva de EROs resulta em peroxidação lipídica, ativação leucocitária e elevada produção de citocinas, fatores que contribuem para o dano tecidual em várias patologias, como por exemplo no AVE (DI LISA et al., 2009; PRADEEP et al., 2012).

Além disso, as ERs tem uma vida curta e sua recombinação química é quase imediata (RICE-EVANS; BURDON, 1993). Visto isso, torna-se muito difícil a medição imediata dos mesmos, o que torna bem aceito a medição de seus produtos formados. A determinação da formação de grupos carbonil (>C – O) é um método bastante utilizado para avaliar o dano das ERs às proteínas. Particularmente, os aminoácidos histidina, arginina e lisina são os principais alvos das ERs (PRATICO; DELANTY, 2000). Por sua vez, a peroxidação lipídica (LPO) é um processo fisiológico e continuo que ocorre nas membranas celulares. Além de ser um fator de renovação da membrana este processo é essencial para a síntese de prostaglandinas e leucotrienos. No entanto este processo pode se tornar tóxico quando as defesas antioxidantes são insuficientes ou quando há uma produção intensa de ERs (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1995). A LPO produz aldeídos, gases hidrocarbonados e vários resíduos químicos, como o malondialdeído (MDA), dienos conjugados e 4-hidroxinonenal (PUNCHARD; KELLY, 1996). Desta forma, esta reação pode ser estimada pela medida de seus produtos, e é utilizada para medir indiretamente a produção de RLs e ERs. (PUNCHARD; KELLY, 1996).

O tecido cerebral por ser altamente lipídico pode sofrer lipoperoxidação devido a sua alta concentração lipídica e por possuir poucos antioxidantes endógenos sendo, alto consumo de oxigênio, alta concentração de ferro, os quais podem funcionar, como pró-oxidantes em condições adversas (SAEED et al., 2007; CHEHAIBI et al., 2016). A baixa oxidação tecidual também pode provocar oxidação das proteínas de membrana e dano de DNA (CHEHAIBI et al., 2016).

A hipóxia tecidual compromete a respiração celular aeróbica diminuindo a fosforilação oxidativa e a geração de ATP (TARDINI; YOSHIDA, 2003).

Durante a isquemia também ocorre a produção de radicais superóxidos pela quebra de elétrons do sistema de transporte dentro da mitocôndria ou pela via da ciclooxigenase do metabolismo do ácido araquidônico (KUNZ et al., 2010). Ocorre a ativação de proteases e fosfolipases inespecíficas induzida pelo acúmulo de Ca2+

intracelular no período de reperfusão, que leva à síntese de mediadores pró- inflamatórios como o fator ativador plaquetário e os compostos eicosanóides (leucotrienos, tromboxanos e prostaglandinas) (CAMPOS; YOSHIDA, 2004).

O óxido nítrico (NO) é outro radical envolvido com a lesão de isquemia e reperfusão. Na reperfusão, o NO reage com o radical superóxido dando origem a um radical altamente reativo e citotóxico, o peroxinitrito (ONOO-) (CAMPOS; YOSHIDA, 2004; KUNZ et al., 2010) que por sua vez, forma diversos outros produtos, entre eles o nitrito e o nitrato, metabólitos do NO endógeno acessíveis para análise quantitativa (ROMITELLI et al., 2007). A mensuração dos produtos finais do NO, NOx, são comumente utilizados para mediar a produção do NO (TATSCH, 2011).

Os RLs promovem um ciclo vicioso na mitocôndria, inibindo o transporte de elétrons e despolarização da membrana, levando a produção excessiva de superóxido. Além disso, o aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial leva a tumefação dessa organela e à liberação de moléculas pró-apoptóticas, representadas pelas caspases (CASP) (AKPAN; TROY, 2016).

As células humanas apresentam um mecanismo de defesa celular para combater a intensa produção das EROs provenientes de diversas fontes. Esse mecanismo é denominado sistema de defesa antioxidante e atua na prevenção e no reparo físico e químico dos diversos sistemas orgânicos (VALKO et al., 2007). Este sistema é composto principalmente pela ação cooperativa de três principais enzimas antioxidantes: a SOD, o sistema glutationa GSHPx/GSHR e catalase (CAT) além de um sistema de antioxidantes não-enzimaticos (vitaminas A, C, E e D, e glutationa reduzida) (HALLWELL; GUTTERIDGE, 1999).

Em relação a localização dessas enzimas antioxidantes, a SOD é encontrada no citosol ou no meio extracelular (Cu/ZnSOD) e na mitocôndria (MnSOD), enquanto o sistema glutationa GSHPx/GSHR e CAT estão presentes no citosol e peroxissomos, respectivamente (BOVERIS; CADENAS, 1997; NELSON et al., 2006; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).

A CAT (EC1.11.1.6) é uma enzima tetramérica, formada por quatro subunidades idênticas de 60.000 Da, contendo um único grupo ferroprotoporfirina por unidade, e tem uma massa molecular de aproximadamente 240.000 Da (MATÉS et al., 1999). Encontra-se enclausurada no peroxissoma que é a principal organela responsável pela desintoxicação celular e pela oxidação de ácidos graxos de cadeia longa, fonte inesgotável de peróxidos orgânicos, produtos carbonílicos e oxigênio.

Participa da conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, sendo que os dois caminhos mais utilizados para estudo de sua atividade referem-se à medida do decaimento na concentração de H2O2 e da geração do oxigênio (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).

A SOD (EC1.15.1.1) é uma metaloenzima que desempenha importante papel, já que catalisa a dismutação do radical superóxido em peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular. O H2O2, por sua vez, é degradado pela CAT ou GSHPx, resultando em água e O2. Existem três classes de SOD, dependendo de sua localização e do metal componente: SOD1, SOD2 e SOD3. A SOD1 é uma enzima citosólica dependente de cobre e zinco (CuZnSOD), é encontrada no citoplasma, compartimentos nucleares e lisossomos de células de mamíferos (ZELKO; MARIANI, 2002).

A SOD2 é uma enzima mitocondrial dependente de manganês (MnSOD) é encontrada somente em mitocôndrias de células aeróbicas (SEIZI, 2003; GAŁECKA et al., 2008). Vários estudos têm demonstrado a relevância da MnSOD como agente protetor da doença cardiovascular. A atividade da MnSOD é diretamente induzida pela presença de colesterol LDL oxidado (ox-LDL), EROs e fumo, o qual contém várias substâncias oxidantes em sua composição (KINSCHERF et al., 1997; MARAGON et al., 1997). Além disso, existem evidências indicando que a superexpressão da MnSOD inibe, in vitro, a oxidação da LDL pelas células endoteliais humanas (FANG et al., 1998). Yamagishi et al. (2001) realizaram estudos com compostos miméticos da MnSOD e demonstram que esta enzima impede a ativação e agregação plaquetária, que é também estimulada pela hiperglicemia e hipercolesterolemia, fortes indutores do AVE.

A SOD3 é uma enzima extracelular dependente de cobre e zinco: é a mais recente descoberta dessa família de enzimas, possui um peso molecular de 135.000 Da e uma das suas características é a sua alta afinidade pela heparina. Além disso, SOD3 foi primeiramente detectada em plasma humano, linfa, ascites e fluido cerebroespinhal e o padrão de expressão dessa enzima é altamente restrito a células e tecidos específicos, em que a sua atividade pode exceder a da SOD1 e MnSOD (ZELKO; MARIANI, 2002).

A lesão do DNA mitocondrial causada pelo estresse oxidativo merece destaque pelo fato da mitocôndria ser a principal fonte de EROs. Por essa razão, o DNA está exposto a altos níveis EROs, promovendo mutações nos genes das próprias enzimas antioxidantes. Em resposta à hipercolesterolemia, macrófagos,

linfócitos e células musculares lisas liberam citocinas à circulação sistêmica, induzindo a ativação da cascata inflamatória que promove dano oxidativo intracelular e mutação gênica, especialmente da MnSOD (FORTUNATO; DI TARANTO, 2007; DEDOUSSIS et al., 2008).

A isquemia associada ao estresse oxidativo induz um processo inflamatório o qual potencializa a lesão cerebral (FANN et al., 2013) (Figura 3).

Figura 3 – Fisiopatologia do AVE

A dislipidemia é um dos principais fatores que podem levar ao AVE. Após o AVE ocorre uma hipoperfusão e excitotoxicidade levando há um aumento do estresse oxidativo, inflamação, apoptose e dano do DNA. O BDNF é responsável pela modulação da plasticidade e pode exercer uma ação protetora no local da lesão aguda do SNC.

Fonte: Pascotini (2016).