SeminárioIII.II-Guião

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A Unidade Cardiovascular (CVU) como elemento dinâmico na Doença e Regeneração

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Introdução

- Realidades Cardiológicas Europeia e Portuguesa

Grande prevalência de doenças do sistema circulatório em Portugal e na Europa, onde os valores são mais acentuados; Destacam-se as que levam à destruição ou degeneração do tecido cardíaco por perda de cardiomiócitos (doença isquémica cardíaca e hipertensão).

- Meios de Tratamento e Regeneração Cardíaca

A terapêutica prescrita para as doenças cardíacas referidas está bastante restringida a nível farmacológico, fazendo do transplante cardíaco o único recurso que simultaneamente impede a morte do doente e apresenta um bom prognóstico. Contudo, a pouca disponibilidade de corações viáveis para transplante e a elevada procura dos mesmos colocam em causa a viabilidade deste método de tratamento.

Por outro lado, tem vindo a desenvolver-se a hipótese de regeneração cardíaca como alternativa. Neste sentido, estudos recentes com incidência nos mecanismos morfogénicos e histogénicos cardíacos têm apoiado a possibilidade de existência de uma Unidade Cardiovascular como uma entidade histogénica mínima funcional, afastando-se do paradigma do cardiomiócito como a célula principal do tecido cardíaco.

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- Definição de CVU

Por unidade cardiovascular entende-se o conjunto de cardiomiócitos, capilares e fibroblastos adjacentes que, cooperando mutuamente, conseguem modelar os processos de desenvolvimento, diferenciação e proliferação entre si, através de vias de sinalização celular próprias. O conceito de unidade cardiovascular provém dos resultados publicados que denunciam o envolvimento de células intersticiais e da microvasculatura no controlo celular dos cardiomiócitos, quer em condições fisiológicas, quer patológicas.

- Aplicabilidade das CVUs no Tratamento da Doença

Para integrar o conceito de CVUs na actividade clínica e daí obter bons resultados, é necessário compreender os vários processos histogénicos que levam à sua formação como uma unidade funcional e as interacções moleculares que se dão entre os diferentes tipos celulares que a compõem. Assim, espera-se que a informação teórica disponível facilite o manuseamento da unidade cardiovascular e a torne uma realidade terapêutica acessível aos pacientes.

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Histogénese Pré-Natal

(determinação celular e formação linear do tubo; enrolamento e torção; formação e expansão progressiva das câmaras cardíacas; formação das almofadas endocárdicas, geração valvular e separação das câmaras)

Na fase do tubo linear, o coração é formado por um endocárdio interior e um miocárdio exterior, dividindo-se este último em duas camadas, da base do coração para o vértice: uma interna, a mais esponjosa e uma externa, compacta, que se torna progressivamente mais espessa através da proliferação e remodelação celular.

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Células pré-epicárdicas, derivantes do mesotélio celómico, migram para a superfície do coração e sofrem uma transição epitélio-mesenquimal autónoma, formando células derivadas do epicárdio (EPDCs). Parte das células diferencia-se em células endoteliais, músculo liso e células adventícias, constituindo capilares e pequenas arteríolas e vénulas.

Concomitantemente, há uma enorme proliferação de fibroblastos, alguns deles originários de EPDCs, os quais sintetizam uma matriz extracelular específica (ECM) e factores de crescimento.

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- Formação e estruturação pré-fetal de CVUs

A co-existência de vários tipos celulares leva a uma reorganização da arquitectura celular e tecidual que culmina com a formação das CVUs:

2 - Os cardiomiócitos perdem a sua forma arredondada, alongando-se devido à organização das proteínas sarcoméricas;

- O alinhamento endotelial e a maturação capilar são conseguidos pela deposição de fibronectina, laminina e colagénio IV, enquanto que a deposição de colagénio I e III contribui para a maturação da camada adventícia das arteríolas e vénulas;

- Os pericitos e as células endoteliais associam-se e facilitam o alinhamento dos cardiomiócitos e a maturação da estrutura miocárdica;

Por fim, o último factor que leva à estruturação das CVUs por movimentação celular directa e/ou vias de sinalização advém do estabelecimento de um fluxo cardíaco contínuo e das forças biomecânicas que passam a ser exercidas sobre as células cardíacas.

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Histogénese pós-natal do coração e formação da CVU

O crescimento cardíaco pós-natal e os processos de formação da CVU que se dão neste período envolvem o aumento do tamanho dos cardiomiócitos e a polarização e organização da respectiva rede vascular; estes são influenciados por alterações da circulação à nascença, que englobam a modificação dos valores de pressão arterial, fluxo sanguíneo e subsequente geração de novas forças biomecânicas.

- Reorganização das Ligações Intercelulares (Crescimento e Polarização Celular)

As proteínas das junções de aderência, desmossomas e junções comunicantes (gap junctions) alteram a sua disposição colocando-se nos 2 pólos de cada um dos cardiomiócitos. Estes agregam-se diferencialmente em camadas: os cardiomiócitos que formam as camadas subepicardial e subendocardial organizam-se em hélice; aqueles que formam a parte média da parede ventricular alinham-se circularmente.

- Deposição da ECM

Ao mesmo tempo, os fibroblastos iniciam a segregação de ECM, cujas proteínas constituintes favorecem o recrutamento, diferenciação e organização celular: produzem-se inicialmente fibronectinas; seguidamente lamininas, as quais se concentram nas futuras regiões costaméricas, permitindo a contracção unidireccional das células pela transição progressiva de contactos célula-célula distais para associações célula-matriz; e por fim colagénio I, III e IV, sendo este conjuntamente com a formação do tubo capilar. Os cardiomiócitos ficam assim rodeados por tecido conjuntivo, o qual inclui a matriz extracelular, responsável pela regulação da miofibrilogénese, elongação e polarização dos cardiomiócitos e da formação e morfogénese dos capilares, e por feixes de colagénio, os quais providenciam a estrutura primária para a formação dos capilares sanguíneos. Paralelamente, forma-se uma camada de tecido conjuntivo perimisial, a qual circunda grupos de 2 a 5 camadas de cardiomiócitos. O aspecto final traduz-se no alinhamento paralelo quer dos cardiomiócitos, quer dos capilares.

- Formação de Capilares Sanguíneos

A formação de capilares sanguíneos nas estruturas ocorre a partir das células residentes derivadas do epicárdio ao se diferenciarem em células endoteliais. Simultaneamente, participam células progenitoras endoteliais derivadas da medula óssea, as quais se pensa serem as responsáveis pela formação de novos capilares (neoangiogénese) em corações já marcados por certas patologias.

- Evolução da CVU para além do Período Pós-Natal

A formação da CVU está essencialmente restringida às 2 primeiras semanas pós-natais, durante as quais se estabelece a proporção adequada de cardiomiócitos, capilares e fibroblastos que participam na constituição de cada CVU; após este marco temporal, a CVU sofre poucas alterações ao longo do desenvolvimento do indivíduo, caso este não exiba qualquer doença cardíaca.

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Deterioração da Função Cardíaca e Remodelação da CVU - Envelhecimento

O envelhecimento é um factor de risco para as doenças cardiovasculares, aumentando o desenvolvimento de disfunção cardíaca em resposta a lesões.

- Alterações nos Cardiomiócitos

Durante o envelhecimento, as células que fazem parte da CVU e ECM sofrem profundas alterações degenerativas - os cardiomiócitos diminuem acentuadamente devido a uma acumulação excessiva de produtos

3 resultantes de stress oxidativo, e também a um exagero da activação dos seus processos de autofagia. Os cardiomiócitos senescentes são frequentemente multinucleados e poliplóides, expressando inibidores do ciclo celular como p53 e p16INK4a e apresentando telómeros mais curtos.

A morte dos cardiomiócitos é compensada pela hipertrofia das células contrácteis sobreviventes, mas estudos recentes em humanos também têm demonstrado uma significativa renovação celular na homeostase normal do coração. É possível que novos cardiomiócitos derivem de células progenitoras residentes que se proliferam e diferenciam nestes.

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- Alterações no Tecido Conjuntivo Envolvente

Relativamente às células intersticiais do coração, a rede de capilares permanece relativamente constante durante a vida adulta, enquanto os fibroblastos cardíacos apresentam uma proliferação e potencial de migração diminuídos e modificam a sua produção e deposição de proteínas da ECM. No coração envelhecido, o teor de colagénio I aumenta, assim como a rigidez da sua rede. Proteínas responsáveis pela renovação da ECM também sofrem modificações com a idade, dando-se um aumento do número de isoformas de metaloproteinases (MMPs) e uma diminuição dos níveis de inibidores teciduais das MMPs (TIMPs).

O envelhecimento não influencia substancialmente a composição da CVU, mas afecta a sua função.

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Hipertrofia

- Indicadores e causas de Hipertrofia

Muitos estímulos patológicos resultam em hipertrofia dos cardiomiócitos, a qual se traduz por uma maior síntese proteica, aposição de novos sarcómeros e reindução de um programa genético fetal que acaba por enfraquecer o desempenho cardíaco. Apesar de o crescimento cardíaco ser inicialmente compensatório, actuando como protecção contra agentes externos desgastantes (stressantes), quando estes chegam ao seu máximo de acção, podem originar descompensação e falha cardíaca. Desta forma, ocorre um desequilíbrio da CVU.

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- Tipos de Hipertrofia

A hipertrofia compensatória é fisiológica, verificando-se um aumento do tamanho dos cardiomiócitos, do número de capilares e uma fraca ou nula fibrogénese intersticial. Por sua vez, a hipertrofia descompensatória é patológica, caracterizada pela fibrogénese acentuada provocada pelo abundante número de fibroblastos e de miofibroblastos, assinalando-se também uma diminuição do número de capilares; tal hipertrofia pode levar à perda de cardiomiócitos e à dilatação cardíaca.

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- Alterações no Tecido Conjuntivo

Durante o processo de hipertrofia dá-se simultaneamente um aumento da quantidade de tecido conjuntivo e uma diminuição da angiogénese. Estes dois factores irão levar a uma desorganização progressiva da CVU e a uma menor elasticidade da parede ventricular.

A hipertrofização do tecido cardíaco leva a um aumento do número de miofibroblastos resultantes da conversão de fibroblastos pré-existentes (estímulos como os induzidos por endotelina I, angiotensina II e TGF-β1). Ora, nestas condições, estas novas células iniciam a produção de ECM diferente, modificando as propriedades bioquímicas das enzimas constituintes, o que levará ultimamente a uma exacerbação do processo de fibrose, à semelhança de um mecanismo de feedback positivo.

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Vias de Sinalização na dinâmica e remodelação da CVU

As células do CVU interagem entre si através de importantes vias de sinalização, sendo as mais importantes as de natureza parácrina.

Vão existir então interacções do tipo cardiomiócito-fibroblasto, cardiomiócito-cél. Endotelial e fibroblasto-cél.endotelial.

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Interacções Cardiomiócito-Fibroblasto

4 Numa situação de hipertrofia cardíaca em que ocorre disfunção e são perdidos cardiomiócitos, os fibroblastos acumulam-se para compensarem a perda de massa muscular. Isto possivelmente deve-se à desorganização estrutural gerada nos cardiomiócitos e que, alterando o contacto entre células, leva à estimulação da conversão dos fibroblastos em miofibroblastos e fibrose.

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Outro processo de interacção celular ocorre quando se verifica uma distensão mecânica dos cardiomiócitos e hipertrofia dos mesmos, factores que induzem a libertação de angiotensina II e, por sua vez, de FGF-2 pelos cardiomiócitos, provocando a proliferação de fibroblastos (imagem).

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É ainda atribuído outro processo à fibrose do tecido cardíaco, centrado na hioerexpressão quimérica do gene Gs-alpha, codificador de uma proteína reguladora ligante do GTP.

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- Influência dos fibroblastos sobre os cardiomiócitos

Apesar de menos investigado, surge a hipótese de os fibroblastos conseguirem modificar o perfil de diferenciação e propriedades funcionais de cardiomiócitos em cultura.

As vias sinalizadoras iniciadas no fibroblasto neo-natal, de natureza parácrina, conseguem alterar o padrão electrofisiológico do cardiomiócito.

Os fibroblastos adultos expressam o factor de transcrição GATA4, que actua na diferenciação e reactivação do ciclo celular de cardiomiócitos em cultura.

Já os fibroblastos embrionários participam através da secreção de fibronectina e colagénio, os quais promovem a proliferação dos cardiomiócitos mediada pela integrina beta1.

Por sua vez, ao nível pós-natal, o fibroblasto liberta factores hipertróficos promovendo um aumento do tamanho dos cardiomiócitos sem que haja proliferação dos mesmos.

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Foi já demonstrado o papel dos fibroblastos em situações de crescimento cardiomiocitário patológico, nas quais o miRNA-21 expresso pelos fibroblastos controla a sobrevivência e proliferação dos fibroblastos; porém, a sua expressão exagerada leva à indução da fibrose e hipertrofia cardíaca mediada por essas células (fibroblastos).

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Interacções Cardiomiócito-Célula Endotelial

As células endoteliais são responsáveis pela supressão das necessidades metabólicas dos cardiomiócitos (trofismo), mas desenvolvem outras funções, como o controlo da proliferação e crescimento do cardiomiócito, ou ainda a monitorização do stress aplicado pelas forças biomecânicas geradas pelos fluidos internos. Esta última interacção é mediada por sinalizadores como o NO, a neuroregulina (controla regulação ou dilatação muscular) e a endotelina 1 (que, apresentando receptores em ambas as células, endoteliais e cardiomiócitos, modula o tónus vascular e a contractilidade cardíaca). Outras formas de protecção do cardiomiócito que não contra forças físicas envolvem o controlo da apoptose desencadeada por radicais livres (mediada pela associação neuroregulina 1/erb B4). Por fim, mesmo o processo de angiogénese influencia o cardiomiócito ao controlar o crescimento da mesma por inibição ou estimulação do hipertrofismo celular.

A célula endotelial estabelece uma relação estreita com a CVU ao mantê-la num estado equilibrado, controlando o crescimento de vasos sanguíneos subepicárdicos e intramiocárdicos, protegendo igualmente o coração contra a isquémia. Estas funções são mediadas por moléculas como a FGF2, Hedgehogs e a Angiopoietina 2.

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- Influência do cardiomiócito sobre a célula endotelial

O papel do cardiomiócito, inversamente, baseia-se na indução da vascularização, a qual ocorre nos casos de hipertrofia compensatória, através do aumento de GATA4 e consequente aumento dos níveis de VEFG (que aumentam a angiogénese). Porém, quando a hipertrofia é de tal forma acentuada, a célula nunca chega a produzir os sinalizadores químicos que possam desencadear o processo angiogénico.

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Interacções Fibroblasto-Célula Endotelial

Embora ainda não se conheça a totalidade das vias que relacionam os 2 tipos celulares, já se encontram descritas algumas.

- Influência da célula endotelial sobre o fibroblasto

Sabe-se que células endoteliais estimulam a proliferação e a síntese de colagénio dos fibroblastos cardíacos através de Endotelina-1 (ET-1), por proteína cinase C (PKC) e proteína cinase activada por mitogénio (MAPK) e, da mesma forma, aumentam igualmente a taxa de degradação de colagénio pelos fibroblastos.

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- Influência do Fibroblasto sobre a célula endotelial

Considera-se que a influência do fibroblasto sobre a célula endotelial é feita a partir da IL-6, produzida maioritariamente por esta célula (fibroblasto). A proteína regula os níveis de VEGF libertados por fibroblastos através da via STAT3, a qual participa também no controlo da vasculogénese por VEGFs. A falta de IL-6 nos cardiomiócitos e fibroblastos está efectivamente associada a disfunção ventricular, a uma diminuição do número de células contrácteis e a uma reduzida densidade capilar.

As várias interacções dentro do CVU ainda não são muito conhecidas, no entanto, pode concluir-se que os capilares e as células intersticiais têm um papel importante no controlo da diferenciação e contractilidade dos cardiomiócitos. Alterações nos CVU são evidentes na hipertrofia patológica, onde os cardiomiócitos não activam a regeneração, mas levam á proliferação de CE e FC.

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Regeneração Cardíaca, Reconstrução da CVU e Implicações Terapêuticas

Admitindo o pressuposto de unidade cardiovascular, a regeneração cardiovascular traduz-se pela construção de novas unidades cardiovasculares e a sua integração no tecido cardíaco pré-existente.

- Estratégias Celulares e Abordagens à Formação de CVUs

Para que seja possível criar novas CVUs, delinearam-se estratégias baseadas na terapia celular mediada celularmente (transplantação de células embrionárias, pós-natais ou adultas multi ou unipotentes que tenham potencial de diferenciação cardíaco; mobilização de células progenitoras cardiovasculares circulantes; activação de células progenitoras ou estaminais residentes multipotentes; estímulo de cardiomiócitos sobreviventes para reiniciarem o ciclo celular) ou por factores de crescimento.

Experiências baseadas na transplantação de células extracardíacas em corações pós-isquémicos demonstraram alguma recuperação funcional, embora através de neoangiogénese e não de cardiogénese de novo. - Células Cardiogénicas Residentes e sua utilidade para as CVUs

Poderá também recorrer-se a populações de células cardiogénicas residentes como fonte celular para a regeneração do miocárdio danificado. Porém, a sua forma de actuação e função neste órgão não são bem compreendidas, uma vez que a taxa de regeneração não é significante para o órgão lesado. De qualquer modo, a maioria das células cardiogénicas é pluripotente e consegue gerar células cardíacas, vasculares e ainda fibroblastos.

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- Identificação do Substrato Celular

Várias celulas passíveis de serem consideradas células estaminais têm sido identificadas no coração, tanto no seu estado embrionário como no estado adulto. Pensa-se que estas possam ser distintas das que compõem o restante estroma do órgão, não estando, por isso, com elas relacionadas.

No coração embrionário do rato verificou-se a existência de uma população celular derivada da mesoderme, identificada pela expressão do factor de transcripção Islet-1 (Isl1) do domínio LIM. Foi já provado que este tipo celular consegue diferenciar-e em células endoteliais, musculares lisas, ventriculares e auriculares e ainda do sistema condutor.

Já no coração adulto do roedor identificaram-se células Lin-/c-kit+, células Sca+ e células que expressam transportador cassette ligante ao ATP. Estes três tipos celulares são clonogénicos, com renovação própria e multipotentes, conseguindo diferenciar-se em cardiomiócitos, células musculares lisas e células endoteliais.

6 Localizaram-se ainda células mesoangioblastos (com propriedades pericíticas), células progenitoras cardíacas e cardioesferas, estas últimas residentes no coração humano.

No entanto, a localização destas possíveis células estaminais não viabiliza a sua capacidade de regeneração de tecidos lesados. Investigadores questionam-se mesmo acerca de como será conseguida a sua activação após lesão e se contribuirão para a cardiogénese quando colocadas num coração patológico.

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- Requisitos e Obstáculos na Elaboração de CVUs

Uma das condições necessárias à criação de CVUs e sua aplicação é a da proporção celular ideal. Tal requisito deverá ser monitorizado de forma precisa, por métodos que deverão ser desenvolvidos para se adequarem ao propósito que servem: mapear e garantir o desenvolvimento equilibrado e quantidade adequada de linhagens celulares correctas (ex. moléculas fluorescentes como as utilizadas nos ratos, passadas para tecnologia 3D).

É igualmente necessário entender ao certo que mecanismos de regulação são exercidos pelos fibroblastos sobre as outras células cardíacas (endoteliais e cardiomiócitos), para dessa forma controlar eficientemente a resposta fibrogénica.

- Processos de Regeneração Cardíaca Noutros Animais (para slides 27 e 28)

Ideias para inovação na regeneração cardíaca e novas formas de abordagem e contorno dos obstáculos poderiam ser baseadas nos mecanismos de outras espécies nas quais este processo ocorre normalmente, como por exemplo o peixe zebra e outros anfíbios (o problema coloca-se no facto de, nesses animais, a base cardíaca não ser reconhecida como a CVU, o que condena a pesquisa feita).

- Como garantir o Sucesso das CVUs no Tecido Lesado?

Finalmente, basta encontrar uma forma de transplantar as novas unidades cardiovasculares para o coração marcado por patologia e, mesmo assim, garantir o sucesso da experiência, tendo em conta o ambiente desfavorável e totalmente desprovido de indícios celulares ou moleculares que informem acerca do estado de regeneração ou fibrose.

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Conclusão

Concordância da Teoria:

Para que a regeneração cardíaca possa ser viável, é necessário compreender a fundo o conceito de unidade cardiovascular, bem como a histogénese cardíaca normal e anormal e as várias vias de sinalização que existem entre todos os tipos celulares envolvidos para que assim se compreendam os vários passos que estão escondidos entre todas as etapas.

Contornos dos Problemas Práticos:

A praticabilidade deste paradigma como base da regeneração cardíaca passa irremediavelmente pelo contorno de três problemas:

- Identificação do Substrato Celular:

A identificação de células progenitoras e estaminais capazes de reconstituir os tipos celulares envolvidos;

- Compreensão das Vias Sinalizadoras:

A compreensão das vias sinalizadoras existentes entre todos os tipos celulares da CVU; - Identificação e Compreensão da Influência do Meio:

A identificação de pistas/condições internas e externas que permitam a expansão, diferenciação e integração dos progenitores cardíacos no tecido cardíaco pré-existente num sistema 3D.

Recurso a Outras Áreas da Ciência que possibilitem a Inovação:

Outras estratégias a serem consideradas partem da Bioengenharia e da criação de uma ECM artificial compatível com as células estaminais embrionárias que leve à regeneração de porções da musculatura ventricular, sistema condutor e vasculatura coronária. Aí, a problemática estender-se-ia ainda à inclusão do produto concebido no órgão pré-existente.