Caracterização de uma amostra de indivíduos com deficiência intelectual de origem indeterminada : aspectos clínicos, citogenéticos e moleculares

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CAROLINA RODRIGUES LINCOLN DE CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO DE UMA AMOSTRA DE INDIVÍDUOS COM DEFICIÊNCIA INTELECTUAL DE ORIGEM INDETERMINADA: ASPECTOS CLÍNICOS,

CITOGENÉTICOS E MOLECULARES.

CAMPINAS 2017

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CARACTERIZAÇÃO DE UMA AMOSTRA DE INDIVÍDUOS COM DEFICIÊNCIA INTELECTUAL DE ORIGEM INDETERMINADA: ASPECTOS CLÍNICOS,

CITOGENÉTICOS E MOLECULARES.

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, Área de Concentração Genética Médica.

ORIENTADORA: PROF.ª DRª ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA. COORIENTADORA: PROF.ª DRª MARICILDA PALANDI MELLO.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINA RODRIGUES LINCOLN DE CARVALHO, ORIENTADA PELA PROF.ª DRª ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA.

CAMPINAS 2017

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ORIENTADOR: ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA COORIENTADOR: MARICILDA PALANDI DE MELLO

MEMBROS:

1. PROF.ª DRª. ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA

2. PROF.ª DRª. ANA BEATRIZ ALVAREZ PEREZ

3. PROF.ª DRª. ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA

4. PROF.ª DRª. CARMEN SÍLVIA BERTUZZO

5. PROF.ª DRª. MARIA ISABEL DE SOUZA ARANHA MELARAGNO Souza

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

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Dedico este trabalho ao meu filho Pietro, força que me move para frente e me faz prosperar. Razão pela qual luto diariamente em busca de um mundo melhor.

Ao meu marido Pedro, amor de vidas, minha fortaleza, e quem sensivelmente me escolheu como companheira nessa caminhada rumo ao amadurecimento espiritual.

Aos meus pais, Márcia e Marcel e meu irmão Lucas, Vocês são meu porto seguro, minha rede de apoio e meus exemplos de vida. Não poderia ter

feito melhor escolha. Aos meus filhos de pena Luna, Tchuco, Dino e Branquinha (in memoriam) e meus irmãozinhos de pena, Juvenal e Júnior. Com o carinho gratuito e sincero que vocês têm por mim, acredito em um mundo melhor.

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Do curso de Aprimoramento Profissional ao Doutorado foram mais de 10 anos de Unicamp. Durante todo esse tempo tive a oportunidade de viver na prática o “mundo da genética”, passar pelas mais diversas experiências, conhecer pessoas que me fariam refletir sobre meu papel nesse mundo, evoluir pessoal e profissionalmente. Tornei-me assessora científica na técnica que desenvolvi no mestrado, biologista, professora universitária...

Casei, tive um filho e agora, de certa maneira, outro.

Enfim, foram tantos momentos bons e ruins também (afinal, eles também nos movem pra frente, não é mesmo?), que reafirmo - agora com mais convicção – aquilo que havia dito nos agradecimentos da dissertação: de que sozinho não fazemos nada. Se não fosse a colaboração de várias pessoas – desde a faxineira e o segurança do departamento (cada qual na sua função); pacientes e suas famílias nos confiando a pesquisa; orientadores me guiando profissionalmente; amigos e família ajudando no que fosse necessário e Deus me conduzindo sempre, eu não teria chegado onde cheguei. Por isso, todas as linhas do mundo não serão suficientes para expressar minha gratidão a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a construção e realização deste meu sonho, agora concretizado.

Primeiramente agradeço a Deus por guiar-me sempre pelos melhores caminhos, com saúde, sabedoria, paciência e força para enfrentar os desafios diários.

Aos meus pais Márcia e Marcel, irmão Lucas, meu marido Pedro e meu filho Pietro por tudo que fizeram e fazem por mim. Pela base sólida que tenho como família. Juntos somos um só, por isso esta vitória compartilho com vocês. Amo-os incondicionalmente.

Minhas avós Marina e Odete por serem exemplos em minha vida.

Meus padrinhos Neide e Mauri, tios, primos, sogros, cunhados e minha sobrinha Laís por me apoiarem e torcerem pelo meu sucesso.

À minha orientadora Profa. Dra. Antonia Paula Marques de Faria pela oportunidade de crescimento profissional, pessoal e pela sua orientação, amizade e pela confiança em mim para a condução deste trabalho.

À minha coorientadora Profa. Dra. Maricilda Palandi de Mello pela orientação, amizade, ajuda técnica e por ter me acolhido no CBMEG.

À Profa. Dra. Iscia Lopes Cendes, pelo apoio científico.

Ao Prof. Dr. Fábio Rossi, por sua amizade e auxílio nos testes de microarray.

Ao Dr. Fernando Marson e Henrique Lattanzi, pela amizade e auxílio na análise estatística.

Às Dras. Denise Cavalcanti e Carolina Moreno pelo encaminhamento dos e colaboração com os pacientes do CAISM.

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Melaragno pela contribuição na elaboração da minha tese de doutorado.

Aos pacientes e familiares que participaram deste estudo.

Às agências financiadoras CNPq, FAPESP e FAEPEX pelos auxílios concedidos.

À Universidade Santa Cecília (UNISANTA), em especial os Dres. Lúcia Teixeira, Sílvia Teixeira e Marcelo Teixeira, pela concessão da ajuda de custo. Agradeço também ao diretor do curso Prof. Roberto Patella e coordenadores Camilo Seabra e Jorge Santos também por todo o auxílio necessário para a realização deste estudo.

Às equipes de residentes da Genética Clínica, em especial à Elaine Lustosa, Joana Prota e Mireille Gomes; minha gratidão ainda maior à Joana Prota também pelo auxílio com o microarray e exoma.

À equipe de enfermeiras, por auxiliarem na consulta e coleta dos pacientes.

Às secretárias do Departamento de Genética Médica; do CBMEG e de pós-graduação - em especial à Márcia “Marcinha” - pela amizade e presteza em me auxiliar.

Às responsáveis pela limpeza, sem as quais não seria possível trabalhar no laboratório.

A todos os funcionários do CBMEG e DGM – FCM/UNICAMP.

Aos colegas do Departamento de Genética Médica e do CBMEG pela amizade construída, apoio e auxílio em todos esses anos.

A todos os professores que contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional.

E não menos importante...

Minhas amigas Célia Patriani e meninas do grupo “Sendo Mães” e meu amigo Daniel Siquieroli pela amizade, apoio e incentivo.

Minha amiga Laisa di Salvio pelo seu exemplo de força, coragem e determinação para conseguir seus objetivos. Te agradeço pelo incentivo em todos os momentos e por me ensinar que a amizade verdadeira se renova todos os dias, independente da distância.

Meus amigos Ilária, Társis e Luciana pela amizade, pelo auxílio, apoio, incentivo e torcida.

Minha amiga Pamela Pontes, minha eterna gratidão por toda a ajuda nesses anos. Especialmente sem você este trabalho não teria sido conduzido, tampouco concluído. Espero um dia poder retribuir à altura tudo que fez por mim.

Minha amiga Milena Simioni: uma pessoa como poucas. Muito obrigada por toda a ajuda, em todas as esferas deste trabalho.

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“Veni, vidi, vici”

“Vim, vi, venci” Júlio César, 45 a.C.

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distúrbios, acometendo de 1% a 3% da população nos países industrializados, enquanto nos países em desenvolvimento estima-se prevalência cerca de três vezes maior. Devido à heterogeneidade de fatores causais associados a essa condição, sua investigação diagnóstica pode ser complexa e 40% dos casos não têm sua origem determinada. Recentemente, com a aplicação da tecnologia genômica, alterações cromossômicas crípticas, mutações gênicas e rearranjos genômicos diversos vêm sendo relacionados à DI, modificando as estratégias de pesquisa nessa área. Entre as mesmas, destacam-se as de Microarray-based Copy Number Variation (CNV), Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification (MLPA), a Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH), além de Next-Generation Sequencing (NGS). Em projeto anterior, a técnica de MLPA foi aplicada na investigação de rearranjos subteloméricos em 62 pacientes, com alteração em 3,2% deles. Diante da perspectiva de prosseguir na triagem por MLPA e, quando negativa, indicar a análise por microarray cromossômico ou o sequenciamento do exoma, foi proposta a continuidade do projeto, visando caracterizar uma amostra de indivíduos com DI de origem indeterminada quanto a aspectos clínicos e fatores causais. Sendo assim, 300 indivíduos foram avaliados clinicamente, submetidos a triagem por MLPA subtelomérico, com identificação de alterações patogênicas em 22 (7,3%) [del1p (2 casos), del1q, del4p, del6p, del18q, delXYp, dup7p, dup7q, dup11p, dup15p, dup17p, dupXYp (2 casos), del1p/dup4p, del4p/dup8p, del4p/dup12p, dup4p/del8p, dup4p/del13q, del5p/dup9p, del9p/dup19q e dup9p/del18p]. Entre os 278 restantes, 21 pacientes foram estudados pela a técnica de microarray, com detecção de variantes patogênicas em 11 [del1p36.33-p36.32/dup4p16.3-p15.33; del7p15.3-p15.2; del7q11.23; del15q21.2-q22.2; del22q11.21; delXq21.1-q21.33; dup6p11.2/dup10q26.3; dup12p13.2-p13.1; dup15q11.2-q13.1; dupXp22.33 e dupXq26.2). O sequenciamento do exoma foi realizado para outros 13 indivíduos, com alterações observadas em sete casos concluídos, envolvendo os genes KIRREL3/SHANK2, CTTNBP2, TCF4, PRKCG, RAI1, HTT e KMT2D. Considerando as 40 alterações identificadas pelas três técnicas utilizadas, em 36 casos foi estabelecida correlação genótipo-fenótipo, corroborando o diagnóstico laboratorial. Conforme verificado na literatura, a aplicação desses métodos, incluídos nos algoritmos atuais de investigação diagnóstica da DI, se mostram efetivos e complementares, ampliando consideravelmente as perspectivas de determinação do diagnóstico etiológico dessa condição.

Palavras chave: Deficiência intelectual. Aberrações cromossômicas. MLPA. Hibridização genômica comparativa. Sequenciamento completo de exoma.

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population in industrialized world, while in developing countries it is considered to be three times higher. The etiology is heterogeneous and includes multiple genetic and environmental factors, although its cause remains undetermined in about 40% of the cases. Recently, with the application of genomic technology, cryptic chromosomal alterations, gene mutations and several genomic rearrangements have been related to ID, modifying research strategies in this area. Among them, the most important are microarray, Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification (MLPA), Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), and Next Generation Sequencing (NGS). Lincoln-de-Carvalho (2009) applied the MLPA technique to investigate 62 patients for subtelomeric rearrangements and found copy number changes in 3.2% of cases. Considering the perspective of continuing the search for CNVs by MLPA and indicate the analysis by microarray or exome sequencing for negative cases, the present project followed with the propose of characterizing a sample with idiopathic ID regarding clinical aspects and genetic etiology. Therefore, the clinical characterization of 300 patients was performed based on their medical records. After screening using subtelomeric MLPA, pathogenic alterations were identified in 22 (7.3%) cases [del1p (2 cases), del1q, del4p, del6p, del18q, delXYp, dup7p, dup7q, dup11p, dup15p, dup17p, dupXYp (2 cases), del1p/dup4p, del4p/dup8p, del4p/dup12p, dup4p/del8p, dup4p/del13q, del5p/dup9p, del9p/dup19q e dup9p/del18p]. The microarray technique was performed for 20 patients, and pathogenic variants were detected in 11 of them [del1p36.33-p36.32/dup4p16.3-p15.33; del7p15.3-p15.2; del7q11.23; del15q21.2-q22.2; del22q11.21; delXq21.1-q21.33; dup6p11.2/dup10q26.3; dup12p13.2-p13.1; dup15q11.2-q13.1; dupXp22.33 and dupXq26.2). Whole exome sequencing was performed for 13 individuals with alterations observed in seven concluded cases involving the KIRREL3/SHANK2, CTTNBP2, TCF4, PRKCG, RAI1, HTT and KMT2D genes. Considering the total of 40 alterations detected by combining the three tecniques, the genotype-fenotype correlations were concluded in 36 cases, corroborating the laboratory diagnosis. As verified in the literature, the application of these methods, included in the current diagnostic algorithms of DI, are effective and complementary, considerably broadening the prospects for determining the etiological diagnosis of this condition.

Key words: Intellectual disability. Chromosome aberrations. Multiplex ligation-dependent probe amplification. Comparative genomic hybridization. Whole exome sequencing.

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Figura 1. Técnica de MLPA e suas etapas. 33 Figura 2. Algoritmo para a investigação de DI (modificado de Miller et al.61. 37 Figura 3. Algoritmo proposto para a investigação de DI idiopática (adaptado de

Galasso et al.60 e Miller et al.61). 42

Figura 4. Ciclos utilizados na amplificação da região de interesse dos genes alterados. 46 Figura 5. Ciclos utilizados nas reações de sequenciamento pelo método de Sanger. 47 Figura 6. Associação da presença de alteração genética com marcadores

demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição numérica, dos pacientes

incluídos no estudo. 60

Figura 7. Gráfico do resultado de MLPA para os indivíduos sem alteração (P)

para o kit SALSA MLPA P036. 62

Figura 8. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 para

os cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68). 64

Figura 9. Em azul, localização dos genes SLC6A12 e KDM5A (cromossomo 12p), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 12p presentes nos

kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 64

os cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68). 65

Figura 11. Sequenciamento do fragmento complementar à sonda 12p

(kit SALSA MLPA P036) correspondente a uma porção da sequência do exon 18

do gene SLC6A12. 65

os seis indivíduos (P74, P97, P108, P113, P122 e P257). 66 Figura 13. Em azul, localização dos genes POLR3K e DECR2 (cromossomo 16p),

cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 16p presentes nos

kits MLPA P036 e P070, respectivamente108. 66

Figura 14. Gráfico do resultado de MLPA com o kit MLPA P070 para

os seis indivíduos (P74, P97, P108, P113, P122 e P257). 67 Figura 15. Sequenciamento do fragmento complementar à sonda 16p

(kit MLPA P036) correspondente à porção da sequência do exon 1 do gene POLR3K. 67 Figura 16. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070

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Figura 18. Resultado de FISH com sonda subtelomérica para a região 1p para o paciente P98, mostrando apenas um sinal (verde) no cromossomo 1 normal

(seta branca). 70

Figura 19. Genes relacionados aos sinais clínicos da deleção 1p36 e sua

localização no cromossomo 1, modificado de Jordan et al.133. 73 Figura 20. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 1p e duplicação 4p no paciente. 77 Figura 21. FISH com as sondas subteloméricas para 1p (marcadas em vermelho)

e 4p (em verde), mostrando um sinal em vermelho no cromossomo 1 normal, nenhum sinal em vermelho no cromossomo 1 anômalo, três sinais em verde: dois

para os dois cromossomos 4 normais e outro sinal no cromossomo 1 derivado. 77 Figura 22. Microarray mostrando a deleção em 1p36.3. Em vermelho a região

deletada e abaixo, os genes localizados nesta região. 78

Figura 23. Microarray mostrando a duplicação em 4p16. Em azul a região

duplicada em abaixo, os genes nesta região. 78

Figura 24. Representação esquemática mostrando CNVs patogênicas descritas

na região identificada (14Mb de 4p16). 79

Figura 25. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070.

A seta em vermelho mostra deleção 4p no paciente. 80

Figura 26. Em azul, localização do gene PIGG (cromossomo 4p16.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 4p presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070108. 81

Figura 27. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 4p e duplicação 8p no paciente. 82 Figura 28. Em azul, localização do gene FBCO25 (cromossomo 8p23.3), cuja

sequência foi utilizada para a confecção das sondas 8p presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070108. 82

Figura 29. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 4p e duplicação 12p no paciente. 83 Figura 30. Resultado de FISH com sondas subteloméricas para as regiões 4p

(verde) e 12p (vermelho) para a paciente P124, mostrando apenas um sinal no cromossomo 4 normal (seta) e três sinais vermelhos para os cromossomos 4

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Figura 32. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 4p e deleção 8p no paciente. 85 Figura 33. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 4p e deleção 13q no paciente. 86 Figura 34. Em azul, localização dos genes F7 e CDC16 (cromossomo 13q34),

cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 13q presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 87

A seta em vermelho mostra deleção XYp no paciente. 97

Figura 36. Em azul, localização do gene SHOX (cromossomos X e Y, em região pseudoautossômica), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas XYp presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 97 Figura 37. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018 mostrando

a deleção envolvendo as regiões Xp22.31 e Xp22.33. 98

A seta em vermelho mostra deleção 1q no paciente. 100

Figura 39. Em azul, localização do gene SH3BP5L ou KIAA1720 (cromossomo 1q44) cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 1q presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070108. 100

A seta em vermelho mostra deleção 18q no paciente. 104

Figura 41. Localização dos genes RBFA e CTDP1 (cromossomo 18q23),

cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 18q presentes nos kits

A seta em vermelho mostra duplicação 7p no paciente. 106

Figura 43. Em azul, localização dos genes ADAP1 e SUN1 no cromossomo 7p22.3, cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 7p presentes nos kits

Figura 44. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P365 mostrando a duplicação envolvendo as regiões 7p22.1 e 7p22.3 no paciente. 107 Figura 45. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070.

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A seta em vermelho mostra duplicação 15q-cen no paciente. 112 Figura 48. Em azul, localização dos genes MKRN3 e NDN no cromossomo 15q-cen

(15q11.2), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas “15p”

presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 112 Figura 49. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P365 mostrando a duplicação envolvendo a região 15q11.2 com os genes MKRN3, MAGEL2 e SNRPN

no paciente. 113

Figura 50. Representação esquemática mostrando o cromossomo 15 e, abaixo dele, um zoom da região duplicada na paciente P130, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas

na região identificada (5,9 Mb em 15q11.2-13.1)108. 113

Figura 51. Mapa de expressão dos genes para a SPW e AS, bem como os pontos de quebra (BP1-BP5) comuns às condições. Na reta vermelha, a extensão da duplicação observada na paciente P130, com 5,9 Mb, entre BP2 e BP3. BP – ponto de quebra;

Cen – Centrômero; Tel – telômero. 115

A seta em vermelho mostra duplicação 17p no paciente. 118

Figura 53. Em azul, a localização do gene RPH3AL (cromossomo 17p13.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 17p presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070108. 118

A seta em vermelho mostra duplicação XYp nos pacientes P258 e P303. 121 Figura 55. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018.

As setas em vermelho mostram a extensão da duplicação XYp na paciente P303. 121 Figura 56. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018.

As setas em vermelho mostram a extensão da duplicação XYp no paciente P258. 123 Figura 57. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070.

A seta em vermelho mostra duplicação 7q no paciente. 125

Figura 58. Em azul, a localização do gene VIPR2 (cromossomo 7q36.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 7q presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070108. 126

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Figura 61. Em azul, a localização do gene CHMP2A (cromossomo 19q13.43), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 19q presentes nos kits

SALSA MLPA P036 e P070108. 128

Figura 62. Resultado de FISH com sondas subteloméricas para as regiões 9p (vermelho) e 19q (verde) em núcleos interfásicos para a paciente P169, mostrando

apenas um sinal vermelho e três sinais verdes. 129

As setas em vermelho mostram duplicação 9p e duplicação 18p no paciente. 132 Figura 64. Em azul, localização dos genes USP14 e THOC1 (cromossomo 18p11.32), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 18p presentes nos kits

Figura 65. Representação esquemática mostrando o cromossomo X e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P23, com os genes incluídos nessa

alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas

CNVs descritas na região identificada (16,4 Mb em Xq21.1-q21.3)108. 139 Figura 66. Representação esquemática mostrando o cromossomo 15 e, abaixo dele,

um zoom da região deletada no paciente P420, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas

CNVs descritas na região identificada (6,9 Mb em 15q21.2-q22.2) 108. 142 Figura 67. Representação esquemática mostrando o cromossomo X e, abaixo dele,

CNVs descritas na região identificada (1,4 Mb em em Xq26.2)108. 145 Figura 68. Representação esquemática mostrando o cromossomo 7 e, abaixo dele,

CNVs descritas na região identificada (2,4 Mb em 7p15.3p15.2)108. 148 Figura 69. Representação esquemática mostrando o cromossomo 22 e, abaixo dele,

um zoom da região deletada na paciente P151, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas

CNVs descritas na região identificada (3,2 Mb em 22q11.21)108. 152 Figura 70. Representação esquemática mostrando o cromossomo 7 e, abaixo dele,

(16)

CNVs descritas na região identificada (421 kb em 6p11.2)108. 162 Figura 72. Representação esquemática mostrando o cromossomo 10 e, abaixo dele,

CNVs descritas na região identificada (143 kb em 10q26.3)108. 163 Figura 73. Representação esquemática mostrando o cromossomo 12 e, abaixo dele,

um zoom da região deletada na paciente P284, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas

CNVs descritas na região identificada (664 kb em 12p13.2p13.1)108. 165 Quadro 1. Critérios para seleção de pacientes com rearranjos teloméricos

submicroscópicos (adaptada de De Vries et al.100). 41 Quadro 2. Caracterização clínica dos pacientes com DI idiopática. 53

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Tabela 2. SALSA MLPA P070-B2 HUMAN TELOMERE-3. 45

Tabela 3. SALSA MLPA P365-A1 HUMAN TELOMERE-14. 50

Tabela 4. SALSA MLPA P018-F1 SHOX. 51

Tabela 5. Dados demográficos e clínicos dos pacientes incluídos no estudo. 54 Tabela 6. Variantes identificadas e confirmadas nos indivíduos incluídos no estudo

por meio da técnica de MLPA subtelomérico. 56

Tabela 7. Variantes identificadas e não confirmadas nos indivíduos incluídos

no estudo por meio da técnica de MLPA subtelomérico. 57

Tabela 8. Variantes identificadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da

técnica de microarray. 57

Tabela 9. Variantes identificadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da

técnica de sequenciamento de exoma. 58

Tabela 10. Alterações identificadas em seis indivíduos da casuística com triagem por MLPA subtelomérico dentro da normalidade que foram submetidos a outros

protocolos investigativos. 58

Tabela 11. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição numérica, dos pacientes

Tabela 12. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição categórica, dos pacientes

Tabela 13. Alterações encontradas por meio do kit SALSA MLPA P036 e

confirmação – ou não – por meio do kit SALSA MLPA P070. 63 Tabela 14. Características clínicas encontradas em pacientes com deleção

terminal 1p36 (adaptado de Shapira et al.118, Heilstedt et al.119; Gajecka et al.120;

Battaglia et al.121; Oiglane-Shlik et al.122). 71

Tabela 15. Características clínicas encontradas na paciente P124 em comparação com sinais fenotípicos típicos em indivíduos com deleção 4p e duplicação 12p

(adaptado Zollino et al. 172, Zumkeller et al.194, Battaglia et al.154, Battaglia et al.155). 91 Tabela 16. Características clínicas encontradas no paciente P166 em comparação

com sinais fenotípicos típicos em indivíduos com deleção 4p e duplicação 8p

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Tabela 18. Características clínicas encontradas no paciente P237 em comparação com sinais fenotípicos típicos em mesmo rearranjo (duplicação 4p, deleção 8p)

(adaptado de Sagar et al.209; Skrlec et al.210). 95

Tabela 19. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes relacionados a

doenças e envolvidos na alteração observada no caso P130. 114 Tabela 20. Características clínicas encontradas em pacientes com duplicação 9p,

deleção 18p (adaptado de Guilherme et al.424, Sebold et al.432). 133 Tabela 21. Alterações presentes nos indivíduos da casuística investigados por meio

da técnica de aCGH. 136

Tabela 22. Resultados obtidos nos testes de exoma. 137

Tabela 23. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na

alteração observada no caso P23. 139

Tabela 26. Região cromossômica, tamanho e número de genes OMIM situados nas

regiões onde foram encontradas perda de heterozigosidade no caso P81. 146 Tabela 27. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na

Tabela 32. Alterações presentes nos seis indivíduos da casuística, com resultado por MLPA subtelomérico dentro da normalidade e que foram submetidos a outros

protocolos investigativos. 168

Tabela 33. Dados do levantamento de prontuários dos 300 pacientes incluídos no

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ACTB Actin beta

ADAM10 A disintegrin and metalloproteinase domain 10 ADAP1 ArfGAP with dual PH domains 1

ADCYAP1 Adenylate cyclase activating polypeptide 1

ADNPM Atraso do desenvolvimento psicomotor

aGH Hibridização Genômica em Arrays

AKT3 V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3

ANS Agência Nacional de Saúde Suplementar

array-CGH array Comparative Genomic Hybridization (Hibridização Genômica Comparativa baseada em plataforma array)

ARSF Arylsulfatase F

ASMT Acetylserotonin O-methyltransferase

BAZ1B Bromodomain adjacent to zinc finger domain 1B

BCL2L14 BCL2 like 14

BCL7B BCL tumor suppressor 7B

BERA Brainstem Evoked Response Audiometry

BET1L Bet1 golgi vesicular membrane trafficking protein like

BRAT1 BRCA1 associated ATM activator 1

BRWD3 Bromodomain and WD repeat domain containing 3 CARD11 Caspase recruitment domain family member 11 CASZ1 Castor zinc finger 1

CBMEG Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética

CDC16 Cell division cycle 16 CDC45 Cell division cycle 45

CDKN1B Cyclin dependent kinase inhibitor 1B

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CEPID-BRAINN Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão: Instituto Brasileiro de Neurociência e

Neurotecnologia (Brazilian Institute of Neuroscience and Neurotechnology)

CGG Citosina−Guanina−Guanina

CGH Comparative Genomic Hybridization (Hibridização Genômica Comparativa) CHD7 Chromodomain helicase DNA binding protein 7

CHM CHM, Rab escort protein 1

CHMP2A Charged multivesicular body protein 2A

CHST12 Carbohydrate sulfotransferase 12

CLDN3 Claudin 3

CLDN4 Claudin 4

CLIP2 CAP-Gly domain containing linker protein

cm centímetro

CNVs Copy Number Variations (Variações em número de cópias) COMT Catechol-O-methyltransferase

CPLX1 Complexina 1

CpG ilhas ricas em Citosina e Guanina

CREBL2 cAMP responsive element-binding protein-like 2 CRIPAK Cysteine rich PAK1 inhibitor

(20)

CTTNBP2 Cortactin-binding protein 2 CYCS Cytochrome c, somatic

CYP2E1 Cytochrome P450, subfamily IIE C7orf31 Chromosome 7 open reading frame 31

Del deleção

DECIPHER DatabasE of genomiC varIation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources DECR2 2,4-dienoyl-CoA reductase 2

DFNA5 DFNA5, deafness associated tumor suppressor

DGM Departamento de Genética Médica

DGV Database of Genomic Variant

DI Deficiência Intelectual

DIAPH2 Diaphanous related formin 2

DILX Deficiência Intelectual Ligada ao cromossomo X

DISAPRE Laboratório de Pesquisa em Distúrbios, Dificuldades de Aprendizagem e Transtornos de

Atenção FCM-UNICAMP

DMRT1 Doublesex and MAB3-related transcription fator 1

DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)

DOCK8 Dedicator of cytokinesis 8

Dup duplicação

DUSP16 Dual specificity phosphatase 16 DYX1C1 Dynein axonemal assembly factor 4 ECE1 Endothelin converting enzyme 1

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

EIF3B Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B

EIF4H Eukaryotic translation initiation factor 4H

ELN Elastin

FAM36A (ou COX 20) COX20, cytochrome c oxidase assembly factor

FAM62B (ou ESYT2) Extended synaptotagmin 2 FANCB Fanconi anemia complementation group B

FAPESP Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo

FBXL18 F-box and leucine rich repeat protein 18

FCM Faculdade de Ciências Médicas

FGF2 Fibroblast growth factor 2

FGFR3 Fibroblast growth factor receptor 3

FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Hibridização in situ com Fluorescência)

FKBP6 FK506 binding protein 6

FMR1 gene Fragile-X Mental Retardation 1

FMRP Fragile-X Mental Retardation Protein

FSCN1 Fascin actin-bundling protein 1

FTSJ2 (ou MRM2) Mitochondrial rRNA methyltransferase 2

FZD9 Frizzled class receptor 9

F7 Coagulation factor VII

g gramas

(21)

GPC3 Glypican 3 GPC4 Glypican 4

GPER G protein-coupled estrogen receptor 1

GPR19 G protein-coupled receptor 19

GP1BB Glycoprotein Ib platelet beta subunit GTF2I General transcription factor III

GTF2IRD1 GTF2I repeat domain containing 1

GTG bandamento G com Tripsina e corante Giemsa

CTTNBP2 Cortactin-binding protein 2

HC Hospital de Clínicas

HEATR2 (ou DNAAF5) Dynein axonemal assembly factor 5

HERC2 HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2

HNRNPU Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U

HSBP1L1 Heat shock factor binding protein 1 like 1 HSPG2 heparan sulfate proteoglycan 2

HS6ST2 Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2 HTT Huntingtin

HUWE1 gene HECT, UBA and WWE domain containing 1

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

INTS1 Integrator complex subunit 1

IQCE IQ motif containing E

ISCA Consortium International Standards for Cytogenomic Arrays

JARID1A (ou KDM5A) Lysine demethylase 5A KAL1 (ou ANOS1) Anosmin 1

KANK1 KN motif and ankyrin repeat domain containing protein 1

kb kilobases

KCNAB2 Potassium voltage-gated channel subfamily A regulatory beta subunit 2 KCNG2 Potassium voltage-gated channel modifier subfamily G member 2

KDM5A Lysine demethylase 5A

KDM6A Lysine-specific demethylase 6A KIRREL3 Kin of irre-like 3

KMT2D Lysine methyltransferase 2D

LAT2 Linker for activation of T-cells family member 2

LETM1 Leucine íper and EF-hand containing transmembrane protein 1

LFNG Fringe, Drosophila, Homolog of, Lunatic LIMK1 LIM domain kinase 1

LIPC Lipase C, hepatic type

LOH12CR1 (ou BORCS5) BLOC-1 related complex subunit 5 LPIN2 Lipin 2

LRP6 Low Density Lipoprotein receptor-related protein 6 LUZP1 Leucine íper protein 1

LZTR1 Leucine zipper like transcription regulator 1

M Molar

(22)

MECP2 Methyl CpG binding protein 2 MKRN3 Zinc finger protein 127 MLXIPL MLX interacting protein like

MMP23B Matrix metallopeptidase 23B MPP6 Membrane palmitoylated protein 6

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Amplificação de Múltiplas Sondas

Dependentes de Ligação)

MSX1 Muscle segment homeobox 1

MYO5A Myosin VA MYO1E Myosin IE

MYP2 ou Myopia 2 (high grade, autosomal dominant)

NCBI National Center for Biotechnology Information ND não determinado

NDN Necdin, MAGE family member

NFATC1 Nuclear factor of activated T-cells 1

ng nanogramas

NGS Next Generation Sequencing (Sequenciamento de nova geração) NIPA1 Non imprinted in Prader-Willi/Angelman syndrome 2

NLGN4X Neuroligin 4

NOTCH Notch 1

np braço curto do cromossomo n NPVF Neuropeptide VF precursor NPY Neuropeptide Y

nq braço longo do cromossomo n

NSD1 Nuclear receptor binding SET domain protein 1

NUDT1 Nudix hydrolase 1

OCA2 OCA2 melanosomal transmembrane protein

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man OMS Organização Mundial de Saúde

OSBPL3 Oxysterol binding protein like 3

PAFAH1B1 (ou LIS1) Platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1

pb pares de base

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase)

PDPN Podoplanin

pH potencial Hidrogeniônico

PIGG Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class G PI4KA Phosphatidylinositol 4-kinase alpha

POF1B Premature ovarian failure, 1B POLR3K RNA polymerase III subunit K POU3F4 POU class 3 homeobox 4

PPP2R3B Protein phosphatase 2 regulatory subunit B''beta PQLC1 PQ loop repeat containing 1

(23)

PRODH Proline dehydrogenase oxidase 1 PTEN Phosphatase and tensin homolog

PTPRD Protein tyrosine phosphatase, receptor type D

QI Quociente Intelectual

qPCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa em Tempo Real)

RAB27A RAB27A member RAS oncogene family RAI1 Retinoic acid-induced gene 1

RBFA Ribosome binding factor A (putative) RERE Arginine-glutamic acid dipeptide repeats RFC2 Replication factor C subunit 2

RIC8A RIC8 guanine nucleotide exchange factor A RPH3AL (ou NOC2) Rabphilin 3A like

RM Ressonância Magnética RN Resolução Normativa

RNF216 Ring finger protein 216

RS Rearranjos Subteloméricos

RTN4R Reticulon 4 receptor

SCARF2 Scavenger receptor class F member 2 SDK1 Sidekick cell adhesion molecule 1 SERPIND1 Serpin family D member 1

SHANK2 SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2 SHOX Short stature homeobox

SH3BP5L SH3 binding domain protein 5 like

SKI SKI proto-oncogene

SLBP Stem-loop binding protein

SLC6A8 gene Solute carrier family 6 member 8 SLC6A12 Solute carrier family 6 member 12 SLC25A1 Solute carrier family 25 member 1 SNAP29 Synaptosome associated protein 29

SNC Sistema Nervoso Central

SNPs Single Nucleotide Polymorphisms

SNRPN Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N SNV Single Nucleotide Variation

SNX8 Sorting nexin 8

SPEN Spen íperxxiii transcriptional repressor SPRN Shadow of prion protein

STK31 Serine/threonine kinase 31 STS Steroid sulfatase

STX1A Syntaxin 1A

SUN1 Sad1 and UNC84 domain containing 1

SXF Síndrome do X-Frágil

SYCE1 Synaptonemal complex central element protein I TACC3 Transforming acidic coiled-coil containing protein 3 TANGO2 Transport and golgi organization 2 homolog

(24)

TC Tomografia computadorizada

TCF4 Transcription factor 4 TCF12 Transcription factor 12

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TE Tris-EDTA

TFDP3 Transcription factor Dp family member 3 THOC1 Tho complex, subunit 1

TNFRSF4 TNF receptor superfamily member 4 TNFRSF18 TNF receptor superfamily member 18 TRIM50 Tripartite motif-containing protein 50

TSHZ1 Teashirt zinc finger homeobox 1 TXNL4A Thioredoxin like 4A

UBE3A Ubiquitin protein ligase E3A UBE4B Ubiquitination íper E4B

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas

USP14 Ubiquitin-specific protease 14 USP18 Ubiquitin specific peptidase 18 USP26 Ubiquitin specific peptidase 26

UTI Unidade de Terapia Intensiva

UTR Untranslated Region (Região não traduzida)

VAMP7 Vesicle associated membrane protein 7 VCX3A Variable charge, X-linked 3A

VIPR2 Vasoactive intestinal peptide receptor 2 VPS37D VPS37D, ESCRT-I subunit

WBSCR22 (ou BUD23) rRNA methyltransferase and ribosome maturation factor

WBSCR27 Methyltransferase like 27

WBSCR28 Transmembrane protein 270

WDR60 WD repeat domain 60 WDR72 WD repeat domain 72

WES Whole Exome Sequencing (Sequenciamento completo do exoma) WHO World Health Organization

WHSCR-1 Região crítica para a síndrome de Wolf-Hirschhorn 1

WHSCR-2 Região crítica para a síndrome de Wolf-Hirschhorn 2 WHSC1 (ou NSD2) Nuclear receptor binding SET domain protein 2 WHSC2 (ou NELFA) negative elongation íper complex member A

YWHAE Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein épsilon ZBED1 Zinc finger BED-type containing 1

ZNF24 Zinc finger protein 24

ZNF238 (ou ZBTB18) Zinc finger and BTB domain containing protein 18 ZNF711 Zinc finger protein 711

 alfa

(25)

1. INTRODUÇÃO 28

1.1. Fatores Genéticos associados à DI 29

1.1.1. Anomalias cromossômicas 29

1.1.1.1. Anomalias cromossômicas submicroscópicas 30

1.1.2. Síndromes monogênicas associadas à DI e à Deficiência

Intelectual ligada ao X (DILX) 31

1.2. Investigação diagnóstica da DI 32

1.2.1. A técnica de MLPA 33

1.2.2. A técnica de microarray 34

1.2.3. Sequenciamento do exoma 36

1.2.4. Uso dos métodos apresentados na investigação diagnóstica da DI 37

2. OBJETIVOS 39

2.1. Objetivo Geral 39

2.2. Objetivos Específicos 39

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 40

3.1. Seleção dos pacientes 40

3.2. Estratégia de investigação 41

3.2.1. Triagem por MLPA 42

3.2.2. Validação dos resultados de MLPA 46

3.2.2.1. Validação pela técnica de sequenciamento pelo método de

Sanger 46

3.2.2.2. Validação pela técnica de FISH 48

3.2.2.3. Validação pela técnica de MLPA 49

3.2.3. Técnica de microarray 51

3.3. Caracterização clínica da casuística e análise estatística 53

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54

4.1. Caracterização da casuística 54

4.2. Resultados da Investigação Diagnóstica 56

4.3. Comparação da casuística conforme a presença ou não de alterações 58 4.4.Investigação de anomalias subteloméricas por MLPA 61

4.4.1. Alterações não confirmadas 63

4.4.1.1. Alteração del 12p 63 4.4.1.2. Alteração del 16p 66 4.4.2. Alterações confirmadas 68 4.4.2.1. Alteração del(1)(p36) 68 4.4.2.1.1. Paciente 57 (Lincoln-de-Carvalho, 2009) 68 4.4.2.1.2. Paciente P98 68 4.4.2.1.3. Paciente P136 76 4.4.2.2. Alteração em 4p 79 4.4.2.2.1. Paciente P316 79 4.4.2.2.2. Paciente P166 81

(26)

Deleção 4pter e a síndrome de Wolf -Hirschhorn 87

Duplicação 4pter 92

4.4.2.3. Alteração del 6p 95

4.4.2.4. Alteração del XYp 95

4.4.2.4.1 Paciente P85 95 4.4.2.5. Alteração del 1q 99 4.4.2.5.1 Paciente P192 99 4.4.2.6 Alteração del 18q 103 4.4.2.6.1. Paciente P137 103 4.4.2.7. Alteração dup 7p 105 4.4.2.7.1 Paciente P161 105 4.4.2.8. Alteração dup 11p 108 4.4.2.8.1. Paciente P191 108

4.4.2.9. Alteração “dup 15p” (15q-cen) 111

4.4.2.9.1. Paciente P130 111

4.4.2.10. Alteração dup 17p 117

4.4.2.10.1. Paciente P236 117

4.4.2.11. Alteração dup XYp 120

4.4.2.11.1. Paciente P303 120 4.4.2.11.2. Paciente P258 122 4.4.2.12. Alteração dup 7q 125 4.4.2.12.1. Paciente P4 125 4.4.2.13. Alteração del5p/dup9p 127 4.4.2.13.1. Paciente P64 127 4.4.2.14. Alteração del9p/dup19q 127 4.4.2.14.1. Paciente P169 127 4.4.2.15. Alteração dup9p/del18p 131 4.4.2.15.1. Paciente P194 131

4.5. Investigação de alterações pelos métodos de microarray e

sequenciamento de exoma 136 4.5.1. Paciente P23 137 4.5.2. Paciente P42 141 4.5.3. Paciente P81 144 4.5.4. Paciente P108 147 4.5.5. Paciente P151 150 4.5.6. Paciente P152 155 4.5.7. Paciente P158 161 4.5.8. Paciente P284 164 4.6. Outros resultados 167 5. CONCLUSÕES 169 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 170

(27)

8.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 206

8.3. Protocolo Padrão MLPA 207

8.4. Artigo 209

(28)

1. INTRODUÇÃO

A deficiência intelectual (DI) ou transtorno do desenvolvimento intelectual, isolada ou associada a anomalias congênitas, é um dos principais fatores de redução da qualidade de vida. Para o indivíduo e sua família representa limitação em diferentes graus, em geral determinando necessidade de supervisão e proteção permanentes. No âmbito populacional, é considerada problema de saúde pública, por sua prevalência e consequências negativas para a produtividade e relações sociais, além do aumento na demanda por serviços médicos e educacionais especializados1,2.

Trata-se de condição complexa, identificada pela redução substancial das funções intelectuais, concomitante a déficits no comportamento adaptativo, envolvendo os domínios conceitual, social e prático. Uma forma objetiva de classificação baseia-se em testes psicométricos para determinação do quociente intelectual (QI), os quais, embora vistos como um instrumento imperfeito, são considerados satisfatórios na avaliação do potencial de inteli-gência, sendo utilizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS), que considera quatro níveis de gravidade: DI leve (QI entre 50-70), DI moderada (QI entre 35-49), DI grave (QI entre 20-34) e DI profunda (QI inferior a 20). Contudo, a maioria dos estudos sobre as causas de DI classifica os indivíduos apenas em dois grupos, o dos indivíduos com DI leve (QI entre 50 e 70) e os demais com DI grave (QI seja inferior a 50)2,3.

A confirmação da DI costuma ser mais tardia, mas em muitos casos a suspeita diagnóstica surge antes dos cinco anos de idade, quando não é possível realizar avaliações sistemáticas do funcionamento intelectual, porém se observa que a criança não atinge os marcos esperados do desenvolvimento neuropsicomotor, caracterizando o atraso global do desenvolvimento, que pode resultar na deficiência intelectual no adulto1,2,4-6.

A DI representa uma das categorias mais amplas de distúrbios, acometendo de 1% a 3% da população nos países industrializados, com aproximadamente um terço dos casos atribuídos a causas genéticas. Já nos países em desenvolvimento, estima-se prevalência três vezes maior, atribuída ao efeito de fatores ambientais adversos, como desnutrição proteico-calórica, infecções do sistema nervoso central, além de idade materna avançada, maior frequência de casamentos consanguíneos e carência de serviços de aconselhamento genético

7-9

. Com relação à gravidade, os casos de DI leve são a maioria, com frequência de sete a oito vezes maior do que as formas mais graves, sendo caracterizadas muitas vezes como atraso na fala, alteração do comportamento e/ou baixo rendimento escolar10.

(29)

No Brasil, conforme dados do Censo Demográfico 2010, são mais de 45 milhões de pessoas com pelo menos uma forma de deficiência (física ou mental), o que representa aproximadamente 23% da população. Dentre esses, pelo menos 2,6 milhões ou 1,4% da população seriam deficientes intelectuais, o que deve corresponder a subestimativas, tendo em vista os índices propostos para países em desenvolvimento11.

Entre os indivíduos encaminhados para avaliação em serviços de Genética Clínica, 60% a 70% apresentam algum grau de comprometimento intelectual e, tendo em vista a significativa heterogeneidade causal e fenotípica dessa condição, um dos grandes desafios é a determinação do diagnóstico etiológico, que permanece indeterminado em cerca de 40% dos casos1,12,13. Embora fatores não-genéticos estejam comumente associados à DI, com destaque para alguns teratógenos como álcool e outras drogas, infecções como rubéola e sífilis, além de complicações peri e(ou) neonatais, uma parcela significativa é atribuída a causas genéticas, incluindo desde anomalias cromossômicas a mutações de ponto, ou ainda fatores epigenéticos, em especial entre as formas mais graves. Entretanto, mesmo com o refinamento das técnicas de investigação diagnóstica, 60% dos casos de deficiência intelectual atribuída a causas genéticas permanecem de origem indeterminada4,6,14-16.

1.1. Fatores Genéticos associados à DI

Entre as causas genéticas de DI destacam-se as cromossomopatias, em particular a síndrome de Down, as heredopatias de transmissão monogênica, incluindo diversos erros inatos do metabolismo e o grupo da DI ligada ao X. Além disso, mecanismos como dissomia uniparental e fatores epigenéticos, como erros na impressão genômica ou imprinting, também são descritos, por exemplo, em um percentual dos indivíduos com as síndromes de Angelman e Prader-Willi17-19.

1.1.1. Anomalias cromossômicas

Estima-se que 15% dos casos de DI se relacionem a anomalias cromossômicas identificadas pelo exame de cariótipo convencional, com destaque para a trissomia do cromossomo 21 entre as aneuploidias, além de diversas cromossomopatias estruturais como deleções, translocações em geral desbalanceadas e cromossomos marcadores, envolvendo pelo menos 5 a 10 milhões de pares de bases. Mais recentemente, a aplicação de técnicas de citogenética molecular tem possibilitado a identificação de alterações cromossômicas inferiores a esse limite em indivíduos com DI classificada como idiopática, caracterizando

(30)

diversas síndromes de microdeleção ou duplicação submicroscópicas, parte delas relacionadas a rearranjos subteloméricos20-22.

1.1.1.1. Anomalias cromossômicas submicroscópicas

Durante um período, parte dos estudos nessa área se concentraram nas regiões adjacentes aos telômeros, por características que as tornam candidatas a ocorrência de rearranjos, como a quase ausência de histonas e nucleossomos, riqueza em genes e ilhas CpG e probabilidade alta de recombinação23. Embora os rearranjos subteloméricos descritos em muitos estudos envolvam regiões específicas, é provável que a interação significativa de sequências subteloméricas homólogas inicie o processo de recombinação entre as mesmas. Apesar do mecanismo de duplicação e separação das regiões cromossômicas terminais não estar totalmente elucidado, já se sabe que erros podem ocorrer e que mutações envolvendo essas regiões podem ser herdadas, com ou sem consequências clínicas, e se associam a diversas condições, incluindo a DI24.

De fato, diversos estudos demonstraram a relevância dos rearranjos subteloméricos entre os fatores relacionados à DI. Um dos principais foi o de Knight e colaboradores25 em indivíduos com DI idiopática, identificando essas alterações em 7,4% dos que apresentavam deficiência moderada ou grave e em 0,5% dos com DI leve. Estudos posteriores mostraram uma proporção maior de alterações subteloméricas em indivíduos com DI leve (10% a 33%), sendo essas variações possivelmente relacionadas a diferenças no tamanho da amostra e nos critérios de seleção da casuística. De todo modo, a revisão realizada por De Vries e colaboradores26, estabelecendo que uma amostra de 2.500 indivíduos com DI, 5% apresentavam rearranjos subteloméricos, colocou essas alterações como causa comum de DI idiopática, justificando sua inclusão na investigação diagnóstica dessa condição27-29.

Posteriormente, com o desenvolvimento das técnicas de microarray foi possível identificar e mapear alterações como polimorfismos de nucleotídeo único ou simples (Single Nucleotide Polymorphisms ou SNPs) em indivíduos de diferentes grupos populacionais. A medida da associação entre os SNPs mapeados e diversas condições complexas, a partir da análise de grandes coortes de pacientes, tem revolucionado o estudo de numerosas características e doenças30-32.

Inserções e deleções também são comuns, variando em tamanho desde um até milhares de pares de bases e, à semelhança dos SNPs, podem ou não ter efeito deletério sobre o fenótipo. Entre essas, incluem-se as chamadas variações no número de cópias de segmentos

(31)

de DNA do genoma humano (Copy Number Variations, CNV), definidas como sequências de DNA de 1 kb ou mais, nas quais há divergência no número de cópias observado entre os indivíduos33-35 e sendo classificadas como deleções, duplicações, repetições invertidas ou mesmo hotspots de rearranjo cromossômico, entre outras36-38.

A relação entre CNVs e DI é relatada em vários estudos, permitindo estimar que seriam responsáveis por 5% a 20% dos casos de DI, sendo essa variação dependente dos critérios de seleção clínica utilizados39-44.

Contudo, como a identificação de CNVs no genoma é recente, a confirmação de sua patogenicidade é complexa e requer investigação de aspectos como transmissão a partir de um genitor normal ou afetado, expressão variável conforme o sexo, caracterização do quadro clínico associado, identificação dos genes presentes na região e detecção (ou não) em indivíduos normais, justificando a ampliação dos estudos em indivíduos com DI de causa indeterminada.

1.1.2. Síndromes monogênicas associadas à DI e à Deficiência Intelectual ligada ao X (DILX)

Numerosos erros metabólicos, predominantemente de transmissão recessiva, se relacionam a atraso global do desenvolvimento, assim como diversas síndromes monogênicas que são conhecidas pela determinação de DI em graus variados, como a distrofia miotônica, a síndrome de Noonan e condições correlatas e a esclerose tuberosa, entre outras4,15.

Contudo, a maior parte dos estudos relacionados a heredopatias monogênicas associadas a DI tem como foco a identificação de genes do cromossomo X, ou a deficiência intelectual ligada ao X (DILX), pela peculiaridade de sua transmissão, em geral envolvendo várias genealogias.

A DILX é uma das causas genéticas mais frequentes de DI, ocorrendo em 10-12% de todos os homens afetados, provavelmente pelo maior número de genes no cromossomo X em comparação a qualquer outro segmento autossômico45. As mulheres podem manifestar sintomas mais brandos, possivelmente pela inativação preferencial do cromossomo X.

Nesse grupo, destaca-se a síndrome do X-frágil (SXF - MIM 300624), principal causa monogênica de DI, bem como muitas outras condições que se associam ou têm a DI como manifestação principal e são determinadas por genes do cromossomo X27,46-49. A SXF, somente menos frequente que a síndrome de Down, ocorre em aproximadamente 1:4.000 homens e 1:8.000 mulheres50-52.

(32)

Na SXF, a denominação “X-Frágil” se refere a uma região mais sujeita a quebras ou falhas, ou seja, um “sítio frágil”, no qual a cromatina não se condensa apropriadamente durante a mitose, situado em Xq27.3. Na quase totalidade dos casos, a SXF é causada por uma mutação dinâmica, caracterizada pela expansão de uma sequência de trinucleotídeos CGG, situada na região 5’ não-traduzida do primeiro exon do gene FMR1 (MIM 309550 - Fragile-X Mental Retardation). O número normal de repetições é aproximadamente 60, enquanto em pacientes com a SXF ocorrem centenas de repetições. Mais de 200 cópias da repetição levam a uma metilação excessiva de citosinas no promotor de FMR1, comprometendo o funcionamento normal (ou a transcrição) e silenciando o gene. A proteína codificada pelo gene FMR1, denominada FMRP, encontra-se expressa em vários tecidos, incluindo epitelial e Sistema Nervoso Central (SNC), sendo seu RNAm produzido em níveis elevados durante o desenvolvimento fetal, principalmente em neurônios colinérgicos e piramidais do hipocampo. Dessa forma, a deficiência funcional do gene é vinculada ao fenótipo da SFX, que inclui, além da DI (em geral de moderada a grave no sexo masculino), distúrbios de comportamento e linguagem, face alongada e mandíbula proeminente, orelhas grandes e/ou em abano e macrorquidia, comumente observados a partir da puberdade53-55.

1.2. Investigação diagnóstica da DI

Recentemente, com a aplicação da tecnologia genômica, alterações cromossômicas crípticas, mutações gênicas e rearranjos genômicos diversos vêm sendo relacionados à DI, modificando as estratégias de pesquisa nessa área. Entre as mesmas, destacam-se a Hibridização Genômica em Arrays (aGH), a Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification (MLPA), a Hibridização In Situ por Fluorescência (fluorescent in-situ hybridization ou FISH), além do sequenciamento do exoma15,24,56-59.

Nos países industrializados vem sendo recomendado como procedimento inicial a realização de testes como “microarray cromossômico” ou “cariótipo molecular”, e mesmo o sequenciamento do exoma, pela maior resolução para detecção de alterações genômicas15,60-63. Já nos países em desenvolvimento, a análise cromossômica convencional ainda é a alternativa de investigação predominante, em geral com resolução que varia de 450-850 bandas por lote haploide, ou de 3-5 Mb, e dependendo da extensão, alterações como microduplicações e microdeleções intersticiais ou subteloméricas não são identificadas6,16,64.

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1.2.1. A técnica de MLPA

A técnica denominada Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação) é um método sensível, econômico e rápido, para a quantificação relativa do número de cópias de mais de 50 sequências de ácidos nucleicos em único experimento, permitindo detectar deleções e duplicações de diversos genes, além de mutações de ponto conhecidas64,65. Descrita por Schouten64, parte de um princípio simples, o de hibridizar uma mistura de sondas à amostra de DNA genômico a ser analisada, seguida da amplificação dos produtos de ligação por PCR, utilizando um par de primers universal. Os fragmentos finais são separados e lidos em aparelho de eletroforese capilar, sendo possível a quantificação relativa de cópias gênicas (Figura 1).

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Atualmente, a empresa MRC-Holland produz kits de MLPA para o estudo de várias condições genéticas. Segundo o fabricante, entre as vantagens dessa técnica em relação a outras utilizadas na identificação de alterações genômicas estão a detecção de muitas sequências do DNA genômico em uma mesma reação utilizando apenas 20 ng de DNA (rendimento alto), a disponibilização de resultados em 24 horas (praticidade alta e rapidez), a possibilidade de inclusão de muitas amostras em um mesmo ensaio, a capacidade de detectar sequências que diferem em apenas um nucleotídeo e o uso de protocolo único para muitas aplicações diferentes, com custo relativamente baixo. Entretanto, a técnica não permite identificar rearranjos cromossômicos equilibrados ou alterações externas à região de anelamento das sondas.

Diversos estudos que aplicaram a técnica de MLPA na pesquisa de rearranjos subteloméricos (RS) em DI idiopática tiveram resultados similares aos que utilizaram outros métodos, identificando alterações subteloméricas em cerca de 10% dos pacientes29,58,66,67, percentual também verificado em estudo realizado por nosso grupo de pesquisa68. Segundo Rooms et al.69, Morozin Pohovski et al.29, Boggula et al.67, entre outros, os resultados obtidos por MLPA justificam sua inclusão como método de triagem de RS em indivíduos com DI de origem não esclarecida.

1.2.2. A técnica de microarray

Embora técnicas como a de MLPA permitam a identificação de novas regiões cromossômicas associadas à DI, uma parcela significativa dos casos permanece de causa indeterminada. Pela necessidade de testar todo o genoma em um experimento único, técnicas baseadas em hibridação com fluorescência, como a hibridação genômica comparativa (Comparative Genomic Hybridization - CGH) e a hibridização genômica em arrays (aGH) foram desenvolvidas70.

A técnica de aGH (Hibridização Genômica em array) é capaz de detectar perdas e ganhos de material genético e, ao contrário da análise citogenética convencional, dispensa a cultura celular. Além disso, não há desvio para a análise de uma região cromossômica específica, já que todo o genoma é analisado71. Foi descrita inicialmente no final da década de 90 por Pinkel et al.72 como arrayCGH (Hibridização Genômica Comparativa), uma variante da técnica de CGH utilizando sondas de DNA genômico imobilizadas em lâminas, sendo realizada a análise comparativa, com base nas intensidades de hibridização dos DNAs (referência e investigado) às sondas inseridas na lâmina. A resolução chega a alguns kb,