INVESTIGAÇÃO DAS PROPRIEDADES NEUROPROTETORAS DE COMPOSTOS INÉDITOS DERIVADOS DO PROBUCOL EM
UM MODELO DE OXITOSE EM CÉLULAS HT22
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutor em Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Farina
Coorientador: Prof. Dr. Mark William Lopes
Florianópolis, SC, Brasil 2019
Este trabalho é dedicado aos meus pais, Adão e Lurdes, que não mediram esforços para permitir que eu pudesse ir atrás da minha formação acadêmica.
Primeiramente, meus agradecimentos vão para a minha família, pelo apoio incondicional que me foi dado durante toda a minha caminhada, mesmo sem entender os aspectos da vida acadêmica ou as escolhas que eu fiz relacionadas a ela.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcelo Farina, pelo exemplo de ética e dedicação, além de todo o conhecimento que me foi passado. Será um exemplo que levarei para toda a vida.
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Mark William Lopes, por sempre estar disponível para ajudar e contribuir com o meu trabalho nestes dois últimos anos de doutorado.
Ao meu orientador do doutorado sanduíche, Prof. Axel Methner, por ter me acolhido em seu laboratório e pela confiança em mim depositada, além de ter me dado a chance de aprender muito em seu grupo de pesquisa.
Aos antigos e atuais colegas do Laboratório de Experimentação em Neuropatologias: Aline, Carolina, Cinara, Débora, Dirleise, Glorister, Heloisa, Josiane, Juliana, Juliete, Letícia, Luiz, Marina, Mauricio, Rafaela, Ruth, Sthéfani, Tanara e Viviane; pela convivência diária, ajuda nos experimentos e pela companhia nos momentos de descontração.
Aos membros do grupo do Prof. Methner: Ann-Kathrin, Christina, Elena, Federica, Felicia, Li, Partha, Rahel e Verena; por terem sido tão receptivos comigo e terem me ajudado no laboratório e nas burocracias da vida na Alemanha.
Aos membros do Laboratório de Bioquímica Experimental, do Laboratório de Defesas Celulares, do Laboratório de Neuroquímica I e do Laboratório de Neuroquímica III pela ajuda sempre prestada quando um reagente ou um equipamento é necessário, além da convivência diária.
Aos membros do LAMEB III, principalmente ao Denis e a Vanessa, pelo auxílio no uso dos equipamentos.
Ao PPG Bioquímica e a Universidade Federal de Santa Catarina, que me permitiram adquirir mais um grau acadêmico.
A todos os professores do CCB que, de alguma maneira, contribuíram com a minha formação nestes últimos quatro anos.
Aos membros da banca examinadora, que dedicaram seu tempo para ler e contribuir com esta tese de doutorado.
Ao apoio financeiro da CAPES, tanto pela bolsa de doutorado quanto pela bolsa de doutorado sanduíche.
Ao apoio financeiro do DAAD, que permitiu que eu ficasse um tempo a mais do que o planejado na Alemanha.
E finalmente, a todos os meus amigos e familiares que me apoiaram nesta conquista.
“From the moment of commitment Nature conspires to help you”
O estresse oxidativo é caracterizado por um desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e os níveis de defesas antioxidantes nas células. O mesmo está envolvido em muitas doenças, incluindo condições neurodegenerativas. Devido a isso, muitas estratégias terapêuticas utilizam compostos antioxidantes como fármacos para o tratamento de tais condições. O probucol (PB) é um composto antioxidante com propriedades neuroprotetoras e hipocolesterolêmicas. Estudos prévios mostram que o PB e seu derivado succinobucol apresentam propriedades protetoras em vários modelos de doenças neurodegenerativas. No presente estudo, apresentamos dois novos compostos derivados do PB, aqui denominados como RC363 e RC574. O modelo de oxitose induzido por glutamato (Glu) em células HT22 foi escolhido para avaliar os potenciais efeitos neuroprotetores dos compostos. Neste modelo, as células HT22 são expostas a uma concentração elevada (5 mM) de Glu, levando a depleção de GSH, inibição da glutationa peroxidase 4 (GPx4), aumento da produção de hidroperóxidos lipídicos, perturbação mitocondrial e morte celular. Assim, objetivamos avaliar o possível efeito protetor do PB e seus derivados, além de tentar elucidar seus mecanismos de ação. Para isso, as células foram pré-incubadas com os compostos durante 24 horas e, em seguida, eram desafiadas com Glu durante 24 horas (para os testes de morte e viabilidade celular) ou 6 horas (para investigar os mecanismos da morte). Os compostos, até a concentração de 5 µM, não foram tóxicos para as células. Nos testes de proteção, uma pré-incubação com os compostos RC363 e RC574, na concentração mínima de 0,5 µM, foi eficiente em proteger as células de um desafio com Glu 5 mM, enquanto o PB não exibiu nenhum efeito protetor. Este efeito protetor não foi associado a uma recuperação nos níveis de GSH e nem a um efeito antioxidante direto, já que os compostos tiveram um baixo desempenho no teste do DPPH e não foram capazes de inibir totalmente a produção de espécies reativas (ER) induzida por Glu. O efeito protetor dos compostos não esteve associado a um aumento da atividade da PI3K ou da PKC. Por outro lado, os compostos RC363 e RC574 foram capazes de inibir os efeitos do Glu no potencial de membrana mitocondrial (PMM) e na produção de ânion superóxido (O2•-) mitocondrial. Porém, os compostos não foram capazes de inibir a diminuição da capacidade respiratória mitocondrial induzida por Glu, nem a morte celular induzida pela translocação da tBid. Os compostos RC363 e RC574 aumentaram o imunoconteúdo de GPx1 nas células
HT22, enquanto o PB e o RC574 aumentaram a atividade da GPx, porém este efeito não parece ser importante para inibir a morte celular induzida por Glu. Os compostos RC363 e RC574 também mostraram grande eficiência em inibir a morte celular induzida pela inibição da GPx4. Apesar do mecanismo de proteção exato não poder ter sido evidenciado no presente estudo, o mesmo traz valiosas informações sobre os efeitos protetores dos novos compostos RC363 e RC574, as quais poderão ser utilizadas no futuro para o uso dos mesmos em estratégias terapêuticas para condições onde o estresse oxidativo está envolvido.
Palavras-chave: Probucol. Estresse oxidativo. Glutamato. HT22. Glutationa peroxidase.
Oxidative stress is characterized by an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the levels of antioxidant defenses in cells. It is involved in many diseases, including neurodegenerative conditions. Due to these facts, many therapeutic strategies use antioxidant compounds as pharmaceuticals for the treatment of such conditions. Probucol (PB) is an antioxidant compound with neuroprotective and hypocholesterolemic properties. Previous studies have shown that PB and its derivative succinobucol present protective properties in several models of neurodegenerative diseases. In the present study, we present two new compounds derived from PB, here named as RC363 and RC574. The glutamate (Glu)-induced oxitosis model in HT22 cells was chosen to evaluate the potential neuroprotective effects of the compounds. In this model, HT22 cells are exposed to high (5 mM) Glu concentrations, leading to GSH depletion, inhibition of glutathione peroxidase 4 (GPx4), increased production of lipid hydroperoxides, mitochondrial perturbation, and cell death. Thus, we aimed to evaluate the possible protective effect of PB and its derivatives, besides trying to elucidate their mechanisms of action. For this, the cells were preincubated with the compounds for 24 hours and then challenged with Glu for 24 hours (for death and cell viability tests) or 6 hours (to investigate the mechanisms of death). The compounds, up to the 5 μM concentration, were not toxic to cells. In the protection assays, a preincubation with RC363 and RC574, at the minimum concentration of 0.5 μM, were effective in protecting the cells from a challenge with 5 mM Glu, whereas the PB showed no protective effect. This protective effect was not associated with a recovery in GSH levels nor a direct antioxidant effect since the compounds had poor performance in the DPPH test and were not able to fully inhibit reactive species (RS) production induced by Glu. The protective effect of the compounds was not associated with an increase in PI3K or PKC activity. On the other hand, compounds RC363 and RC574 were able to inhibit the effects of Glu on the mitochondrial membrane potential (MMP) and the production of mitochondrial superoxide anion (O2•-). However, the compounds were not able to inhibit the decrease in Glu-induced mitochondrial respiratory capacity, nor the cell death Glu-induced by tBid translocation. The compounds RC363 and RC574 increased the immunocontent of GPx1 in HT22 cells, whereas PB and RC574 increased GPx activity, but this effect does not appear to be important to inhibit Glu-induced cell death. Compounds RC363 and RC574 also
showed great efficiency in inhibiting cell death induced by inhibition of GPx4. Although the exact mechanism of protection may not have been evidenced in the present study, it provides valuable information on the protective effects of the new RC363 and RC574 compounds, which may be used in the future for their use in therapeutic strategies for conditions where oxidative stress is involved.
Keywords: Probucol. Oxidative stress. Glutamate. HT22. Glutathione peroxidase.
Figura 1 - Esquema mostrando as EROs que se formam quando os elétrons escapam da CTE, bem como as defesas antioxidantes intracelulares que as depletam. ... 27 Figura 2 - Os compostos que foram avaliados no presente estudo. ... 30 Figura 3 - Esquema da estrutura do trocador cistina/glutamato (xc-). ... 32 Figura 4 - Esquema mostrando a cascata de eventos intracelulares após a exposição da célula a altas concentrações de Glu. ... 33 Figura 5 - Exemplos de imagens de células com mitocondriais tubulares, intermediárias e fragmentadas, respectivamente. ... 43 Figura 6 - Efeitos do Glu na viabilidade e morte celular em células HT22. ... 50 Figura 7 - Efeitos do PB e seus derivados na viabilidade e morte celular em células HT22. ... 51 Figura 8 - Efeitos do PB e seus derivados na viabilidade e morte celular de células HT22 desafiadas com Glu. ... 53 Figura 9 - Micrografias de contraste de fase de células HT22 expostas aos compostos e ao Glu. ... 54 Figura 10 - Efeitos dos compostos RC363 e RC574 de forma concentração e tempo dependente em células HT22 desafiadas com Glu. ... 56 Figura 11 - Efeitos do PB e seus derivados em neurônios corticais primários de camundongos desafiados com Glu. ... 57 Figura 12 - Efeitos do PB e seus derivados nos níveis de NPSH em células HT22 desafiadas com Glu. ... 59 Figura 13 - Efeitos do PB e seus derivados na morte e viabilidade celular de células HT22 desafiadas com BSO. ... 61 Figura 14 - Efeito do PB e seus derivados na produção de ER em células HT22 desafiadas com Glu. ... 63 Figura 15 - Avaliação do PB, seus derivados e do Trolox no teste do DPPH. ... 64 Figura 16 - Efeitos do Trolox na morte e viabilidade celular em células HT22 desafiadas com Glu. ... 65 Figura 17 - Papel da via da PI3K/Akt no efeito protetor induzido pelo PB e seus derivados em células HT22 desafiadas com Glu. ... 67 Figura 18 - Papel da ativação da PKC no efeito protetor induzido pelo PB e seus derivados em células HT22 desafiadas com Glu. ... 69 Figura 19 - Efeito do PB e seus derivados no PMM em células HT22 desafiadas com Glu. ... 71
Figura 20 - Efeitos do PB e seus derivados na produção de O2•- em células HT22 desafiadas com Glu. ... 72 Figura 21 - Efeito do PB e seus derivados na morfologia mitocondrial de células HT22 desafiadas com Glu. ... 74 Figura 22 - Efeitos do PB e seus derivados no consumo de O2 mitocondrial em células HT22 desafiadas com Glu... 75 Figura 23 - Efeitos do PB e seus derivados em células HT22 expressando a tBid. ... 77 Figura 24 - Efeitos do PB e seus derivados na produção de hidroperóxidos lipídicos em células HT22 desafiadas com Glu ou CuOOH. ... 79 Figura 25 - Efeitos do PB e seus derivados no imunoconteúdo da proteína GPx1 em células HT22. ... 81 Figura 26 - Efeitos do PB e seus derivados na atividade da enzima GPx em células HT22. ... 82 Figura 27 - Papel da GPx no efeito protetor do PB e seus derivados em células HT22 desafiadas com Glu. ... 84 Figura 28 - Efeitos do PB e seus derivados na viabilidade de células HT22 desafiadas com RSL3. ... 85
Tabela 1 - Ações pré-clínicas e mecanismos de ação do PB em estudos envolvendo o sistema nervoso. Revisão dos principais artigos encontrados com os termos “probucol” e “neuron” no PubMed. ... 29 Tabela 2 - Efeitos do PB e seus derivados na atividade da enzima 12-LOX humana purificada. ... 78
12-HETE – 12-Hydroxyeicosatetraenoic acid (ácido 12-hidroxieicosatetraenoico)
AIF – Apoptosis Inducing Factor (Fator Indutor de Apoptose) ANOVA – Análise de Variância
ARE – Antioxidant Response Element (Elemento de Resposta Antioxidante)
ATP – Adenosine Triphosphate (Trifosfato de Adenosina) AVC – Acidente Vascular Cerebral
BSA – Bovine Serum Albumin (Albumina Sérica Bovina) BSO – Butionina Sulfoximina
CAT – Catalase CTB – CellTiter-Blue®
CTE – Cadeia de Transporte de Elétrons
DCFH-DA – 2',7'-Dicloro-Dihidro-Fluoresceína Diacetato DMSO – Dimetil sulfóxido
DO – Densidade Óptica
DPI – Diphenyleneiodonium (Difenilenodionio) DPPH – 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazil
EDTA – Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético)
ER – Espécies Reativas
ERN – Espécies Reativas de Nitrogênio ERO – Espécies Reativas de Oxigênio
FCCP – Carbonil Cianeto 4-(Trifluorometoxi) Fenilidrazona FMN – Flavina Mononucleotídeo
GCL – Glutamato Cisteína Ligase
GFP – Green Fluorescent Proteín (Proteína Fluorescente Verde) Glu – Glutamato
GPx – Glutationa Peroxidase GR – Glutationa Redutase GSH – Glutationa Reduzida GSSG – Glutationa Oxidada
HBSS – Hank’s Balanced Salt Solution
HDL – High Density Lipoprotein (Lipoproteína de Alta Densidade) IP – Iodeto de Propídeo
LDL – Low Density Lipoprotein (Lipoproteína de Baixa Densidade) LOX – Lipoxigenase
MSA – β-Mercaptosuccinic Acid (Ácido β-Mercaptosuccínico) MTT – 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio
NADPH – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Reduzida NPSH – Non Protein Thiol (Tióis Não Proteicos)
Nrf2 – Fator Nuclear (Derivado de Eritroide 2) 2 PB – Probucol
PI3K – Phosphatidylinositol-3 Kinase (Fosfatidilinositol-3 Cinase) PMM – Potencial de Membrana Mitocondrial
SDS – Dodecil Sulfato De Sódio SFB – Soro Fetal Bovino SNC – Sistema Nervoso Central SOD – Superóxido Dismutase tBid – Bid truncada
tBuOOH – Tert-Butil Hidroperóxido Trx – Tiorredoxina
Ca2+ – Cálcio
CuOOH – Cumeno Hidroperóxido Fe2+ – Íon Ferroso
Fe3+ – Íon Férrico H2O – Água
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio MeHg – Metilmercúrio
O2 – Oxigênio Molecular O2•- – Ânion Superóxido OH•- – Radical Hidroxila
1 INTRODUÇÃO ... 25 1.1 ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES
25
1.2 PROBUCOL ... 28 1.3 O MODELO DE OXITOSE EM CÉLULAS HT22 ... 31 2 JUSTIFICATIVA ... 35 3 OBJETIVOS ... 37 3.1 OBJETIVOS GERAIS ... 37 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 37 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 39 4.1 CULTURA CELULAR ... 39
4.2 PREPARAÇÃO DE NEURÔNIOS CORTICAIS
PRIMÁRIOS DE CAMUNDONGOS ... 39 4.3 TESTES DE MORTE E VIABILIDADE CELULAR ... 39 4.4 OBTENÇÃO DE MICROGRAFIAS DE CONTRASTE DE FASE 40
4.5 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE NPSH ... 41
4.6 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES
REATIVAS (ER) ... 41 4.7 ATIVIDADE SEQUESTRADORA DO RADICAL 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZIL (DPPH) ... 42
4.8 DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL DE MEMBRANA
MITOCONDRIAL (PMM) ... 42
4.9 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE O2•
-MITOCONDRIAL ... 42 4.10 ANÁLISE DA MORFOLOGIA MITOCONDRIAL ... 43 4.11 ANÁLISE DO CONSUMO DE O2 MITOCONDRIAL ... 44 4.12 EXPRESSÃO DA BID TRUNCADA (tBID) ... 44 4.13 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA LOX HUMANA PURIFICADA ... 45
4.14 ANÁLISE DA PRODUÇÃO DE HIDROPERÓXIDOS LIPÍDICOS ... 45 4.15 IMUNODETECÇÃO DA PROTEÍNA GPX1 ... 46 4.16 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA GPX . 47 4.17 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 48 5 RESULTADOS ... 49 5.1 CURVAS DE CONCENTRAÇÃO DO GLU E DOS COMPOSTOS... 49 5.2 EFEITO PROTETOR DOS COMPOSTOS NA MORTE INDUZIDA POR GLU ... 51 5.3 EFEITO DOS COMPOSTOS FRENTE A DEPLEÇÃO DE GSH INDUZIDA POR GLU ... 58 5.4 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DOS COMPOSTOS... 62
5.5 ENVOLVIMENTO DA VIA DA PI3K/AKT NA
NEUROPROTEÇÃO EXERCIDA PELOS COMPOSTOS... 66
5.6 ENVOLVIMENTO DA PKC NO PAPEL
NEUROPROTETOR EXERCIDO PELOS COMPOSTOS ... 68 5.7 PARAMÊTROS MITOCONDRIAIS EM CÉLULAS HT22 EXPOSTAS AO PB E SEUS DERIVADOS E/OU GLU ... 70 5.8 EFEITOS DOS COMPOSTOS NA PRODUÇÃO DE HIDROPERÓXIDOS LIPÍDICOS ... 78 5.9 PAPEL DA GPX NA PROTEÇÃO EXERCIDA PELOS COMPOSTOS... 80 5.10 EFEITO PROTETOR DOS COMPOSTOS FRENTE À INATIVAÇÃO DA GPX4 ... 85 6 DISCUSSÃO ... 87 7 CONCLUSÕES ... 97 REFERÊNCIAS ... 99 ANEXO I – Patente ... 113 ANEXO II – Manuscrito ... 115
1 INTRODUÇÃO
1.1 ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES
O estresse oxidativo, em uma definição clássica, é uma condição patofisiológica caracterizada por um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e os níveis de defesas antioxidantes. Porém, abordagens mais recentes mostram o estresse oxidativo como algo mais complexo (Sies, 2015). Hoje sabe-se que alguns oxidantes, principalmente o peróxido de hidrogênio (H2O2), podem ser geradas de forma específica pelo metabolismo, atuando em várias vias de sinalização celular, como vias de proliferação, diferenciação, reparo tecidual e inflamação (D'autréaux e Toledano, 2007; Sies, 2014).
O estresse oxidativo está envolvido em muitas doenças humanas, tais como o câncer, traumas, doenças cardiovasculares, autoimunes e neurodegenerativas, tendo também um importante papel no processo de envelhecimento (Finkel e Holbrook, 2000). Muitos agentes exógenos, tais como drogas e contaminantes ambientais, podem induzir um estado de estresse oxidativo. Nestas situações aqui descritas, as EROs podem ser geradas como um subproduto do metabolismo mitocondrial (Hayashi e Cortopassi, 2015).
As mitocôndrias são organelas celulares que possuem uma dupla membrana, sendo responsáveis pela produção de trifosfato de adenosina (ATP) em células eucarióticas através do processo de fosforilação oxidativa. Em sua membrana interna, estão embebidas as enzimas que formam a cadeia de transporte de elétrons (CTE). Os elétrons são transferidos entre os complexos da CTE enquanto o oxigênio molecular (O2) é utilizado como aceptor final de elétrons. A passagem de elétrons pela CTE fornece energia para o bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas, gerando o potencial eletroquímico necessário para a síntese de ATP no processo de fosforilação oxidativa (Hatefi, 1985). No entanto, mesmo em condições fisiológicas, os elétrons podem escapar da CTE antes que eles possam reduzir completamente o O2 em água (H2O). Nesses casos, os elétrons reagem com o O2 e formam a ERO ânion superóxido (O2•-). Como um radical livre, ou seja, tendo um elétron desemparelhado na camada de valência, o O2•- pode reagir com proteínas e lipídios, levando à disfunção celular e causando danos na membrana plasmática da célula. Além disso, a partir do O2•- é gerado o radical hidroxila (OH•-) numa reação dependente de ferro (Murphy, 2009). A enzima superóxido
dismutase (SOD) é responsável por catalisar a conversão do O2•- em H2O2, uma forma mais estável e menos reativa que o O2•- (Mccord e Fridovich, 1969). O H2O2, por sua vez, pode reagir com o íon ferroso (Fe2+) para formar OH•- e íon férrico (Fe3+), um processo conhecido como reação de Fenton (Figura 1). O OH•- é a ERO mais danosa por ser muito reativa, causando danos oxidativos nas proteínas, peroxidação lipídica, além de quebras e oxidações nas cadeias de DNA, sendo que não há nenhuma enzima que possa catalisar a sua degradação (Imlay et al., 1988).
As células eucarióticas contam com defesas antioxidantes para antagonizar os efeitos deletérios das EROs (Davies, 2000). A SOD é, como dito anteriormente, a enzima responsável por catalisar a conversão do O2•- em H2O2, que apesar de ser uma ERO, não é um radical livre, sendo então menos reativo que o O2•- (Mccord e Fridovich, 1969). Para evitar que o H2O2 reaja com o Fe2+ com a consequente produção de OH•-, as enzimas catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) catalisam a quebra do H2O2 em O2 e H2O (Figura 1). A CAT é uma enzima contendo heme que está presente em grandes quantidades nos peroxissomos, enquanto a GPx degrada H2O2 dependendo da concomitante oxidação de glutationa reduzida (GSH), sendo que algumas isoformas também são capazes de reduzir hidroperóxidos lipídicos (Díaz et al., 2012; Brigelius-Flohé e Maiorino, 2013). Além disso, as abundantes enzimas da classe das peroxirredoxinas são peroxidases dependentes de grupos tiós em seus sítios ativos que também atuam na defesa contra as EROs (Poole et al., 2001). Ainda, a selenoenzima tiorredoxina redutase (TrxR) atua revertendo as alterações oxidativas causadas em proteínas pelas EROs, sendo sua função catalisar a redução da tiorredoxina (Trx) que, nessa forma, pode reduzir pontes dissulfeto, sulfóxidos em resíduos de cisteína e resíduos de metionina oxidados em proteínas, restaurando suas funções originais (Arnér e Holmgren, 2000). O controle da expressão de muitos genes envolvidos na defesa antioxidante está associado com a translocação nuclear da proteína fator nuclear (derivado de eritroide 2) 2 (Nrf-2), um fator de transcrição que, em condições celulares pró-oxidativas, ativa a expressão gênica de diversas enzimas com ação antioxidante. Essa proteína, na presença de agentes eletrofílicos, se desliga da proteína Keap1 e, no núcleo, se liga aos elementos de resposta antioxidante (ARE), sequência presente na região promotora de genes que codificam proteínas antioxidantes, ativando a transcrição dos mesmos (Ishii et al., 2000). Além das defesas enzimáticas acima mencionadas, moléculas orgânicas de baixo peso molecular, como vitamina C e bilirrubina, são
capazes de degradar EROs de uma forma não-enzimática (Bartosz, 2010; Koekkoek e Zanten, 2016).
Figura 1 - Esquema mostrando as EROs que se formam quando os elétrons escapam da CTE, bem como as defesas antioxidantes intracelulares que as depletam.
A ubiquinona (representada como Q), quando reduzida de forma incompleta, i.e., na forma de radical semiquinona, pode reagir diretamente com o O2 e
formar o O2•- que, por sua vez, é convertido em H2O2 pela SOD. Tanto o O2•
-quanto o H2O2 podem reagir com o Fe2+ e formar o OH•-. O H2O2 é quebrado
em O2 e H2O pela CAT e/ou GPx.
Os neurônios, células responsáveis pela comunicação no sistema nervoso de mamíferos, são especialmente suscetíveis aos danos causados pelas EROs. Isto é devido ao fato de eles possuírem baixos níveis de defesas antioxidantes e conterem um elevado teor de ácidos graxos poli-insaturados em suas membranas, que são mais suscetíveis ao dano oxidativo. Além disso, o sistema nervoso central (SNC) apresenta níveis elevados de ferro e cobre, o que facilita a reação de Fenton/Haber Weiss. Adicionalmente, as células neuronais consomem muito O2, aumentando o fluxo de elétrons na CTE mitocondrial e, consequentemente, a produção de EROs (Wang e Michaelis, 2010). Muitas doenças neurodegenerativas têm o estresse oxidativo como uma de suas principais características, o que provavelmente desempenha um papel importante no processo de morte neuronal. Assim sendo, disfunção mitocondrial e estresse oxidativo estão associados com o
desenvolvimento de condições neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer, de Parkinson e de Huntington, bem como a esclerose lateral amiotrófica (Bhat et al., 2015).
A fim de reduzir o impacto da produção de EROs, muitas abordagens terapêuticas sugerem que o uso de compostos que aumentam a expressão das enzimas de defesas antioxidantes acima mencionadas, bem como a adição de flavonoides e ácidos graxos ω-3 na dieta, podem ajudar a prevenir patologias associadas ao estresse oxidativo (Casañas‐ Sánchez et al., 2014; Amara et al., 2015). Assim, os danos oxidativos induzidos pelas EROs são evitados, levando ao retardamento do avanço de tais doenças, incluindo condições neurodegenerativas (Mcbean et al., 2016). Muitos destes compostos são compostos fenólicos naturais encontrados em plantas que, além de atuarem como antioxidantes diretos (i.e., apresentam atividade scavenger de radicais livres), são capazes de aumentar a defesa celular antioxidante. Muitos compostos antioxidantes sintéticos também estão disponíveis ou sob investigação (Molino et al., 2016). Um composto sintético que possui propriedades antioxidantes e que chamou a atenção do nosso grupo de pesquisa é o fármaco hipolipidemiante probucol.
1.2 PROBUCOL
O probucol (PB) é um composto fenólico que, durante muitos anos, foi utilizado como um fármaco não-estatina para o tratamento da hipercolesterolemia. Apesar de ainda ser usado no Japão, o PB não é mais utilizado nos países ocidentais por induzir uma diminuição nos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) e aumentar o intervalo QT no eletrocardiograma dos pacientes (Yamashita e Matsuzawa, 2009; Yamashita et al., 2015). O mecanismo pelo qual o PB exerce seu efeito hipocolesterolêmico é principalmente através do aumento da excreção do colesterol na bile (Tawara et al., 1986). Estudos mostram que o PB também pode inibir a oxidação e a deposição tecidual de lipoproteína de baixa densidade (LDL), inibindo assim a aterogênese (Parthasarathy et al., 1986; Niimi et al., 2013), além de inibir a formação de células espumosas por macrófagos THP-1 in vitro (Yamamoto et al., 1988). Estudos também mostram os efeitos benéficos de alguns análogos do PB. Um exemplo é o succinobucol, que apresentou propriedades farmacocinéticas e anti-inflamatórias superiores quando comparado com o PB (Sundell et al., 2003; Murata et al., 2004), além de já ter sido usado em testes clínicos (Muldrew e Franks, 2009) e ter sido
demonstrado que o mesmo não induz a prolongação do intervalo QT (Tardif et al., 2003).
Adicionalmente, o nosso grupo observou que o PB e o seu derivado, succinobucol, apresentam efeitos neuroprotetores em uma variedade de modelos de doenças neurodegenerativas, e ainda contra a intoxicação por metilmercúrio (MeHg), em parâmetros tanto bioquímicos quanto neurológicos/comportamentais (Farina et al., 2009; Colle et al., 2012; Ribeiro et al., 2013; Santos et al., 2015). A Tabela 1 resume alguns dos efeitos pré-clínicos do PB publicados previamente.
Tabela 1 - Ações pré-clínicas e mecanismos de ação do PB em estudos envolvendo o sistema nervoso. Revisão dos principais artigos encontrados com os termos “probucol” e “neuron” no PubMed.
Estudo Efeito do PB observado Possíveis mecanismos atribuídos
Naito et al. (1995) Proteção de células PC12 em um desafio de glutamato.
Inibição da produção de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico Pike et al. (1997) Proteção de neurônios
hipocampais de rato em um desafio com peptídeo β-amiloide.
Inibição da produção de EROs.
Cameron e Cotter (1999) Reversão do decréscimo da velocidade do impulso nervoso no nervo ciático de ratos diabéticos.
Inibição da produção de EROs.
Pillot et al. (2000) Proteção de neurônios corticais expostos à proteína priônica celular.
Inibição da produção de EROs.
Gassó et al. (2001) Proteção de neurônios granulares cerebelares de um desafio com MeHg.
Inibição da produção de EROs.
Sponne et al. (2003) Proteção de neurônios corticais de ratos de um desafio com peptídeo β-amiloide.
Inibição da ruptura do citoesqueleto das células.
Sponne et al. (2004) Proteção de oligodendrócitos de um desafio com peptídeo derivado da proteína priônica
-
Ved et al. (2005) Proteção do Caenorhabditis elegans em um modelo da doença de Parkinson.
Inibição da produção de EROs.
Farina et al. (2009)* Proteção de neurônios granulares cerebelares de um desafio com MeHg.
Aumento da atividade da GPx1.
Al-Majed (2011) Proteção de ratos em um modelo de isquemia do prosencéfalo.
Aumento dos níveis de GSH e ATP.
Colle et al. (2012)* Proteção de fatias estriatais de ratos em um modelo da doença de Huntington.
Inibição da produção de EROs.
Santos et al. (2012)* Proteção de camundongos em um modelo da doença de Alzheimer.
Aumento da atividade da enzima glutationa redutase e inibição da peroxidação lipídica.
Colle et al. (2013a)* Proteção de sinaptossomas enriquecidas com mitocôndrias em um desafio com ácido 3-nitropropiônico.
Inibição da produção de EROs.
Colle et al. (2013b)* Proteção de ratos em um modelo da doença de Huntington.
Ribeiro et al. (2013)* Proteção de camundongos em um modelo da doença de Parkinson.
Aumento da atividade da enzima GPx1.
Ray et al. (2014) Proteção de C. elegans em um modelo da doença de Parkinson
Inibição da produção de EROs.
Santos et al. (2015)* Proteção de camundongos expostos à estreptozotocina.
Aumento da atividade da enzima GPx1.
Zhou et al. (2016) Proteção de ratos submetidos a um modelo de lesão da medula espinhal.
Aumento da via de sinalização mTOR.
Caballero et al. (2017) Proteção de neurônios cerebelares granulares de um desafio com MeHg.
Inibição da translocação da cofilina e actina para a mitocôndria.
De Paula Nascimento-Castro et al. (2018)
Proteção de camundongos em um modelo da doença de Huntington.
-
*Estudos publicados pelo nosso grupo de pesquisa.
Em estudos publicados pelo nosso grupo, foi observado um aumento da atividade da enzima GPx induzido pelo PB in vivo (Colle et al., 2013a) e um aumento na atividade da enzima glutamato cisteína ligase (GCL; enzima que catalisa a etapa limitante da síntese de GSH) induzido por succinobucol in vitro (Colle et al., 2016). Assim, o nosso grupo de pesquisa se interessou por avaliar o efeito protetor de novos compostos inéditos derivados do PB, os quais poderiam não apresentar os efeitos colaterais do PB. Estudos prévios sugerem que a síntese de novos análogos do PB é uma alternativa eficaz para a obtenção de moléculas úteis para o tratamento de doenças, incluindo neurodegenerativas (Ladopoulou et al., 2013). Em colaboração com o Prof. Dr. Antônio Luiz Braga (Departamento de Química/CFM/UFSC), nós obtivemos dois novos compostos derivados do PB, o RC363 e o RC574 (Figura 2).
Figura 2 - Os compostos que foram avaliados no presente estudo.
Esses compostos foram planejados através da técnica de simplificação molecular, de modo que a porção molecular responsável pela ação farmacológica (grupamento contendo dois átomos de enxofre e porção fenólica) foi mantida em relação às distâncias interatômicas com simplificação e enrijecimento da cadeia lateral (Pinacho Crisóstomo et al., 2006). Além disso, foi sintetizado um derivado de
selênio, prevendo um possível bioisosterismo em relação ao análogo de enxofre e possibilitando a avaliação de compostos com diferentes graus de lipossolubilidade, já que o uso de compostos orgânicos contendo selênio são conhecidos por apresentarem maior potência farmacológica quando comparados com os seus análogos de enxofre (Nogueira et al., 2004). Estudos futuros poderão avaliar se estas alterações na estrutura do PB poderão melhorar parâmetros farmacocinéticos como absorção, distribuição e tempo de meia-vida, levando à obtenção de estruturas adequadas para o desenvolvimento de fármacos. A modulação pontual dos átomos presentes na estrutura possibilitará estudos detalhados de relação estrutura-atividade.
Como mencionado anteriormente, nós observamos que o PB e o succinobucol modulam a atividade da GPx e aumentam os níveis de GSH por meio de um aumento na atividade da GCL. Assim, surgiu o interesse de testar o potencial efeito neuroprotetor dos novos compostos derivados do PB em um modelo de depleção de GSH em células neuronais, o que pode ser feito tratando as células da linhagem HT22 com uma alta concentração de glutamato (Glu).
1.3 O MODELO DE OXITOSE EM CÉLULAS HT22
As células HT22 constituem uma linhagem celular que apresenta características neuronais, sendo derivada da linhagem HT4, constituída, por sua vez, por neurônios hipocampais de camundongo. Apesar destas células expressarem receptores metabotrópicos de Glu (Guan et al., 2015; Sato et al., 2016) e receptores colinérgicos (Liu et al., 2009), estas células não expressam receptores ionotrópicos de Glu (Davis e Maher, 1994), o que exclui a possibilidade de se induzir excitotoxicidade glutamatérgica nestas células. Porém, quando estas células são expostas a concentrações elevadas de Glu (2-8 mM), o sistema antiporte de cistina/glutamato (sistema xc-) é inibido/revertido, diminuindo os níveis de cisteína intracelulares, um importante precursor biossintético da GSH (Murphy et al., 1989).
O sistema xc-, responsável por fazer o antiporte cistina/glutamato, medeia a captação do aminoácido cistina em troca do Glu. O sistema é composto por duas subunidades: uma cadeia leve xCT, que confere especificidade e realiza a atividade de transporte, e uma cadeia pesada 4F2, altamente conservada em outros transportadores de aminoácidos. As duas subunidades são ligadas por uma ponte dissulfeto (Sato et al., 2000; Lewerenz et al., 2012a) (Figura 3). A força motriz do sistema é a alta concentração intracelular e baixa concentração extracelular de Glu
que, quando presente em altas concentrações extracelulares, inibe a atividade do sistema, sendo o Glu o único inibidor fisiológico deste transportador. Ao ser inibido, as concentrações de cistina e, consequentemente, cisteína intracelulares, decrescem rapidamente, comprometendo a síntese de GSH (Lewerenz et al., 2012b), demonstrando que o sistema xc- possui duas funções: o de controle do Glu extracelular e uma função “antioxidante”. O decréscimo de GSH intracelular leva a uma cascata de eventos que resulta em produção de EROs, disfunção mitocondrial e ativação de vias de apoptose, induzindo um tipo de morte celular programada chamado oxitose, também conhecido como ferroptose. Este tipo de morte se diferencia da apoptose principalmente por não ser necessária a ativação de caspases (Shirlee et al., 2001; Lewerenz et al., 2018).
Figura 3 - Esquema da estrutura do trocador cistina/glutamato (xc-).
O sistema é composto por duas subunidades: uma cadeia leve xCT, que confere especificidade e realiza a atividade de transporte, e uma cadeia pesada 4F2, altamente conservada em outros transportadores de aminoácidos. As duas subunidades são ligadas por uma ponte dissulfeto. (Lewerenz et al., 2012b)
A depleção de GSH leva, através de uma diminuição da atividade da GPx4 por um mecanismo desconhecido (Seiler et al., 2008), à ativação de lipoxigenases (LOX) que catalisam a produção de hidroperóxidos lipídicos (Li et al., 1997; Pallast et al., 2009). Estes peróxidos solúveis causam danos às mitocôndrias que, por sua vez, liberam proteínas que sinalizam apoptose, como o citocromo c e o fator indutor de apoptose (AIF), além da geração de um segundo boost de EROs mitocondrial. Este processo parece ter envolvimento da proteína Bid que, ao ser translocada para a mitocôndria após ser clivada pela caspase-8, ativa vias de morte celular (Tobaben et al., 2011; Neitemeier et al., 2017) (Figura 4). Além disso, as EROs geradas causam a ativação continuada de várias famílias de proteínas cinases, como a família das MAPK, que acabam contribuindo para o processo de morte celular (Fukui et al., 2009).
Figura 4 - Esquema mostrando a cascata de eventos intracelulares após a exposição da célula a altas concentrações de Glu.
Altas concentrações de Glu provocam a depleção da cistina intracelular, levando a diminuição da atividade da GPx4 e ativação da LOX. A LOX, por sua vez, catalisa a formação de peróxidos lipídicos que causam influxo de cálcio (Ca2+) além de danos oxidativos nas mitocôndrias, levando a morte celular por
oxitose/ferroptose (Lewerenz et al., 2018).
O modelo de oxitose em células HT22 é amplamente utilizado para compreender os mecanismos de morte celular induzida por estresse oxidativo, bem como para descobrir novas abordagens terapêuticas que previnam condições neurodegenerativas onde o estresse oxidativo está
envolvido (Albrech et al., 2010), já que o mesmo parece estar profundamente envolvido na morte por oxitose em células HT22, considerando que o tratamento com compostos antioxidantes é eficiente em prevenir a morte celular (Behl, 2000; Fukui et al., 2010).
2 JUSTIFICATIVA
A compreensão dos mecanismos de morte neuronal em doenças neurodegenerativas, assim como o papel do estresse oxidativo em tais processos, é uma questão relevante para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas bem-sucedidas para tais doenças. Além disso, é importante descobrir novos compostos com potenciais propriedades neuroprotetoras, de modo a evitar/retardar o processo de morte neuronal. Levando em consideração os resultados obtidos anteriormente com o PB e o succinobucol, estamos interessados na compreensão dos mecanismos relacionados a tal proteção, além da eficácia dos novos compostos aqui apresentados. Além disso, a compreensão de como estes compostos tornam as células mais resistentes ao estresse oxidativo pode ajudar na compreensão dos mecanismos moleculares de morte neuronal induzida por estresse oxidativo, gerando informações que serão usadas no futuro para o desenvolvimento racional de novas estratégias terapêuticas no tratamento de doenças neurodegenerativas.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Em uma tentativa de melhor compreender os efeitos do PB e seus derivados em cultivos celulares expostos a uma situação de estresse oxidativo, o objetivo geral do presente estudo é avaliar se estes compostos apresentam propriedades protetoras usando células HT22 desafiadas com Glu como modelo e, em caso positivo, elucidar os mecanismos protetores dos mesmos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i. Avaliar os efeitos do tempo e concentração na possível proteção conferida pelos compostos derivados do PB na morte neuronal induzida por Glu;
ii. Avaliar o efeito protetor dos compostos em um modelo de oxitose em neurônios corticais primários de camundongos;
iii. Avaliar a produção de EROs em neurônios tratados com os compostos e/ou Glu;
iv. Determinar se o mecanismo protetor dos compostos é devido a uma atividade antioxidante direta;
v. Determinar os níveis de tióis não proteicos (NPSH) em células HT22 tratadas com Glu e/ou compostos;
vi. Avaliar o papel das vias da fosfatidilinositol-3 cinase (PI3K)/Akt e da proteína cinase C (PKC) na possível proteção exercida pelos compostos;
vii. Determinar os efeitos dos compostos e/ou Glu em parâmetros mitocondriais como potencial de membrana mitocondrial, produção de EROs mitocondriais, morfologia mitocondrial, consumo de O2 mitocondrial e morte induzida por tBid;
viii. Avaliar o efeito dos compostos na produção de hidroperóxidos lipídicos em células HT22 desafiadas com Glu;
ix. Avaliar o papel das enzimas GPx1 e GPx4 no efeito protetor dos compostos.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 CULTURA CELULAR
A linhagem neuronal HT22 foi gentilmente cedida pelo Prof. Dave Schubert (Instituto Salk, La Jolla, CA, EUA). As células foram mantidas em dubecco’s modified eagle medium (DMEM) suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) 10%, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 µg/mL) e glutamina (2 mM) a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As células foram repicadas a cada dois dias por tripsinização (Tripsina-EDTA a 0,05%) e usadas entre as passagens 5-15.
4.2 PREPARAÇÃO DE NEURÔNIOS CORTICAIS PRIMÁRIOS DE CAMUNDONGOS
A preparação dos neurônios corticais primários de camundongos foi realizada como descrito anteriormente (Steinbeck et al., 2011). Filhotes de camundongos C57BL/6J no 18º dia embrionário foram decapitados, o cérebro removido e o neocórtex de cada hemisfério cerebral dissecado. As meninges foram removidas e o tecido foi fragmentados. A separação das células foi feita por tripsinização do tecido, seguido de trituração. Os neurônios corticais foram cultivados em placas de 96 poços pré-revestidas com poli-L-lisina na presença de meio condicionado de astrócitos numa atmosfera umidificada a 37°C e 5% de CO2, numa densidade de 50.000 neurônios por poço. Após 3 horas, o meio foi trocado por um novo meio DMEM contendo 5% de SFB. No dia seguinte, as células foram tratadas concomitantemente com os compostos (3 µM) e Glu (5 mM) durante 24 horas.
4.3 TESTES DE MORTE E VIABILIDADE CELULAR
Para determinar os efeitos dos compostos e/ou Glu na viabilidade celular, as células foram semeadas em placas de 96 poços numa densidade de 2.500 células por poço 24 horas antes do tratamento com os compostos a 1, 3 e 5 µM, ou veículo (etanol 0,1%). A sequência de cada condição de tratamento (diferentes compostos e concentrações), bem como sua posição na placa de 96 poços, foi feita de forma aleatória numa tentativa de minimizar potenciais vieses. Vinte e quatro horas após o tratamento com os compostos, o meio foi substituído por um novo contendo SFB 3% (a concentração de SFB foi diminuída durante a
incubação com o Glu numa tentativa de conter a proliferação celular observada no tratamento com os compostos, já que a confluência das células HT22 pode influenciar a sensibilidade das mesmas ao Glu) e as células foram tratadas com Glu (3 ou 5 mM) durante 1, 3, 6 ou 24 horas. Após a incubação com Glu, as células foram submetidas ao teste do iodeto de propídeo (IP), um composto químico impermeável a membrana plasmática que, ao se ligar ao DNA de células em processo de morte (i.e. com danos na membrana plasmática), emite uma fluorescência vermelha, permitindo a mensuração da morte celular (Nieminen et al., 1992). Para isso, 5 µL de IP 147 µg/mL foram adicionados em cada poço, seguido de uma incubação de 20 minutos a 37°C no escuro. A fluorescência foi mensurada em um leitor de microplacas nos comprimentos de onda de 535 nm (excitação) e 617 nm (emissão) (Tecan, Mannedorf, Suíça). Em seguida, as células foram submetidas ao teste do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT), um composto químico que, ao ser metabolizado pelas desidrogenases mitocondriais, forma um produto de coloração roxa chamado formazan, que ao ser solubilizado em dimetil sulfóxido (DMSO), pode ser usado para medir a viabilidade celular (Mosmann, 1983). Para isso, o meio das células foi removido e 100 µL de uma solução de MTT 0,5 µg/mL a 37°C foram adicionados em cada poço, seguido de uma hora de incubação a 37°C. Em seguida, os poços foram esvaziados e o produto formazan foi dissolvido em 100 µL de DMSO e a absorbância lida em um leitor de microplacas em um comprimento de onda de 540 nm (Tecan, Mannedorf, Suíça). Alternativamente, as células foram submetidas ao teste CellTiter-Blue® (CTB), onde as células são expostas ao composto resazurina que, ao ser metabolizado por células viáveis, forma o produto fluorescente redorufina (O'brien et al., 2000). Para isso, foram adicionados 20 µL do reagente no meio das células, seguido de uma incubação a 37°C durante 4 horas. Em seguida, a fluorescência foi mensurada a 562/590 nm (excitação/emissão) utilizando um leitor de microplacas (Tecan, Mannedorf, Suíça).
4.4 OBTENÇÃO DE MICROGRAFIAS DE CONTRASTE DE FASE As células foram semeadas em placas de 96 poços numa densidade de 2.500 células por poço 24 horas antes do tratamento com os compostos a 3 µM ou veículo (etanol 0,1%). Vinte e quatro horas após o tratamento com os compostos, o meio foi substituído por um novo contendo SFB 3% e as células foram tratadas com Glu 5 mM durante 24 horas. Em seguida, as células foram fotografadas em um
microscópio Axio Invertido 40 CFL, usando uma câmera CARL ZEISS em 100x de aumento.
4.5 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE NPSH
Para avaliar os efeitos do Glu e/ou dos compostos no conteúdo de NPSH, as células HT22 foram semeadas em placas de 6 poços numa densidade de 50.000 células por poço, e então tratadas 24 horas após o plaqueio com os compostos na concentração de 3 µM. Após 24 horas, o meio foi trocado por um novo contendo SFB 3%, e as células foram tratadas com Glu 5 mM durante 6 ou 24 horas. As células foram lavadas com hank’s balanced salt solution (HBSS), coletadas em 200 µL de PBS/Triton 0,5% e misturadas com uma solução de ácido tricloroacético 10%. Após a centrifugação (5.000 x g a 4°C por 10 minutos), o pellet de proteínas foi descartado e os grupos tióis livres foram determinados conforme descrito por Ellman (1959). A absorbância foi lida em 412 nm usando GSH como padrão. Os valores foram ajustados pela quantidade de proteína nas amostras, que foi determinada conforme descrito por Lowry et al. (1951). Os valores são expressos como porcentagem do controle.
4.6 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS (ER)
Para avaliar o efeito do Glu e/ou dos compostos na produção de ER, foi utilizada a sonda fluorescente 2',7'-dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato (DCFH-DA) que, ao ser internalizada pelas células e ter seus grupos acetato removidos, emite uma fluorescência verde ao reagir com compostos que possuem um elétron desemparelhado na camada de valência (Kalyanaraman et al., 2012).
As células HT22 foram semeadas em placas de 12 poços numa densidade de 25.000 células por poço, e então tratadas após 24 horas do plaqueio com os compostos na concentração de 3 µM. Após 24 horas, o meio foi trocado por um novo contendo SFB 3%, e as células foram tratadas com Glu a 5 mM durante 6 horas. As células foram então incubadas com DCFH-DA na concentração de 1 µM durante 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com HBSS, coletadas via tripsinização, e a intensidade da fluorescência foi analisada em citometria de fluxo no canal FITC (FACSCanto II, BD, EUA). Ao menos 10.000 eventos foram registrados por amostra.
4.7 ATIVIDADE SEQUESTRADORA DO RADICAL 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZIL (DPPH)
Para avaliar se os compostos possuem atividade sequestradora de radicais livres, foi utilizado o teste do DPPH. Este composto de cor púrpura possui um elétron desemparelhado na camada de valência e, ao ser reduzido por um composto antioxidante, muda para a cor amarela (Sharma e Bhat, 2009). Os compostos e o controle positivo ácido ascórbico, na concentração de 25 µM, foram incubados durante 20 minutos com o radical estável DPPH (0,3 µM) em etanol absoluto. Em seguida, foi feita a leitura da absorbância (518 nm) em um leitor de microplacas (Tecan, Mannedorf, Suíça).
4.8 DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL (PMM)
Para avaliar os efeitos do Glu e/ou dos compostos no PMM, foi utilizada a sonda fluorescente JC-1. Esta sonda, em sua forma monomérica, emite fluorescência verde. Porém, ao se acumular no interior das mitocôndrias devido à carga elétrica negativa presente no interior das mesmas, a JC-1 forma agregados que emitem fluorescência na cor vermelha, permitindo assim a mensuração do PMM (Chazotte, 2011).
As células HT22 foram semeadas em placas de 24 poços numa densidade de 12.500 células por poço, e foram então tratadas 24 horas após o plaqueio com os compostos na concentração de 3 µM. Após 24 horas, o meio foi trocado por um novo contendo SFB a 3%, e as células foram tratadas com Glu 5 mM durante 9 horas. As células foram lavadas com HBSS e incubadas com JC-1 (5 µM) durante 20 minutos a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas e a fluorescência foi lida em um leitor de microplacas numa emissão de 488 nm e excitação de 525 e 590 nm, que correspondem aos J-agregados vermelhos e aos monômeros verdes, respectivamente. Os resultados são expressos como a razão da fluorescência vermelho/verde.
4.9 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE O2•- MITOCONDRIAL Para avaliar os efeitos do Glu e/ou dos compostos na produção de O2•- mitocondrial, foi utilizada a sonda fluorescente MitoSOX®, que detecta O2•- produzido na mitocôndria (Robinson et al., 2006).
As células HT22 foram semeadas em placas de 24 poços numa densidade de 12.500 células por poço, e foram então tratadas 24 horas após o plaqueio com os compostos na concentração de 3 µM. Após 24 horas, o meio foi trocado por um novo contendo SFB a 3%, e as células foram tratadas com Glu 5 mM durante 6 horas. As células foram lavadas com HBSS e incubadas com a sonda MitoSOX® na concentração de 5 µM (veículo: DMSO 0,1% final) durante 12 minutos a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas e a fluorescência foi lida em um leitor de microplacas numa emissão de 510 nm e excitação de 580 nm. Os resultados são expressos como porcentagem do controle.
4.10 ANÁLISE DA MORFOLOGIA MITOCONDRIAL
Para a análise da morfologia mitocondrial, foi usada a sonda fluorescente MitoTracker® Green, que se acumula na mitocôndria das células de uma forma independente do PMM, permitindo a análise da morfologia das mesmas (Pendergrass et al., 2004). As células HT22 foram semeadas em placas pretas de 96 poços com fundo transparente, em uma densidade de 2.500 células por poço, e então tratadas com os compostos a 3 µM. Após 24 horas, as células foram expostas a 5 mM de Glu durante 6 horas. As células foram então incubadas com MitoTracker® Green (200 nM) e Hoescht (0,5 µg/mL) durante 15 minutos em meio sem SFB a 37°C, e depois incubadas em meio normal durante mais 15 minutos a 37°C. As células foram então incubadas em tampão de Tyrose (NaCl 145 mM, HEPES 20 mM, NaCO3 5 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,5 mM, MgCl2 1 mM e KH2PO4 0,4 mM) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As imagens foram capturadas automaticamente em um microscópio Opera Phenix HCS (Perkin Elmer, Norwalk, EUA) e analisadas automaticamente no software Harmony®. As células foram classificadas como contendo mitocôndrias tubulares, intermediárias ou fragmentadas (Figura 5).
Figura 5 - Exemplos de imagens de células com mitocondriais tubulares, intermediárias e fragmentadas, respectivamente.
Foi realizado um “treinamento” do software, em que o usuário classificava algumas células dentro destes três grupos possíveis. Em seguida, o software classificava de forma automática as muitas células fotografadas de acordo com esse “treinamento”.
4.11 ANÁLISE DO CONSUMO DE O2 MITOCONDRIAL
Para analisar o consumo de O2 mitocondrial, foi utilizado um respirômetro de alta resolução (Oroboros Oxygraph-O2K, Áustria). As células HT22 foram semeados em placas de 100 mm a uma densidade de 500.000 células/placa. Após 24 horas, as células foram expostas aos compostos (3 µM) durante 24 horas, e depois a Glu 5 mM durante 6 horas. As células foram tripsinizadas, ressuspensas em 2 mL de meio e contadas. O consumo de oxigênio das células foi monitorado em uma câmara fechada sob agitação contínua de 750 r.p.m. a 37°C em 2 mL de meio de crescimento. Após a respiração de rotina ser registrada, 2 μg/µL de oligomicina foram adicionados para inibir a ATP sintase e estimar o consumo de O2 associado a produção de ATP. A capacidade máxima do sistema de transferência de elétrons foi avaliada pela titulação com o protonóforo carbonil cianeto 4-(trifluorometoxi) fenilidrazona (FCCP), um desacoplador da CTE em passos de 0,5 μM até que a respiração máxima fosse atingida. A respiração foi inibida pela adição de 0,5 μM de rotenona (inibidor do complexo I mitocondrial) e 2,5 μM de antimicina A (inibidor do complexo III mitocondrial) para determinar o consumo de O2 não mitocondrial (ROX). A respiração associada à produção de ATP foi determinada como: Respiração de rotina - respiração inibida com oligomicina. A capacidade respiratória máxima foi determinada como: respiração máxima - ROX. A capacidade de reserva foi determinada como: respiração máxima - respiração de rotina. 4.12 EXPRESSÃO DA BID TRUNCADA (tBID)
Para induzir a expressão da proteína tBid, as células HT22 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 12.500 células/poço. Após 24 horas, o meio foi substituído por 500 mL de um meio novo e as células foram tratadas com os compostos (3 µM) durante 24 horas. Os plasmídeos foram generosamente cedidos pelo Prof. Carsten Culmsee (Philipps-Universität Marburg, Alemanha) e foram sintetizados como descrito (Oppermann et al., 2014). 2 µg do plasmídeo contendo pIRES-tBid ou do plasmídeo contendo um vetor vazio pcDNA 3.11 foram dissolvidos separadamente em meio isento de SFB e 4,5 µL
do reagente de transfecção Attractene (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi adicionado à solução de DNA (para cada poço a ser tratado). Para permitir a formação dos complexos do reagente com os plasmídeos, as amostras foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionadas 60 µL da mistura de transfecção ao meio de cultura das células a uma concentração final de 2 µg de DNA/poço e 4,5 µL de Attractene/poço. Após 24 horas da transfecção, foi realizado o teste de viabilidade CTB.
4.13 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA LOX HUMANA PURIFICADA
A determinação do potencial efeito inibitório dos compostos na enzima 12-LOX humana purificada foi realizada conforme descrito por Ohri et al. (2005). A reação foi realizada em um volume de 2 mL sob agitação constante à temperatura ambiente. O tampão de reação foi composto por HEPES 25 mM (pH 8,0) e Triton 0,01%. O ácido araquidônico (10 µM) foi usado com substrato para a enzima. A atividade da enzima foi determinada através da produção do produto 12-HETE (ácido 12-hidroxieicosatetraenoico) monitorada a 234 nm. Os compostos foram adicionados (concentração final de 20 e 30 µM em DMSO) e a reação foi iniciada pela adição da enzima purificada (~200 nM) depois que uma leitura basal estável em 234 nm for observada. O controle foi determinado usando o mesmo volume de DMSO usado para adicionar os compostos. Os resultados são expressos como taxa de inibição da atividade enzimática.
4.14 ANÁLISE DA PRODUÇÃO DE HIDROPERÓXIDOS LIPÍDICOS
Para avaliar os efeitos do Glu e/ou dos compostos na produção de hidroperóxidos lipídicos, foi utilizada a sonda fluorescente Bodipy 581/591 C11 (Naguib, 1998).
As células HT22 foram semeadas em placas de 24 poços numa densidade de 12.500 células por poço, e foram então tratadas 24 horas após o plaqueio com os compostos na concentração de 3 µM. Após 24 horas, o meio foi trocado por um novo contendo SFB a 3%, e as células foram tratadas com Glu 5 mM durante 12 horas. As células foram lavadas com HBSS e incubadas com a sonda Bodipy 581/591 C11 na concentração de 5 µM (veículo: DMSO 0,1% final) durante 1 hora a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com HBSS,
coletadas via tripsinização, e a intensidade da fluorescência foi analisada em citometria de fluxo nos canais FITC (sonda oxidada) e PE (sonda reduzida) (FACSCanto II, BD, EUA). Ao menos 10.000 eventos foram registrados por amostra. Os resultados foram calculados como a razão entre a fluorescência da sonda oxidada sobre a sonda reduzida e são expressos como porcentagem do controle.
4.15 IMUNODETECÇÃO DA PROTEÍNA GPX1
Para avaliar os níveis da proteína GPx1 nas células HT22 após incubação com os compostos, foram utilizadas técnicas de imunodetecção via Western Blotting conforme descrito previamente (Lopes et al., 2015). Para isso, as células HT22 foram semeadas em placas de 6 poços numa densidade de 50.000 células por poço. Após 24 horas, as células foram tratadas com os compostos (3 µM) em triplicatas. Após 30 horas de incubação (sendo as últimas 6 horas com meio contendo SFB 3%), o meio foi removido, as células foram lavadas com PBS, e 100 µL de stop solution (Tris 100 mM pH 6,8, EDTA 4 mM, SDS 4%) foram adicionados ao poço. As células foram raspadas, sendo que estes mesmos 100 µL de solução foram usadas para fazer um pool de 3 poços para cada tratamento. Em seguida, as amostras foram fervidas a 100°C durante 8 minutos. A dosagem de proteínas foi determinada conforme descrito por Peterson (1977). Em seguida, foram adicionados nas amostras o tampão de diluição (40% glicerol, 100 mM Tris, azul de bromofenol, pH 6,8) 25:100 (v/v) e β-mercaptoetanol (concentração final 8%).
As proteínas (máximo de 60 g por poço) foram isoladas através de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS) utilizando gel de separação de acrilamida com concentração de 12% e gel de entrada 4%. A eletroforese foi realizada com corrente fixa de 60 mA e voltagem máxima de 150 V durante aproximadamente 2 horas e 15 minutos. Após a corrida, os géis foram submetidos ao processo de eletrotransferência e transferidos para membranas de nitrocelulose usando um sistema semi-dry (1,2 mA/cm2; 1,5 horas) como descrito previamente (Bjerrum e Heegaard, 1988). Para verificar a eficiência do processo de transferência, as membranas foram coradas com Ponceau S.
As membranas foram bloqueadas com 5% de albumina sérica bovina (BSA) em TBS (Tris 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,5) por 1 hora e, após sucessivas lavagens com TBS-T (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0,1%, pH 7,5), incubadas overnight (4ºC) com o anticorpo anti-GPx1 diluído em TBS-T contendo 2% de BSA na diluição de
1:2500. Para a detecção dos complexos imunes, as membranas foram incubadas por 1 hora com anticorpo secundário anti-mouse ou rabbit (conjugado à peroxidase) e reveladas em um fotodocumentador (ChemiDoc™ MP, Bio-Rad, California, EUA) após a emissão de quimioluminescência induzida por reagentes adicionados a membrana de acordo com as recomendações do fabricante. As membranas foram incubadas com o anticorpo anti-β-actina (1:2500) para verificar se a mesma quantidade de proteínas foi aplicada no gel. O imunoconteúdo foi determinado pela razão entre a densidade óptica (DO) da banda da proteína alvo e a DO da banda da β-actina. As bandas foram quantificadas utilizando o software ImageLab®.
4.16 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA GPX
Para determinar os níveis da atividade da enzima GPx, as células HT22 foram semeadas em placas de 100 mm numa densidade de 250.000 células por poço. Após 24 horas, as células foram tratadas com os compostos (3 µM) por mais 30 horas. Após esse período, as células foram coletadas por tripsinização, centrifugadas, lavadas com PBS e então ressuspendidas em 50 µL de tampão (sacarose 250 mM, Tris 20 mM pH 7,4, β-mercaptoetanol 400 µM). As amostras foram sonicadas no gelo durante 10 minutos 3 vezes, sendo homogeneizadas em um vortex durante 20 segundos em cada intervalo de sonicação. Após este processo, as amostras foram centrifugadas (10.000 g, 15 minutos, 4°C), e o sobrenadante coletado para posterior medida da atividade enzimática.
A atividade da GPx foi realizada conforme método descrito previamente (Wendel, 1981) otimizado para células HT22 (Panee et al., 2007). O meio de ensaio enzimático continha tert-butil hidroperóxido (tBuOOH) (0,32 mM), GSH (1,88 mM), glutationa redutase (GR) (84 mU), ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (1 mM), nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) (0,2 mM) e Tris pH 7,6 (100 mM). A GPx catalisa a redução do tBuOOH utilizando a GSH como co-substrato e produz glutationa oxidada (GSSG). A GSSG é reduzida pela GR com o consumo de NADPH, que foi mensurado através da leitura em espectrofotômetro a 340 nm. A atividade enzimática foi expressa como nanomoles de NADPH consumidos por minuto por miligrama de proteína.
4.17 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar se os dados apresentavam distribuição normal. Quando os dados apresentaram distribuição normal, a análise estatística foi feita usando o teste Análise de Variância (ANOVA) de uma ou duas vias seguido pelo teste de Tukey. Quando os dados não apresentaram distribuição normal, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn’s. Em todos os testes, a diferença foi considerada significativa quando P ≤ 0,05.
5 RESULTADOS
5.1 CURVAS DE CONCENTRAÇÃO DO GLU E DOS COMPOSTOS Inicialmente, avaliou-se o efeito dos compostos derivados do PB e do Glu, de forma isolada, na viabilidade e morte de células HT22, para que assim fosse determinada a concentração usada nos experimentos subsequentes. Para isso, as células foram plaqueadas e, após 24 horas, tratadas com os compostos ou com o veículo. Após a incubação de 24 horas, o meio foi trocado por um novo contendo 3% de SFB, e as células foram então tratadas com Glu (Figura 6).
As figuras 6A e 6B mostram o efeito do Glu na viabilidade e morte celular, respectivamente, em células HT22 de forma concentração dependente após 24 horas de incubação. O Glu causou um decréscimo na viabilidade celular e um aumento da morte, avaliados pelos métodos do MTT e incorporação do IP, de uma forma concentração dependente. As figuras 6C e 6D mostram o efeito do Glu em células HT22 de forma tempo dependente, nas concentrações de 3 e 5 mM. O Glu não causou nenhuma diminuição da viabilidade ou aumento da morte celular nos tempos de 1, 3 e 6 horas. Baseados nesses resultados, foi decidido que as concentrações de 5 e 10 mM de Glu seriam utilizadas para avaliar morte e viabilidade celular após 24 horas de incubação, e o tempo de 6 horas para avaliar os mecanismos de morte.
Figura 6 - Efeitos do Glu na viabilidade e morte celular em células HT22.
Após 48 horas do plaqueio, o meio foi substituído (SFB 3%) e as células foram expostas ao Glu (1, 3, 5, 8 e 10 mM) nos tempos e concentrações indicadas. Para o ensaio MTT, os dados são mostrados como porcentagem da viabilidade celular tendo o controle (células não tratadas) como 100%. Para o ensaio de incorporação do IP, os dados são mostrados como porcentagem de morte celular tendo células tratadas com Triton 0,2% como 100%. ANOVA de uma via seguido pelo teste Tukey. **P ≤ 0,01; ****P ≤ 0,0001 compara com seus respectivos controles. (n = 4)
As figuras 7A e 7B mostram o efeito do PB e seus derivados na viabilidade e morte celular, respectivamente, em células HT22 de forma concentração dependente após 48 horas de incubação. As concentrações usadas foram baseadas em estudos anteriores do nosso grupo, onde o PB e o succinobucol foram testados in vitro (Colle et al., 2013a; Colle et al., 2016). Os compostos não causaram perda de viabilidade ou morte nas
concentrações usadas (1, 3 e 5 µM). Apesar de não haver diferença significativa, os compostos parecem ter um efeito indutor de proliferação celular na concentração de 5 µM. Para evitar potenciais vieses relacionados a isso, a concentração de 3 µM foi escolhida para ser usada nos testes subsequentes.
Figura 7 - Efeitos do PB e seus derivados na viabilidade e morte celular em células HT22.
Após 24 horas do plaqueio, as células foram expostas aos compostos em etanol 0,1% (veículo) durante 48 horas. Para o ensaio do MTT, os dados são mostrados como porcentagem da viabilidade tendo o controle (células não tratadas) como 100%. Para o ensaio de incorporação do IP, os dados são mostrados como porcentagem de células tratas com Triton 0,2% como 100%. ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey (n=5).
5.2 EFEITO PROTETOR DOS COMPOSTOS NA MORTE INDUZIDA POR GLU
Definidas as concentrações, objetivamos então avaliar o efeito protetor do PB e seus derivados na perda de viabilidade e na morte celular induzida por Glu. Para tanto, as células foram incubadas com os compostos (3 µM) durante 24 horas, e depois desafiadas com Glu (5 e 10 mM) durante 24 horas. As figuras 8A e 8B mostram o efeito dos
compostos e do Glu na viabilidade e morte celular, respectivamente. No teste de viabilidade celular (Figura 8A), é possível observar que o Glu diminuiu a viabilidade em 50% e 90% nas concentrações de 5 e 10 mM, respectivamente. O PB não alterou significativamente a viabilidade das células desafiadas com Glu, enquanto o composto RC363 exibiu uma proteção completa em ambas as concentrações de Glu testadas, tendo o composto RC574 exibido proteção completa na concentração de 5 mM e proteção parcial na concentração de 10 mM de Glu. Os mesmos efeitos são observados no teste de incorporação do IP (Figura 8B). De fato, o teste ANOVA de duas vias mostrou que há uma interação entre o tratamento com os compostos e com o Glu, tanto no teste do MTT (F(6, 48) = 5,539; P = 0,0002) quanto no teste do IP (F(6, 48) = 14,29; P < 0,0001).
