ANA CAROLINA PIVA DE OLIVEIRA
Análise da expressão gênica e produção de Cazymes pelo fungo Laetiporus sulphureus ATCC 52600
Analysis of gene expression and production of Cazymes by fungus Laetiporus sulphureus ATCC 52600
CAMPINAS 2018
Análise da expressão gênica e produção de Cazymes pelo fungo Laetiporus sulphureus ATCC 52600
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em BIOLOGIA FUNCIONAL E MOLECULAR, na área de BIOQUÍMICA
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas for the degree of Master FUNCTIONAL AND MOLECULAR BIOLOGY, in the area of BIOCHEMISTRY
Supervisor/Orientador: FABIO MARCIO SQUINA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ANA CAROLINA PIVA DE OLIVEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. FABIO MARCIO SQUINA
CAMPINAS 2018
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Oliveira, Ana Carolina Piva de, 1990-
OL4a Análise da expressão gênica e produção de Cazymes pelo fungo Laetiporus sulphureus ATCC 52600 / Ana Carolina Piva de Oliveira. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Fabio Marcio Squina.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
1. Biomassa. 2. Genomas. 3. Transcriptoma. 4. Secretôma. 5. Enzimas. I. Squina, Fabio Marcio. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Analysis of gene expression and production of Cazymes by fungus
Laetiporus sulphureus ATCC 52600
Palavras-chave em inglês: Biomass Genomes Transcriptome Secretome Enzymes
Área de concentração: Bioquímica
Titulação: Mestra em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:
Fabio Marcio Squina [Orientador] Hiroshi Aoyama
Fernando Segato
Data de defesa: 04-05-2018
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Fabio Marcio Squina (orientador)
Prof. Dr. Hiroshi Aoyama
Prof. Dr. Fernando Segato
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
À Deus. Obrigada Senhor, por me conduzir e me guiar até aqui.
Aos meus pais, a minha gratidão eterna. Vocês são essenciais. Obrigada por serem alicerce em minha vida. Tudo foi, é e sempre será graças a vocês.
À minha família e amigos, agradeço o amor, carinho e suporte. Cheguei até aqui graças a cada um de vocês, que foram fundamentais em cada uma das etapas que vivi durante o Mestrado. Sou profundamente grata a todos, sem sombra de dúvidas vocês fazem parte dessa obra e têm um lugar único em meu coração.
Aos amigos do CTBE e Unicamp, obrigada por me ensinarem tanto, por doarem o tempo e a atenção de vocês e por compartilharem seus conhecimentos comigo.
Aos amigos e colaboradores que foram essenciais para a conclusão desse trabalho, muito obrigada.
Ao Fábio meu orientador, por sua excelência, agradeço a oportunidade e paciência. À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), ao Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) e ao Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), agradeço a oportunidade, o suporte técnico e financeiro.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Professor André Luís Ferraz (USP – Lorena) pelo projeto temático ao qual o presente estudo está vinculado e pelo microrganismo cedido para estudo.
“O amor ainda é a melhor fonte de energia renovável do planeta.”
permitem a identificação de genes, transcritos e proteínas envolvidos em processos adaptativos em microrganismos. Esses estudos, podem auxiliar no desenvolvimento de sistemas enzimáticos com diversas aplicações biotecnológicas, como por exemplo, a degradação de polissacarídeos derivados da biomassa para produção de biocombustíveis. Os fungos, em especial os basidiomicetos, são organismos efetivos na biodegradação da biomassa vegetal, na natureza eles atuam na presença de substratos altamente lignificados e recalcitrantes através da ação de enzimas ativas em carboidratos “Cazymes”. Os basidiomicetos de decomposição parda, possuem enzimas envolvidas na degradação dos materiais lignocelulósicos (formado principalmente por celulose, hemicelulose e lignina), juntamente com um mecanismo não enzimático, através da geração de radical hidroxila via reação de Fenton. Neste trabalho genoma, transcriptoma e secretôma do fungo de decomposição parda Laetiporus sulphureus, foram sequenciados e analisados em resposta ao crescimento em meio contendo bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. As análises de transcriptoma foram realizadas em dois diferentes tipos de cultivos, líquido e semi-sólido. Um total de 12.802 genes codificadores de proteínas foram anotados, dentre os quais 363 codificam Cazymes. A diversidade de Cazymes identificadas, tais como celulases, hemicelulases e uma série de enzimas oxidativas, fornecem ao fungo as enzimas necessárias para a hidrólise efetiva da biomassa lignocelulósica. A primeira análise transcriptômica em cultivo líquido revelou 231 Cazymes expressas, das quais, 71 foram superexpressas durante o crescimento em bagaço (BIN) em comparação com o controle (T0). Entre as Cazymes altamente expressas em BIN, foram observadas álcool oxidases (AA3) e β-glicosidases (GH5), e entre as superexpressas em T0 foram identificadas uma variedade de enzimas com atividade oxidativa. Na segunda análise transcriptômica em cultivo semi-sólido, 338 genes codificantes de Cazymes foram transcritos, dos quais destacam-se diversas enzimas consideradas centrais na produção de peróxido de hidrogênio, além de celobiohidrolase (GH7), β-xilanase (GH10) e endoglucanase (GH5). As enzimas identificadas com maior número de espectros no secretôma corroboram com a abundância de transcritos identificados no transcriptoma em meio semi-sólido. A análise combinada do genoma, transcriptoma e secretôma do fungo L. sulphureus descrita nesse trabalho forneceu uma visão global de sua resposta ao crescimento em diferentes condições de cultivo utilizando bagaço como fonte de carbono. Além disso, o estudo contribuiu para uma melhor compreensão do repertório de enzimas lignocelulolíticas e industrialmente relevantes desse fungo.
identification of genes, transcripts and proteins involved in adaptive processes of microorganisms. These studies can assist the development of enzymatic systems with diverse biotechnological applications, such as the degradation of polysaccharides derived from biomass for biofuels production. Fungi, especially basidiomycetes, are effective organisms in plant biomass biodegradation, since in nature they act in the presence of highly lignified and recalcitrant substrates through the action of carbohydrate active enzymes "Cazymes". The brown-rot basidiomycetes produce enzymes involved in the degradation of lignocellulosic materials (mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin), together with non-enzymatic mechanism related with hydroxyl radical generation, via Fenton reaction. In the present study, genome, transcriptome and proteome of the brown-rot fungus Laetiporus
sulphureus were sequenced and analyzed in response to growth in medium containing
sugarcane bagasse as a carbon source. Transcriptome analyzes were performed on two different types of cultures, liquid and semi-solid media. A total of 12.802 genes coding-proteins were annotated, among which 363 coding Cazymes. The diversity of Cazymes identified, such as cellulases, hemicellulases and a series of oxidative enzymes, provide to the fungus with the necessary proteins for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. The first transcriptomic analysis in liquid media revealed 231 Cazymes, from which, 71 were overexpressed during bagasse (BIN) growth compared to control (T0). Among the upregulated Cazymes in BIN, alcohol oxidases (AA3) and β-glucosidases (GH5) were observed, and among the overexpressed in T0 a variety of enzymes with oxidative activity were identified. In the second transcriptomic analysis of semi-solid culture, 338 Cazymes genes coding were observed, from which several enzymes considered central in the production of hydrogen peroxide, besides cellobiohydrolase (GH7), β-xylanase (GH10) and endoglucanase (GH5). The enzymes identified with the greatest number of spectra in the secretome corroborate with the abundance of transcripts identified in the transcriptome in semi-solid medium. The combined genome, transcriptome and secretome analysis of the L. sulphureus fungus described in this study provided an overview of its response to growth under different growing conditions. In addition, the study contributed to a better understanding of the repertoire of lignocellulolytic and industrially relevant enzymes of this fungus.
Keywords: Biomass degradation, Genome, Transcriptome, Secretome, Cazymes,
Figura 1. Modelo simplificado da parede celular vegetal mostrando os principais componentes: celulose, hemicelulose e também a lamela média e a parede celular primária. Retirado de http://www.wikiwand.com/en/Cellulose
Figura 2. Organização das moléculas de celulose mostrando as ligações de hidrogênio entre os grupamentos hidroxila (linhas tracejadas) e entre as moléculas de D-glicose.
Retirado de http://www.wikiwand.com/en/Cellulose
Figura 3. (1) álcool p-comaril, (2) álcool coniferil, e (3) álcool sinapil. Retirado de Stanley et al. 2013.
Figura 4. Modelo clássico de degradação da celulose. Editado de Dutta & Wu, 2014.
Figura 5. Representação do modo de ação de agentes doadores de elétrons para LPMOs (AA9). Retirado de Dutta & Wu, 2014.
Figura 6. Modelo clássico de degradação da hemicelulose. Editado de Dutta & Wu, 2014. Figura 7. Esquema do mecanismo de degradação da lignocelulose pelos fungos de decomposição parda utilizando o sistema Fenton. Hifas fúngicas no lúmen das células
vegetais produzem compostos redutores de ferro (RC), peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e ácido oxálico. O ácido oxálico liga-se a Fe³⁺ como um complexo que se difunde na parede celular juntamente com H₂O₂ e RC. Com a mudança de pH, o RC sequestra o Fe³⁺ do complexo Fe-oxalato e o reduz a Fe²⁺. O Fe²⁺ reage com H₂O₂ (reação de Fenton) e produz radicais hidroxila (OH) que destroem a lignocelulose. Retirado de Cragg et al. 2015.
Figura 8. Figuras mostrando o fungo de decomposição parda Laetiporus sulphureus crescido em troncos de árvores em florestas. Retirado de https://commons.wikimedia.org Figura 9. Esquema geral do cultivo semi-sólido em bagaço. Observa-se que após 7 dias de
cultivo o micélio fúngico ocupou todo o substrato.
Figura 10. Atividade enzimática específica do extrato fúngico de L. sulphureus. As
atividades hidrolíticas dos extratos foram determinadas após 7 dias de cultivo em meio semi-sólido.
lignocelulose para montagem do gráfico.
Figura 12. Genes que codificam Cazymes secretadas e não secretadas no genoma (excluindo GT e CE10).
Figura 13. Análise filogenômica de L. sulphureus e géneros relacionados. A árvore
filogenômica foi construida usando o método de máxima verossimilhança (ML) implementado no FastTree e modelo evolutivo WAG. Foram utilizados 601 genes ortologos de cópia única presentes nos 31 genomas de Basidiomicetos analisados. Valores de bootstrap (1000 re-amostragenes) acima de 0.8 são mostrados.
Figura 14. Gráfico Volcano dos genes diferencialmente expressos identificados nos substratos estudados no transcriptoma em meio líquido. Genes superexpressos (log2
foldchange ≥1.0 e p ≤ 0.05) estão em vermelho e genes menos expressos (log2 foldchange ≤ −1.0 e p ≤ 0.05) estão em verde.
Figura 15. Expressão diferencial entre o crescimento em bagaço (BIN) comparado com a referência (tempo zero - T0) com pelo menos 1 TPM no transcriptoma em meio líquido. Figura 16. Famílias de interesse que codificam Cazymes no transcriptoma de L. sulphureus realizado em meio SS, dado em log10 TPM. Foram selecionadas algumas
famílias relevantes para a degradação da lignocelulose para montagem do gráfico.
Figura 17. Perfil eletroforético de L. sulphureus cultivado em meio SS em bagaço combinado com glicose. I, II e III indicam as replicatas, M indica o marcador molecular, kDa
kilodaltons.
Figura 18. Distribuição das enzimas identificadas no secretôma de L. sulphureus. Foram
considerados número absoluto de enzimas para a montagem do gráfico. As proteínas foram identificadas pelo dbCAN.
Figura 19. Gráfico correlacionando os resultados de ômicas obtidos. Foram considerados
Tabela 1. Informações estatísticas sobre a montagem do genoma do fungo L. sulphureus. Tabela 2. Distribuição de Cazymes superexpressas e reprimidas em BIN (log2 foldchange ≥1.0 e ≤ -1.0 e ≥2 ou ≤−2). Valores em ordem decrescente de log2FoldChange. As proteínas
com diferenças estatisticamente significativas (≥2 ou ≤−2) estão destacadas em negrito.
Tabela 3. Celulases e enzimas oxidativas identificadas no secretôma de L. sulphureus em meio semi-sólido.
1. INTRODUÇÃO ... 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
2.1.COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA ... 19
2.1.1 Celulose ... 20
2.1.2 Hemicelulose ... 21
2.1.3 Lignina ... 22
2.2 PROCESSAMENTO DA BIOMASSA ... 23
2.2.1 Enzimas ativas em carboidratos ... 24
2.2.1.1 Complexo celulolítico ... 25
2.2.1.2 Hemicelulases... 27
2.2.1.3 Ligninases... 29
2.3 BASIDIOMICETOS ... 30
2.3.1 Fungos de decomposição parda ... 31
2.4 REAÇÃO DE FENTON ... 32 2.5 Laetiporus sulphureus ... 34 3. OBJETIVOS ... 36 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 37 4.1 Microrganismo ... 37 4.2 Manutenção da linhagem ... 37
4.3 Cultivo em meio líquido ... 37
4.4 Extração de DNA e sequenciamento ... 37
4.5 Montagem e anotação do genoma ... 38
4.6 Extração de RNA e sequenciamento ... 38
4.7 Processamento dos dados de RNA-seq ... 39
4.8 Cultivo em meio semi-sólido (SS) ... 39
4.9 Obtenção dos extratos enzimáticos ... 39
4.10 Avaliação da degradação de substratos polissacarídicos ... 40
4.11 Cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) ... 40
4.12 Processamento e análise dos dados de proteômica ... 41
4.15 Análise filogenética ... 41
5. RESULTADOS ... 42
5.4 Análise filogenômica... 47
5.5 Análise transcriptômica e genes diferencialmente expressos do cultivo em meio líquido ... 49
5.6 Análise transcriptômica do cultivo em meio semi-sólido (SS) ... 54
5.7 Análise secretômica do cultivo em meio semi-sólido (SS) ... 56
5.8 Correlação entre os resultados de ômicas... 61
6. DISCUSSÃO ... 63
7. CONCLUSÃO ... 67
8. REFERÊNCIAS ... 68
9. ANEXOS ... 80
1. INTRODUÇÃO
A energia e o acesso aos serviços energéticos, são fundamentais para o crescimento e desenvolvimento econômico global, entretanto, a matriz energética mundial é constituída principalmente por combustíveis fósseis como carvão, gás natural e petróleo que são fontes não renováveis e emitem gases poluentes na atmosfera (Araujo, Navarro & Santos, 2013; Goldemberg & Johansson, 2004; Soccol et al. 2010).
A dependência por esse tipo de sistema energético durante anos, e o uso indiscriminado dos recursos naturais desde o início da civilização moderna, acarretou o atual cenário internacional de declínio nas reservas de petróleo e desastres ambientais (Araujo, Navarro & Santos, 2013; Demain, 2009; Koh & Ghazoul, 2008). Como decorrência desse cenário, somada à crescente globalização e demanda por energia, as extensas mudanças climáticas, entre elas o aquecimento global, são notoriamente conhecidas (Baeyens et al. 2015; Moreira et al. 2016).
A substituição dos combustíveis fósseis torna-se assim uma alternativa promissora, dado o atual panorama de crise energética mundial, e impulsionam as buscas por recursos alternativos para a geração de energia (Leite & Leal, 2007). Nesse contexto, são crescentes os incentivos promovidos por governos ao redor do mundo, para redução nas emissões de dióxido de carbono e por abordagens economicamente mais viáveis como os biocombustíveis (Soccol et al. 2010).
O acordo de Paris, selado em 2015 na 21ª Conferência das Partes (COP21) da UNFCCC (sigla em inglês para Convenção-Quadro das Nações Unidas sobre a Mudança do Clima), foi adotado como uma dessas medidas governamentais em resposta às ameaças de mudança climática global. O objetivo central do acordo, é reduzir e também estabilizar as concentrações de gases de efeito estufa na atmosfera. O compromisso, que foi assinado entre 195 países parte da UNFCCC, assegura que o aumento da temperatura média global fique abaixo de 2°C acima dos níveis pré-industriais, e ainda, garante a continuidade dos esforços de limitar o aumento da temperatura até 1,5°C acima dos níveis pré-industriais (UNFCCC, 2015).
Nesse contexto, as biorrefinarias vêm ganhando destaque, pois empregam tecnologias para produção de energia renovável, incentivando assim a substituição dos recursos fósseis e tecnologias petroquímicas pelos recursos renováveis, como a biomassa vegetal utilizada na produção dos biocombustíveis (Pervaiz & Correa, 2009). De acordo com Koh & Ghazoul (2008), biocombustíveis são combustíveis renováveis derivados de matérias-primas biológicas, e incluem tanto as formas líquidas, como o bioetanol (equivalente da gasolina) e
biodiesel (equivalente do diesel), quanto as formas gasosas, como o biogás (metano) ou hidrogênio.
Entre os combustíveis renováveis, o etanol possui vantagens em diferentes aspectos, e entre as principais qualidades está o fato dele ser sustentável, devido ao não acometimento da camada de ozônio, pelo balanço positivo dos gases de efeito estufa (GEE) emitidos na atmosfera, como o CO2 (Walter et al. 2011). É o biocombustível mais produzido
em todo o mundo, tendo os EUA como maior produtor seguido do Brasil (CONAB, 2017), este que também é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar (CONAB, 2017), representando uma das culturas agrícolas mais relevantes no país. A região sudeste concentra a produção do etanol, enquanto que as regiões nordeste e centro-oeste se destacam pela expansão no plantio e no processamento da cana (CONAB, 2016).
O Bioetanol no Brasil é produzido por um processo denominado primeira geração, que extrai o caldo da cana-de-açúcar para posterior fermentação e destilação. Esse procedimento, gera um produto que chega com um preço competitivo para o mercado de combustíveis. Contudo, para atender à crescente demanda por combustíveis renováveis (Sexton et al. 2009; Milanez et al. 2015), deve-se obter um aumento na produção de etanol pela valorização dos subprodutos da cana (Soccol et al. 2010). Para que isso possa ser alcançado, sem aumentar a área plantada das culturas de cana, no caso do Brasil, é preciso o desenvolvimento de tecnologias capazes de obter energia a partir da biomassa vegetal (Gupta & Verma, 2015; Pauly & Keegstra, 2008; Silva et al. 2010).
Na última década, o aumento na frota de veículos no Brasil ocasionou um crescimento significativo no setor de combustíveis, levando consequentemente ao aumento na produção interna de etanol. Entretanto, devido a estagnação de investimentos no setor sucroenergético nos períodos entre 2008 e 2010, a oferta de etanol também estagnou implicando no aumento do preço do etanol hidratado e levando os consumidores a optar pelo uso da gasolina (Milanez et al. 2012). Como decorrência desse cenário, houve um incremento no consumo e importação da gasolina no período, dado a limitação do país em refinar esse combustível (Milanez et al. 2015). Esse panorama, exigiu o resgate da atratividade econômica do etanol, que engloba opções tecnológicas que impactem a sua produtividade, como as iniciativas dedicadas ao etanol celulósico (E2G) (Milanez et al. 2015).
O bagaço da cana-de-açúcar, é a biomassa mais abundante nas agroindústrias sucroalcooleiras. Esse material, têm potencial para ser utilizado na obtenção de diversos artigos de interesse comercial: ração animal, fertilizantes, cosméticos e como fonte de energia, podendo
ser matéria-prima para a produção do etanol celulósico ou etanol de segunda geração (2G) (Hahn-Hägerdal et al. 2006; da Costa & Bocchi, 2012).
Dentre as principais vantagens dessa biomassa, está a sua disponibilidade excedente e baixo custo, além de ser renovável e não competir com a produção de alimentos (Silva et al. 2010). A estimativa é que a cada tonelada de cana moída são gerados cerca de 280 kg de bagaço (Assad, 2017), que tradicionalmente, é utilizado nas próprias usinas, onde é consumido para a cogeração de energia elétrica, garantindo assim a autossuficiência enérgica da agroindústria, e diminuindo ainda mais as emissões dos GEE (Walter et al. 2011). Contudo, apesar das notáveis vantagens da biomassa lignocelulósica, o etanol celulósico ainda não é comercialmente viável, haja vista os altos custos do processo (Milanez et al. 2015).
O etanol 2G é produzido a partir da conversão do material lignocelulósico em açúcares fermentescíveis. Esses materiais são formados por células vegetais, delimitadas por uma parede celular constituída principalmente por celulose (40-50%), hemicelulose (20-40%) e lignina (20-30%) (Carpita & Gibeaut, 1993), e para a sua desconstrução em açúcares mais simples, é necessário a ação sinérgica de enzimas com atividade hidrolítica.
A celulose é organizada em estruturas micro fibrilares embebidas por uma matriz de hemicelulose e lignina. As ligações covalentes e interações entre os polissacarídeos e os compostos aromáticos da lignina, tornam o material altamente complexo e recalcitrante. Desta forma, a decomposição da biomassa é um dos passos cruciais para seu emprego na produção de combustíveis (Rytioja et al. 2014). Essa é uma das maiores barreiras econômicas, e afeta diretamente o rendimento na produção dos biocombustíveis, pois gera um gargalo no sistema produtivo (Sun & Cheng, 2002). Por isso, enzimas capazes de degradar os polissacarídeos da parede vegetal, do ponto de vista aplicado à produção de bioetanol, são de especial interesse e movimentam um mercado multibilionário.
Os fungos filamentosos são altamente especializados na degradação da biomassa, pois representam grandes fontes de enzimas utilizadas na conversão da lignocelulose na natureza (Mäkelä, Donofrio & de Vries, 2014). Os basidiomicetos, são naturalmente capazes de produzir tais enzimas, e dentre os dois principais grupos de fungos basidiomicetos: decomposição branca e decomposição parda, os fungos de decomposição parda possuem o repertório enzimático necessário para degradar a celulose e hemicelulose. Além disso, esses organismos podem gerar espécies reativas de oxigênio, via reação de Fenton, que atuam na despolimerização dos constituintes da parede celular vegetal auxiliando a degradação da lignina (Koenigs, 2007; Murmanis, Highley & Palmer, 1988; Hammel et al. 2002; Tanaka, Itakura & Enoki, 2000; Yamakawa et al. 2005; Arantes & Milagres, 2006).
Com os avanços nas tecnologias de sequenciamento em larga escala, inúmeros genomas de microrganismos decompositores estão sendo elucidados para auxiliar na identificação de novos genes codificantes de enzimas lignocelulolíticas. Essas por sua vez, estão sendo avaliadas quanto a sua utilização no desenvolvimento e melhoramento de coquetéis lignocelulolíticos comerciais (Berka et al. 2011; Hori et al. 2014; Kuo, Bushnell & Grigoriev, 2014; Nogueira et al. 2015). Desta forma, pode-se ampliar o repertório de enzimas lignocelulolíticas atualmente utilizadas nos processos biotecnológicos, através de ferramentas como a engenharia de proteínas (Floudas et al. 2012; Lundell, Mäkelä & Hildén, 2010; Miyauchi et al. 2016).
Combinando dados de genômica transcriptômica e proteômica, é possível fazer avaliações mais específicas no entendimento e aprofundado da biologia desses fungos filamentosos, bem como, compreender o seu comportamento frente a fontes de carbono complexas, como o bagaço de cana-de-açúcar (Horta et al. 2014).
O fungo de decomposição parda L. sulphureus possui uma série de metabolitos com propriedades antioxidantes e antimicrobianas (Turkoglu et al. 2007), além de dispor de substancias potenciais que podem ser empregadas como corantes (Weber, Mucci & Davoli, 2004; Davoli et al. 2005), em sistemas biológicos para biorremediação de áreas contaminadas (Mtui & Masalu 2008), entre outras características que o tornam promissor. Contudo, o conhecimento sobre quais enzimas esse fungo emprega na degradação de polissacarídeos é limitado (Ferraz et al. 2001; Valadares et al. 2016), e nenhum estudo foi realizado descrevendo a resposta transcriptômica desse microrganismo na presença de bagaço de cana-de-açúcar.
Diante do exposto, o principal objetivo neste trabalho foi utilizar uma abordagem multi-ômica, para revelar as Cazymes do fungo L. sulphureus ATCC 52600. Para isso, foram gerados dados de genômica e transcriptômica a partir das técnicas de sequenciamento de DNA e RNA (RNA-seq - Next Generation RNA sequencing), bem como dados de secretômica. Nossos resultados fornecem uma compreensão global de quais estratégias esse organismo emprega na degradação do bagaço de cana-de-açúcar, pois L. sulphureus não somente possui uma ampla gama de enzimas como é capaz de expressá-las e secretá-las para descontruir a biomassa lignocelulósica.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
A biomassa lignocelulósica está presente em diversos tipos de matéria orgânica provenientes de fontes vegetais ou animais, como por exemplo resíduos agrícolas, resíduos florestais, materiais lenhosos e gramíneas, e têm potencial para a produção de biocombustíveis (Anwar, Gulfraz & Irshad, 2014). Trata-se de um material orgânico, renovável, e o mais abundante na Terra, constituindo a parede celular das plantas. Esta, por sua vez, possui uma estrutura rígida que protege a planta contra agressores externos, como o ataque de patógenos, determina a forma e o volume da planta, e também oferece proteção mecânica para os tecidos vegetais (Taiz & Zeiger, 2009; Guerriero et al. 2016).
A parede celular vegetal pode ser primária ou secundária, e diferem tanto no papel fisiológico que desempenham quanto na composição química. Por exemplo, a parede primária permite o crescimento da planta por possuir uma estrutura extensível composta por células de crescimento, enquanto que a parede secundária está presente em tecidos de sustentação, pois é responsável pelo suporte mecânico das plantas (Rubin, 2008; Taiz & Zeiger, 2009; Guerriero et al. 2016).
A composição da parede celular pode variar de acordo com a fonte da biomassa, e também pode apresentar maior ou menor grau de complexidade. Basicamente, ela é constituída por microfibrilas de celulose embebidas em uma matriz de hemicelulose e lignina, e pequenas quantidades de pectina, lipídios, minerais, cinzas, proteínas e açúcares, que também podem ser encontrados em diferentes graus, a depender da biomassa (Pauly & Keegstra, 2008; Taiz & Zeiger, 2009). Na Figura 1 é possível visualizar a arquitetura da parede celular e os principais elementos que a compõem.
Figura 1. Modelo simplificado da parede celular vegetal mostrando os principais componentes: celulose, hemicelulose e também a lamela média e a parede celular primária. Retirado de http://www.wikiwand.com/en/Cellulose
2.1.1 Celulose
A celulose é o polissacarídeo mais abundante dos materiais lignocelulósicos. Constituindo cerca de 40 a 50% da massa seca total, é o principal polissacarídeo responsável pela rigidez da parede vegetal (Aguiar & Ferraz, 2011). Encontra-se na parede celular primária em microfibrilas, e é formado por moléculas de D-glicose, unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1,4, criando estruturas lineares que são ordenadas e altamente compactadas (porções cristalinas) e porções com menor grau de organização (amorfas) (Horn et al. 2012; Rytioja et al. 2014).
A longa cadeia de celulose está ligada entre si por ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals, formando as microfibrilas que se mantêm alinhadas paralelamente e firmemente juntas, lado a lado, conferindo assim resistência à tração (Figura 2) (Himmel et al. 2007). Além disso, a molécula adota uma conformação em forma de haste, bastante rígida e resistente a hidrólise devido à porção cristalina, que pelo alto grau de compactação, impede a acessibilidade das enzimas. Já a porção amorfa é facilmente hidrolisada pelas celulases (Payne et al. 2015; Guerriero et al. 2016).
Figura 2. Organização das moléculas de celulose mostrando as ligações de hidrogênio entre os grupamentos hidroxila (linhas tracejadas) e entre as moléculas de D-glicose.
Retirado de http://www.wikiwand.com/en/Cellulose
2.1.2 Hemicelulose
A hemicelulose é o segundo polímero mais abundante nos materiais lignocelulósicos, podendo ser encontrada tanto na parede celular primária quanto na parede celular secundária. A sua quantidade pode variar de 20 a 40%, dependendo no tipo de material, e trata-se de um polissacarídeo ramificado, que se liga às moléculas de celulose formando uma rede coesa entre as microfibrilas, e também impedindo o contato entre elas, funcionando assim, como um revestimento (Taiz & Zeiger, 2004).
Diferentemente da celulose, a hemicelulose é um heteropolímero composto por vários monômeros, sendo os componentes estruturais básicos: pentoses (xilose e arabinose), hexoses (manose, glicose, galactose) e açúcares ácidos (ácido glucurônico, galacturônico e metilgalacturônico) (Aguiar & Ferraz, 2011; Horn et al. 2012). Os monossacarídeos são, no geral, unidos por ligações do tipo β-1,4 e ocasionalmente por ligações do tipo β-1,3 (Pèrez et al. 2002).
A heterogeneidade da estrutura da hemicelulose, se dá segundo a diversidade de combinações possíveis entre as unidades monoméricas e suas ligações e ramificações. Desta forma, as hemiceluloses são classificadas de acordo com o polissacarídeo mais abundante da cadeia, sendo os mais comuns xilano, xiloglucano e manano (Pèrez et al. 2002; Scheller & Ulvskov, 2010; Van den Brink & de Vries, 2011).
O xilano é o tipo de polímero mais abundante na hemicelulose e muito comum em angiospermas (Horn et al. 2012). Este polímero é formado por cadeias de xilose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1,4 e, muitas vezes, pode apresentar substituições por monômeros de arabinose, glicose ou glicosearabinose ligados à sua cadeia, originando arabinoxilano, glucuronoxilano e glucuronoarabinoxilano respectivamente (Quiroz-Castañeda & Folch-Mallol, 2011). O xiloglucano, é formado por uma cadeia de resíduos de glicose com ligações do tipo β-1,4, e interagem com as microfibrilas de celulose contribuindo para a integridade da estrutura da celulose. Tanto xilano quanto xiloglucano, podem ainda conter outros tipos de substituições, como: ácido glucurônico, ácido 4-O-metil éter glucurônico, ácido acético, ferúlico e p-cumárico, ligados aos seus resíduos. Já o manano é composto inteiramente por resíduos de manose, unidos por ligação β-1,4, podendo apresentar ramificações de galactose e glicose, resultando em galactomananas, e glucomananas respectivamente (Scheller & Ulvskov, 2010; Quiroz-Castañeda & Folch-Mallol, 2011).
2.1.3 Lignina
A lignina é o terceiro componente mais abundante nos materiais lignocelulósicos, representando cerca de 25% desses materiais (Boerjan, Ralph & Baucher, 2003). É um polímero heterogêneo, altamente resistente à degradação química e biológica, pois é responsável pelo suporte estrutural da parede celular das plantas, e ocorre amplamente nas paredes secundárias e na lamela média (Taiz & Zeiger, 2009). Este heteropolímero complexo é formado por três álcoois aromáticos: coniferil, p-comaril e sinapil (Figura 3), que devido à natureza hidrofóbica, impedem o acesso a organismos degradantes e produtos químicos (Boerjan, Ralph & Baucher, 2003; Martinez et al, 2005).
A lignina, juntamente com a hemicelulose, formam uma matriz amorfa onde as fibras de celulose ficam inseridas. Ela é encontrada em tecidos de sustentação e vascularização, e age como agente de defesa contra patógenos, pois protege os polissacarídeos da parede celular do processo de degradação (Martinez et al. 2005). Além disso, a hidrólise da lignina não gera açúcares fermentáveis, como na hidrólise da celulose e hemicelulose, mas pelo contrário, produz compostos fenólicos que são inibidores dos processos de fermentação, gerando um desafio no processamento da biomassa (Kricka, Fitzpatrick & Bond, 2014).
2.2 PROCESSAMENTO DA BIOMASSA
Para a obtenção do etanol 2G, é necessário a conversão dos materiais lignocelulósicos em açúcares fermentáveis. Para que os açúcares se tornem acessíveis, a biomassa precisa ser desconstruída, desta forma, o processamento da biomassa envolve as etapas de pré-tratamento da matéria bruta para depois submetê-la à etapa de sacarificação pela hidrólise enzimática.
O pré-tratamento, é uma parte importante para melhoria da eficiência do processo, pois aumenta a acessibilidade do material, tendo um grande impacto na digestabilidade da celulose (Sindhu, Binod & Pandey, 2016). Atualmente, vários métodos potenciais estão sendo avaliados a fim de aumentar a acessibilidade da celulose, pela remoção da hemicelulose ou da lignina. Tais métodos podem ser físicos, químicos, biológicos e físico-químicos, garantindo assim, melhora das taxas de hidrólise, pela alteração da estrutura física e química da biomassa (Agbor et al. 2011; Arantes, Jellison & Goodell, 2012).
No pré-tratamento biológico, microrganismos são utilizados na degradação seletiva da lignina e da hemicelulose. Este método possui vantagens, pois minimiza a utilização de produtos químicos, e os gastos com energia durante o processo. Os fungos de podridão branca
Figura 3. (1) álcool p-comaril, (2) álcool coniferil, e (3) álcool sinapil. Retirado de Stanley et al. (2013).
e parda, são importantes fontes de enzimas que podem ser empregados na degradação de compostos lignificados, por exemplo (Alvira et al. 2010). Enzimas como lacases e peroxidases, de fungos de podridão branca como Phanerochaete chrysosporium, mostraram eficiência na degradação da lignina (Shi, Chinn & Sharma-Shivappa, 2008).
Na fase de sacarificação da biomassa, enzimas irão atuar em sinergia para hidrolisar os polissacarídeos, e então liberar os açúcares fermentescíveis para posterior conversão em etanol (Balat, Balat & Öz, 2008). Os principais produtores dessas enzimas, são os fungos decompositores (especialmente basidiomicetos), bactérias, e alguns animais que se alimentam de materiais lignocelulósicos, como os cupins (Watanabe & Tokuda, 2010; Sweeney & Xu, 2012). Devido aos seus sistemas enzimáticos exclusivos, esses organismos vêm sendo extensivamente estudados (Dionisi et al. 2015).
2.2.1 Enzimas ativas em carboidratos
Na natura, a degradação dos materiais lignocelulósicos, ocorre pela ação sinérgica de celulases, hemicelulases e enzimas oxidativas. Tais enzimas, foram agrupadas em um banco de dados, denominado CAZy: Carbohydrate Active Enzymes (http://www.cazy.org), que engloba enzimas que hidrolisam, polimerizam ou modificam os carboidratos. Elas são divididas em classes, de acordo com sua sequência de aminoácidos e similaridade estrutural (Cantarel et al. 2009; Levasseur et al. 2013; Lombard et al. 2014):
Glicosil Hidrolases (GHs): Catalisam a hidrólise e/ou rearranjo das ligações glicosídicas;
Carboidrato Esterases (CEs): Catalisam a hidrólise de ésteres de carbono;
Polissacarídeo Liases (PLs): Catalisam a clivagem não-hidrolítica de ligações glicosídicas;
Glicosil Transferases (GTs): Fazem a construção de ligações glicosídicas;
Módulos de Ligação a Carboidratos (CBMs): Auxiliam na adsorção da enzima sob o substrato;
Atividade Auxiliar (AAs): São proteínas oxidativas que agem em conjunto com outros grupos de Cazymes na degradação da lignina e celulose.
2.2.1.1 Complexo celulolítico
Para a completa degradação da celulose, são necessários pelo menos quatro grupos enzimáticos atuando em sinergia: endoglucanases, celobiohidrolases (CBHs), mono-oxigenases (LPMOs) e beta-glicosidases (Carpita & Gibeaut, 1993; Rytioja et al. 2014). As celulases são hidrolases, pois clivam as ligações glicosídicas pela adição de uma molécula de água (Davies & Henrissat, 1995), e pertencem à classe das GHs (Figura 4), com exceção das LPMOs, que são pertencentes à família das AAs, e possuem um mecanismo diferente de ação, pois são enzimas oxidativas.
1. Endo- β-1,4 glucanases (EGLs): Iniciam a degradação da celulose, clivando aleatoriamente as ligações β-1,4 internas da cadeia, principalmente nas regiões amorfas, liberando oligossacarídeos de vários tamanhos, criando assim, novas extremidades/terminais (sendo um terminal redutor e um terminal não redutor), para facilitar o ataque de outras enzimas, como as celobiohidrolases (Aro, Pakula & Penttila, 2005; Yoon et al. 2007; Castro & Pereira, 2010). As EGLs pertencem às famílias de GHs 5, 6, 7, 8, 9, 12, 44 e 45 (Van den Brink & de Vries, 2011; Levasseur et al. 2013; Kubicek, Starr & Glass, 2014).
2. Celobiohidrolases (CBHs): Catalisam a hidrólise da cadeia da celulose cristalina em ambas as extremidades, redutora (CBH tipo I) e não redutora (CBH tipo II), resultando na liberação de oligossacarídeos, e principalmente moléculas de celobiose, que é um dissacarídeo de glicose inibidor de CBHs (Aro, Pakula & Penttila, 2005; Yoon et al. 2007). As celobiohidrolases estão presentes nas famílias de GHs 5, 6, 7, 9 e 48 (Van den Brink & de Vries, 2011; Levasseur et al. 2013).
3. β-1,4 glicosidases (BGLs): Finalizam o processo de hidrólise, quebrando a celobiose em monômeros de glicose, diminuindo assim o produto da inibição das CBHs (Gusakov & Sinitsyn, 1992; Aro, Pakula & Penttila, 2005; Yoon et al. 2007). As BGLs pertencem às famílias de GHs 1, 3, 5, 9, 30 e 116 (Hakulinen et al. 2000; Häkkinen et al. 2012; Levasseur et al. 2013), mas a maioria daquelas empregadas na hidrólise da celulose pertence à família GH3 (Hakulinen et al. 2000).
As CBHs e EGLs, podem ainda apresentar uma estrutura modular conhecida como módulos de ligação a carboidrato CBMs (Carbohydrate Binding Modules). Esses CBMs, auxiliam na adsorção da enzima sob o substrato, aumentando a sua concentração e também a atividade em substratos cristalinos, sem interferir na atividade sobre substratos solúveis ou amorfos (Shoseyov, Shani & Levy, 2006; Koivula et al. 2012).
Normalmente, as EGLs e CBHs só atacam as regiões amorfas e cristalinas da molécula de celulose, respectivamente. Porém, algumas endoglucanases de fungos
basidiomicetos e bactérias, foram observadas por serem capazes de degradar a celulose cristalina, atuando assim como CBHs (Yoon et al. 2007). Essas proteínas, denominadas endoglucanases processivas, possuem sítios de ligação que são intermediários entre os túneis fechados de CBHs e as fissuras abertas de EGs (Payne et al. 2015). Desta forma, fungos basidiomicetos de podridão parda, que geralmente possuem um número reduzido de CBHs, podem degradar a celulose cristalina até celobiose, como já foi relatado em G. trabeum (Cohen, Suzuki & Hammel, 2005) e F. palustres (Yoon & Kim, 2005)
Figura 4. Modelo clássico de degradação da celulose. Editado de Dutta & Wu (2014).
O mecanismo oxidativo para degradação da celulose, envolve enzimas oxido-redutoras pertencentes às famílias AA9 e AA10 que são LPMOs (do inglês, Lytic Polysaccharide Mono-Oxygenases), e que até pouco tempo atrás eram conhecidas como hidrolases da família GH61, e módulos de ligação a carboidratos CBM33, respectivamente (Vaaje-Kolstad et al. 2010; Lombard et al. 2014).
A descoberta das LPMOs, revolucionou as pesquisas na área de química verde, dado que elas melhoram substancialmente a performance hidrolítica em substratos celulósicos, catalisando internamente a cadeia de celulose pela presença de oxigênio, cátions metálicos e de doadores de elétrons (Vaaje-Kolstad et al. 2010; Dutta & Wu, 2014). Enzimas da família AA9 presentes em fungos, em combinação com as demais GHs descritas acima, exercem um forte efeito na degradação da biomassa recalcitrante, sendo adicionadas a coquetéis celulolíticos nas indústrias (Dutta & Wu, 2014; Garajova et al. 2016).
A atividade de AA9 é dependente de oxigênio e elétrons. Dado que o oxigênio está naturalmente disponível, os elétrons precisam ser fornecidos por agentes redutores, para que a
reação aconteça, sendo esses agentes das mais variadas fontes, haja vista que LPMOs são promíscuas (Figura 5) (Johansen, 2016). Deste modo, os agentes redutores podem ser desde doadores de elétrons não enzimáticos, como os compostos de baixo peso molecular (CBMM): ácido oxálico, ácido ascórbico, peptídeos e compostos aromáticos, como também podem ser enzimas, tais como: celobiose desidrogenase (CDH) (AA3_1 e AA8), e outras proteínas presentes na família AA3, como aril álcool oxidase (AA3_2) (Arantes, Jellison & Goodell, 2012; Levasseur et al. 2013; Garajova et al. 2016).
Figura 5. Representação do modo de ação de agentes doadores de elétrons para LPMOs (AA9). Retirado de Dutta & Wu (2014)
2.2.1.2 Hemicelulases
Após as rupturas na cadeia de celulose, as cadeias laterais da hemicelulose começam a serem removidas, seguidas pelas cadeias principais. No entanto, a variedade estrutural da hemicelulose exige um arsenal enzimático mais complexo para a sua degradação. Como já mencionado no tópico 2.1.2, os polissacarídeos mais abundantes na cadeia de hemicelulose: xilano, xiloglucano e manano, são hidrolisados por um conjunto específico de enzimas: endoxilanases e β-xilosidases para xilano, endoglucanases e β-glicosidases para xiloglucano, e endomananases e β-manosidases para manano (de Vries & Visser, 2001; Van den Brink & de Vries, 2011). Além destas, outras enzimas, como as esterases pertencentes à família das CEs, também são recrutadas no processo para remover os grupamentos laterais (ramificações), dado o caráter heterogêneo da hemicelulose (Figura 6):
1. β-1,4-endoxilanases e β-1,4- xilosidases: As xilanases hidrolisam as regiões internas da cadeia de xilano, despolimerizando sua estrutura e gerando polissacarídeos menores, que são convertidos em monômeros de xilose pelas β-xilosidases, que por sua vez, atuam nas extremidades não-redutoras da cadeia de xilano (Kurakake, Osada & Komaki, 1997; Van den
Brink & de Vries, 2011). As xilanases pertencem às famílias de GH5, 8, 10, 11, 30, 43 e 51, e as xilosidases são pertencentes às famílias GH1, 3 (maioria), 30, 39, 43, 51, 52, 54, 116 e 120 (Van den Brink & de Vries, 2011; Levasseur et al. 2013).
2. Endo-β-1,4-D-mananases e β-1,4-D-manosidases: As mananases clivam as ligações internas na cadeia de manano, liberando oligossacarídeos que são convertidos em monômeros de manose pelas β-manosidases, que por sua vez, atuam nas extremidades não redutoras da cadeia. As mananases pertencem às famílias GH5, 26 e 113, e as manosidases às famílias GH1, 2 e 5 (Van den Brink & de Vries, 2011; Levasseur et al. 2013).
3. Acetil xilano esterases: Pertencentes às famílias CE1, 4, 5 e 16, essas enzimas removem os substituintes O-acetil a partir da posição C2 e/ou C3 e C4 dos resíduos de xilose na molécula de acetil xilano (Caufrier et al. 2003; Van den Brink & de Vries, 2011). Têm função importante na sacarificação do xilano, uma vez que a retirada de grupos acetil presentes na cadeia principal facilitam a ação das endoxilanases (Van den Brink & de Vries, 2011).
4. Arabinanases: Removem os resíduos de L-arabinose substituídos no C3 das unidades de xilose, podendo serem divididas em exo-α-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) que degradam p-nitrofenil-α-L-arabinofuranosideos e arabinanas ramificadas, e endo-1,5-α-L-arabinases (EC 3.2.1.99), que hidrolisam somente oligômeros maiores que quatro arabinoses covalentemente ligadas (Squina et al. 2010; Van den Brink & de Vries, 2011). As arabinofuranosidases fúngicas estão presentes principalmente nas famílias GH51 e GH54 (Van den Brink & de Vries, 2011).
5. α-Glucuronidases: Essas enzimas, pertencentes às famílias GH67 (exclusiva de Ascomicetos) e GH115, hidrolisam as ligações α-1,2 entre ácido glucurônico e resíduos de xilose na glucuronoxilana (Van den Brink & de Vries, 2011). A especificidade da enzima junto ao substrato varia de acordo com a fonte microbiana (Tenkanen & Siika-Aho, 2000).
6. Ácido ferúlico esterases e ácido p-coumárico esterases: Clivam ligações éster na cadeia de xilano, entre as cadeias laterais de arabinose e do ácido ferúlico, e entre arabinose e ácido p-coumárico (Crepin, Faulds & Connerton, 2004; Van den Brink & de Vries, 2011).
Figura 6. Modelo clássico de degradação da hemicelulose. Editado de Dutta & Wu (2014).
2.2.1.3 Ligninases
Entre todos os polímeros que constituem o material lignocelulósico, a lignina é o mais resistente à degradação enzimática devido a sua complexa rede de compostos aromáticos (Doherty, Mousavioun & Fellows, 2011), e por isso apenas poucos microrganismos são capazes de degradá-la ou modificá-la. Fungos basidiomicetos (podridão branca e podridão parda) e bactérias do gênero Streptomyces sp. e Nocardia sp., estão entre esse seleto grupo de microrganismos produtores de ligninases, sendo os mais eficientes os basidiomicetos de podridão branca (Kirk & Cullen, 1998; Thevenot, Dignac & Rumpel, 2010).
O processo de degradação desse composto aromático é parcialmente compreendido, e estudos indicam que a sua biodegradação não pode ser efetuada de modo eficiente somente pelas enzimas ligninolíticas (Aguiar & Ferraz, 2011). Contudo, em termos gerais, sabe-se que as enzimas do complexo ligninolítico são as oxidases, e podem ser agrupadas em pelo menos duas classes distintas: fenoloxidases, e enzimas que produzem peróxido de hidrogênio (Aguiar & Ferraz, 2011).
As fenoloxidases são metaloproteínas, que contêm um grupo prostético heme, e são capazes de oxidar as subestruturas da lignina na presença de peróxido de hidrogênio. Essas enzimas são separadas em dois subgrupos: um que contém as enzimas peroxidases (AA2), que são dependentes de peróxido de hidrogênio para atuarem - lignina peroxidases (LiP), manganês-peroxidases (MnP) e manganês-peroxidases versáteis (VP), e outro subgrupo, que inclui enzimas independentes de peróxido, são as cuproproteínas denominadas lacases (AA1). Estas por sua vez, catalisam a redução de O2 a H2O, e simultaneamente oxidam as subunidades fenólicas da
hidrogênio, são acessórias às peroxidases, são elas: glioxal oxidase (AA5_1), piranose 2-oxidase (AA3_4) e aril álcool 2-oxidase (AA3_2) (Martinez et al. 2005).
A biodegradação efetiva da lignina é observada somente pelos fungos de podridão branca. Os decompositores de podridão parda, perderam durante a evolução as peroxidases e lacases, e por isso adquiriram um mecanismo oxidativo para degradação da lignina, que será discutido nos próximos tópicos.
2.3 BASIDIOMICETOS
Os basidiomicetos pertencentes à classe Agaricomycetes, constituem um grande grupo de fungos com mais de 20.000 espécies descritas (Kirk et al., 2008; Madigan et al., 2016). Eles colonizam os troncos das árvores, e também madeira morta, formando tecidos verdadeiros denominados basidiocarpos (corpo de frutificação), os quais são constituídos de hifas septadas especializadas (Tortora, Funke & Case, 2012). O basidiocarpo desses fungos, apresenta-se de várias formas: orelha de pau (pelo aspecto de “prateleira” que formam nos troncos das árvores), ferrugem e carvões (fitopatogênicos), entre outros. Muitos apresentam-se como os familiares cogumelos, que podem ser comestíveis ou altamente venenosos (Tortora, Funke & Case, 2012). A reprodução desses microrganismos pode ocorrer de modo assexuado ou sexuado, porém, a maioria dos fungos forma esporos sexuados. O ciclo de vida se inicia de esporos haploides (basidiósporos), que se pareiam originando um micélio com hifas dicarióticas (dois núcleos por célula) septado. Os núcleos então se fundem (cariogamia), formando um zigoto (fase diploide do ciclo), que sofrerá meiose originando novos basidiósporos que, por sua vez, levarão ao desenvolvimento de corpos de frutificação (basidioma) (Putzke & Putzke, 2013; Madigan et al., 2016).
Os basidiomicetos são naturalmente capazes de produzir enzimas que degradam a biomassa, por possuírem um papel ecológico crucial no ciclo do carbono como decompositores de lignocelulose e, até o presente momento, estes são os organismos mais eficientes na degradação da lignina (Floudas et al. 2012). Sua capacidade de produção de enzimas possibilita a atuação em diversos substratos, e com grande versatilidade em relação a formas de vida. Essa atuação em questão pode ser aplicada em processos tecnológicos, incluindo fabricação de papel e celulose, descontaminação de solos e efluentes industriais, nutrição animal e na conversão dos materiais lignocelulósicos da parede vegetal em açúcares fermentescíveis, destinados à bioconversão em etanol (Aguiar & Ferraz, 2011).
A maioria das enzimas produzidas por esses fungos pode ser encontrada nos dois principais grupos de basidiomicetos: fungos de decomposição branca que atacam simultaneamente celulose, hemicelulose e lignina, e fungos de decomposição parda que degradam celulose e hemicelulose, e iniciam a degradação da lignina através de um mecanismo não enzimático (Lundell, Mäkelä & Hildén, 2010; Ohm et al. 2014). Este último, representando cerca de 7% dos basidiomicetos, está presente principalmente em gimnospermas (Rytioja et al. 2014). A divisão desses grupos, se dá de acordo com a modificação que esses fungos causam nos materiais decompostos, assim, diferentes espécies de fungos, têm variados conjuntos CAZy para atender às suas necessidades e aos seus diversos papéis ecológicos (Rytioja et al. 2014).
Os fungos de podridão branca, como por exemplo Phanerochaete chrysosporium, são eficientes degradadores de lignina, quebrando-a em moléculas menores até CO2 e H2O e
assim, os materiais decompostos adquirem uma cor esbranquiçada característica na madeira (Kirk & Cullen, 1998). As enzimas responsáveis pela degradação deste composto aromático nesses fungos, são uma série de peroxidases, lacases e enzimas produtoras de peróxido de hidrogênio, que de acordo com estudos genômicos comparativos, surgiram quando os grandes depósitos de carbono orgânico começaram a diminuir, na era Carbonífera (Lundell et al. 2014; Kuuskeri et al. 2016).
2.3.1 Fungos de decomposição parda
Fungos de decomposição parda, como Gloeophyllum trabeum, que é um fungo modelo e o melhor compreendido e estudado dentro deste grupo, evoluíram a partir dos fungos de podridão branca, sendo os únicos organismos capazes de degradar eficientemente a celulose e hemicelulose, sem causar a remoção substancial da lignina (Floudas et al. 2012). Esses organismos, estão presentes principalmente no hemisfério norte, e atacam preferencialmente madeiras de coníferas, dominando as florestas boreais (Eastwood et al. 2011). À medida que o processo de degradação avança, o material escurece e adquire um resíduo castanho característico de madeira em decomposição, devido ao acúmulo dos resíduos de lignina (Arantes & Goodell, 2014).
Análises de genômica comparativa desses microrganismos, indicam que a evolução dos mesmos foi acompanhada por perdas de algumas enzimas consideradas centrais para a degradação da biomassa (Eastwood et al. 2011; Arantes, Jellison & Goodell, 2012; Floudas et al. 2012). A ausência de celobiohidrolases (GH6 e GH7), que são necessárias para hidrolisar a celulose cristalina, são um exemplo dessa redução, além de LPMOs (AA9) e celobiose
desidrogenase (AA3_1 e AA8). O número de genes atribuídos à algumas enzimas hemicelulolíticas e ligninolíticas também foi reduzido nesses fungos, tais como: endoxilanases (GH10 e GH11), lacases (AA1) e peroxidases (AA2). Isso pode ser explicado pela preferência que esses organismos têm por madeiras macias (do inglês, softwoods), compostas predominantemente por manano ao invés de xilano (Lundell, Mäkelä & Hildén, 2010; Arantes, Jellison & Goodell, 2012; Rytioja et al. 2014).
Contudo, alguns estudos detectaram a remoção da lignina em mais de 20% nesses fungos, mesmo sem ter sido detectado atividade de lacase e peroxidase (Worrall, Anagnost & Zabel, 1997; Machuca & Ferraz 2001). Essas observações, evidenciam a participação de um mecanismo alternativo, responsável pela completa degradação da celulose e parcial da lignina, na ausência das enzimas mencionadas, representando ainda, um menor custo energético para esses fungos (Riley et al. 2014; Rytioja et al. 2014).
Está bem estabelecido que nos estágios iniciais de degradação, o mecanismo alternativo mencionado, ocorre basicamente em duas etapas: inicialmente um passo oxidativo, que modifica a parede celular da planta, através da ação de radicais livres (⋅OH) altamente destrutivos, gerado por um mecanismo conhecido como reação de Fenton (Arantes & Goodell 2014). Desta forma, os constituintes da parede celular tornam-se acessíveis ao ataque das enzimas, garantindo assim, o segundo passo no processo de sacarificação dos polissacarídeos por esse grupo de fungos (Arantes, Jellison & Goodell, 2012).
2.4 REAÇÃO DE FENTON
O mecanismo bioquímico, utilizado pelos fungos de decomposição parda para a biodegradação da parede celular de plantas lignificadas, foi empregado como uma alternativa em relação ao sistema utilizado pelos fungos de decomposição branca. Esses microrganismos, adquiriram um sistema oxidativo, baseado em radical hidroxila, capaz de, aleatoriamente, atacar os constituintes da parede vegetal, causando um rompimento não enzimático da lignocelulose, pela reação de Fenton (Arantes, Jellison & Goodell, 2012; Floudas et al. 2012).
A reação de Fenton mediada é baseada em reações entre peróxido de hidrogênio, e íons ferro (que estão naturalmente disponíveis na madeira) em um meio ácido, dentro da parede celular da planta, formando assim espécies reativas de oxigênio (⋅OH) que causarão a ruptura imediata da matriz de lignocelulose, por serem altamente reativos. Além de despolimerizar a celulose cristalina, o radical hodroxila (⋅OH) pode atacar os anéis aromáticos da lignina (Kaneko et al. 2005):
Fe²⁺ + H2O2 Fe³⁺ + ⋅OH + ¯OH
As hifas fúngicas no lúmen das células vegetais, irão produzir compostos que reduzem ferro (RC), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido oxálico (Figura 7). O ácido oxálico
é responsável por se ligar ao íon férrico Fe³⁺, formando um complexo (Fe-oxalato) que permitirá a difusão pela parede celular da planta, juntamente com a entrada do peróxido e dos compostos redutores de ferro (RC) (Cragg et al. 2015). Assim, e através da mudança de pH entre lúmen – parede celular, o RC é capaz de sequestrar o íon férrico Fe³⁺ do complexo Fe-oxalato, reduzindo-o a íon ferroso Fe²⁺. Desta forma, o íon bivalente (Fe²⁺) reage com H2O2 e produz
radical hidroxila (Cragg et al. 2015).
Figura 7. Esquema do mecanismo de degradação da lignocelulose pelos fungos de decomposição parda utilizando o sistema Fenton. Hifas fúngicas no lúmen das células
vegetais produzem compostos redutores de ferro (RC), peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e ácido oxálico. O ácido oxálico liga-se a Fe³⁺ como um complexo que se difunde na parede celular juntamente com H₂O₂ e RC. Com a mudança de pH, o RC sequestra o Fe³⁺ do complexo Fe-oxalato e o reduz a Fe²⁺. O Fe²⁺ reage com H₂O₂ (reação de Fenton) e produz radicais hidroxila (OH) que destroem a lignocelulose. Retirado de Cragg et al. 2015.
Como já mencionado em tópicos anteriores, as enzimas produzidas pelos fungos de podridão parda, e que são responsáveis pela produção de H2O2 através da redução do oxigênio
celular são: glioxal oxidase (AA5_1) e algumas enzimas da família GMC (glicose – metanol – colina) oxidorredutases - aril álcool oxidase e glicose 1-oxidase (AA3_2), álcool oxidase (AA3_3) e piranose 2-oxidase (AA3_4) (Martinez et al., 2005). Assim, durante o processo de degradação, as subestruturas da lignina sofrerão um processo de desmetilação produzindo
metanol. Este por sua vez, será utilizado pelas enzimas acima mencionadas, principalmente as álcool oxidases (AA3_3), para fornecer o H2O2 necessário para a reação de Fenton. Além disso,
essas enzimas ainda protegem a hifa fúngica do metanol, que é tóxico para as células (Figura 7) (Arantes, Jellison & Goodell, 2012; Cragg et al. 2015).
O ferro bivalente Fe²⁺ (ferroso) que entra na reação é escasso em ambiente aeróbicos, por isso, faz-se necessário a solubilização e redução da forma mais estável do íon ferro Fe³⁺ (férrico) para Fe²⁺ (Eastwood et al. 2011). Os compostos que reduzem ferro (RC), são naturalmente produzidos pelos fungos de podridão parda, são eles: compostos de baixo peso molecular (CBMM) (incluindo ácido oxálico), que podem penetrar através da parede celular, ao contrário das enzimas, e também, como já mencionado no tópico 2.2.1.1, enzimas doadoras de elétrons capazes de reduzir ferro (Arantes, Jellison & Goodell, 2012; Cragg et al. 2015). Após a redução do Fe³⁺ para Fe²⁺, como mostra a Figura 7, o RC volta para o lúmen da célula, onde novamente dará início ao mecanismo.
2.5 Laetiporus sulphureus
Conhecido popularmente como “frango da floresta” (do inglês, chicken of the
woods), o fungo de decomposição parda Laetiporus sulphureus pertence à ordem Polyporales,
e cresce em várias espécies de árvores, principalmente coníferas, formando corpos de frutificação de tamanhos impressionantes, nas cores laranja e/ou amarelo vibrantes. É um cogumelo comestível, popular na Europa e América do Norte, e o tamanho do seu basidiocarpo sugere que esse fungo possa secretar enzimas que apresentem eficiência diferenciada de hidrólise da biomassa (Nagy et al. 2016).
Essa espécie cresce geralmente no final do verão e no outono, em árvores vivas e também em madeira morta, próximo às raízes e em partes mais altas do tronco de árvores como carvalhos, eucaliptos e pinheiros. Dado o tamanho de seus basidiomas, além da sua textura, sabor e valor nutricional, são muito utilizados na culinária no norte da América, sendo muito apreciados por coletores de cogumelos (Oliveira, 2017). Laetiporus significa "com poros brilhantes" e sulphureus significa “cor de enxofre”.
L. sulphureus também possui diversas propriedades interessantes, sendo um fungo
potencial para ser empregado em sistemas biológicos, como por exemplo em biorremediação de efluentes industriais contaminados com corante, bem como outros contaminantes, devido à suas propriedades oxidativas (Mtui & Masalu, 2008). Sua notável coloração também tem sido investigada para a produção comercial de pigmentos (Weber, Mucci & Davoli, 2004; Davoli et
al. 2005), além de ser um fungo produtor de metabolitos antioxidantes, o qual pode ser utilizado na indústria alimentícia como suplemento, estabilizando a deterioração oxidativa de alimentos (Turkoglu et al. 2007). Šiljegović e colaboradores (2011) também investigaram a capacidade antimicrobiana dos extratos de L. sulphureus, tanto para aplicação na indústria alimentícia, como uma alternativa às drogas antimicrobianas comerciais utilizadas na medicina. Entretanto, apesar das possíveis aplicações de L. sulphureus em diferentes áreas, existem poucos estudos na literatura sobre o repertório enzimático desse microrganismo, bem como sua capacidade em degradar a biomassa lignocelulósica (Ferraz et al. 2001; Machuca & Ferraz 2001; Valadares et al. 2016).
Figura 8. Figuras mostrando o fungo de decomposição parda Laetiporus sulphureus crescido em troncos de árvores em florestas. Retirado de https://commons.wikimedia.org
3. OBJETIVOS
O objetivo geral dessa dissertação de mestrado foi ampliar o conhecimento quanto ao repertório de enzimas lignocelulolíticas e industrialmente relevantes do fungo L. sulphureus, e seu potencial biotecnológico. Desta forma, objetivou-se construir uma base genética do fungo através do sequenciamento do genoma e estudos de transcriptomica e secretômica, visando determinar o conteúdo de genes, transcritos e enzimas relacionadas à degradação do bagaço de cana-de-açúcar neste basideomiceto. Os objetivos específicos foram:
Sequenciar genoma, transcriptoma e secretôma do fungo L. sulphureus, para determinar quais genes são induzidos e quais enzimas são produzidas durante o cultivo utilizando bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono.
Realizar e analisar o RNA-seq de L. sulphureus crescido em dois diferentes tipos de cultivos: líquido por 24 horas e semi-sólido por 7 dias, avaliando as diferenças e similaridades na expressão das enzimas.
Caracterizar as atividades celulolíticas e hemicelulolíticas do secretôma do fungo, buscando identificar as principais Cazymes.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Microrganismo
O basidiomiceto L. sulphureus ATCC 52600 foi obtido de uma cultura existente no laboratório de Ciência da Madeira da Escola de Engenharia de Lorena, USP para a utilização nesse estudo.
4.2 Manutenção da linhagem
Os cultivos de L. sulphureus foram realizados em placas de Petri contendo extrato de malte 2% (20 g L¯1), extrato de levedura 0,2% (2 g L¯1) e ágar-ágar 2% (20 g L¯1) e
incubados durante aproximadamente 10 dias a 30ºC. A partir dessas placas foram obtidos os micélios para serem usados como pré-inóculo nos cultivos líquidos e semi-sólidos.
4.3 Cultivo em meio líquido
Para o pré-inóculo, 15 discos de ágar-micélio (8 mm de diâmetro) foram inoculados em frascos Erlenmeyer de 200 mL contendo 100 mL de meio líquido composto de extrato de malte 2,0% (20 g L¯1) e extrato de levedura 0,2% (2 g L¯1) e incubados a 30°C, 180 rpm por 7
dias. Foram utilizados 6 frascos para o cultivo do micélio, 3 foram filtrados e congelados (-80ºC) para posterior extração do RNA total, o qual foi denominado de tempo zero (T0) e/ou referência, e os 3 frascos restantes foram filtrados e transferidos para os cultivos líquidos preparados em frascos Erlenmeyer de 200 mL com 1,0g de bagaço de cana-de-açúcar in natura (BIN) cada, e 100 mL de meio contendo sulfato de amônio (6 g L¯1), fosfato de potássio
dibásico (1 g L¯1), cloreto de potássio (1 g L¯1) e sulfato de magnésio (1 g L¯1). Os cultivos
foram mantidos a 30ºC, 180rpm por 24 horas e foram denominados BIN. O micélio mais substrato foi recolhido por filtração em funil de Buchner, lavado com água estéril, prensado entre folhas de papel de filtro para remoção do excesso de água e armazenados em freezer -80ºC para posterior extração do RNA total.
4.4 Extração de DNA e sequenciamento
O micélio obtido dos pré-inóculos foi congelado e triturado com nitrogênio líquido, e a extração do DNA genômico foi realizada pelo método fenol/clorofórmio. Neste método, para cada 100mg de micélio triturado, foram adicionados 500 uL de tampão de extração (Tris HCl 200mM pH 8.0, NaCl 250mM, EDTA 25mM, SDS 0,5%) e 500uL de fenol:clorofórmio (1:1 v/v) seguido de agitação em vortex e centrifugação. O sobrenadante 1 foi transferido para
novo tubo e o volume completado para 1,5mL com clorofórmio seguindo-se de agitação e centrifugação a 16.000g por 5 minutos. Foram adicionados ao sobrenadante 2.540uL de isopropanol, e a mistura foi centrifugada novamente. O sedimento foi ressuspendido em 50uL de água estéril. Foi adicionado à suspensão 10mg.mL-1 de RNAse e a mistura foi incubada a 37ºC por 1h. A etapa de purificação do DNA foi realizada usando DNeasy Kit (Qiagen) segundo instruções do fabricante. O sequenciamento Illumina foi preparado utilizando uma biblioteca paired-end de 300 pb e duas bibliotecas mate-pair de 5 a 7 kb e 8 a 11 kb de acordo com instruções do fabricante e sequenciadas na plataforma Illumina HiSEq 2500 disponível no Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE/CNPEM).
4.5 Montagem e anotação do genoma
A qualidade das sequências geradas foi analisada pelo software FastQC v0.11.5 (Andrews et al. 2010) e a remoção dos adaptadores e sequências de baixa qualidade foi realizada utilizando o algoritmo Trimomatic 0.32 (Bolger, Lohse & Usadel, 2014). As bibliotecas mate-pair também foram processadas com NextClip para remover as reads sem adaptadores de junção mate-pair. A montagem do genoma foi realizada com Velvet 1.2.10 utilizando um kmer = 55, a montagem dos scaffoldings utilizando as bibliotecas mate-pair foram realizadas pelo SSPACE 3.0 e o conjunto resultante foi refinado utilizando Pilon versão 1.16. O software Augustus foi utilizado para predição dos genes, em seguida as sequências gênicas foram analisadas contra os bancos de dados do dbCAN, SwissProt, Pfam e EggNOG para a anotação funcional. Os peptídeos sinal foram preditos utilizando o software SignalP v.4.0 (Petersen et al. 2011) e as regiões transmembranares foram preditas utilizando TMHMM (Krogh et al. 2001). Os genes ribossomais foram identificados pelo ITSx usando Modelos Fúngicos.
4.6 Extração de RNA e sequenciamento
O micélio obtido dos cultivos líquidos foi triturado com nitrogênio líquido, e a extração do RNA total foi realizada pelo protocolo mirVana™ Isolation Kit, segundo instruções do fabricante. A solução resultante foi tratada com DNAse (DNA-Free RNA Kit, Zymo Research) para a remoção de DNA residual. Em seguida, a purificação foi realizada usando RNeasy Kit (Qiagen) e a qualidade do RNA foi verificada utilizando RNAnano chip Bioanalyzer 2100 (Agilent). As bibliotecas de cDNA foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante (Illumina) e sequenciadas na plataforma Illumina HiSEq 2500 disponível no Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE/CNPEM).
