Estudo de interação de clonazepam e excipientes em formulações farmacêuticas sólidas e validação de método indicativo de estabilidade

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

Franciny Aparecida Alves

Estudo de interação de Clonazepam e excipientes

em formulações farmacêuticas sólidas e validação

de método indicativo de estabilidade

CAMPINAS 2017

ESTUDO DE INTERAÇÃO DE CLONAZEPAM E

EXCIPIENTES EM FORMULAÇÕES

FARMACÊUTICAS SÓLIDAS E VALIDAÇÃO DE

MÉTODO INDICATIVO DE ESTABILIDADE

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.

Orientador: PAULO CÉSAR PIRES ROSA

O arquivo digital corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno Franciny Aparecida Alves e orientada pelo Dr. Paulo César Pires Rosa.

CAMPINAS

Comissão Examinadora de Defesa

Prof. Dr. Paulo César Pires Rosa (orientador)

Profa. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya Profa. Dra. José Luiz Costa

Observação: Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

“Não é o que você faz, mas quanto amor você dedica no que faz que realmente importa ”

Primeiramente agradeço a Deus, que me possibilitou a oportunidade e o interesse em realizar esse trabalho.

Aos meus pais, José Carlos e Marlene, por transmitirem valores não só por palavras, mas com exemplo de vida, e por me fazerem acreditar que seria capaz de vencer os desafios.

Ao meu esposo Bruno, que desde que entrou na minha vida, deu mais sentido a tudo, transformando dificuldades em desafios, fortalecendo minha vontade de vencer e realizar meus objetivos, pelo companheirismo e por me encorajar a seguir em frente, me apoiando sempre.

Aos meus avós, tios, primos e todos meus familiares, pelo amor, carinho e por apoiar, torcer e vibrar pelas minhas conquistas.

Aos meus amigos que me ajudaram, apoiaram e tornam minha vida mais feliz.

Às professoras Dra. Alexandra Sawaya, Dra. Marcia Cristina, pelas contribuições durante a qualificação do projeto de pesquisa. À colaboração dos professores Dr. José Luiz Costa, Dra.Maria de Lourdes Moraes e novamente Dra. Alexandra Sawaya na análise prévia e aos professores Dr. José Luiz Costa, Dra. Alexandra Sawaya, por aceitarem compor a banca da defesa e fazer as contribuições finais para a dissertação.

Ao Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa, pela oportunidade, paciência e por todos os ensinamentos. Meus sinceros agradecimentos, sem seu direcionamento e apoio, com certeza, este projeto jamais teria se concretizado.

Os estados de ansiedade e os distúrbios do sono representam problemas comuns, e os agentes sedativo-hipnóticos estão entre as drogas mais largamente prescritas em todo o mundo. Clonazepam, é um derivado benzodiazepínico amplamente administrado como ansiolítico, anticonvulsivante, relaxante muscular e anestésico sedativo. O delineamento do estudo de interação de excipientes de formulação de Clonazepam e o desenvolvimento de método indicativo de estabilidade são as grandes dificuldades na área farmacêutica, desafiando profissionais de desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Através deste estudo é possível evidenciar a estabilidade do medicamento. Este trabalho teve como principais objetivos, aplicar a análise por Infravermelho (IR) para verificação da degradação e alteração dos grupos funcionais; aplicar análise térmica, devido a importância no estudo de caracterização, a determinação do grau de pureza e a realização de ensaios de estabilidade e cinética de decomposição; e desenvolver e validar um método para a quantificação de Clonazepam, com uma nova análise cromatográfica sem uso de tampão na fase móvel, para ser aplicado nos estudos de estabilidade de formulações farmacêuticas e na análise de produtos de degradação. Os resultados obtidos da análise térmica mostraram que os excipientes estudados não evidenciaram mudanças no comportamento térmico das misturas binárias clonazepam-excipiente sem indicação de incompatibilidade. O método analítico desenvolvido por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) mostrou-se adequado para a quantificação de Clonazepam e de suas impurezas, baseando-se nos parâmetros de validação da resolução da ANVISA (899/2003). A implementação da análise térmica e a aplicação de novos métodos analíticos têm sido consideradas importantes ferramentas nas diferentes áreas da indústria farmacêutica, fornecendo informações que determinam os parâmetros de qualidade tecnológicos do medicamento, visando o desenvolvimento de novas formulações.

PALAVRAS-CHAVE: Clonazepam; Estabilidade; Produtos de Degradação;

Anxiety and sleeping disturbs states represent common problems and the sedative-hypnotics agents are among the most widely prescribed drugs all over the world. Clonazepam is a benzodiazepine derivative largely given as an anxiolytic, anticonvulsant, muscle relaxant and sedative anaesthetic. The delineation of the study on the interaction of excipients of Clonazepam formulation and the development of indicative method of stability are the major difficulties in the pharmaceutic area, challenging pharmaceutics products developers. Through the present study, it is possible to demonstrate the medication stability. This study has had as main objectives to apply the analysis via Infrared (IR) to verify the degradation and alteration of the functional groups; to apply thermal analysis, due to their importance in the characterization study, the determination of the purity degree and the execution of stability and decomposition kinetic tests; and to develop and validate a method for the quantification of Clonazepam, with a new chromatographic analysis with no use of buffer in the mobile phase to be applied in the studies of stability of pharmaceutic formulations and in the analysis of degradation products. The results obtained from the thermal analysis have showed that the studied excipients did not reveal changes in the thermal behaviour of the binary mixtures, clonazepam-excipient, with no indication of incompatibility. The analytic method developed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) has been shown adequate for quantification of Clonazepam and its impurities, based on the validation parameters of the Brazilian Health Regulatory Agency’s (ANVISA) resolution (899/2003). The implementation of thermal analysis and the application of new analytic methods have been considered important tools in the diverse areas of the pharmaceutical industry, providing information that define the technological quality parameters of the medication, aiming the development of new formulations.

KEYWORDS: Clonazepam; Stability; Degradation Products; Excipients; Methods Development; Validation; Thermal Analysis.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Estrutura molecular do Clonazepam (A), Composto Relacionado A (B),

Composto Relacionado B (C) respectivamente. ... 22

FIGURA 2 – Fluxograma de validação de métodos analíticos... 50

FIGURA 3 – Espectro de Infravermelho do Clonazepam ... 56

FIGURA 4 – Espectro de Infravermelho do Amido. ... 57

FIGURA 5 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Amido... 57

FIGURA 6 – Espectro de Infravermelho do Estearato de magnésio ... 58

FIGURA 7 – Espectro de Infravermelho da mistura de CLZ e Estearato de magnésio ... 58

FIGURA 8 – Espectro de Infravermelho da Celulose microcristalina ... 59

FIGURA 9– Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Celulose microcristalina. ... 60

FIGURA 10 – Espectro de Infravermelho da Lactose monohidratada ... 60

FIGURA 11 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Lactose monohidratada ... 61

FIGURA 12 – Espectro de Infravermelho da mistura de excipientes ... 61

FIGURA 13 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e excipientes ... 62

FIGURA 14 – Curva de DSC do Clonazepam ... 63

FIGURA 15 – Curva de DSC do Amido ... 63

FIGURA 16 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Amido. ... 64

FIGURA 17 – Curva de DSC comparativa de Clonazepam e Amido ... 64

FIGURA 18A – Curva de TG e DTG do Clonazepam. ... 66

FIGURA 18B - Curva de TG e DTG do Amido (b), mistura de Clonazepam com Amido (c) e comparativo (d). ... 67

FIGURA 19 – Curva de DSC do Estearato de magnésio ... 68

FIGURA 20 – Curva de DSC da mistura de CLZ e Estearato de magnésio ... 68

FIGURA 21 – Curva de DSC Comparativa de CLZ e Estearato de magnésio... 69

FIGURA 22 – Curva de TG e DTG do CLZ (a), Estearato de magnésio (b), mistura de Clonazepam com Estearato de magnésio (c) e comparativo (d) ... 71

FIGURA 24 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Celulose microcristalina

... .73

FIGURA 25 – Curva de DSC Comparativa de Clonazepam e Celulose microcristalina ... 73

FIGURA 26 – Curva de TG e DTG do Clonazepam(a), Celulose microcristalina(b), mistura de Clonazepam com Celulose microcristalina(c), e comparativo(d) ... 76

FIGURA 27 – Curva de DSC da Lactose ... 77

FIGURA 28 – Curva de DSC da mistura de Clonazepam e Lactose ... 78

FIGURA 29 – Curva de DSC comparativa do Clonazepam e Lactose ... 78

FIGURA 30A – Curva de TG e DTG do Clonazepam (a) e Lactose (b) ... 80

FIGURA 30B – Curva de TG e DTG para mistura de CLZ com Lactose (c) e comparativo (d) ... 80

FIGURA 31 – Curva de DSC mistura de excipientes ... 82

FIGURA 32 – Curva de DSC Clonazepam e mistura de excipientes ... 83

FIGURA 33 – Curva de TG da mistura de Clonazepam e excipientes ... 84

FIGURA 34 – Cromatograma da solução de padrões de CLZ, CR A, CR B ... 85

FIGURA 35 – Cromatograma da solução amostra de CLZ à 0,1mg/mL ... 86

FIGURA 36 – Curva Analítica - Área x Concentração Clonazepam ... 91

FIGURA 37 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica Clonazepam ... 91

FIGURA 38 – Gráfico de Resíduos Clonazepam ... 92

FIGURA 39 – Gráfico de Resíduos Padronizados Clonazepam ... 92

FIGURA 40 – Curva Analítica - Área x Concentração CR A ... 93

FIGURA 41 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica CR A ... 94

FIGURA 42 – Gráfico de Resíduos CR A ... 94

FIGURA 43 – Gráfico de Resíduos Padronizados CR A ... 95

FIGURA 44 – Curva Analítica - Área x Concentração CR B ... 96

FIGURA 45 – Curva Analítica - Concentração Obtida x Concentração Teórica CR B ... 96

FIGURA 46 – Gráfico de Resíduos CR B ... 97

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Ensaios necessários para a validação ... 37

TABELA 2 – Parâmetros e critérios de aceitação estudados na validação ... 44

TABELA 3 – Misturas binárias de excipientes ... 47

TABELA 4 – Formulação da amostra simulada ... 49

TABELA 5 – Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de Linearidade ... 52

TABELA 6 – Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de Exatidão. ... 53

TABELA 7 – Absorção dos principais grupos funcionais para o Clonazepam ... 56

TABELA 8 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para Clonazepam e Amido ... 65

TABELA 9 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para Clonazepam e Estearato de magnésio ... 69

TABELA 10 – Dados dos ensaio de TG para Clonazepam , Estearato de magnésio e mistura de Clonazepam com Estearato de magnésio ... 71

TABELA 11 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para Clonazepam e Celulose microcristalina ... 74

TABELA 12 – Dados dos ensaios de TG para Clonazepam, Celulose microcristalina e mistura de Clonazepam com Celulose microcristalina ... 74

TABELA 13 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para Clonazepam e Lactose ... 79

TABELA 14 – Dados dos ensaio de TG para Clonazepam, Lactose e mistura de Clonazepam com Lactose ... 81

TABELA 15 – Resultados de entalpia e temperatura para o ensaio de DSC para mistura de excipientes. ... 81

TABELA 16 – Adequação do sistema . ... 87

TABELA 17 – Seletividade / Especificidade... 88

TABELA 18 – Degradação Forçada Padrão. ... 88

TABELA 19 – Degradação Forçada Amostra. ... 88

TABELA 20 – Produtos de Degradação encontrados no teste de degradação Forçada ... 89

TABELA 21 – Linearidade Clonazepam. ... 90

TABELA 22 – Linearidade CR A. ... 93

TABELA 23 – Linearidade CR B. ... 95

TABELA 24 – Limite de Quantificação de Clonazepam. ... 98

TABELA 25 – Limite de Quantificação de CR A. ... 98

TABELA 26 – Limite de Quantificação de CR B ... 98

TABELA 27 – Padrão CLZ – Precisão Intradia. ... 99

TABELA 28 – Padrão CLZ – Precisão Interdia . ... 99

TABELA 29 – Exatidão do Clonazepam . ... 100

TABELA 30 – Exatidão do CR A . ... 100

TABELA 31 – Exatidão do CR B . ... 101

TABELA 32 – Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CLZ. ... 102

TABELA 33 – Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CR A. ... 102

TABELA 34 – Robustez - Condições Testadas x Condição Normal CR B. ... 102

TABELA 35 – Estudo de estabilidade ... 104

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µ – Micro

°C – Graus Célcius % - Porcentagem

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária BZDs - Benzodiazepícos

C8 – Octil C – Carbono

Cf – Concentração Final

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência cm-1 – Centímetro a menos 1

CMD - Concentração média determinada CR A – Composto Relacionado A

CR B – Composto Relacionado B DP – Desvio Padrão

DPR – Desvio Padrão Relativo

DSC - Calorimetria Exploratória Diferencial DTA - Análise Térmica Diferencial

DTG - Termogravimetria Derivada Ed - Edição

FE – Fase Estacionária FM – Fase Móvel

FT/IR - Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier g - Grama

GABA - Ácido gama-aminobutírico H - Hidrogênio

HPLC - High Performance Liquide Chromatography ICH - International Conference on Harmonisation IFA – Insumo Farmacêutico Ativo

IV – Infra-Vermelho J - Jaule

LQ – Limite de Quantificação M - Molar mg – Miligramas min - Minutos mL – Mililitros mm – Milímetros N - Nitrogênio ng - Nanogramas nm – Nanômetro O - Oxigênio

pKa – Log negativo da Constante de Acidez pKb – Log negativo da Constante Básica p/p – Peso por Peso

p/v – Peso por Volume

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada RE – Resolução

RRT – Tempo de Retenção Relativo SNC – Sistema Nervoso Central T - Temperatura

TG - Termogravimetria

USP – United States Pharmacopeial UR – Umidade Relativa

v/v/v – Volume por volume por volume v/v – Volume por volume

SUMÁRIO

3.3 Estudo de compatibilidade fármaco x excipiente ... 24

3.3.1 Excipientes ... 26

3.4 Análise Térmica ... 26

3.5 Espectroscopia de Infravermelho ... 27

3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) ... 28

3.7 Estabilidade ... 29

3.7.1 Estudo de Degradação Forçada ... 33

3.8 Desenvolvimento de Métodos ... 35 3.9 Validação de Métodos ... 36 3.9.1 Especificidade/Seletividade ... 38 3.9.2 Linearidade ... 39 3.9.3 Exatidão ... 40 3.9.3.1 Fármaco ... 40 3.9.3.2 Forma Farmacêutica ... 41 3.9.3.3 Impurezas ... 41 3.9.4 Precisão ... 41

3.9.4.1 Repetitividade (Precisão Intradia) ... 43

3.9.4.2 Precisão Intermediária (Precisão Interdia) ... 43

3.9.4.3 Reprodutibiblidade ... 44

3.9.5 Limite de Quantificação ... 44

3.9.6 Robustez ... 44

4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 46

4.1.1 Matérias-primas ... 46

4.1.2 Reagentes ... 46

4.1.3 Consumíveis ... 47

4.1.4 Aparelhagem experimental ... 47

4.2 Métodos ... 47

4.2.1 Estudo de interação fármaco + excipiente ... 47

4.2.2 Infravermelho ... 48

4.2.3 Termogravimetria ... 48

4.2.3.1 Calorimetria exploratória diferencial ... 49

4.2.4 Desenvolvimento do método cromatográfico ... 49

4.2.4.1 Preparo das Soluções ... 49

4.2.4.2 Condições Cromatográficas ... 50 4.2.5 Validação do Método ... 51 4.2.5.1 Elaboração do protocolo ... 51 4.2.5.2 Seletividade/Especificidade ... 52 4.2.5.2.1 Degradação Forçada ... 52 4.2.5.3 Linearidade ... 53 4.2.5.4 Exatidão ... 54 4.2.5.5 Precisão ... 54 4.2.5.6 Limite de Quantificação ... 55 4.2.5.7 Robustez ... 55 4.2.5.8 Estudo de estabilidade ... 56 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57 5.1 Infravermelho ... 47

5.2 Calorimetria Exploratória Diferencial e Termogravimetria ... 62

5.2.1 Clonazepam e Amido ... 62

5.2.1.1 DSC Clonazepam e Amido ... 62

5.2.1.2 TG Clonazepam e Amido ... 65

5.2.2 Clonazepam e Estearato de Magnésio ... 67

5.2.2.1 DSC Clonazepam e Estearato de Magnésio ... 67

5.2.2.2 TG Clonazepam e Estearato de Magnésio ... 69

5.2.3 Clonazepam e Celulose microcristalina ... 71

5.2.3.2 TG Clonazepam e Celulose microcristalina ... 73

5.2.4 Clonazepam e Lactose monoidratada ... 76

5.2.4.1 DSC Clonazepam e Lactose monoidratada ... 76

5.2.4.2 TG Clonazepam e Lactose monoidratada ... 79

5.2.5 Excipientes e Clonazepam com excipientes ... 81

5.2.5.1 DSC Excipientes e Clonazepam com excipientes ... 81

5.2.5.2 TG Excipientes e Clonazepam com excipientes ... 83

5.3 Desenvolvimento de métodos ... 84 5.4 Validação de métodos ... 86 5.4.1 Adequação do Sistema ... 86 5.4.2 Especificidade/Seletividade ... 87 5.4.3 Linearidade ... 90 5.4.4 Limite de Quantificação ... 98 5.4.5 Precisão ... 98 5.4.6 Exatidão ... 100 5.4.7 Robustez ... 101 5.4.8 Estabilidade ... 103 6 CONCLUSÃO ... 106 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 108 ANEXOS ... 108

1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1.1 Introdução

Os estados de ansiedade e os distúrbios do sono representam problemas comuns, e os agentes sedativo-hipnóticos estão entre as drogas mais largamente prescritas em todo o mundo. Clonazepam (CLZ) é o principio ativo do medicamento referência, genérico e similar, na forma farmacêutica de comprimido, solução. É um derivado benzodiazepínico amplamente administrado como ansiolítico, anticonvulsivante, relaxante muscular e anestésico sedativo. Possui ação inibitória das funções do sistema nervoso central e sua biotransformação ocorre principalmente pela redução do grupo 7-nitro, durante a qual, espécies tóxicas podem ser formadas (SHARMA et al, 2010).

Os ansiolíticos à base de Clonazepam são as substâncias mais consumidas no Brasil entre os 166 princípios ativos de remédios tarja preta segundo o Boletim do Sistema Nacional de Gerenciamento de Produtos Controlados da ANVISA, entre 2007 e 2010. Além disso, o consumo brasileiro de CLZ, em 2007 era de 29 mil caixas por ano. Em 2015, este número atingiu os 23 milhões, de acordo com a IMS Health agravando ainda mais a situação.

O emprego de métodos analíticos sensíveis é imprescindível para que o controle de qualidade possa garantir a eficácia e a segurança do uso de um medicamento. A escolha do método a ser utilizado na análise depende de vários fatores, tais como a natureza do fármaco, pureza e quantidade de amostra. Além disso, deve-se levar em conta as condições do laboratório e os custos envolvidos na análise (AVEDAÑO, 1993).

Entre os métodos para este fim destacam-se os métodos espectroscópicos, cromatográficos e térmicos. Neste contexto, a análise térmica constitui um grupo de técnicas de grande interesse na área farmacêutica, visto que propicia a obtenção de dados relevantes quanto ao comportamento térmico de fármacos e insumos farmacêuticos, em tempo relativamente curto, fundamentais para a a avaliação de possíveis incompatibilidades e para o desenvolvimento de novos produtos.

As principais técnicas termoanalíticas aplicadas nessa área são: calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise térmica diferencial (DTA) e a termogravimetria

(TG) (GIRON, 1986; CLAS et al., 1999). A aplicação da análise térmica no Brasil com esta finalidade é recente e vem crescendo significativamente nos últimos dez anos. Poucos trabalhos foram publicados na literatura contendo dados de análise térmica para o CLZ. Esse fato motiva a avaliação da estabilidade térmica desse fármaco e de compatibilidade fármaco/excipiente.

Em complementação às avaliações de interação fármaco-excipiente, o estudo de compatibilidade através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência pode ser realizado pelo análise do produto de degradação de um fármaco ou somente como técnica complementar as outras técnicas. Além disso, a cromatografia tornou-se uma ferramenta muito útil para a determinação de benzodiazepínicos.

Tradicionalmente, o clonazepam é quantificado por método cromatográfico farmacopéico. Devido à relevância terapêutica do clonazepam e de sua ampla comercialização no país, torna-se importante o desenvolvimento do presente trabalho de forma a contribuir para a avaliação da qualidade das especialidades farmacêuticas contendo este fármaco.

2 OBJETIVOS

2.1.1 Objetivo geral

Desenvolver e validar um método para quantificação do Clonazepam e seus produtos de degradação e aplicá-lo no estudo de degradação forçada. Avaliar interações entre CLZ e excipientes por análises térmicas e infravermelho.

2.1.2 Objetivos específicos

Desenvolver e validar método cromatográfico e avaliar a estabilidade térmica do Clonazepam e seus processos de decomposição.

Avaliar as possíveis interações entre o Clonazepam e excipientes utilizados em formulações farmacêuticas por análise térmica e infravermelho.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Benzodiazepínicos

Na década de 50, diante do elevado risco oferecido pelo tratamento ansiolítico com barbitúricos, foram mobilizados esforços visando à descoberta de novas substâncias tranquilizantes (FERRAZ, 2010). Assim, se deu a descoberta dos benzodiazepínicos (BZDs), possibilitando a diferenciação entre sedativos, hipnóticos e tranquilizantes, sendo o clordiazepóxido o primeiro da classe a ser comercializado (COELHO, 2011; FORSAN, 2010).

O mecanismo de ação dessas substâncias se baseia na interação com um grupo de receptores denominados receptores ácido gama-aminobutírico (GABAA) localizados no sistema nervoso central (SNC) e que são responsáveis pela resposta inibitória. Essa interação ocorre de forma indireta, pois os receptores dos benzodiazepínicos se situam na mesma estrutura desses receptores e dessa forma aumentam a resposta do GABA (neurotransmissor inibitório). Desse modo, os compostos supracitados apresentam os efeitos de sedação, redução da ansiedade e agressividade, indução do sono, relaxamento muscular, amnésia anterógrada e anticonvulsivante (FUCHS; WANNMACHER, 2010; RANG; DALE, 2012)

A classe dos BZDs apresentou vantagens como segurança e uma tolerância diminuída, fatores responsáveis pela sua aceitação e formidável sucesso (FERRAZ, 2010). Além disso, segundo Fuchs e Wannmacher (2010), eles substituíram os barbitúricos como hipnóticos, uma vez que os BZDs possuem um maior índice terapêutico e não são indutores enzimáticos.

Motivada por sua relativa segurança, na medida em que são necessárias altas doses de BZDs para um efeito tóxico, sua prescrição e utilização ocorrem de forma abusiva; mesmo sendo medicamentos controlados e dispensados apenas mediante apresentação de receituário médico (TELLES FILHO et al., 2011).

Estimativas apontam que o consumo de Benzodiazepínicos dobra a cada período de cinco anos. Esse consumo crescente pode ter sido resultado da introdução copiosa de novas drogas pertencentes a essa classe, a pressão crescente através de propaganda efetuada pela indústria farmacêutica ou, ainda, hábitos de prescrição inadequada por parte dos prescritores (CASTRO et al., 2013).

Em estudo realizado por Auchewskiet et al. (2004), foi observado que os principais efeitos adversos que comprometem o usuário de BZDs são a diminuição da atividade psicomotora, prejuízo da memória e o desenvolvimento de dependência. Em casos de superdosagem pode haver hipotonia muscular, dificuldade de deambulação e desmaio, contudo a letalidade é rara. Entretanto, episódios graves de intoxicação por fármacos desse grupo são desencadeados pela administração conjunta de outros depressores do SNC (OGA et al. 2014).

Além dos casos de intoxicação advindos da superdosagem também são relatados que os BZDs estão relacionados a crimes como suicídio, homicídio, violência sexual e acidentes no trânsito (SMINK et al., 2008).

As pesquisas mais recentes apontam o clonazepam como um dos Benzodiazepínicos mais utilizados no Brasil (TELLES FILHO et al., 2011). A alta prevalência do uso desse fármaco a nível nacional pode ser explicada pela existência do Programa Nacional de Assistência Farmacêutica que distribui o medicamento Clonazepam gratuitamente, mediante apresentação de receita. (BRASIL, 2007). Devido a uma maior popularização e aceitação terapêutica, o CLZ vem se destacando nos últimos estudos de caráter epidemiológico como o benzodiazepínico mais usado (BETTIOL, 2012).

3.2 Clonazepam

O Clonazepam (Figura 1) é um benzodiazepínico de ação curta a intermediária. Devido a suas marcantes propriedades antiepilépticas, quando comparado a outros benzodiazepínicos, é muito utilizado na clínica como adjuvante no tratamento de convulsões. A nomenclatura química do CLZ [5- (2-clorofenil) -1,3-di-hidro-nitro-2H-1,4-benzodiazepi-2-ona] denota sua classificação como 7-nitrobenzodiazepina (NEGRUSZ et al., 2003).

A molécula do referido fármaco foi sintetizada a partir do nitrazepam através do processo de halogenação. O CLZ se caracteriza por apresentar uma estrutura molecular relativamente simples e por isso foi um dos primeiros de sua classe a ser sintetizado em laboratório, sendo considerado um “Benzodiazepínico clássico” (FERRAZ, 2010).

A) B) C)

Figura 1 – Estrutura molecular do Clonazepam (A), Composto Relacionado A (B), Composto Relacionado B (C) respectivamente.

É indicado em casos de stress pós-traumático, transtornos obsessivo-compulsivos e pânico associado a fobias, além de possuir utilizações no tratamento da epilepsia. Como os benzodiazepínicos são drogas sedativas, eles são utilizados como agentes de indução da anestesia geral em cirurgia e endoscopia. (DRUMMER, 1998)

O clonazepam se apresenta em termos físico-químicos como um pó cristalino branco e insolúvel em água (solubilidade igual a 100mg/L), com coeficiente de partição de 2,41, ponto de fusão variando entre 236,5-238,5°C, peso molecular de 315,71g/mol e um PKa de 1,50 (DRUGBANK, 2005; FERNER, 2008).

Segundo Ganança et al. (2002), as características farmacológicas do CLZ são similares às dos demais benzodiazepínicos; possuindo efeitos ansiolíticos, sedativos e propriedades serotoninérgicas. Esse composto é capaz de estimular a produção de serotonina a nível central e facilitar a transmissão do Ácido-Gama-Aminobutírico (GABA). Além dessas propriedades, o mesmo é considerado um fármaco seletivo para o tratamento da epilipsia, pois potencializa os canais de GABA no núcleo talâmico impedindo, dessa forma, o ciclo tálamo-cortical sincrônico reticular, responsável por descargas repetitivas nos ataques epilépticos (GOLAM, 2009; RANG; DALE, 2012).

A dose diária de uso geralmente se situa entre 1,5 e 10mg. Esse fármaco é rapidamente e totalmente absorvido após a administração por via oral. A biodisponibilidade absoluta do clonazepam é de aproximadamente 90%, com uma concentração máxima sendo alcançada entre 1-4 horas (GOODMAN et al., 2012). Possui metabolização hepática (citocromo P450, incluindo CYP3A) e a

biotransformação acontece prioritamente através da redução do grupo 7-nitro para o derivado 7-aminoclonazepam, sendo que apenas 2% da dose são excretadas de forma inalterada na urina (DRUGBANK, 2005).

Segundo Bares et al. (2004), o citado fármaco demonstra uma estreita faixa terapêutica plasmática de 10 a 50 ng/mL. Devido a isso, o monitoramento do tratamento com o clonazepam em pacientes epilépticos é recomendado. Além disso, também são muitos os relatos descrevendo casos de abuso desse medicamento, envolvendo tentativas de suicídio, crimes sexuais, homicídios, entre outros (ADAMOWICZ, KALA, 2010; BATISSE et al., 2014; SMINK et al., 2008).

O polimorfismo pode ocasionar desvios de qualidade durante o processo produtivo e influenciar o desempenho dos medicamentos. Muitas das propriedades físico-químicas de um sólido variam quando a estrutura cristalina deste é alterada. Além de alterações nas propriedades físico-químicas, o polimorfismo pode ocasionar alterações na estabilidade química, principalmente, para os compostos com predisposição à degradação no estado sólido (ARAUJO et al., 2012). De acordo com Santos et al. (2014), o CLZ possui uma forma de cristal conhecida, porém não foi possível fazer sua classificação polimórfica.

Assim, atualmente é preconizada a realização de análises para sua detecção em diferentes matrizes biológicas e com diversas finalidades e, estas em sua maioria, empregam métodos cromatográficos como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e a cromatografia gasosa (CG) (BARES, 2004; CHEZÉ et al., 2004).

3.3 Estudo de compatibilidade fármaco x excipiente

Entende-se como incompatibilidade química entre substâncias a existência de qualquer interação entre elas, em função do aquecimento, que dá origem a alterações da estrutura química da substância avaliada, seja por decomposição da molécula original ou pela formação de uma nova espécie química. Estas informações adquirem atenção especial na área farmacêutica, pois certas interações físicas e químicas entre fármaco e excipientes da formulação podem afetar não somente a natureza química, mas também a estabilidade e a biodisponibilidade do ingrediente

farmacologicamente ativo e, por consequência, afetar seu efeito terapêutico e a eficácia do medicamento (ARAÚJO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2005).

Uma formulação é composta, além do fármaco ou insumo farmacêutico ativo, de vários componentes conhecidos como excipientes (adjuvantes farmacotécnicos) com função farmacêutica variada e especializada, como por exemplo, excipientes usados para melhorar o sabor, odor, aspecto como corantes podem ocasionar a degradação do IFA. O desenvolvimento de uma formulação apropriada exige considerar as características físicas, químicas e biológicas de todos os componentes utilizados na produção do produto. Uma formulação bem-sucedida de uma forma farmacêutica depende da seleção cuidadosa dos excipientes que serão adicionados para facilitar a administração, promover a biodisponibilidade do fármaco e protegê-lo de fatores extrínsecos que levariam à degradação (AULTON, 2005; DESAI et al., 2003).

A ocorrência de interações no estado sólido entre fármacos e excipientes em formas farmacêuticas sólidas pode ocasionar mudanças na estabilidade física e química como solubilidade, dissolução e possivelmente biodisponibilidade dos fármacos. A avaliação desta interação pode ser analisada por métodos espectroscópicos, térmicos e cromatográficos. Estas análises são realizadas, porque, se o fármaco for compatível com os excipientes em altas temperaturas, é necessariamente compatível com os mesmos em temperatura ambiente (DESAI et al., 2003).

Atualmente, o estudo de compatibilidade fármaco-excipiente envolve técnicas de análise térmica, como DSC (THOMAS & NAATH, 2008, OLIVEIRA et al., 2011). O DSC associado às técnicas de TG tem-se mostrado de muita utilidade nos estudos de pré-formulação na investigação e predição de incompatibilidades físico-químicas entre fármaco e excipientes (CLAS et al., 1999).

Os estudos de compatibilidade fármaco-excipientes são geralmente conduzidos através da obtenção de curvas de DSC do fármaco, do excipiente e da mistura na proporção inicial de 1:1 do fármaco e do excipiente.

3.3.1 Excipientes

O conceito tradicional de excipientes farmacêuticos postula-os como substâncias que não apresentam funções farmacológicas e que são inseridos em uma formulação para facilitar sua administração e promover sua preservação. A qualidade destes excipientes está intimamente ligada à qualidade do medicamento e sua ação terapêutica esperada no organismo (LIRA, 2004).

As fórmulas farmacêuticas podem ser compostas por diversas classes de excipientes como diluentes, absorventes, veículos, agentes suspensores, revestimentos, agentes estabilizantes, flavorizantes, corantes, edulcorantes, agentes molhantes, desagregantes, deslizantes, dentre outros (FERREIRA, 2008). Porém as que apresentam importância para as formas farmacêuticas sólidas de uso oral são: dessecantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes e molhantes.

Os dessecantes, são substâncias que por serem higroscópicas, protegem a formulação contra umidade. Os desintegrantes ou desagregantes são utilizados para acelerar a desintegração das formas farmacêuticas sólidas em água ou nos líquidos do organismo. A presença do agente desintegrante na formulação visa facilitar a desagregação da forma farmacêutica, aumentando a área superficial e promovendo a dissolução do fármaco (VILLANOVA, 2009). Os diluentes são substâncias geralmente inertes, adicionadas ao fármaco com a finalidade de fornecer formas farmacêuticas sólidas com volume adequado. A presença de diluentes muito hidrofílicos como a lactose, pode aumentar a captura de líquidos e, conseqüentemente aumentar a molhabilidade das partículas, acelerando a velocidade de liberação dos fármacos. Os lubrificantes favorecem o fluxo dos pós, facilitando seu deslocamento no momento do preparo. Os agentes molhantes quando adicionados à formulação, aumentam a molhabilidade do ativo e promovem o aumento da velocidade de dissolução do fármaco. (FERREIRA, 2008).

3.4 Análise Térmica

O conhecimento das propriedades físico-químicas de fármacos é fator indispensável durante o desenvolvimento de medicamentos. O planejamento racional de uma forma farmacêutica deve, portanto, iniciar com a caracterização do princípio

ativo em questão, de modo a otimizar parâmetros de qualidade da forma farmacêutica final.

O termo análise térmica refere-se a um grupo de técnicas nas quais propriedades físico-químicas de uma substância são mensuradas em função do tempo ou da temperatura enquanto a amostra é submetida a um programa controlado de temperatura (GIRON, 2002).

DSC e TG são as técnicas termoanalíticas mais difundidas e empregadas para o desenvolvimento de diferentes estudos sendo aplicadas a uma grande variedade de materiais farmacêuticos (OZAWA, 2000).

A aplicação de métodos térmicos de análise, em especial o DSC e a TG tem sido de fundamental importância no estudo de caracterização, desenvolvimento e controle de qualidade de produtos farmacêuticos (BUCKTON et al, 1991). As principais aplicações nessa área têm visado a caracterização de matérias-primas e produtos acabados (BROWN et al, 1999; THOMPSON, 2000) a determinação do grau de pureza (KSIQZCZAK et al, 2004) e a realização de ensaios de estabilidade e cinética de decomposição (IGLESIAS et al, 1998; MEDEIROS et al, 2001).

A determinação do ponto de fusão utilizando métodos calorimétricos vem sendo bastante empregada como método de avaliação do grau de pureza de fármacos e identificação de polimorfismos (KSIQZCZAK et al, 2004; WIDMANN, 1991). Através da DSC pode-se determinar a faixa de fusão de uma substância e, baseando-se na equação de Van’t Hoff (FORD, 1989) é possível determinar a fração molar de impurezas contidas neste material. Quando uma substância é submetida a aquecimento, o conjunto das impurezas é fundido formando no sistema uma fase líquida. Acima desta temperatura então, a fase sólida consiste somente em substância pura. A presença de impurezas, mesmo em pequena quantidade na amostra produz considerável aumento no intervalo de fusão, iniciando a fusão em uma temperatura mais baixa que a temperatura determinada para a substância pura (CONSTANTINO et al, 2004).

3.5 Espectroscopia de Infravermelho

A espectroscopia de infravermelho (IV) é uma técnica que utiliza a faixa do infravermelho do espectro magnético para identificar moléculas através dos

grupamentos funcionais. Os grupos funcionais apresentam uma energia de vibração (pode ser deformação axial ou deformação angular) que ao ser absorvida, gera uma banda no espectro permitindo a identificação dos grupamentos presentes nessa molécula (SILVERSTEIN et al, 2005).

Esta técnica como identifica moléculas, serve para analisar a pureza da amostra, identificar possíveis impurezas e verificar as possíveis interações fármaco-excipiente (SILVERSTEIN et al, 2005).

A análise por Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) em estudos de compatibilidade funciona como análise complementar ao DSC e TG. Pani e colaboradores (2012), afirmam que as técnicas de DSC e FTIR são rápidas.

3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos, em especial na área farmacêutica. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis. O método desenvolvido para análise deve possibilitar uma separação adequada do composto selecionado em um tempo razoável. Para tanto, alguns itens relacionados ao sistema CLAE como bomba, detector e injetores são relevantes para o bom desenvolvimento do método e favorecendo uma boa separação (COLLINS, 2002).

As bombas com programadores permitem o uso de eluição por gradiente, geralmente aplicada aos compostos com polaridades diferentes, como impurezas de síntese do fármaco e compostos relacionados. Na eluição por gradiente, quantidades crescentes do solvente mais forte são adicionadas a outro, aumentando a força do eluente para obtenção de uma separação satisfatória. O sistema de bombeamento não deve gerar no detector ruídos que possam encobrir sinais mais fracos (USP 32, 2009).

O injetor manual, de maneira geral, é composto de uma válvula de injeção que possui alça de amostragem de volume fixo. Alguns sistemas recentes possuem uma

seringa de injeção que mede o volume a ser usado na injeção. Esses sistemas permitem a injeção de volumes pequenos com boa reprodutibilidade, fato importante quando se faz necessária a injeção de soluções concentradas de fármaco, sob condições de degradação, para que os produtos de degradação sejam detectados. Os injetores produzidos nos últimos anos apresentam a opção de refrigeração do compartimento de amostras, que pode ser importante para soluções de compostos termolábeis, evitando degradação da amostra (USP 32, 2009).

O sistema de detecção deve garantir que propriedades do analito sejam detectadas como a absorção de luz na região do ultravioleta e visível. Os detectores de absorção no ultravioleta e o arranjo de diodos são os mais utilizados nas indústrias farmacêuticas, pelo fato de que a maioria dos fármacos apresentam absorção na região do ultravioleta (STAFIEJ, 2007).

Segundo Collins (2006), na CLAE as espécies que estão sendo avaliadas sofrem influência da fase estacionária (FE) e, ao mesmo tempo, as propriedades destas são continuamente influenciadas pela fase móvel (FM). A FM exerce duas funções principais, a primeira é arrastar os componentes da amostra através do sistema cromatográfico e a segunda é participar do processo de separação. As principais características físico-químicas requeridas das FM utilizadas em CLAE são: - alto grau de pureza e fácil purificação;

- solubilizar a amostra sem decompor os seus componentes; - não decompor ou dissolver a FE;

- ter baixa viscosidade;

- ser compatível com o tipo de detector utilizado;

- ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra.

Uma FM ideal deve também apresentar baixa toxicidade, e ter custo reduzido. De modo geral, em qualquer tipo de CLAE a FM é de extrema importância, pois participa do processo de separação. Parâmetros importantes, como seletividade da separação, tempo de retenção e solubilidade do composto de interesse na FM, apresentam consideráveis variações em função das mudanças de composição na FM. A força cromatográfica da FM mede a sua capacidade em interagir com os componentes da amostra. Essas interações são devido às diferenças forças como as

de van der Waals, as dipolo-dipolo, ligação de hidrogênio e iônicas. A retenção de um componente é controlada pela força do solvente (COLLINS, 2006).

3.7 Estabilidade

A estabilidade é definida como o tempo durante o qual a especialidade farmacêutica ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente, mantém dentro dos limites especificados e nas mesmas condições e características que possuía quando da época de sua fabricação. Pode também ser definida como o período de tempo compreendido entre o momento no qual o produto está sendo fabricado e sua potência está reduzida a não mais do que 10%, desde que os produtos de alteração estejam todos seguramente identificados e previamente reconhecidos seus efeitos (TABORIANSKI, 2003; VEHABOVIC et al., 2003; STULZER & SILVA, 2006).

A estabilidade dos produtos farmacêuticos depende de fatores ambientais como temperatura, umidade, luz e de outros fatores relacionados ao próprio produto como propriedades físicas e químicas, de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais de embalagens (BRASIL, 2005).

Com a finalidade de garantir a integridade química, física, microbiológica, terapêutica e toxicológica do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo, são preconizados estudos de estabilidade (MATTHEWS, 1999; LUCAS et al., 2004; ANSEL et al., 2007).

O estudo de estabilidade descrito pela RE nº1/2005 (BRASIL, 2005) possui como principal aplicabilidade a determinação do prazo de validade do produto farmacêutico. Porém, também determina a quantificação dos produtos de degradação e o método analítico correspondente, que resultou na publicação de um Informe Técnico nº 1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos nos casos em que a impureza ou o padrão do produto de degradação não estão disponíveis. Estes procedimentos envolvem a realização de testes de estresse sob condições variadas (BRASIL, 2008).

Os estudos na fase de pré-formulação incluem a estabilidade no estado sólido do fármaco isolado e a estabilidade na presença dos excipientes. Estas etapas são realizadas para reduzir ou prevenir a ocorrência de deterioração devido à hidrólise, oxidação, entre outros processos. Por sua vez, o estudo da estabilidade da formulação tem por finalidade avaliar o comportamento dos medicamentos em função do tempo e a influência de uma variedade de condições e fatores, sendo levado em consideração tanto o fármaco, quanto a mistura de excipientes ou veículos utilizados, assim como a interação entre ambos, face às condições as quais estão submetidos (BRASIL, 2005; MAMEDE et al., 2006).

É muito importante a análise de estabilidade das misturas binárias preparadas para o estudo de compatibilidade, pois algumas reações de incompatibilidade podem não ocorrer instantaneamente. Além disso, a exposição das misturas a um estresse térmico pode favorecer alterações no estado cristalino do fármaco ou pode favorecer a transformações de uma forma polimórfica em outra (COSTA, 2005). Estas alterações podem promover mudanças físico-químicas nas misturas e favorecer uma possível incompatibilidade entre o fármaco e excipiente e até uma inatividade do fármaco.

Para a realização desse estudo, as zonas climáticas constituem um dos importantes fatores a serem considerados. Devido à grande variabilidade climática, o mundo foi subdividido em zonas com diferentes especificações de temperatura e umidade, para possibilitar a comercialização dos produtos em outras zonas climáticas (CARVALHO et al., 2005; BOTT & OLIVEIRA, 2007).

Para o procedimento dos ensaios de estabilidade realizados no Brasil, de zona climática 4, tropical e úmida, as indústrias farmacêuticas seguem a RE nº 1/2005 da ANVISA que define três estudos:

Estudo de Estabilidade Acelerada: estudo projetado para acelerar a degradação química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em condições forçadas de armazenamento. O produto é submetido à temperatura de 40ºC (graus Célsius) e umidade relativa (UR) de 75% durante 3 e 6 meses. Os dados obtidos, juntamente com aqueles derivados dos estudos de longa duração, são usados para avaliar efeitos químicos e físicos prolongados em condições não aceleradas e para avaliar o impacto de curtas exposições a condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do produto, que podem ocorrer durante o transporte.

Estudo de Estabilidade de Longa Duração: estudo projetado para verificação das características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo de validade esperado. A temperatura utilizada é de 30ºC e 75% UR por 6, 12, 18, 24 e 36 meses. Os resultados são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e recomendar as condições de armazenamento.

Estudo de Estabilidade de Acompanhamento: estudo realizado para verificar se o produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas, biológicas, e microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de estabilidade de longa duração. O período de estudo é de 12, 24 e 36 meses.

Esses estudos são realizados em câmaras climáticas qualificadas de acordo com normas internacionais, que proporcionam o controle de temperatura e umidade em seu interior, projetados para serem utilizados continuamente (NUNES et al., 2007).

Para a avaliação dos estudos, as amostras são retiradas nos tempos determinados pelo guia. São determinadas as seguintes análises: doseamento, quantificação de produtos de degradação, dissolução e pH (quando aplicáveis) (BRASIL, 2005).

O uso de métodos indicadores de estabilidade, seletivos aos princípios ativos e seus produtos de degradação, são altamente recomendados pela ANVISA para acompanhamento de resultados provenientes de estudos de estabilidade de medicamentos (BRASIL, 2003; BRASIL, 2005). No entanto, poucas monografias existentes em farmacopeias incluem métodos para análise de produtos de degradação, e poucos fabricantes conhecem e desenvolvem metodologias validadas para detecção e quantificação desses produtos. Para o desenvolvimento e validação de métodos indicativos de estabilidade, preconiza-se a realização de testes de estresse, para obtenção de padrões, para fim de análise (BAKSHI & SINGH, 2002; BOUDREAU et al., 2004; CARVALHO et al., 2005).

A realização do teste de estresse, assim como o desenvolvimento do método analítico para a identificação e quantificação dos produtos de degradação é de extrema importância para as indústrias farmacêuticas, pois no momento do registro, pós-registro e renovação, o estudo de estresse, acompanhado de sua análise crítica deverá ser contemplada.

3.7.1 Estudo de Degradação Forçada

O teste de estresse é definido como um teste de estabilidade para fármacos e medicamentos sob condições extremas, mais ainda do que aquelas utilizadas para o estudo de estabilidade acelerada. (KLICK et al., 2005; SILVA et al., 2009; BRASIL, 2012). Este teste mostra-se como uma tendência dentro do planejamento para o desenvolvimento de uma forma farmacêutica, pois a investigação da estabilidade intrínseca do fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de adjuvantes, aditivos de proteção específicos e de acondicionamento, que provavelmente melhorarão a integridade do fármaco e do produto. Demonstrando-se assim, que o conhecimento do comportamento químico pode ser usado para garantir a estabilidade da forma farmacêutica desejada (REYNOLDS et al., 2002; AULTON, 2005).

Um dos principais objetivos a serem atingidos através desse teste é demonstrar a especificidade ao desenvolver um método indicativo de estabilidade, sobretudo quando poucas informações estão disponíveis sobre os possíveis produtos de degradação. Estes também fornecem informações sobre as rotas de degradação e dos produtos formados, que poderiam ser produzidos durante o período de armazenamento (REYNOLDS et al., 2002).

A identificação dos produtos de degradação está relacionado à segurança dos medicamentos, pois pode ocorrer a formação de produtos tóxicos e/ou a perda parcial ou total da atividade terapêutica do fármaco, são necessários o isolamento e a caracterização das propriedades física e química dos produtos de degradação, assegurando a segurança biológica a partir da determinação dos níveis de segurança aceitáveis e de seus limites de quantificação, com relação à posologia diária (MORIWAKI et al., 2001).

A natureza do teste de estresse utilizado para o fármaco depende de suas características intrínsecas e da forma farmacêutica a ser desenvolvida. Para o medicamento, o planejamento do estudo deve ser baseado nas propriedades do fármaco e dos excipientes utilizados na formulação, assim como nas condições de armazenamento. Neste caso, são utilizadas condições mais severas do que as

condições do estudo de estabilidade acelerado, como estratégia para a fase de desenvolvimento da forma farmacêutica (KLICK et al., 2005).

A Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 53, de 4 de dezembro de 2015, estabelece parâmetros para a notificação, identificação e qualificação de produtos de degradação em medicamentos com substâncias ativas sintéticas e semi-sintéticas, classificados como novos, genéricos e similares. Essa avaliação é fundamental para garantir a segurança do produto. Nesta norma são definidos parâmetros para estudar os compostos de degradação formados, de acordo com a quantidade presente no produto, relacionando com a máxima dose diária. O limite do produto de degradação está relacionado com sua toxicidade, sendo que compostos desconhecidos são permitidos em quantidades mínimas, enquanto que compostos conhecidos podem estar presentes em níveis intermediários e compostos com estudo de toxicidade realizado, comprovando sua baixa toxicidade, podem estar presentes até níveis maiores, considerados seguros.

As condições de degradação e os parâmetros do perfil de degradação são citados no guia 04 de 2015, que dispõe sobre os requisitos para obtenção do perfil de degradação, e identificação e qualificação de produtos de degradação. O perfil de degradação é a descrição detalhada dos resultados e das práticas analíticas utilizadas na detecção, identificação, elucidação estrutural e determinação quantitativa dos produtos de degradação presentes no insumo farmacêutico ativo e no medicamento e tem como ponto chave os estudos de degradação forçada.

Os requisitos para os testes de degradação forçada dependerão das necessidades do projeto e do estágio de desenvolvimento do fármaco ou do medicamento. Geralmente, são realizados no início do processo de desenvolvimento de medicamentos, onde o fármaco é submetido a uma série de condições, tais como hidrólise (ácido-base), fotólise, oxidação por peróxido e temperatura, a fim de avaliar os subprodutos resultantes e suas possíveis vias de degradação (SILVA et al., 2009; SINGH; REHMAN, 2012; HOTHA et al., 2013). Para isso, é necessário desenvolver um método analítico capaz de detectar a perda do fármaco e identificar os produtos de degradação (HOTHA et al., 2013).

Em resumo, os estudos de degradação forçada são realizados para alcançar os seguintes objetivos:

1. Estabelecer vias de degradação de fármacos e medicamentos (REYNOLDS et al., 2002; KATS, 2005; HOTHA et al., 2016; BLESSY et al., 2013).

2. Diferenciar os produtos de degradação que estão relacionados com o fármaco daqueles que são gerados a partir de excipientes e/ou adjuvantes numa formulação (REYNOLDS et al.,2002; KATS, 2005; BRUMMER, 2011; BLESSY et al., 2013). 3. Elucidar a estrutura dos produtos de degradação (REYNOLDS et al., 2002; BLESSY et al.,2013).

4. Determinar a estabilidade intrínseca de um fármaco na formulação (BLESSY et al., 2013).

5. Elucidar os mecanismos de degradação, tais como hidrólise, oxidação, termólise ou fotólise do fármaco e do medicamento (BLESSY et al., 2013; ICH Q1A(R2), 2003; REYNOLDS et al., 2002; SINGH; BAKSHI, 2002).

6. Desenvolver um método analítico adequado para indicar a estabilidade (CIONE et al, 2011).

7. Compreender as propriedades físico-químicas das moléculas do fármaco (BRUMMER, 2011).

8. Gerar formulações mais estáveis (BLESSY et al.,2013).

9. Produzir um perfil de degradação semelhante ao que seria observado em um estudo formal de estabilidade, sob as condições preconizadas pelos guias do ICH (ICH guidelines. 2014).

10. Resolver problemas relacionados à estabilidade (BRUMMER, 2011).

3.8 Desenvolvimento de Métodos

Ao desenvolver um método cromatográfico busca-se primeiramente obter uma separação completa entre os compostos analisados. O método analítico para determinação de teor deve sempre buscar a seletividade do analito entre os diversos componentes da formulação do medicamento. O desempenho cromatográfico é influenciado pelo equipamento, FM, FE, temperatura e tipo de eluição(NEUE, 2006). O desenvolvimento de métodos envolve a avaliação e otimização de condições, incluindo etapas de preparação da amostra, separação cromatográfica, detecção e quantificação. Outros fatores importantes que devem ser considerados no desenvolvimento são os problemas relacionados ao cromatograma como picos

assimétricos ou alargados, picos artefatos, picos negativos, variação do tempo de retenção e reações químicas durante a separação, podendo resultar em baixa resolução e até coeluições indesejadas, comprometendo o método proposto (NETO, 2009).

A partir das características e propriedades da amostra, as demais partes integrantes para a realização da análise são determinadas para a otimização das condições analíticas. Alguns questionamentos à respeito da amostra devem ser feitos. Por exemplo, para o desenvolvimento de métodos para análise de fármacos na indústria farmacêutica é necessário saber qual solvente ou mistura deles será utilizado para solubilizar a amostra; qual a estabilidade da amostra; quais os procedimentos que devem ser usados na extração do composto ativo; quais as membranas filtrantes que não retêm o ativo; qual a faixa de absorção do composto de interesse; qual o valor de pKa ou pKb do analito, solubilidade, volatilidade, polaridade e quais as propriedades do analito que permitem escolher o tipo de detector a ser usado. Ainda com relação à amostra, a seleção adequada de uma técnica de preparo de amostra é um fator chave na obtenção de resultados confiáveis e exatos (JARDIM, 2010).

3.9 Validação de Métodos

A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, mediante sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais reconhecida e exigida. Dados analíticos não-confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominado validação. A validação de um método é um processo contínuo que começa no planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferência. Para registro de novos produtos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a validação de metodologia analítica e, para isso, a maioria deles tem estabelecido documentos oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação. Um processo de validação bem-definido e documentado oferece às agências

reguladoras evidências objetivas de que os métodos e os sistemas são adequados para o uso desejado (WHO, 1992; CODEX, 1995)

A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda à exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (BRASIL, 2003).

A validação do método inicia com a criação do protocolo de validação, no qual é descrito o planejamento da estratégia analítica, etapas de análise e especificações. Na área farmacêutica, as validações são conduzidas conforme o que preconiza a Resolução da Anvisa RE nº 899, de 29/05/2003 e os guias ICH Q2A e Q2B (BRASIL, 2003; ICH, 1995).

Os testes são classificados em 4 categorias, de acordo com a sua finalidade: I - Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias–primas.

II - Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas.

III - Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo). IV – Testes de Identificação.

Para cada categoria será exigido um conjunto de ensaios, conforme a tabela 1 abaixo (BRASIL, 2003).

Tabela 1 – Ensaios necessários para a validação Parâmetro

Analítico Categoria I

CategoriaII

Quantitativo Ensaio Limite Categoria III Categoria IV

Especificidade

Seletividade Sim Sim Sim * Sim

Linearidade Sim Sim Não * Não

Faixa Sim Sim * * Não

Precisão

Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não

Precisão

Intermediária ** ** Não ** Não

Limite de

Detecção Não Não Sim * Não

Limite de

Quantificação Não Sim Não * Não

Exatidão Sim Sim * * Não

Robustez Sim Sim Sim Não Não

*Pode ser necessário dependendo da natureza do teste.

** Se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária comprovação da Precisão Intermediária.

3.9.1 Especificidade/Seletividade

A especificidade/seletividade de um método demonstra a capacidade de medir com exatidão o princípio ativo, em presença de outros componentes que possam estar presentes na matriz da amostra, como por exemplo: impurezas, produtos de degradação, excipientes, entre outros.

Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos de amostras (fármaco ou medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses materiais. Quando a impureza ou o padrão do produto de degradação não estiverem disponíveis, pode-se comparar os resultados do ensaio das amostras contendo impurezas ou produtos de degradação com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia

farmacopéica ou outro procedimento validado). Estas comparações devem incluir amostras armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor umidade, hidrólise ácida/básica, oxidação)

Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos. A utilização de ferramentas de pureza de pico (por exemplo, com auxilio de detector de arranjo defotodiodos ou espectrometria de massas) são interessantes para demonstrar que o pico cromatográfico é atribuído a um só componente(BRASIL, 2003).

3.9.2 Linearidade

A Linearidade de um método analítico demonstra a capacidade de obter resultados que são diretamente proporcionais às concentrações do analito dentro de uma dada faixa. Linearidade é usualmente expressa em termos da variância em torno da inclinação da reta da linha de regressão linear, calculada de acordo com uma relação matemática estabelecida (método dos mínimos quadrados) a partir de resultados obtidos na análise de amostras com diferentes concentrações do princípio ativo.

Se houver relação linear aparente após exame visual do gráfico, os resultados dos testes deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para determinação do coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Se não houver relação linear, realizar transformação matemática, como a logarítmica, quadrática, etc.

A linearidade pode ser determinada pela análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes. As concentrações devem seguir intervalos de acordo com o ensaio utilizado. Para a determinação de impurezas, deve-se partir do nível de impureza esperado até 120% do limite máximo especificado. Quando apresentarem importância toxicológica ou efeitos farmacológicos inesperados, os limites de quantificação e detecção devem ser adequados às quantidades de impurezas a serem controladas(BRASIL, 2003; ICH, 1995).

3.9.3 Exatidão

A exatidão de um método analítico, expressa o grau de concordância entre o valor médio obtido de uma série de resultados e o valor de referência aceito (valor exato convencional). Também chamado de grau de recuperação (recovery). Resultado exato é o resultado ideal sem erro sistemático (BRASIL, 2003; ICH, 1995). A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada.

A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, conforme a equação 1:

A exatidão pode ser avaliada para o fármaco, forma farmacêutica e impurezas seguindo os critérios a seguir (BRASIL, 2003):

3.9.3.1 Fármaco

- Aplicando-se a metodologia analítica proposta na análise de uma substância de pureza conhecida (padrão de referência);

- Comparação dos resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida.

3.9.3.2 Forma Farmacêutica

- Na análise de uma amostra, na qual quantidade conhecida de fármaco foi adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado);

- Nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento estão indisponíveis, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao medicamento.

3.9.3.3 Impurezas

- Análise pelo método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação ao medicamento ou ao fármaco;

- No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de degradação, aceita-se a comparação dos resultados obtidos com um segundo método bem caracterizado (metodologia farmacopéica ou outro procedimento analítico validado).

3.9.4 Precisão

A precisão de um método analítico expressa o grau de concordância (ou grau de dispersão) entre resultados obtidos, de uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra sob condições experimentais pré-estabelecidas. Este parâmetro depende somente da distribuição de erros aleatórios e não está relacionado com exatidão (BRASIL, 2003).

A precisão de um método analítico pode ser expressa como o desvio padrão (DP) ou desvio padrão relativo (DPR) de uma série de medidas, conforme equação 2:

Onde: DP = Desvio padrão;

CMD = Concentração média determinada.

De acordo com PAGANO et al (2004), a avaliação estatística da precisão (n=6) pode ser realizada calculando o coeficiente de variação ou desvio padrão relativo (DPR) em porcentagem, conforme equação 2, e a avaliação entre os grupos (n=12) pode ser realizado além do cálculo do DPR (%), é recomendado realizar a comparação das variâncias empregando o teste F e a comparação das médias obtidas através do teste t, descritos nas equações 4,5 e 6 respectivamente.

Onde: Cv = Coeficiente de Variação

S = Desvio Padrão amostral (n-1) = Média das amostras (n).

Onde: SB = maior desvio padrão amostral (n-1) Sw = menor desvio padrão amostral (n-1)

O valor de F obtido deve ser comparado ao tabelado sendo aceito se F calculado for menor ou igual ao F tabelado.