Condições Cromatográficas

Os experimentos em CLAE se iniciaram com base na Farmacopéia Americana, cuja fase móvel é constituída de uma mistura de tampão fosfato/metanol/tetraidrofurano na proporção de 600:520:130 v/v/v.

Devido à alta quantidade de tampão, foi desenvolvida nova fase móvel, constituída de acetonitrila/água na proporção 600:400 v/v.

Foram avaliadas as proporções entre os constituintes da fase móvel, volume de injeção, vazão da fase móvel e temperatura de análise da coluna.

As condições de análise testadas foram: - Volumes de injeção: 5µL à 50µL

- Temperaturas da coluna: 25ºC à 40ºC - Vazões da FM: 0,8 mL/min à 1,5mL/min - Modos de eluição: isocrático e gradiente - Comprimento de onda: 254nm

- Colunas analítica: C8 – 125 x 4,6mm - 5µm / C8 - 150 x 4,6mm - 5µm / C8 – 250 x 4,6mm - 5µm

A coluna foi previamente estabilizada com a fase móvel durante 30 minutos nas respectivas condições pré-estabelecidas.

CR B a fim de observar os seguintes parâmetros: N (número de pratos teóricos) ≥ 2000; T (assimetria) entre 0,8 - 1,2; R (resolução) ≥ 2 e o coeficiente de variação entre as injeções ≤ 2 %, a fim de constatar a adequabilidade do sistema.

4.2.5 Validação do Método

A próxima etapa iniciou-se com a validação da metodologia desenvolvida. O objetivo da validação consistiu em demonstrar que o método analítico desenvolvido é adequado para o seu propósito e garantir, por meio de estudos experimentais, que ele atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.

Para tanto, executou-se os parâmetros de linearidade, especificidade/ seletividade, precisão, exatidão, limite de quantificação e robustez adequados à análise.

Figura 2 - Fluxograma de validação de métodos analíticos

4.2.5.1 Elaboração do protocolo

O primeiro passo foi elaborar o protocolo de validação. O mesmo teve como objetivo descrever os procedimentos a serem utilizados para validar o método analítico, incluindo o cronograma, responsabilidades e os critérios de aceitação para a aprovação de um método analítico ou parte destes para uso na rotina.

No protocolo foram incluidas as seguintes informações: - Objetivos do estudo;

- Local/planta onde será conduzido o estudo; - Responsabilidades;

- Descrição dos procedimentos a serem seguidos;

- Equipamentos a serem usados, padrões e critérios para produtos e processos Programa de Validação Levantamento da documentação Método

Reagentes/Padrões Protocolo Análise Relatório Método Validado

relevantes;

- Processos e/ou parâmetros; - Critérios de aceitação.

4.2.5.2 Seletividade/Especificidade

A seletividade e especificidade do método foi estudada com diferentes registros analíticos obtidos de padrão, amostra e placebo. Essas soluções foram preparados de modo que a solução final tivesse a concentração de 0,1µg/mL

Injetou-se separadamente cada solução para determinar se havia interferência de componentes que poderiam estar presentes na matriz da amostra e demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses materiais.

4.2.5.2.1

Degradação Forçada

A especificidade do método foi verificada também a partir da avaliação dos possíveis produtos de degradação que poderiam interferir na determinação de CLZ.

Preparou-se uma solução padrão, solução amostra contendo respectivamente 0,1mg/mL de CLZ, 0,1µg/mL de CR A e CR B. Além disso, preparou-se uma solução placebo e diluente.

A solução da amostra simulada dos excipientes foi preparada da mesma maneira que a solução obtida com a formulação do CLZ, pesando-se, entretanto, quantidade da mistura dos excipientes equivalente à massa dos comprimidos que conteria 2mg de CLZ.

As injeções foram realizadas após exposição da amostra, padrão, placebo e diluente nas seguintes condições:

 Após exposição à luz UV por 24 e 48 horas;

 Após a exposição à temperatura de 60 ºC por 24 e 48 horas sob pressão em banho-maria;

 Após hidrólise ácida com HCl 0,1N por 24 e 48 horas;

 Após hidrólise básica com NaOH 0,1N por 24 e 48 horas;

4.2.5.3 Linearidade

Executou-se a linearidade do método analítico para o Clonazepam, CR A e CR B, a fim de demonstrar a capacidade de obter resultados que são diretamente proporcionais às concentrações do analito dentro de uma dada faixa.

- Soluções estoque

Foram preparadas soluções mais concentradas de Clonazepam, CR A e CR B (1,0mg/mL, 0,1mg/mL e 0,1mg/mL respectivamente). Pesou-se 10,00mg do padrão de cada ativo, adicionou-se um pouco de diluente e colocou-se as soluções em ultrassom até total solubilização. Após, completou-se o volume com o diluente.

- Soluções intermediárias

Foram preparadas por diluições sucessivas partindo da solução estoque preparada previamente.

As concentrações das soluções intermediárias usadas estão descritas conforme tabela 5. Essas soluções foram empregadas para preparo da curva analítica (curva de calibração). Cada nível de concentração foi injetado em triplicata no cromatógrafo.

Tabela 5 – Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de

Linearidade Concentração Volume da solução estoque de Clonazepam (mL) Volume da solução estoque de Composto Relacionado A (mL) Volume da solução estoque de Composto Relacionado B (mL) Balão (mL) Concentração Teórica (mg/mL) Clonazepam Composto Relacionado A Composto Relacionado B 120% 6 0,06 0,06 50 0,12 0,00012 0,00012 110% 5,5 0,055 0,055 50 0,11 0,00011 0,00011 100% 5 0,05 0,05 50 0,10 0,00010 0,00010 90% 4,5 0,045 0,045 50 0,09 0,00009 0,00009 80% 4 0,04 0,04 50 0,08 0,00008 0,00008 40% 2 0,02 0,02 50 0,04 0,00004 0,00004 20% 1 0,01 0,01 50 0,02 0,00002 0,00002

O estudo de regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados, foi empregado para determinação da equação da reta.

4.2.5.4 Exatidão

A exatidão foi determinada através do teste de recuperação, sendo expressa como percentual de recuperação, analisando-se nove soluções contendo CLZ, CR A, CR B (baixa, média, alta).

- Soluções estoque

Foram preparadas três soluções mais concentradas de cada composto, Clonazepam, CR A e CR B (1,0mg/mL, 0,1mg/mL e 0,1mg/mL respectivamente). Pesou-se 10,00mg do padrão de cada ativo, adicionou-se um pouco de diluente ao balão de 10mL e levou as soluções em ultrassom até total solubilização. Após, completou-se o volume com o diluente.

- Soluções intermediárias

Foram preparadas por diluições sucessivas partindo das soluções estoque preparadas previamente conforme tabela abaixo. Cada solução foi injetada em triplicata.

Tabela 6 - Níveis de concentrações das soluções usadas no ensaio de Exatidão

Concentração Volume da solução estoque de Clonazepam (mL) Volume da solução estoque de Composto Relacionado A (mL) Volume da solução estoque de Composto Relacionado B (mL) Balão (mL) Concentração Teórica (mg/mL) Clonazepam Composto Relacionado A Composto Relacionado B 120% 6 0,06 0,06 50 0,12 0,00012 0,00012 100% 5 0,05 0,05 50 0,10 0,00010 0,00010 20% 1 0,01 0,01 50 0,02 0,00002 0,00002

4.2.5.5 Precisão

A precisão foi realizada a partir de seis determinações de Clonazepam em um mesmo dia e sob as mesmas condições, em uma concentração igual à concentração de 100% das impurezas.

- Solução padrão Clonazepam

Pesou-se 10,00mg de padrão de Clonazepam e transferiu-se para um balão de 100,0mL. Adicionou-se aproximadamente 5,0mL de diluente e levou-se ao

ultrassom até a completa dissolução. Completou-se o volume com diluente (Cf = 0,1mg/mL).

- Solução amostra estoque Clonazepam

Pesou-se 85,00 mg de amostra de Clonazepam e transferiu-se para um balão de 10,0mL. Adicionou aproximadamente 5,0mL de diluente e levou-se ao ultrassom até a completa dissolução. Completou-se o volume com diluente. (Cf = 0,1mg/mL) - Solução amostra 100%

As soluções foram injetadas uma vez cada preparação, com exceção do padrão que injetou-se 6 vezes. As áreas dos picos foram determinadas e então calculou-se o desvio padrão relativo (DPR) entre as áreas obtidas. A precisão intermediária foi preparada da mesma forma, porém por outro analista e em dias diferentes.

4.2.5.6 Limite de Quantificação

O LQ foi determinado a partir de diluições sucessivas de uma solução padrão de CLZ de concentração 0,1mg/mL até a obtenção do menor nível determinável, através do desvio padrão relativo das injeções. Injetou-se 6 vezes a Solução 20% da Linearidade.

4.2.5.7 Robustez

Para avaliação da robustez do método, as soluções padrão e amostra foram preparadas na concentração de 0,1mg/mL e submetidas a pequenas variações, como:

- Variação da coluna (outro lote, fabricante, coluna similar) - Vazão da fase móvel - Variação de ± 0,1mL/min;

- Temperatura da forno da coluna - Variação de ± 2°C - Composição da fase móvel - Variação de ± 2%

- Estabilidade das soluções – As soluções foram avaliadas por 5 dias, armazenadas a temperatura ambiente.

Foram injetadas as soluções nas condições normais e respectivas alterações realizadas.

4.2.5.8 Estudo de estabilidade

Realizou-se o preparo da amostra simulada de excipientes, conforme descrito na tabela 4. As amostras foram armazenadas em câmaras climáticas, sob as seguintes condições de temperatura e umidade: 40ºC ± 2ºC / 75% ± 5% UR e 30ºC ± 2º C/75% ± 5% UR por 30, 60 e 90 dias.

Avaliou-se as soluções preparadas conforme descrito no item 2.2.5.4. As soluções foram injetadas no cromatógrafo para a observação da possível redução ou aumento no teor do fármaco e/ou formação de produtos de degradação.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Infravermelho

Os espectros do Clonazepam no infravermelho foram apresentados na Figura 3. Os picos observados estão de acordo com a estrutura química do Clonazepam, com a identificação dos principais grupos funcionais na Tabela 7 (SILVERTEIN, 2005).

Tabela 7 – Absorção dos principais grupos funcionais para o Clonazepam Faixa de absorção cm-1 Grupo Funcional Patente Observadas 1700 1693 Deformação C = O, amida 1614 1614 Deformação C=N 1550 1538 Deformação C=C, aromático 1500 1490 Deformação C=C, aromático 1450 1445 Deformação C=C, aromático 1338 1333 Deformação N-O2

750 752 Deformação anel aromático

Figura 3 – Espectro de Infravermelho do Clonazepam

Na figura 4 é apresentado o espectro do amido, onde são observadas as bandas em 3294 cm-1 deformação da ligação O-H; 2924 cm-1estiramento da ligação C-H; 1151 cm-1estiramento da ligação C-O-C, 1080 cm-1, deformação angular de C- OH. Os dados obtidos estão de acordo com o esperado para identificação do amido,

conforme grupos funcionais encontrados (LILTORPA, 2011)

Figura 4 – Espectro de Infravermelho do Amido

No espectro obtido da mistura binária entre a Clonazepam e amido, figura 5, são observadas as principais bandas de identificação da Clonazepam,1693cm-1, 1614cm-1, 1538cm-1, 1490cm-1, 1445 cm-1,1335cm-1 e 752cm-1. As bandas do amido estão sobrepostas às bandas do clonazepam, mas é possível observar um alargamento das bandas próximas à 3200 cm-1da deformação da ligação O-H. Os dados obtidos por FTIR para mistura Clonazepam com amido não são indicativos de incompatibilidade.

Na figura 6 é apresentado o espectro do estearato de magnésio, onde são observadas as bandas em 2916 e 2851 cm-1 deformação axial da ligação O-H e C-H, 1573 cm-1 deformação axial assimétrica do íon carboxilato; 1460 cm-1 deformação angular da ligação C-H;1111 cm-1 deformação axial da ligação C-O de éster, 724 cm- 1

deformação angular assimétrica de CH2.

Figura 6 – Espectro de Infravermelho do Estearato de magnésio

No espectro obtido da mistura binária entre a Clonazepam e estearato de magnésio, figura 7, são observadas as principais bandas de identificação da Clonazepam, 1693 cm-1, 1614 cm-1, 1542 cm-1, 1491 cm-1, 1434 cm-1, 1337 cm-1 e 724 cm-1. Também são observadas as bandas do estearato de magnésio em 2918 cm-1 e 2851 cm-1,1573 cm-1, 1462 cm-1, C-H; 1102 cm-1, indicando que não há incompatibilidade entre esses insumos estudados conforme (CHADHA, 2014).

Figura 7 – Espectro de Infravermelho da mistura de CLZ e Estearato de magnésio

Na figura 8 é apresentado o espectro da celulose microcristalina, onde são observadas as bandas em 3332 cm-1 deformação axial da ligação O-H; 2896 cm-1, deformação axial da ligação C-H; 1428 cm-1 deformação angular da ligação O-H de álcoois, 1162 cm-1 deformação axial da ligação C- O de álcoois primários, 899 cm-1 deformação angular de C-H.

Figura 8 – Espectro de Infravermelho da Celulose microcristalina

No espectro obtido da mistura binária entre a Clonazepam e celulose microcristalina, figura 9, são observados as principais bandas de identificação da Clonazepam, 1693 cm-1, 1614 cm-1, 1538 cm-1, 1490 cm-1, 1434 cm-1e 1335 cm-1. As bandas que identificam a celulose estão em regiões de sobreposição com as bandas do clonazepam, não sendo possível avalia-las individualmente. Os dados obtidos por FTIR para mistura Clonazepam de sódio com a celulose não são indicativos de incompatibilidade.

Figura 9 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e Celulose microcristalina

O espectro de FTIR obtido da amostra lactose monohidratada, Figura 10, apresenta banda fraca em 1657 cm-1 e 1169 cm-1, que correspondem respectivamente, à deformação angular dos grupos OH da água, e ao estiramento assimétrico da ligação C-O-C.Além disso, apresentou bandas características entre 3522 cm-1 e 3250 cm-1, correspondentes ao estiramento axial do grupo hidroxila, sendo que em 3522 cm-1 é visível uma acentuada banda característica da forma monohidratada (FIGUEIREDO, 2012; RAUT, et al., 2011). É possível observar também a banda de deformação axial simétrica de C-O-C em 1020 cm-1.

No espectro da mistura de CLZ com a lactose monohidratada, Figura 11, são observadas as bandas de identificação do Clonazepam em 1693 cm-1, 1614 cm-1, 1538 cm-1, 1490 cm-1, 1434 cm-1 e 1335 cm-1. As bandas que identificam a lactose estão em regiões de sobreposição com as bandas do CLZ, não sendo possível avaliá-las individualmente. Os dados obtidos por FTIR para mistura CLZ com a lactose não são indicativos de incompatibilidade.

Figura 11 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e

Lactose monohidratada

Na figura 12 é apresentado o espectro de IV da mistura de excipientes é possível observar algumas bandas de excipientes, 3332 cm-1 banda da lactose, 2918 cm-1, 2851cm-1e 1579 cm-1 proveniente do estearato de magnésio, 1020 cm-1 banda da celulose. Para os demais excipientes ocorre a sobreposição de bandas não sendo possível identificá-los com precisão.

No espectro da mistura entre Clonazepam e todos os excipientes, figura 13, são observadas algumas das principais bandas de identificação da Clonazepam 1691 cm-1, 1616 cm-1, 1542 cm-1, 1491 cm-1, 1434 cm-1 e 1337 cm-1. É possível também observar algumas bandas de excipientes, 2918 cm-1, 2851 cm-1 proveniente do estearato de magnésio.

Figura 13 – Espectro de Infravermelho da mistura de Clonazepam e excipientes

As principais bandas de Clonazepam e bandas provenientes dos excipientes são visualizadas com mínimos deslocamentos em comparação com os espectros individuais. Os dados obtidos por espectroscopia de Infravermelho mostram que os excipientes apresentam compatibilidade com Clonazepam nas condições testadas, já que a similaridade das bandas estavam de acordo com a literatura e não houve formação de outras bandas no espectro.