Eletroporação de células biológicas isoladas através de eletrodo capilar: estudos numéricos dos efeitos elétricos e mecânicos na membrana celular

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Jˆanio Anselmo

ELETROPORA ¸C ÃO DE C ÉLULAS BIOL ÓGICAS ISOLADAS ATRAV ÉS DE ELETRODO CAPILAR: ESTUDOS NUM ÉRICOS DOS EFEITOS EL ÉTRICOS E

MEC ˆANICOS NA MEMBRANA CELULAR

Florian´opolis, SC 2014

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ELETROPORA ¸C ÃO DE C ÉLULAS BIOL ÓGICAS ISOLADAS ATRAV ÉS DE ELETRODO CAPILAR: ESTUDOS NUM ÉRICOS DOS EFEITOS EL ÉTRICOS E

MEC ˆANICOS NA MEMBRANA CELULAR

Disserta¸cão submetida ao Programa de Pós-Gradua¸cão em Engenharia El´ e-trica para a obten¸cão do Grau de Mes-tre em Engenharia Elétrica.

Orientadora: Profa._{. Daniela Ota} Hi-sayasu Suzuki, Dra._.

Coorientador: Prof. Jefferson Luiz Brum Marques, PhD.

Florian´opolis, SC 2014

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Anselmo, Jânio

Eletroporação de células biológicas isoladas através de eletrodo capilar : Estudos numéricos dos efeitos elétricos e mecânicos na membrana celular / Jânio Anselmo ;

orientadora, Daniela Ota Hisayasu Suzuki ; coorientador, Jefferson Luiz Brum Marques. - Florianópolis, SC, 2014. 141 p.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica.

Inclui referências

1. Engenharia Elétrica. 2. Modelos matemáticos. 3. Eletroporação. 4. Membrana celular. 5. Deformação mecânica. I. Suzuki, Daniela Ota Hisayasu. II. Marques, Jefferson Luiz Brum. III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica. IV. Título.

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ELETROPORA ¸C ÃO DE C ÉLULAS BIOL ÓGICAS ISOLADAS ATRAV ÉS DE ELETRODO

CAPILAR: ESTUDOS NUM ÉRICOS DOS EFEITOS EL ÉTRICOS E MEC ÂNICOS NA MEMBRANA

CELULAR

Esta Disserta¸cão foi julgada aprovada para a obten¸cão do T´ıtulo de “Mestre em Engenharia Elétrica”, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Gradua¸cão em Engenharia Elétrica.

Florian´opolis, SC, 22 de dezembro 2014.

Prof. Carlos Galup-Montoro, Dr. Coordenador do Curso

Prof. Jefferson Luiz Brum Marques, PhD. Coorientador

Banca Examinadora:

Prof. Fernando Mendes de Azevedo, D.Sc. Universidade Federal de Santa Catarina

Profa._{. Daniela Ota Hisayasu Suzuki, Dr}a._.

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Prof. Jos´e Marino Neto, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Walter Pereira Carpes Junior, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Pedro Xavier de Oliveira, Dr. Universidade Estadual de Campinas

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ficos a confian¸ca de descoberta de novas ferramentas para aux´ılio de diagn´osticos, tratamento, ou at´e mesmo a cura das di-versas patologias existentes.

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Esse é o momento em que retribuo o carinho e a paciência das pessoas que fizeram parte desse esfor¸co. A vocês meu profundo obri-gado. Carregarei vocês sempre comigo, nunca deixarão de existir em mim. Se um dia estivermos longe, mesmo pela geografia, é através do pensamento que seus ensinamentos e bons momentos se farão presentes, fazendo-me sentir saudades! Agrade¸co a vocês todo esse sucesso.

Ao Nosso Senhor Jesus Cristo, pelas bên¸cãos recebidas durante essa etapa de vida, por ter-me guiado e acolhido nos momentos dif´ıceis. A Ele, toda honra e toda glória.

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A minha esposa, companheira e amiga Marihelly, minha “pan-dinha”, sempre paciente nos meus momentos de stress, retribuindo-os com amor! Agrade¸co a Deus por vocˆe ter entrado em minha vida.

Ao meu filho, meu amor, meu “galakinho”, Gabriel Lula An-selmo. Suas risadas me renovam e fazem tão bem, sabia? Hoje eu entendo que quando nasce um filho, nasce um pai. Você é o presente de Deus em nossas vidas.

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A Maria Ot´ılia Cabral Anselmo, minha mãe, meu exemplo de mulher, que, mesmo sem ter grandes conhecimentos da área técnica, vive sempre perguntando sobre o andamento da disserta¸cão e, com suas palavras de carinho, tentando me guiar.

Ao Thiago Anselmo, meu amado irm˜ao, meu bra¸co forte, pela sua compreens˜ao. Quando tive que me afastar dos compromissos pro-fissionais, ele assumiu todas as responsabilidades, podendo eu assim me dedicar ao cumprimento de mais essa etapa.

A Higor Rachadel e Jorge Alexandrino Cardoso Costa, meus ami-gos, conselheiros, que muitas vezes agem como se fossem pais. S˜ao dois gigantes no conhecimento t´ecnico e na verdadeira arte da amizade.

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A minha orientadora e professora Daniela Ota Hisayasu Suzuki, pela inicia¸cão acadêmica, pelas inúmeras reuniões que sempre se tor-naram uma aula à parte, pela paciência em retirar minhas dúvidas e entender meus momentos de dificuldades. Você fez jus à palavra orien-ta¸cão! Foi um orgulho seguir seus passos.

Ao meu coorientador e professor Jefferson Luiz Brum Marques. A fus˜ao do seu conhecimento, calma e humildade o fazem essa pessoa

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disponibilizaram culturas celulares para realiza¸cão dos experimentos. Ao professor Vander Baptista, por permitir o uso de seu labora-tório e do estirador de capilares, e também pelas idéias pertinentes.

Ao professor Stephen G. Weber, da Universidade de Pittsburgh, pelo fornecimento de dados para composi¸c˜ao de artigo cient´ıfico.

Ao professor Mohamad Sawan, da Universidade de Montreal, por ministrar a disciplina de Smart Medical Devices e pela corre¸c˜ao de artigo cient´ıfico.

Aos meus colegas do mestrado do IEB-UFSC, Cristiano Rodrigo Azevedo, Gilson Turchiello, Jhazmin Aracelly Arandia Vega, Levi Ce-lestino Pereira e Tâmara Costa do Nascimento, pelas nossas disciplinas realizadas, pelas convivências diárias, almo¸cos, festas e até mesmo pe-los “momentos de atrito”. Tudo isso nos fez unidos e fortes suficientes para estarmos hoje cumprindo mais essa etapa de nossas vidas.

Ao meu amigo de mestrado Wilmer Johan Lobato Malaver, pelas nossas conversas durante almo¸cos, cafés e intervalos de estudos. Por toda a sua ajuda durante as disciplinas, você foi certamente uma pessoa fundamental neste trabalho. A você “mi pata”, todo meu respeito.

Ao mestre e pesquisador Rafael Attili Chiea, pelos seus ensina-mentos, pelo repasse de experimentos e pelo bom conv´ıvio gerado. Sua inteligência e calma somados fazem de você essa pessoa admirável.

Ao mestre, pesquisador e multidisciplinar Fernando Bruinjé Co-sentino. Nossos encontros regados a café para discussões técnicas foram de suma importância na conclusão deste trabalho. Seu conhecimento e simplicidade ultrapassam barreiras.

Aos doutorandos Carlos Frederico Fronza e William Alberto Cruz Casta˜neda, pela grande amizade formada e publica¸c˜oes realizadas em parceria.

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As colegas de mestrado intercambistas portuguesas Ana Teresa Silva Neves e Filipa Borlido Ferreira.

Ao amigos engenheiros telemáticos da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL). Sem sombra de dúvida, vocês sempre serão lembrados a cada avan¸co pessoal e profissional. Se estou concluindo mais essa etapa, certamente vocês são responsáveis por ela.

Ao técnico responsável pelo laboratório de instrumenta¸cão bio-médica, Yasser Mohsen. Suas dicas e informa¸cões do dia a dia influen-ciaram o resultado final desta disserta¸cão.

Aos alunos de gradua¸cão em engenharia elétrica Guilherme Bra-sil Pintarelli e Alexandre Lúcio Gontijo da Silva. Embora com pouco

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A querida e simpática Idezia Mendes e a todas suas colegas de trabalho, pelas novas conversas nos andares do IEB-UFSC e pela or-ganiza¸cão impecável presente em todos os pavimentos do prédio. Que Deus as aben¸coe onde estiverem.

A Wilson Silva Costa e a Marcelo Manuel Siqueira, da Secretaria do Programa de Pós-Gradua¸cão em Engenharia Elétrica, pelo excep-cional trabalho e carisma dedicados a todos os pós-graduandos. Sua prontidão em nos ajudar sempre será lembrada.

Ao amigo Tiago Westphal Souza, pela seu incessante e impecável trabalho gráfico nas figuras presentes neste trabalho. Parabéns! Você realmente tem o dom da arte gráfica.

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A secretária acadêmica do IEB-UFSC, Amanda Assun¸cão, pelo seu cuidado e responsabilidade com todos nós e com o Instituto.

Aos alunos e professores do programa de pós-gradua¸cão em en-genharia elétrica do Laboratório de Circuitos Integrados (LCI), pela gentileza em conceder seus equipamentos (para uso in loco) na realiza-¸

c˜ao de nossos experimentos.

Aos alunos do programa de pós-gradua¸cão em engenharia mecˆ a-nica do Laboratório de Vibra¸cões e Acústica (LVA), pelas contribui¸cões e trocas de informa¸cões pertinentes ao software de simula¸cão COMSOL Multiphysicsr_.

Ao Instituto de Engenharia Biom´edica-UFSC, pelo conhecimento, pela estrutura e as pelas amizades concretizadas.

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A CAPES, pelo apoio financeiro.

A todas as pessoas que entenderam minha ausˆencia para dedica-¸

c˜ao a este compromisso, agrade¸co a compreens˜ao. Espero, num futuro muito breve, retribuir-lhes com minha frequente presen¸ca.

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Eletropora¸cão é o aumento da permeabilidade e condutividade elétrica da membrana plasmática, causada pela aplica¸cão de um campo elétrico externo. Como resultado, tem-se o aparecimento temporário de poros em escala nanométrica em sua membrana, permitindo o transporte de moléculas, genes e até mesmo fármacos para o interior da célula. Tal fenômeno ainda é pass´ıvel de estudos para entendimentos da dinâmica de abertura e crescimento destes poros. Os experimentos com membra-nas planares elucidam os mecanismos envolvidos na eletropora¸cão, mas mascaram a situa¸cão real do comportamento da membrana. Neste con-texto, realizaram-se estudos diretamente em uma célula isolada, com o aux´ılio de eletrodos microcapilares estirados, repletos com eletrólito (EFC). Esta metodologia reduz as influências externas, no entanto, mantém a integridade fisiológica da membrana celular. Neste trabalho, realizaram-se três estudos numéricos para avaliar a influência de parˆ a-metros elétricos e mecânicos envolvidos neste arranjo da eletropora¸cão. No primeiro estudo, com a pipeta distante da célula, observou-se que o raio da célula, a condutividade elétrica do meio e a distância dos pulsos aplicados afetaram a eficiência da eletropora¸cão. A não linearidade da distribui¸cão do potencial elétrico transmembrana, induzido pelo campo elétrico externo, provoca poros concentrados em pequenas regiões. No módulo seguinte, confirmou-se a eleva¸cão de reatância capacitiva nos microcapilares estirados com a varia¸cão da frequência, comparando-se estes resultados com resultados experimentais. O algoritmo desenvol-vido para compensa¸cão desta reatância mostrou-se eficiente em apli-ca¸cão de pulsos de nanossegundos (ns). No terceiro e último módulo, com a pipeta tocando a membrana celular, são fatores relevantes: a deforma¸cão mecânica, a distribui¸cão das tensões de von Mises e o ten-sor de Maxwell. O potencial elétrico transmembrana apresentou uma eleva¸cão significativa na presen¸ca destes fatores. Os estudos da ele-trodeforma¸cão e dos modelos matemáticos mecânicos trazem um novo panorama na eletropora¸cão em arranjos utilizando células isoladas com EFC tocando a membrana.

Palavras-chave: Eletropora¸cão. Eletropermeabiliza¸cão. SCEP. De-forma¸cão mecânica. Membrana celular. Modelos matemáticos. COM-SOL Multiphysicsr. Engenharia biomédica.

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Electroporation is the increase in the electrical conductivity and per-meability of the plasma membrane caused by application of an external electric field. As a result, there is the temporary appearance of nanos-cale pores in its membrane, allowing the transport of molecules, genes and even drugs into the cell. This phenomenon still requires studies to understand the dynamics of opening and growth of these pores. The ex-periments with planar membrane elucidate the mechanisms involved in electroporation, masking the real situation of the behavior of the mem-brane. In this context, studies were made directly on a single-cell, with the aid of electrolyte-filled capillary (EFC). This methodology reduces external influences, however maintains the integrity of the physiologi-cal cell membrane. In this work, there were three numeriphysiologi-cal studies to evaluate the influence of electrical and mechanical parameters in-volved in this arrangement of electroporation. In the first study, with the pipette distant from the cell, it was observed that the radius of the cell, the electrical conductivity and the distance of the applied pulses affect the efficiency of electroporation. The non-linearity of the distri-bution of the transmembrane electric potential induced by an external electric field causes pores concentration in small regions. In the next module, confirmed the lifting capacitive reactance in electrolyte-filled capillary with the frequency variation, by comparing these results with experimental results. The algorithm developed for this reactance com-pensation was efficient in the application of nanosecond pulses (ns). In the third and last module, with the pipette touching the cell membrane, are relevant factors: a mechanical deformation, the distribution of von Mises stress tensor and Maxwell. The electric potential transmembrane showed a significant increase in the presence of these factors. Studies of eletrodeformation and mechanical mathematical models bring a new scenario for electroporation in arrangements using isolated cells with EFC touching the membrane.

Keywords: Electroporation. Electropermeabilization. SCEP. Mecha-nical deformation. Cell membrane. Mathematical models. COMSOL Multiphysicsr. Biomedical engineering.

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Figura 1 Membrana plasm´atica celular . . . 37

Figura 2 Fosfolip´ıdio . . . 38

Figura 3 Dinˆamica fosfolip´ıdica . . . 39

Figura 4 Poros hidrof´obicos e hidrof´ılicos . . . 42

Figura 5 Energia associada a um poro . . . 44

Figura 6 Eletropora¸cão em suspensões de células . . . 45

Figura 7 Eletropora¸c˜ao com EFC distante da membrana . . . 47

Figura 8 Eletropora¸c˜ao com EFC tocando a membrana . . . 48

Figura 9 Célula única isolada presente no campo elétrico uniforme 53 Figura 10 Modelo representativo 3D - EFC + célula . . . 55

Figura 11 Modelo geométrico representativo 2D-axissimétrico - EFC + Célula . . . 56

Figura 12 Gr´afico da compara¸c˜ao entre resultados de Zudans et al. (2007) e resultados simulados . . . 59

Figura 13 Gráfico da tensão transmembrana e condutividade da membrana celular em rela¸cão ao ângulo (θ) para potencial elétrico de 500 V . . . 61

Figura 14 Gráfico da tensão transmembrana e condutividade da membrana celular em rela¸cão ao ângulo (θ) para potencial elétrico de 4 kV . . . 62

Figura 15 Gráfico varia¸cão temporal da tensão transmembrana para potenciais elétricos de 500 V a 4 kV . . . 63

Figura 16 Gráfico da varia¸cão da condutividade da membrana em rela¸cão ao raio celular . . . 64

Figura 17 Gráfico da distribui¸cão do campo elétrico para potenciais de 500 V a 4 kV . . . 65

Figura 18 Gráfico da varia¸cão da condutividade da membrana em rela¸cão aos meios intra e extracelulares . . . 66

Figura 19 Estrutura celular - esquema de uma c´elula eucari´otica . 70 Figura 20 Circuito equivalente da ponta do microeletrodo e mem-brana celular . . . 72

Figura 21 Modelo representativo em 3D - EFC . . . 73

Figura 22 Modelo representativo em 2D-axissim´etrico - EFC . . . 74 Figura 23 Arranjo experimental - impedˆancia dos microeletrodos

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-sultados simulados - impedância EFC´s . . . 77 Figura 25 Gráfico da varia¸cão da impedância do capilar estirado com o aumento da frequência . . . 78 Figura 26 Gráfico da varia¸cão da impedância do capilar estirado com a varia¸cão do diâmetro da ponta do eletrodo . . . 79 Figura 27 Gráfico de Vmpara os pulsos retangulares unipolares de

1, 0 ms a 100, 0 ns de dura¸cão . . . 81 Figura 28 Gráfico do pulso de compensa¸cão, Vinc(t) e o potencial

transmembrana pós-compensa¸cão, ambos com dura¸cão de 10, 0 µs . 84 Figura 29 Gráfico do pulso de compensa¸cão, Vinc(t) e o potencial

transmembrana pós-compensa¸cão, ambos com dura¸cão de 100, 0 ns 85 Figura 30 Exemplo de tensão mecânica em um corpo de prova . . . 88 Figura 31 Exemplo de deforma¸cão normal . . . 90 Figura 32 Exemplo de deforma¸cão por cisalhamento . . . 91 Figura 33 Exemplo de for¸ca de tra¸cão e compressão em um corpo de prova . . . 93 Figura 34 Diagrama de tensão-deforma¸cão de um material n˜ ao-ferroso . . . 94 Figura 35 Teoria da máxima energia de distor¸cão (von Mises) . . . . 95 Figura 36 Modelo representativo em 2D-axissimétrico do desloca-mento do microeletrodo . . . 97 Figura 37 Arranjo para medi¸cão da posi¸cão do eletrodo . . . 99 Figura 38 Gráfico da compara¸cão entre os dados experimentais e os dados simulados da impedância da fenda . . . 100 Figura 39 Gráfico da distribui¸cão de tensões mecânicas de von Mi-ses para o toque do EFC e deforma¸cão na membrana . . . 103 Figura 40 Gráfico da tensão transmembrana e condutividade da membrana celular em rela¸cão ao ângulo (θ), ambos para toque do EFC e deforma¸cão na membrana . . . 104 Figura 41 Gráfico da densidade de energia de deforma¸cão elástica 105 Figura 42 Gráfico da distância entre EFC e membrana celular . . . . 106 Figura 43 Gráfico da pressão exercida pelo EFC na membrana . . . 107 Figura 44 Gráfico da distribui¸cão do campo elétrico e densidade de corrente elétrica, durante deforma¸cão mecânica da membrana celular . . . 108

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na compensa¸cão da reatância capacitiva . . . 119 Figura 47 Fluxograma do posicionamento do eletrodo e aplica¸cão do est´ımulo da eletropora¸cão . . . 123 Figura 48 Fluxograma da compensa¸cão da impedância . . . 127 Figura 49 Especifica¸cão técnica do micromanipulador Narishige mo-delo WR-6 . . . 131

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Tabela 1 Organiza¸cão estrutural do trabalho . . . 36 Tabela 2 Parâmetros do modelo para simula¸cão de célula única isolada na presen¸ca de um campo elétrico uniforme. . . 54 Tabela 3 Parâmetros utilizados para análise da queda de potencial elétrico no capilar estirado. . . 56 Tabela 4 Parâmetros do modelo para simula¸cão da impedância dos EFC´s. . . 75 Tabela 5 Parâmetros do modelo para simula¸cão da deforma¸cão mecânica . . . 97

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IARC International Agency for Research on Cancer . . . 33 OMS Organiza¸cão Mundial da Saúde . . . 33 RMD Resistência a múltiplas drogas . . . 33 EFC Electolyte filled capillary . . . 35 RE Reversible electroporation . . . 40 IRE Irreversible electroporation . . . 40 BE Bulk electroporation . . . 44 SCEP Single-cell electroporation . . . 44 MEF Malhas de Elementos Finitos . . . 57 AMD Advanced Micro Devices . . . 58 GHz Gigahertz . . . 58 GB Gigabyte . . . 58 RAM Ramdom Access Memory . . . 58 RER Ret´ıculo endoplasmático rugoso . . . 70 REL Ret´ıculo endoplasmático liso . . . 70 3D 03 dimensões . . . 73 2D 02 dimensões . . . 73 PCA´s Patch-clamp amplifiers . . . 77

INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia 79

SI Sistema Internacional de Unidades . . . 88 SNC Sistema Nervoso Central . . . 95

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Vm Potencial el´etrico transmembrana induzido (V) . . . 40

fs Constante relativa ao formato geom´etrico da c´elula . . . 40

g Constante relativa às caracter´ısticas elétricas das solu¸cões intra e extracelulares e da membrana . . . 40 E0 Campo elétrico aplicado (V/m) . . . 40

r Raio da c´elula (m) . . . 40 θ Angulo entre o vetor de campo el´ˆ etrico aplicado e o vetor na

posi¸c˜ao na membrana (rad) . . . 40 td Tempo decorrido (s) . . . 40

τ0 Constante de tempo . . . 40

Cm Capacitˆancia da membrana celular biol´ogica (F/m) . . . 40

δm Espessura da membrana celular biol´ogica (m) . . . 40

σi Condutividade intracelular (S/m) . . . 40

σe Condutividade extracelular (S/m) . . . 40

σm Condutividade da membrana celular biol´ogica (S/m). . . 40

rph Raio do poro hidrof´obico (m) . . . 41

rp Raio de uma regi˜ao circular da membrana (m) . . . 43

Wp Energia do poro (J) . . . 43

Wmec Energia mecˆanica do poro (J) . . . 43

Wel Energia eletrost´atica do poro (J) . . . 43

WinterEnergia de efeitos est´ericos do poro (J) . . . 43

rc Raio cr´ıtico a partir do qual poros hidrof´obicos se tornam

hidrof´ılicos (m) . . . 43 Ze Impedˆancia do eletrodo EFC (Ω) . . . 47

d Distˆancia entre o eletrodo e a membrana (m) . . . 48 Zf Impedˆancia da fenda entre o eletrodo e a membrana (Ω) . . . 48

Ag Define o aspectos “Ag” do processo de forma¸c˜ao de poros

hidrof´ılicos (V) . . . 51 Bg Define o aspectos “Bg” do processo de forma¸c˜ao de poros

hidrof´ılicos (V) . . . 51 Vem Potencial el´etrico na membrana externa (V) . . . 53

Vim Potencial el´etrico na membrana interna (V). . . 53

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Vpp Potencial transmembrana cr´ıtico (V) . . . 54

hs Altura da simula¸c˜ao (m). . . 54

ws Largura da simula¸c˜ao (m) . . . 54

N Arranjo cúbico de face centrada . . . 54 p Fra¸cão de volume da suspensão . . . 54 Vtotal Potencial total aplicado (V) . . . 55

Va Potencial total simulado (V) . . . 55

Eef Campo el´etrico no capilar (parte n˜ao estirada) (V/m) . . . 55

Ltotal Comprimento total do capilar (m) . . . 55

l Comprimento da ponta do capilar estirado (m) . . . 55 Di Diˆametro interno do capilar n˜ao estirado (m) . . . 55

D_iest Diˆametro interno na ponta do capilar estirado (m) . . . 55 J Densidade de corrente el´etrica (A/m2_{) . . . 64}

ε0 Permissividade el´etrica do v´acuo (F/m) . . . 71

Vin(t) Pulso de entrada (V) . . . 71

Rin Resistor de entrada (Ω). . . 71

Cin Capacitˆancia de entrada (F) . . . 71

Re Resistˆencia do EFC (Ω) . . . 71

Ce Capacitˆancia do EFC (F) . . . 71

Ceqc Capacitˆancia equivalente do do EFC (F) . . . 71

Cm Capacitˆancia da membrana plasm´atica (F) . . . 71

Rm Resistˆencia da membrana plasm´atica (Ω) . . . 71

Ri Resistˆencia do meio intracelular (Ω) . . . 71

εrP Permissividade el´etrica relativa do PBS . . . 74

εrs Permissividade el´etrica relativa da s´ılica . . . 74

εrb Permissividade el´etrica relativa do borosilicato . . . 74

σP BS Condutividade el´etrica da solu¸c˜ao (PBS) (S/m) . . . 74

εre Permissividade el´etrica relativa do microeletrodo . . . 74

XCeq Reatˆancia capacitiva equivalente (Ω). . . 82

Req Resistˆencia equivalente (Ω) . . . 82

Ceq Capacitˆancia equivalente (F) . . . 82

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tc Tempo desejado para Ceq atingir a plena carga (s) . . . 82

∆F Varia¸cão de for¸ca – F (N) . . . 87 ∆A Varia¸cão de área (m2_{) . . . 87}

∆Fx Componente “x” da for¸ca – F (N) . . . 87

∆Fy Componente “y” da for¸ca – F (N) . . . 87

∆Fz Componente “z” da for¸ca – F (N) . . . 87

σ Tens˜ao normal (N/m2_{) . . . 87}

τ Tens˜ao de cisalhamento (N/m2_{) . . . 88}

AB Reta AB (m) . . . 89 n Eixo n (m) . . . 89 ∆s Comprimento original da reta AB (m) . . . 89 A Ponto A pertencente ao eixo “n” . . . 89 B Ponto B pertencente ao eixo “n” . . . 89 A0 Deslocamento espacial do ponto A (m) . . . 89 B0 Deslocamento espacial do ponto B (m) . . . 89 ∆s0 Deslocamento espacial da reta AB (m) . . . 89 med Deforma¸c˜ao normal m´edia (m/m) . . . 89

An Deforma¸c˜ao normal no ponto A em dire¸c˜ao de “n” (m) . . . . 89

γ Deforma¸cão por cisalhamento (rad) . . . 90 AC Reta AC (m) . . . 90 t Eixo t (m) . . . 90 θ0 Deslocamento do ângulo em rela¸cão aπ_/₂_{(rad) . . . 91}

At Deforma¸c˜ao por cisalhamento no ponto A em dire¸c˜ao de “t”

(m) . . . 91 Deforma¸cão espec´ıfica . . . 91 E Módulo de elasticidade (Pa) . . . 92 ν Coeficiente de Poisson . . . 92 δ Varia¸cão do comprimento “L” do material de prova (m) . . . 92 δ0 Varia¸cão da espessura do material de prova (m) . . . 92 L Comprimento do material de prova (m) . . . 92 P For¸ca de tra¸cão ou compressão do material de prova (N) . . . 92 σlp Limite de proporcionalidade (N/m2) . . . 92

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σm Condutividade el´etrica da membrana (S/m) . . . 98

νm Coeficiente de Poisson da membrana . . . 98

EEF C M´odulo de elasticidade do EFC (Pa) . . . 98

ρEF C Densidade do EFC (kg/m3) . . . 98

σEF C Condutividade el´etrica do EFC (S/m) . . . 98

νEF C Coeficiente de Poisson do EFC . . . 98

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1 INTRODU ¸C ÃO . . . 33 1.1 JUSTIFICATIVA . . . 33 1.2 OBJETIVOS . . . 35 1.2.1 Objetivo geral . . . 35 1.2.2 Objetivos espec´ıficos . . . 35 1.3 ORGANIZA ¸C ÃO DO TRABALHO . . . 36 2 FUNDAMENTA ¸C ÃO TE ÓRICA . . . 37 2.1 MEMBRANA PLASM ÁTICA CELULAR . . . 37 2.1.1 Bicamada fosfolip´ıdica . . . 38 2.1.2 Estabilidade e dinâmica fosfolip´ıdica . . . 39 2.2 A ELETROPORA ¸C ÃO . . . 39 2.2.1 Modelos teóricos da eletropora¸cão . . . 41 2.2.2 Forma¸cão de poros . . . 41 2.3 ABORDAGENS EXPERIMENTAIS . . . 44 2.3.1 Eletropora¸cão em suspensões de células (BE) . . . 45 2.3.2 Eletropora¸cão de célula única (SCEP) . . . 46 2.3.2.1 Lab on a chip . . . 46 2.3.2.2 Capilar estirado distante da membrana . . . 47 2.3.2.3 Capilar estirado tocando a membrana . . . 48 3 O MODELO MATEM ÁTICO . . . 51 3.1 INTRODU ¸C ÃO . . . 51 3.2 DEFINI ¸C ÃO DO MODELO MATEM ÁTICO . . . 51 3.3 VALIDA ¸C ÃO DO MODELO MATEM ÁTICO . . . 52 3.4 MATERIAIS E M ÉTODOS . . . 55 3.4.1 Equa¸cões governantes e malha de elementos finitos . 57 3.5 RESULTADOS E DISCUSS ÕES . . . 58 3.5.1 Extrapola¸cões do modelo matemático . . . 63 3.6 CONCLUS ÃO . . . 67 4 ESTUDOS NUM ÉRICOS DO ELETRODO EFC . . . 69 4.1 INTRODU ¸C ÃO . . . 69 4.1.1 O novo prisma da eletropora¸cão . . . 69 4.2 MATERIAIS E M ÉTODOS . . . 71 4.2.1 Circuito equivalente do EFC e da membrana celular 71 4.2.2 Equa¸cões governantes e malha de elementos finitos . 74 4.2.3 Dados do arranjo experimental . . . 75 4.3 RESULTADOS E DISCUSS ÕES . . . 76 4.3.1 Dos estudos do EFC . . . 76

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pacitiva . . . 82 4.3.2.2 Aplica¸cão do algoritmo de compensa¸cão da reatância

ca-pacitiva . . . 82 4.4 CONCLUS ÃO . . . 86 5 ESTUDOS NUM ÉRICOS DA DEFORMA ¸C ÃO

ME-C ÂNICA DA MEMBRANA CELULAR . . . 87 5.1 INTRODU ¸C ÃO . . . 87 5.1.1 Tensão mecânica . . . 87 5.1.1.1 Tensão normal . . . 87 5.1.1.2 Tensão de cisalhamento . . . 88 5.1.2 Deforma¸cão mecânica . . . 89 5.1.2.1 Deforma¸cão normal . . . 89 5.1.2.2 Deforma¸cão por cisalhamento . . . 90 5.1.3 Módulo de elasticidade . . . 92 5.1.4 Coeficiente de Poisson . . . 92 5.1.5 Diagrama de tensão-deforma¸cão . . . 92 5.1.6 Teoria da máxima energia de distor¸cão – von Mises 94 5.2 PAR ÂMETROS FÍSICO-MEC ÂNICOS DA MEMBRANA . . 95 5.3 MATERIAIS E M ÉTODOS . . . 96 5.3.1 Equa¸cões governantes e malha de elementos finitos . 98 5.3.2 Dados do arranjo experimental . . . 99 5.3.2.1 Medida de impedância . . . 99 5.4 RESULTADOS E DISCUSS ÕES . . . 100 5.5 CONCLUS ÃO . . . 110 6 CONSIDERA ¸C ÕES FINAIS E SUGEST ÕES PARA

TRABALHOS FUTUROS . . . 113 6.1 CONSIDERA ¸C ÕES FINAIS . . . 113 6.2 SUGEST ÕES PARA TRABALHOS FUTUROS . . . 114 AP ÊNDICE A -- Circuito equivalente para aplica¸cão da

compensa¸cão da reatância capacitiva . . . 119 AP ÊNDICE B -- Fluxograma do posicionamento do

ele-trodo e aplica¸cão do est´ımulo da eletropora¸cão . . . 123 AP ÊNDICE C -- Fluxograma da compensa¸cão da

impe-dância . . . 128 ANEXO A -- Especifica¸cão técnica - micromanipulador

hidr´aulico Narishige modelo WR-6 . . . 131 REFER ˆENCIAS . . . 133

(35)

1 INTRODU ¸C ˜AO 1.1 JUSTIFICATIVA

O câncer é responsável pelo alto ´ındice de morbi-mortalidade no Brasil; as neoplasias malignas representam a segunda maior causa de morte na popula¸cão (ESTIMATIVA, 2014).

De acordo com dados da International Agency for Research on Cancer (IARC), da Organiza¸cão Mundial da Saúde (OMS), o número de mortes causadas pelo câncer deve subir das estimadas 8,2 milhões anuais para 14 milhões por ano. Estes dados representam custos econˆ o-micos avassaladores, além do sofrimento humano (CANCER, 2014). Em 2030, teremos 21,4 milhões de novos casos de câncer e 13,2 milhões de mortes causadas pela doen¸ca. Isso se deve ao crescimento e enve-lhecimento da popula¸cão, bem como à redu¸cão na mortalidade infantil e nas mortes por doen¸cas infecciosas em pa´ıses em desenvolvimento

(ESTIMATIVA, 2014). No Brasil, a estimativa para o ano de 2014, que

será válida também para o ano de 2015, aponta para a ocorrência de aproximadamente 576 mil casos novos de câncer (ESTIMATIVA, 2014). Parte significativa desses casos poderiam ser evitados com preven¸cão, deteçcão precoce e tratamento de cânceres espec´ıficos.

As células cancer´ıgenas caracterizam-se pela invasão em tecidos adjacentes e pela prolifera¸cão anormal indesejada, podendo entrar na corrente sangu´ınea ou no sistema linfático. Quando ocorre a metástase, migra¸cão para outras partes do corpo humano, o quadro cl´ınico requer maior aten¸cão (GALLINARO, 2013). Outra caracter´ıstica notória, in vitro, em cultura de células tumorais é a ausência de inibi¸cão por con-tato, crescendo as células umas sobre as outras. Nas células normais o contato exerce uma inibi¸cão e estas formam apenas uma monocamada

(MACDONALD; FORD; CASSON, 2004). Uma das terapias utilizadas para

o tratamento do câncer é a quimioterapia, a qual faz uso de compostos qu´ımicos em sua composi¸cão. Entretanto, um dos principais obstáculos para o sucesso do tratamento são os mecanismos de resistência a drogas

(REICHEL et al., 2011).

De forma geral, os tumores são constitu´ıdos de popula¸cões mistas de células malignas, algumas sens´ıveis às drogas e outras resistentes. Durante o tratamento convencional, quimioterápico, as células resis-tentes permanecem e o tumor remanescente retorna a crescer. Um dos mecanismos estudados de resistência é conhecido como resistência a múltiplas drogas (RMD), que é caracterizada pela ausência de resposta

(36)

a diferentes agentes quimioterápicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados (WAGNER-SOUZA et al., 2003). O desenvolvimento de RMD é cada vez mais observado na prática cl´ınica, no tratamento de tumores (CRAGG; NEWMAN; WEISS, 1997). Diante destes fatos, faz-se necessário identificar novas abordagens para a terapêutica do câncer.

Há duas décadas a quimioterapia somou-se com a eletropora¸cão para formar a eletroquimioterapia, um tratamento alternativo para a inser¸cão de quimioterápicos em células tumorais localizadas. Esta é uma metodologia que vem trazendo satisfatórios resultados oncológicos através de aplica¸cões de campos elétricos intensos em tecidos ou c´ elu-las tumorais (TSONG, 1991; WEAVER, 2000; SERSA; CEMAZAR; SNOJ, 2009). Com esse procedimento consegue-se alterar transitoriamente a permeabilidade da membrana celular, permitindo o transporte de f´ ar-macos para a concretiza¸cão da terapia (GEHL, 2003).

Os mecanismos e aplica¸cões práticas da eletropora¸cão vêm rece-bendo cada vez mais aten¸cão. Pode-se citar, a eficiência das vacinas de DNA (RICE; OTTENSMEIER; STEVENSON, 2008). É também usada para a transferência de plasm´ıdeos no desenvolvimento de técnicas relacio-nadas a organismos geneticamente modificados (NICKOLOFF, 1995). A eletropora¸cão possibilita, pela introdu¸cão de marcadores fluorescentes ou plasm´ıdeos nas células, o estudo morfológico e funcional de células do sistema nervoso central (UESAKA et al., 2005;CAPPELLO et al., 2012). A eletropora¸cão irrevers´ıvel pode ser usada para elimina¸cão de micror-ganismos em medicamentos l´ıquidos (GOLBERG; BELKIN; RUBINSKY, 2009). Um efeito indesejado da eletropora¸cão acontece na terapia de desfibrila¸cão card´ıaca, quando a aplica¸cão de campos elétricos causa a abertura de poros nas membranas e, consequentemente, o desequil´ıbrio iônico nas células do cora¸cão (OLIVEIRA, 2008).

Mesmo com a corrente utiliza¸cão da eletropora¸cão, ainda há conceitos e mecanismos que precisam ser estudados. Para tal, faz-se necessária uma aproxima¸cão de estudos comportamentais elétricos e mecânicos da membrana celular. A fusão dessas abordagens pode tra-zer um novo prisma no fenômeno da eletropora¸cão. Estudos derivados dessa jun¸cão podem contribuir para os esclarecimentos dos mecanismos f´ısico-qu´ımicos, como, por exemplo, a evolu¸cão dos poros hidrof´ılicos, a eletropora¸cão in vivo e os efeitos de aplica¸cões de nanopulsos usando capilares estirados repletos de eletrólito (EFC), durante o toque destes, na membrana plasmática.

(37)

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo geral

Este trabalho visa contribuir com os estudos do fenômeno da ele-tropora¸cão em células isoladas utilizando microeletrodo estirado repleto de eletrólito (EFC). Para tal, utilizam-se de modelos matemáticos que permitem expressar o comportamento da condutividade da membrana celular quando a mesma é exposta em campos elétricos não-uniformes e deforma¸cões mecânicas em sua estrutura celular.

1.2.2 Objetivos espec´ıficos

Estudo numérico do modelo matemático da condutividade el´ e-trica da membrana celular: Adapta¸cão do modelo matemático de Glaser et al. (1988) e de Ramos (2005) para analisar a varia¸cão tem-poral da condutividade da membrana. A partir deste, realizar estudos de varia¸cões elétricas (distâncias de potenciais elétricos e distribui¸cão do campo elétrico), varia¸cões estruturais da célula biológica (raio celu-lar) e varia¸cões na condutividade elétrica do meio (intra e extracelular). Estudo da resposta em frequência do microeletrodo EFC: Mo-delar o comportamento das varia¸cões de parâmetros elétricos e geo-métricos do microeletrodo EFC´s. Verificar a influência da reatância capacitiva na condutividade da membrana celular e desenvolver um al-goritmo de compensa¸cão, suavizando os efeitos indesejados da mesma. Realizar compara¸cão do modelo simulado com dados experimentais ex-postos por Chiea (2013).

Estudo numérico do modelo matemático da deforma¸cão me-cânica da membrana celular: Realizar um modelo matemático do fenômeno da eletropora¸cão na presen¸ca do toque e deforma¸cão mecˆ a-nica da membrana celular. Investigar se a impedância (750 kΩ), defi-nida por Bae e Butler (2006), é o valor adequado da fenda para apli-ca¸cão dos est´ımulos da eletropora¸cão. Posteriormente, comparar com dados experimentais obtidos por Chiea (2013). Verificar a influência do tensor de Maxwell na condutividade da membrana celular.

(38)

1.3 ORGANIZA ¸C ˜AO DO TRABALHO

Este trabalho está dividido em seis cap´ıtulos. Apresenta-se, no cap´ıtulo 1, justificativa, introdu¸cão e objetivos (gerais e espec´ıficos). O cap´ıtulo 2 contempla uma fundamenta¸cão teórica e toda temática envolvida no decorrer do trabalho. No cap´ıtulo 3, insere-se o modelo matemático para estudos da condutividade da membrana celular biol´ o-gica dadas varia¸cões de parâmetros estruturais da célula. No cap´ıtulo 4, encontram-se estudos voltados para caracter´ısticas elétricas do eletrodo, do tipo EFC. No cap´ıtulo 5, estão modelos matemáticos para estudos da deforma¸cão mecânica da membrana celular biológica e verifica¸cão da eficácia da mesma na eletropora¸cão. No cap´ıtulo 6, apresentam-se com as conclusões e sugestões para investiga¸cões futuras. A Tabela 1 contempla de forma simplificada a organiza¸cão deste documento.

Tabela 1 – Organiza¸c˜ao estrutural do trabalho Cap´ıtulo Descri¸c˜ao

Cap´ıtulo 1 Introdu¸cão, justificativas e objetivos Cap´ıtulo 2 Fundamenta¸cão teórica

Cap´ıtulo 3 Modelo matem´atico da condutividade da membrana celular Cap´ıtulo 4 Estudos das caracter´ısticas el´etricas do eletrodo

Cap´ıtulo 5 Estudos da deforma¸cão mecânica da membrana celular Cap´ıtulo 6 Conclusões e trabalhos futuros

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2 FUNDAMENTA ¸C ÃO TE ÓRICA 2.1 MEMBRANA PLASM ÁTICA CELULAR

A membrana plasmática, também conhecida como a membrana celular, constitui uma barreira entre o interior do citoplasma (intracelu-lar) e o ambiente externo (extracelu(intracelu-lar). É basicamente uma bicamada formada por fosfolip´ıdios permeados por prote´ınas (integradas e peri-féricas), glicolip´ıdios e colesterol. A membrana plasmática tem uma permeabilidade seletiva. Ela protege o citoplasma e controla tudo que entra e sai da célula. Apenas determinadas substâncias são permitidas o transporte (LODISH, 2008). A Figura 1 representa a estrutura de uma membrana plasmática.

Figura 1 – Membrana plasmática celular – (a) A¸cúcar ligado à pro-te´ına. (b) A¸cúcar ligado ao lip´ıdio. (c) Prote´ınas. (d) Colesterol. (e) Bicamada Fosfolip´ıdica.

(40)

2.1.1 Bicamada fosfolip´ıdica

Os fosfolip´ıdios da membrana celular são moléculas anfif´ılicas, conforme mostrado na Figura 2. Estas possuem uma cabe¸ca polar hi-drof´ılica que contém fosfato, ligada a uma molécula de glicerol. A cauda apolar hidrofóbica é composta por duas cadeias de ácidos graxos, sendo uma cadeia carbônica saturada e uma de cadeia carbônica insaturada, apresentando uma dupla liga¸cão cis (COOPER, 2000), (PAVLIN et al., 2008;ALBERTS et al., 2010).

Figura 2 – Fosfolip´ıdio – (a) Cabe¸ca hidrof´ılica solúvel em água. For-mam a superf´ıcie e o interior da membrana. (b) Colina. (c) Fosfato. (d) Glicerol. (e) Cauda hidrofóbica não solúvel em água, formando a parte interna da membrana. (f) Ácidos graxos saturados. (g) Ácidos graxos insaturados.

(41)

2.1.2 Estabilidade e dinˆamica fosfolip´ıdica

A estabilidade da membrana dá-se através da atra¸cão das cau-das apolares na interface água e hidrocarboneto, enquanto as cabe¸cas polares se repelem (CHIEA, 2013). Embora estável, ela não é uma es-trutura estática. Os lip´ıdios movem-se, proporcionando fluidez à mem-brana. Os lip´ıdios podem girar em torno de seu próprio eixo (rota¸cão), difundir-se lateralmente (difusão lateral), migrar de uma monocamada para outra (inversão - flip-flop), o que acontece raramente, e apresen-tar movimentos de inclina¸cão por causa das cadeias de hidrocarbonetos (flexão) (BROWN, 1996;LODISH, 2008). A Figura 3 ilustra a dinâmica mencionada.

Figura 3 – Dinâmica fosfolip´ıdica – (a) Difusão lateral. (b) Flexão. (c) Rota¸cão. (d) Inversão (flip-flop).

Adaptado de Brown (1996).

2.2 A ELETROPORA ¸C ˜AO

A eletropora¸cão ou eletropermeabiliza¸cão é um fenômeno tran-sitório, que aumenta a permeabilidade da membrana plasmática da célula, quando a mesma é submetida a um campo elétrico externo (

(42)

MI-KLAVˇCI ˇC; PUC, 2006;SUZUKI et al., 2014). Durante esta exposi¸cão um potencial elétrico transmembrana (Vm) é induzido, devido à diferen¸ca

nas propriedades elétricas da membrana plasmática e do meio externo, conhecido como polariza¸cão Maxwell-Wagner (MAXWELL, 1954;COLE, 1968). Quando este potencial atinge a ordem de centenas de milivolts (Vm > 0, 2 V) (TEISSI É; ROLS, 1993), poros de escala nanométrica se

formam na membrana, permitindo a transferência de ´ıons e moléculas solúveis em água para o meio intracelular (SUZUKI, 2009). A eletropo-ra¸cão pode ser revers´ıvel (RE) ou irrevers´ıvel (IRE). Quando revers´ıvel (0, 2 V < Vm< 1, 0 V), ao final do est´ımulo externo, os poros se fecham

e a membrana se restabelece. No caso oposto, tempos o rompimento da membrana, o desequil´ıbrio iˆonico e, consequentemente, a morte celular

(WEAVER; CHIZMADZHEV, 1996).

Para as células de forma esférica, esse potencial elétrico trans-membrana induzido (Vm) é descrito pela Equa¸cão 2.1:

Vm= fsg E0r cos θ [1 − exp (−td/τ0)] (2.1)

onde fs é a constante relativa ao formato geométrico da célula, dada

pela Equa¸cão 2.2, g é a constante relativa às caracter´ısticas elétricas das solu¸cões intra e extracelulares e da membrana, E0é campo elétrico

aplicado (V/m), r é o raio da célula (m), td é o tempo (s) decorrido

desde o in´ıcio da aplica¸cão do campo elétrico e τ0 é a constante de

tempo, dada pela Equa¸c˜ao 2.3:

fs= 3 σe[3 δmr2σi+ (3 δm2 r − δ3m) (σm− σi)] 2 δ3 m(σm+ 2 σe)(σm−1₂σi) − 2 (r − δm)3(σe− σm) (σi− σm) (2.2) τ0= r Cm 2 σeσi 2 σe+σi + r δm2 σm (2.3)

onde Cmé capacitância da membrana celular (F/m), δmé a espessura

da membrana (m), σi, σe e σms˜ao as condutividades do meio

intrace-lular, extracelular e da membrana plasmática (S/m), respectivamente. Considerando-se uma célula esférica f =3_/₂₍_{WANG et al.}_{, 2010),}

a membrana totalmente isolante, g = 1 (SUZUKI et al., 2011). Como τ0´e

tipicamente menor que 1 µs (WANG et al., 2010), significantemente me-nor que o tempo dos pulsos simulados, no presente estudo considerou-se apenas a solu¸cão em regime. Assim a expressão para o cálculo de Vm

(43)

pode ser simplificada, como mostra a Equa¸c˜ao 2.4: Vm=

3

2E0r cos (θ) (2.4)

2.2.1 Modelos te´oricos da eletropora¸c˜ao

Uma série de modelos teóricos têm sido apresentados como poss´ı-veis explica¸cões da eletropora¸cão. Os modelos hidrodinâmico, elástico, hidroelástico e visco-hidroelástico fazem uma análise macro do fenˆ o-meno, na qual a estrutura molecular da membrana não desempenha nenhum papel direto. Os modelos transi¸cão de fase e ruptura dom´ınio-interface representam o outro extremo, tentando explicar o fenômeno pelas propriedades das moléculas lip´ıdicas individuais e as intera¸cões entre elas (PAVLIN et al., 2008).

Um modelo que converge para os dois grupos supracitados é o modelo de forma¸cão de poros, no qual a eletropora¸cão é causada pela forma¸cão de poros aquosos transitórios na bicamada lip´ıdica. Neste modelo, cada poro é formado por um grande número de moléculas de lip´ıdios, mas a forma, o tamanho e a estabilidade do poro são forte-mente influenciados pela estrutura destas moléculas e suas intera¸cões locais. Este modelo é considerado por muitos como a explica¸cão mais convincente para explicar a eletropora¸cão (PAVLIN et al., 2008).

2.2.2 Forma¸c˜ao de poros

Os poros formados na membrana podem ser hidrofóbicos ou hi-drof´ılicos, de acordo com a organiza¸cão das moléculas fosfolip´ıdicas, conforme ilustrado na Figura 4. Na Figura 4a, tem-se a membrana est´ a-tica. Lacunas instáveis que se formam esporadicamente na membrana, pela própria movimenta¸cão dos fosfolip´ıdios, são os poros hidrofóbicos, (Figura 4b). Eles são pequenos (rph< 1 nm), e estão em constante

flu-tua¸cão na escala temporal de picossegundos (TSONG, 1991). Os poros de interesse no estudo da eletropora¸cão são os hidrof´ılicos, Figura 4c. Estes têm dimensões e tempo de existência maiores, permitindo a pas-sagem de moléculas solúveis em água através da membrana. Porém, se o potencial transmembrana for superior ao valor cr´ıtico, (Figura 4d), tem-se o desequil´ıbrio iônico, que leva à inviabilidade celular.

(44)

Figura 4 – Poros hidrofóbicos e hidrof´ılicos – (a) Membrana intacta. (b) Forma¸cão de poros hidrofóbicos flutuantes na membrana. (c) A transi¸cão para uma poro hidrof´ılico, permitindo a passagem de mol´ ecu-las através da membrana celular, eletropora¸cão revers´ıvel. (d) Ruptura da membrana, eletropora¸cão irrevers´ıvel.

(45)

O modelo de forma¸c˜ao de poros aquosos ´e baseado na energia do poro (Wp). Inicialmente, considera-se apenas a diferen¸ca de energia

mecˆanica (Wmec), entre a membrana sem poros, Figura 4a, e a mesma

membrana sendo retirada uma regi˜ao circular de raio rp (WEAVER;

CHIZMADZHEV, 1996; CHEN et al., 2006). Inclu´ıdas as influˆencias da

energia eletrost´atica (Wel), devida ao campo el´etrico externo aplicado,

tem-se a Equa¸c˜ao 2.5, que representa a energia para poros hidrof´obicos. Wp(rp, Vm) = Wmec(rp) + Wel(rp, Vm) (2.5)

Para poros hidrof´ılicos, a organiza¸cão espacial das moléculas pro-voca a sobreposi¸cão das nuvens eletrônicas das cabe¸cas dos fosfolip´ıdios, causando for¸cas intermoleculares (repulsão estérica). Quanto menor o raio do poro, maior a significância deste efeito (NEU; KRASSOWSKA, 1999). Adicionando a energia relacionada a essas for¸cas intermolecula-res (Winter), chega-se à Equa¸cão 2.6 para poros hidrof´ılicos.

Wp(rp, Vm) = Wmec(rp) + Wel(rp, Vm) + Winter(rp) (2.6)

A Figura 5 mostra a rela¸c˜ao entre a energia do poro e seu raio. Quando um poro tem energia tal que ultrapassa a barreira ∆Wp, ou

seja, quando o raio atinge um valor cr´ıtico, rc, as mol´eculas de

fosfoli-p´ıdios se rearranjam e o poro passa a ser hidrof´ılico. Em suma, o raio cr´ıtico rc ´e o raio a partir do qual o poro passa do estado hidrof´obico

para o estado hidrof´ılico, permitindo assim a passagem de moléculas solúveis em água.

Tamb´em ´e poss´ıvel ver que tanto a barreira ∆Wp quanto o raio

cr´ıtico rcdiminuem com o aumento de Vm(pela aplica¸c˜ao de um campo

elétrico, por exemplo), aumentando a possibilidade de forma¸cão de poro hidrof´ılico (WEAVER; CHIZMADZHEV, 1996). A partir deste ponto, qual-quer men¸cão à forma¸cão de poros se refere à forma¸cão de poros hidro-f´ılicos.

(46)

Figura 5 – Energia associada a um poro. W1se refere `a energia do poro

hidrof´obico, W2, `a energia do poro hidrof´ılico. Quando a magnitude de

Vm aumenta, a barreira de energia ∆Wp e o raio cr´ıtico rc diminuem

(∆Wp0 e rc0).

Adaptado de Pavlin et al. (2008) e Weaver e Chizmadzhev (1996).

2.3 ABORDAGENS EXPERIMENTAIS

Na presente literatura, encontram-se dois grandes grupos de ar-ranjos experimentais da eletropora¸c˜ao, sendo o segundo sub dividido em trˆes diferentes metodologias (WANG et al., 2010):

1. Eletropora¸cão em suspensões de células (Bulk electroporation – BE );

2. Eletropora¸cão de célula única (Single-cell electroporation – SCEP ). (a) Dispositivos microeletrônicos - Lab on a chip;

(b) Capilar estirado distante da membrana; (c) Capilar estirado tocando a membrana celular.

Ressalta-se que o enfoque de estudo deste trabalho encontra-se no segundo grupo, expressamente nos itens (b) e (c).

(47)

2.3.1 Eletropora¸cão em suspensões de células (BE)

O cenário experimental de maior difusão consiste na aplica¸cão de pulsos de tensão através de eletrodos posicionados paralelamente entre si, como pode ser visto na Figura 6. Neste tipo de arranjo o campo elétrico que atravessa a solu¸cão é praticamente uniforme e, para células esféricas, a tensão induzida na membrana, Vm, tem solu¸cão anal´ıtica

e é diretamente proporcional ao campo elétrico aplicado e ao raio da célula, Vm ∝ E0r. Pode-se realizar este experimento em tecidos ou

células em suspensão. Para a avalia¸cão dos poros, são realizadas me-didas da varia¸cão da condutância elétrica da suspensão ou da inser¸cão de moléculas fluorescentes ou plasm´ıdeos (HARRISON; BYRNE; TUNG, 1998;SUZUKI et al., 2011).

Figura 6 – Arranjo experimental tradicional da eletropora¸cão com ele-trodos de placas paralelas. O campo elétrico aplicado E0é praticamente

uniforme e provoca diferentes efeitos, dependendo das dimens˜oes das c´elulas.

Adaptado de Pavlin et al. (2008), Chiea (2013).

Este arranjo permite a eletropora¸cão de muitas células simulta-neamente. As principais dificuldades encontradas são ligadas ao equi-pamento para a aplica¸cão de est´ımulos. Para que o campo elétrico seja suficiente para a eletropora¸cão, tensões da ordem de 50 V a 1 kV devem ser aplicadas em cuvetas padrão, de acordo com as dimensões da c´

(48)

e-lula. A corrente que o gerador deve fornecer depende da condutividade da solu¸cão, e, no caso de solu¸cões fisiológicas, pode variar entre alguns miliamperes (mA) até algumas dezenas de amperes (A) se aplicado um campo de 450 V/cm (KOTNIK; BOBANOVI Ć; MIKLAVˇCI ˇC, 1997). Ape-sar de equipamentos comerciais destinados à eletropora¸cão já existirem, eles dificilmente permitem faixas tão extensas de tensão e corrente.

A inconveniência em se utilizar este tipo de experimento no es-tudo da eletropora¸cão é que, sendo as células na suspensão ou no te-cido de tamanhos diferentes, e considerando a rela¸cão entre Vm, E0 e

r (Equa¸cão 2.4), para um mesmo campo elétrico aplicado, o potencial induzido será diferente em cada célula, prejudicando a rela¸cão entre a eficiência na realiza¸cão da eletropora¸cão revers´ıvel e a viabilidade celu-lar. Além disso, os resultados obtidos são uma combina¸cão dos efeitos em cada célula (com suas dimensões e estado particulares) na solu¸cão ou no tecido, o que torna dif´ıcil a análise do que se passa efetivamente na membrana celular. Uma solu¸cão para esse inconveniente é a experi-menta¸cão em célula única.

2.3.2 Eletropora¸cão de célula única (SCEP)

2.3.2.1 Lab on a chip

Técnicas de fabrica¸cão de circuitos integrados permitem a cons-tru¸cão de sistemas para a eletropora¸cão de célula única. A SCEP de células aderentes pode ser realizada em arrays de microeletrodos. Cada eletrodo pode ser controlado independentemente, possibilitando a apli-ca¸cão de est´ımulos diferenciados em células de uma mesma popula¸cão. Também é poss´ıvel realizar medi¸cões eletrofisiológicas durante a eletro-pora¸cão (BRAEKEN et al., 2010;KOESTER et al., 2010).

Sistemas microflu´ıdicos permitem a SCEP de c´elulas em

suspen-são (ODORIZZI et al., 2011), um diferencial em rela¸cão a outras técnicas.

Estes dispositivos frequentemente possuem eletrodos constru´ıdos pr´ o-ximos a “microarmadilhas” (microporos) colocadas no canal por onde fluem as células em suspensão (VALERO et al., 2007). Apenas uma célula fica presa em uma armadilha.

As principais desvantagens desta abordagem são o acesso a uma estrutura que permita a fabrica¸cão de dispositivos microeletrônicos e o tempo de produ¸cão.

(49)

2.3.2.2 Capilar estirado distante da membrana

Uma maneira de direcionar o campo elétrico em uma célula é utilizar eletrodos do tipo microcapilares estirados repletos com ele-trólito (EFC). O posicionamento do EFC é a alguns micrômetros da membrana quando o est´ımulo elétrico é aplicado (NOLKRANTZ et al., 2002, 2001). Com esta técnica, Agarwal et al. (2007) estudaram a in-fluência do tamanho e formato das células na eletropora¸cão. Este tipo de experimento também permite a eletropora¸cão de áreas determinadas em tecidos (OLOFSSON et al., 2007). O pulso aplicado é de 100 a 2 kV, mas a corrente não ultrapassa algumas centenas de microamperes, de-vido à alta impedância dos eletrodos (Ze≈ 10 MΩ). Esta metodologia

experimental ´e ilustrada na Figura 7.

Figura 7 – Arranjo experimental da eletropora¸cão com EFC posicio-nado distante da membrana. O gerador fornece pulsos da ordem de kilovolts (kV). A imagem é ilustrativa, não representando as verdadei-ras propor¸cões.

Adaptado de Chiea (2013).

Uma das principais vantagens deste método é a possibilidade de se registrar informa¸cão referente ao transiente da forma¸cão de po-ros (WANG et al., 2010). Entretanto, uma vez que o campo elétrico aplicado não é uniforme, o potencial transmembrana não pode ser cal-culado analiticamente. Apesar de se poder estimar Vm por métodos

(50)

numéricos (ZUDANS et al., 2007), como a distância entre o eletrodo e a membrana, d, não é precisamente obtida experimentalmente, torna-se dif´ıcil a compara¸cão de dados experimentais com simula¸cões numéricas.

2.3.2.3 Capilar estirado tocando a membrana

Outra op¸cão de arranjo experimental é posicionar o EFC de ma-neira que este levemente toque a superf´ıcie da membrana, como visua-lizado na Figura 8 (RAE; LEVIS, 2002; RATHENBERG; NEVIAN; WITZE-MANN, 2003). A eletropora¸cão acontece somente na região sob a pipeta, e o potencial transmembrana não depende do tamanho e do formato da célula, mas, sim, da impedância da fenda formada entre a ponta do EFC e a membrana, Zf.

Figura 8 – Arranjo experimental da eletropora¸cão com EFC tocando a membrana. A tensão aplicada pelo gerador é da ordem de dezenas de Volts. A imagem é ilustrativa, não representando as verdadeiras propor¸cões.

Adaptado de Chiea (2013).

Esta técnica pode ser utilizada para a inser¸cão de material ge-nético (BOUDES et al., 2008) e na eletropora¸cão de uma única célula in vivo, por exemplo, para estudos de morfologia celular (HAAS et al., 2001, 2002). O mesmo eletrodo usado para a inser¸cão de moléculas pode ser usado para registros eletrofisiológicos (GRAHAM et al., 2007).

(51)

Barker, Billups e Hamann (2009) apontam que esta técnica associada a eje¸cão sob pressão com o aux´ılio de um capilar duplo aumenta a eficiência da inser¸cão de moléculas.

O potencial aplicado no EFC necessário para a eletropora¸cão é da ordem de dezenas de volts (V), significantemente menor em rela¸cão `

a técnica com o EFC distante. Por isso, os equipamentos necessários para a aplica¸cão do pulso e medi¸cão da corrente são mais simples que nos casos anteriormente descritos.

Posicionar o eletrodo é uma das principais dificuldades dessa técnica. É necessário monitorar a corrente através do eletrodo para colocá-lo corretamente no ponto em que toca levemente a membrana, sem perfurá-la. O posicionamento automático do eletrodo é poss´ıvel através do controle de sua movimenta¸cão com um micromanipulador comandado por computador (BAE; BUTLER, 2006).

Uma limita¸cão importante dos experimentos com EFCs é a ne-cessidade de se trabalhar com células aderentes, ou aderir células no fundo do recipiente do banho.

(52)

(53)

3 O MODELO MATEM ´ATICO 3.1 INTRODU ¸C ˜AO

Modelos matemáticos podem ser usados para descrever o com-portamento da membrana celular na presen¸ca do campo elétrico ex-terno. Neumann e Boldt (1989) realizaram um modelo baseado no relaxamento da histerese da membrana celular. Smith, Neu e Kras-sowska (2004) definiram um modelo matemático baseado na energia da membrana. Este modelo permite o cálculo dinâmico, em fun¸cão de Vm,

do número de poros gerados e da evolu¸cão dos seus raios, variáveis de interesse para posteriores estudos de inser¸cão de moléculas na mem-brana plasmática. Miklavˇciˇc e Towhidi (2010) alteraram o modelo de Neumann et al. (1998), que é baseado no esquema de cinética qu´ımica (também conhecida como cinética de rea¸cão), e no modelo barreira de trapézio, para definir um modelo de transporte molecular e analisar a eficiência deste processo para diferentes formas de sinais aplicados.

Embora alguns modelos expressem uma plaus´ıvel consolida¸cão matemática, alguns carecem de valida¸cões com dados experimentais. Sendo assim, o objetivo deste cap´ıtulo 3 é definir uma variante de um modelo matemático no qual se encontram consideradas comprova¸cões com dados experimentais.

3.2 DEFINI ¸C ˜AO DO MODELO MATEM ´ATICO

Ramos (2005) realizou uma adequa¸cão do modelo matemático apresentado por Glaser et al. (1988) em seus experimentos com mem-branas planares. A Equa¸cão 3.1 demonstra o modelo original definido

porGLASER et al..

ln ∆I ∆t

= Ag+ BgVm2 (3.1)

onde Ag e Bg s˜ao equa¸c˜oes detalhadas em Suzuki (2009), as quais

de-finem os diferentes aspectos do processo de forma¸cão de poros hidro-f´ılicos, e Vm é a tensão transmembrana. A Equa¸cão 3.2 representa a

(54)

∆I ∆t = α e Vm Vpp 2 (3.2) onde α = eAg_{, V}

m ´e a tens˜ao transmembrana e Vpp = 1/pBg. Esse

modelo permite analisar a dinâmica da eletropora¸cão, contemplando os momentos iniciais do surgimento dos poros. Sendo o diâmetro da membrana planar de 1, 0 mm, a se¸cão por onde passa a corrente do experimento é aproximadamente Am = 8 × 10−7m2 (GLASER et al.,

1988). No presente estudo, definiu-se a Equa¸c˜ao 3.3:

1 Am ∆I ∆t = 1 Am α e Vm Vpp 2 ∆J ∆t = 1 Am α e Vm Vpp 2 (3.3)

Considerando que a altera¸cão da corrente no experimento de Glaser et al. (1988) ocorreu apenas devido à forma¸cão de poros na membrana (desconsiderou-se a condu¸cão pelo canais iônicos dependen-tes de tensão) e sendo J = σmE, tem-se a equa¸cão da condutividade

da membrana (na Equa¸cão 3.4): ∆σm ∆t = Keα e _Vm Vpp 2 (3.4) onde Keé uma constante de equil´ıbrio, obtida através das compara¸cões

dos primeiros 100 µs dos dados experimentais de Ramos et al. (2012) e simula¸cões em célula única presente em campo elétrico uniforme.

3.3 VALIDA ¸C ˜AO DO MODELO MATEM ´ATICO

As simula¸cões e estudos foram realizadas utilizando o software COMSOL Multiphysicsr versão 4.4 (COMSOL Inc., Burlington, MA), baseado no método de elementos finitos. A valida¸cão do modelo deu-se através da inser¸cão de uma célula esférica isolada em um campo el´ e-trico uniforme, formado por placas paralelas. A simula¸cão geométrica realizada é mostrada na Figura 9.

(55)

Figura 9 – Modelo da célula única isolada presente no campo elétrico uniforme. A geometria celular e a área de simula¸cão não se encontram na mesma escala

Adaptado de Zudans et al. (2007).

Aproveitou-se a simetria axial a fim de amenizar os esfor¸cos com-putacionais. Os potenciais el´etricos nas membranas externas (Vem) e

internas (Vim) foram determinados utilizando a equa¸c˜ao de Laplace

(Equa¸c˜ao 3.5):

∇(σe∇Vem) = 0

∇(σi∇Vim) = 0

(3.5)

onde σe e σi s˜ao as condutividades el´etricas da membrana externa e

interna respectivamente. O potencial transmembrana dar-se-´a pela di-feren¸ca de potencial entre ambas as faces das membranas, segundo a Equa¸c˜ao 3.6

(56)

Para valida¸cão do modelo, como já descrito, compararam-se os resultados simulados com os resultados dos primeiros 100 µs experimen-tais de Ramos et al. (2012). Como o estudo original é concentrado em eletropora¸cão de células em suspensão, houve a necessidade localizar o campo elétrico efetivo em uma única célula, relembrando que a me-todologia aqui exposta trata de estudos em célula isolada. Através da Equa¸cão 3.7, obtivemos o campo elétrico efetivo (RAMOS et al., 2012):

Ef =

1 + p/2

1 + (3p/4N π)1/3E0 (3.7)

onde N é o número de arranjo de células, p é a fra¸cão de volume da suspensão e E0é o campo elétrico total aplicado. Os demais parâmetros

utilizados est˜ao localizados na Tabela 2.

Tabela 2 – Parâmetros do modelo para simula¸cão de célula única isolada na presen¸ca de um campo elétrico uniforme.

S´ımbolo Valor Descri¸c˜ao

Ke 3 × 10−2S/m.s Constante de equil´ıbrio do modelo

α 1 × 10−11 Constante da mobilidade† Am 8 × 10−7m2 Area da membrana planar´ ‡

Vpp 0, 20 V Potencial transmembrana cr´ıtico§

r 4, 87 µm Raio da c´elula∗

δm 5, 0 nm Espessura da membrana∗

E0 100 kV /m Campo el´etrico∗

σe 54, 5 × 10−3S/m Condutividade da solu¸c˜ao∗

σi 1, 0 S/m Condutividade do citoplasma∗

N 4, 0 Arranjo cúbico de face centrada∗ p 0, 28 Fra¸cão de volume da suspensão∗ hs 1, 0 mm Altura do dom´ınio de cálculo

ws 1, 0 mm Largura do dom´ınio de c´alculo

∗_{(RAMOS et al., 2012);}

†_{(SUZUKI, 2009);}

‡_{(SUKHAREV et al., 1982)}

(57)

3.4 MATERIAIS E M ´ETODOS

As geometrias utilizadas nas simula¸cões foram semelhantes às encontradas em Zudans et al. (2007). A Figura 10 demonstra a sua representa¸cão espacial. Para evitar maiores esfor¸cos computacionais devido à geometria 3D, simulou-se em geometria 2D-axissimétrica1 _a

partir do capilar estirado, como demonstra a Figura 11.

Figura 10 – Modelo representativo em 3 dimensões da célula única isolada presente no campo elétrico não-uniforme. Todas as geometrias visualizadas não estão representadas na mesma escala.

Conforme Zudans et al. (2007) a queda de tensão no capilar não estirado é dada pela Equa¸cão 3.8:

Va= Vtotal+

∂V

∂z(Ltotal− l) (3.8)

∂V_/_∂Z_´_{e o campo el´}_{etrico normal onde temos a presen¸}_{ca de V}

a, Vtotal´e o

potencial el´etrico experimental aplicado em todo capilar, Ltotal. Outros

parâmetros para simula¸cão estão representados na Tabela 3.

1 _{Simetria em rela¸}_c˜_{ao a um eixo. Neste caso, como o estudo ´}_{e realizado em 2D, a}

(58)

Figura 11 – Modelo representativo em 2D-axissimétrico da célula única isolada presente no campo elétrico não-uniforme. Todas as geometrias visualizadas não estão representadas na mesma escala.

Adaptado de Zudans et al. (2007).

Tabela 3 – Parâmetros utilizados para análise da queda de potencial elétrico no capilar estirado.

S´ımbolo Valor Descri¸c˜ao

Vtotal 500 V Potencial total aplicado∗

Va 105 V Potencial total simulado

Eef 25, 70 V /cm Campo el´etrico no capilar (parte n˜ao estirada)

Ltotal 15, 0 cm Comprimento total do capilar∗

l 0, 2 cm Comprimento da ponta do capilar estirado∗ Di 0, 1 cm Diˆametro interno do capilar n˜ao estirado

Dest

i 5, 0 µm Diˆametro interno na ponta do capilar estirado

σe 0, 6 S/m Condutividade da solu¸c˜ao∗

σi 0, 13 S/m Condutividade do citoplasma∗

r 10, 0 µm Raio da c´elula∗

δm 7, 0 nm Espessura da membrana∗

hs 2, 1 mm Altura do dom´ınio de c´alculo

ws 1, 0 mm Largura do dom´ınio de c´alculo

(59)

3.4.1 Equa¸c˜oes governantes e malha de elementos finitos

Os modelos de distribui¸cão de campo elétrico foram calculados utilizando o módulo de corrente elétrica (AC/DC). Supondo que a den-sidade de corrente elétrica (J) na membrana celular é divergence-free, a equa¸cão de Poisson é válida e expressa na Equa¸cão 3.9:

−∇ · (σm∇ V ) = 0 (3.9)

onde σm ´e a condutividade da membrana (S/m) e V ´e o potencial

el´etrico (V).

Definidos os parâmetros geométricos da simula¸cão, as malhas de elementos finitos (MEF) foram estabelecidas de duas formas: inicial-mente para valida¸cão do modelo matemático, célula inserida em um campo elétrico uniforme; posteriormente, com a inser¸cão do modelo da eletropora¸cão na membrana celular, conforme descrito nos itens abaixo: 1. Estudos no dom´ınio do tempo, para valida¸cão do mo-delo matemático da condutividade da membrana celular: Utilizou-se uma malha triangular de elementos finitos extrema-mente fina na membrana celular e malha triangular fina nos meios intra e extracelular. A malha completa é composta por 81.610 elementos de dom´ınio e 4.741 elementos de contorno. O tempo médio da simula¸cão é aproximadamente 7 minutos e 3 segundos, para cada varia¸cão de parâmetro.

2. Estudos no dom´ınio do tempo, para estudos da eletropo-ra¸cão com EFC distante: Inseriu-se o modelo da eletropora¸cão na membrana celular, apresentado na Equa¸cão 3.4, bem como a condi¸cão de contorno expressa na Equa¸cão 3.8. Especificou-se uma malha triangular de elementos finitos extremamente fina na membrana celular e malha triangular fina nas demais geometrias. A malha completa é composta por 61.730 elementos de dom´ınio e 4.414 elementos de contorno. O tempo médio da simula¸cão é aproximadamente 3 minutos e 17 segundos, para cada varia¸cão de parâmetro.

(60)

A simula¸c˜ao deste modelo, bem como os demais presentes neste trabalho, foi realizada em um computador pessoal, AMD AthlonII X2 250 com 3,0 GHz de velocidade de processamento, 4,0 GB de mem´oria RAM e com sistema operacional Microsoftr _{Windows 8 de 64 bits.}

A formata¸c˜ao e apresenta¸c˜ao dos dados, deste e demais cap´ıtulos, utilizou scripts confeccionados no programa MATLAB (MathWorks, Natick, MA).

3.5 RESULTADOS E DISCUSS ˜OES

A constante de equil´ıbrio (Ke) foi obtida para Vm(σm= 0) entre

1,8 V e 3,3 V em resultados experimentais e teóricos de suspensão de célula. O erro máximo entre as curvas teóricas e experimentais mostrou-se inferior a 15%. O potencial transmembrana (Vm) aumenta

em conformidade com a Equa¸c˜ao 2.4 e, quando Vmexcede o potencial

transmembrana cr´ıtico (Vpp), tem-se o surgimento dos poros e aumento

da condutividade da membrana (σm).

Na proposta definida pelo modelo matem´atico, baseado em ex-perimentos de Glaser et al. (1988), a condutividade da membrana au-menta com taxa dependente do potencial transmembrana. O valor cr´ıtico do potencial transmembrana (Vpp) proposto por Glaser et al.

(1988) é de 0,46 V pra bicamada lip´ıdica planar. Porém os experimen-tos com células nos mostram diferentes valores. Teissié e Rols (1993), por exemplo, obtiveram um valor de Vpp= 200 mV. Este valor se

mos-tra adequado, pois o valor de Kefoi obtido de experimentos em

suspen-s˜ao celular (RAMOS et al., 2012). Encontram-se diferentes valores desta

constante na literatura (GLASER et al., 1988; SUZUKI et al., 2011;

RA-MOS; SUZUKI; MARQUES, 2004). A dificuldade em comparar os valores

de Ke ´e causada por diferentes parˆametros medidos entre

experimen-tos. Suzuki et al. (2011) investigaram a condutividade da suspensão de células, quando comparada com dois modelos de eletropora¸cão. Glaser et al. (1988) ajustaram os resultados atuais com o modelo matemático da Equa¸cão 3.4. Mesmo com a varia¸cão esperada de Ke, a dinâmica

do modelo é consistente com os diferentes experimentos mencionados. A Figura 12 apresenta a compara¸cão entre resultados de Zudans et al. (2007), ausente de um modelo matemático da condutividade da membrana celular, e os resultados simulados na presen¸ca do modelo da eletropora¸cão.

(61)

15 30 45 60 75 90 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Ângulo, θ° Vm , V +V_pp −V_pp V=500 V V=1000 V V=2000 V V=500 V* V=1000 V* V=2000 V*

Figura 12 – Compara¸cão entre resultados de Zudans et al. (2007) de-marcados na legenda por V∗ (sem o modelo da eletropora¸cão inserido) e dados simulados (com inser¸cão do modelo da eletropora¸cão), ambos para uma distância entre EFC e membrana de 4, 0 µm. As linhas pon-tilhadas em preto são os limiares da eletropora¸cão (|Vpp| = 200 mV).

Pode-se perceber que, para potenciais elétricos até 1000 V, os resultados apresentam-se semelhantes. Para potenciais elétricos supe-riores, as diferen¸cas come¸cam a aumentar. Este comportamento ocorre devido à atua¸cão do modelo matemático empregado. Ressalta-se que, no modelo definido por Zudans et al. (2007), a condutividade da mem-brana é uma constante, o que faz um acréscimo linear na tensão trans-membrana (Vm) diretamente proporcional ao potencial elétrico

apli-cado.

Na Figura 13a tem-se o potencial transmembrana para diferentes distâncias de aplica¸cão do potencial elétrico (500 V). Segundo a litera-tura (WEAVER; CHIZMADZHEV, 1996), quando Vm> 1, 0 V, a

eletropo-ra¸cão entra na sua fase irrevers´ıvel (IRE). Ou seja, para d ≤ 2, 0 µm. Um fator importante para a eficiência de eletropora¸cão é a viabilidade celular. Este parâmetro é associado com uma fra¸cão da área eletropo-rada (AGARWAL et al., 2007). Na suspensão de células, a viabilidade celular está relacionada com a amplitude do pulso (KOTNIK; PUCIHAR;

(62)

a viabilidade quando se utilizam capilares estirados. O campo elétrico aplicado não é uniforme e o potencial transmembrana sem a eletropo-ra¸cão não é válido através da Equa¸cão 2.4.

No contexto da eletropora¸cão, a viabilidade está relacionada com os efluxos de ´ıons da célula. Este desequil´ıbrio iônico pode levar à morte da célula (HABERL et al., 2013). Na Figura 14a, com a eleva¸cão do po-tencial elétrico aplicado (4 kV), tem-se a presen¸ca da eletropora¸cão em todas as distâncias simuladas. Nos primeiros 22° da membrana, em re-la¸cão ao eixo z, ocorrem aberturas de poros do meio extracelular para o intracelular. Após os 22°, em referência ao eixo z, tem-se o processo inverso. Na prática tem-se um desequil´ıbrio iônico, devido a intensi-dade do campo elétrico local. Previamente mencionado, tal fenômeno é conhecido como eletropora¸cão irrevers´ıvel. Uma aplica¸cão prática onde se busca esse procedimento é a elimina¸cão de microrganismos em medicamentos l´ıquidos (GOLBERG; BELKIN; RUBINSKY, 2009).

As Figuras 13b e 14b mostram a condutividade da membrana ce-lular para diferentes distâncias de aplica¸cão do potencial elétrico (500 V e 4 kV, respectivamente). As faixas de valores encontrados estão em conformidade com alguns trabalhos experimentais e teóricos localiza-dos na literatura. Schmeer et al. (2004), Suzuki et al. (2011) apresen-taram valores de ≈ 10−4S/m. No entanto, Hibino, Itoh e Kinosita Jr (1993) apresentaram valores estimados na faixa de 1, 0 × 10−4S/m até 5, 0 × 10−4S/m. Pavlin e Miklavˇciˇc (2003), Pavlin et al. (2005) revelaram estudos teóricos da condutividade efetiva de uma suspen-são de células, usando σm = 4, 0 × 10−4S/m. Kinosita Jr e Tsong

(1977, 1979) apresentaram valores de eritr´ocitos de σm= 5, 0 × 10−4 `a

5, 0 × 10−3S/m.

Nossos resultados assemelham-se também com a condutância da membrana (Gm =σm/δm) (ARNOLD et al., 1987), indicando que o mo-delo da eletropora¸cão e a implementa¸cão geométrica estão em confor-midade com esses estudos (NEU; KRASSOWSKA, 1999;SCHMEER et al., 2004). Neste trabalho, a condutância da membrana intacta é omitida.