EFETIVIDADE DO LASER DE ARSENETO DE GÁLIO E ALUMÍNIO NO REPARO ÓSSEO

EFETIVIDADE DO LASER DE ARSENETO DE GÁLIO E ALUMÍNIO NO REPARO

ÓSSEO

Gyll Rosymberg Brito Coutinho

, Bruna Lorena Soares Cavalcante

, Izabelle Macedo

de Sousa

,

Vinicius Oliveira da Silva

, Maria do Carmo de Carvalho e Martins

, Jean

Douglas Moura dos Santos

, Saulo Araújo de Carvalho

1,5,6,7 _{Centro Universitário UNINOVAFAPI, Rua Vitorino Orthiges Fernandes, 6123 – Uruguai, Teresina–PI,} saulofisio2@hotmail.com

2,3,4,6,7 _{Universidade Estadual do Piauí/Centro de Ciências da Saúde, Rua Olavo Bilac, 2335 – Centro, CEP} 65001-280, Teresina–PI, brunalorenasc@hotmail.com, izabelle_macedo@hotmail.com,

viniciusoliveira.fisio@gmail.com 7

Universidade do Vale do Vale do Paraíba (UNIVAP), Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), Doutorado em Engenharia Biomédica. Av.Shishima Hifumi, 2911,

12244-000 Urbanova São José dos Campos – São Paulo, saulofisio2@hotmail.com

Resumo- O conhecimento de métodos que estimulem a consolidação óssea vem adquirindo considerável

importância atualmente. Dentre eles, estudos experimentais com laserterapia mostraram-se promissores. Objetivou-se avaliar o efeito de diferentes doses de Laser de baixa potência (LBP) sobre o processo de consolidação óssea em rattus norvegicus. Utilizaram-se 45 ratos da espécie rattus norvegicus, divididos em quatro grupos, um controle e três terapêuticos (4J, 6J, 10J) com aplicação de LBP em lesões nas tíbias esquerdas. Após o sacrifício, analisaram-se as dosagens bioquímicas de cálcio, fósforo, fosfatase alcalina e a densidade mineral óssea média. Quanto aos níveis séricos de fósforo, observou-se maior concentração nos grupos terapêuticos. Verificaram-se resultados distintos entre os grupos de animais irradiados, sendo encontrada maior concentração de fosfatase alcalina no de 6J, e conforme a medição da densidade mineral óssea, o de 4J apresentou maior valor, e o de 10J, o menor. Conclui-se que o laser favorece a remodelação óssea, porém conforme a análise radiográfica, os melhores resultados foram obtidos com dosagem de 4J, apesar da análise bioquímica, evidenciar altos níveis de fosfatase alcalina sérica no grupo de 6J.

Palavras-chave: Laser, Consolidação Óssea, Arseneto de Gálio e alumínio, Marcadores Bioquímicos. Área do Conhecimento: Ciências da Saúde/ Fisioterapia e Terapia Ocupacional.

Introdução

O estudo experimental em ratos é uma alternativa valiosa para se estudar a influência de fatores físicos, químicos e biológicos no processo de consolidação óssea, pois apresenta alta reprodutibilidade e a padronização da fratura resulta em soluções de continuidade bastante homogêneas (CASTRO et al., 2005).

Hoppenfeld e Murthy (2001) consideraram o processo de consolidação em três estágios, sendo o primeiro estágio a fase inflamatória, caracterizada pelo debridamento ósseo, reação inflamatória e atividade osteoclástica, liberação de fatores de crescimento e quimiotaxia dos vasos sanguíneos e células ósseas. O segundo estágio, denominado de fase reparativa, na qual ocorre diferenciação das células mesenquimatosas pluripotenciais, o hematoma é invadido por condroblastos e fibroblastos que começam a depositar a matriz para o calo, inicialmente denominado calo mole, composto principalmente

por tecido fibroso e cartilagem com pequena quantidade de osso. Nesta fase, radiograficamente, a linha de fratura começa a desaparecer. O terceiro estágio, fase de remodelagem, leva meses a anos para completar-se, com grande atividade osteoblástica e osteoclástica que resultam na substituição do osso reticulado desorganizado e imaturo por osso lamelar, organizado e maduro, o que aumenta ainda mais a estabilidade do local fraturado.

Nos traumatismos do sistema musculoesquelético a dor é um fator sempre presente e para saná-la são usadas diversas medidas, variando desde a imobilização ao uso de medicação analgésica. As modalidades de tratamento fisioterapêutico são frequentemente utilizadas em seguida a uma fratura, objetivando reduzir a dor e o desconforto. A grande maioria das modalidades, tais como calor e frio, hidroterapia, fluidoterapia e estimulação elétrica, tem um efeito biológico previsível quando aplicadas com sapiência (CASTRO et al., 2005).

Estudo realizado por Liu et al. ( 2007) com osteotomias transversas de tíbias em coelhos evidenciou por meio de análise histológica e radiológica ligeiro estímulo no periósteo e no endósteo e aumento no tamanho do calo ósseo no grupo irradiado com luz laser na dose de 40J. Enquanto a pesquisa de Cerqueira et al. (2007) com irradiação laser de GaAlAs cujo comprimento de onda foi de 830nm, observou-se maior distribuição de trabéculas ósseas mineralizadas em mandíbulas de ovelhas irradiadas com laser que nos animais não irradiados. Destaca-se que no citado trabalho foi usado um distrator ósseo, onde o laser teve maior atuação no período de contenção que no de ativação.

Este trabalho tem como objetivos verificar o efeito de diferentes doses de Laser de baixa potência (LBP) sobre o processo de consolidação óssea em ratos, identificar mudanças histológicas induzidas pela irradiação do LBP sobre o processo de consolidação óssea em ratos, identificar alterações macroscópicas no calo ósseo e comparar radiologicamente as diferenças encontradas nas fraturas em animais submetidos às várias doses e entre animais não irradiados.

Metodologia

O projeto foi, previamente ao início dos experimentos, submetido ao Comitê de ética em Pesquisa do Centro Universitário UNINOVAFAPI, onde obteve parecer favorável à realização do mesmo (processo de número 0016/09). Com base no parecer do CEP, datado de 04 de setembro de 2009, o projeto atendeu ao disposto na Lei 11.794/2008 e aos princípios éticos de experimentação animal preconizado pelo CONCEA. Todos os procedimentos relacionados ao uso de animais como modelo experimental foram realizados segundo as normas preconizadas no “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (Institute of Laboratory Animals Resources, National Academy of Science, Washington, D.C., 1996), pelos Princípios Éticos estabelecidos pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA (2009) e pela legislação nacional para vivissecção animal em vigor (Lei federal 6.638 de 08 de maio de 1979).

Foram utilizados 45 ratos albinos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus), machos, com idade média de 3 meses e massa corporal de 250 a 300 g, provenientes da colônia do Biotério do Centro Universitário UNINOVAFAPI. A amostra foi por conveniência, utilizando o número mínimo de animais necessários para obtenção de resultados válidos, conforme orientações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal em seu

artigo IV dos Princípios Éticos de Experimentação Animal. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas (5 animais/caixa) com dieta de manutenção (Labina® - Purina) e água ad libitum, em sala climatizada com temperatura ambiente de 25º C e fotoperíodo de 12 horas de claro e 12 horas de escuro.

Foram divididos em quatro grupos dispostos da seguinte forma: A (10 animais) – fratura e aplicação de laser de 4J; B (10 animais) – fratura e laser de 6J; C (10 animais) – fratura e laser de 10J; D, Controle (15 animais) – fratura de tíbia esquerda e aplicação de laser desligado (placebo). Após período de aclimatação de duas semanas os animais foram anestesiados por via intraperitoneal com solução composta por quetamina na dose de 40mg/kg e de xilazina na dose de 5mg/kg de peso corporal, e foram produzidas as fraturas utilizando broca dentária de 4mm por um único pesquisador. Para isso inicialmente foi realizada incisão longitudinal com lâmina de bisturi Nº 24 e cabo Nº 4 e posterior solução de continuidade no terço médio da tíbia esquerda (junção do 1/3 médio com o 1/3 distal), realizada através de broca dentária de 0,4mm. Após realização de fratura, ainda com o animal anestesiado, foi administrado Pencivet® ppu 0,1 mL/100g por via intramuscular, e o animal foi acondicionado em caixa apropriada, isolado dos demais, até a sua recuperação completa da anestesia, quando então foi devolvido à sua gaiola no biotério.

Um dia após a realização das fraturas, realizou-se o início o tratamento. A aplicação de luz larealizou-ser pontual foi realizada em um único ponto, no terço médio da incisão, onde foi feita a perfuração com a broca. Os animais foram submetidos ao tratamento uma vez ao dia, cinco vezes na semana, durante quatro semanas.

Para a irradiação laser utilizou-se o equipamento Ibramed modelo Laserpulse, que utiliza como meio de laser Arseneto de Gálio e Alumínio (GaAlAs) com comprimento de onda de 830 nm.

Ao final do período experimental, para realização do sacrifício, os animais de todos os grupos foram anestesiados com doses excessivas de tiopental sódico 100 mg/kg por via intraperitoneal. Imediatamente após a indução de anestesia foi realizada laparotomia ampla seguida de pneumotórax. Em seguida, foi realizada a retirada da tíbia fraturada para a análise histológica, bem como coleta de sangue da veia cava caudal para dosagens bioquímicas.

As dosagens de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina séricos foram realizadas utilizando reagentes Labtest e Dolles, por método colorimétrico seguindo instruções do fabricante.

Durante o processamento do sangue na centrífuga ocorreu a hemólise do sangue de um animal do grupo B contido em um dos tubos de ensaio, tornado a amostra inútil para as dosagens bioquímicas.

A análise radiográfica das tíbias esquerdas foi realizada utilizando aparelho marca Dabi Atlante, modelo Spectro 70X, com incidência ântero-posterior e tempo de exposição aos feixes de raios-X de 3 segundos. As imagens foram scaneadas com scanner específico para imagens radiográficas e calculada a densidade média da área lesada por meio do software Digora for Windows delimitando-se para a análise um quadrado com tamanho de 10x10 pixels.

Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), e analisados por teste t pareado para comparar as diferenças dentro dos grupos, ANOVA seguida de pós-teste de Tukey para comparação entre grupos. O nível de significância estabelecido foi de p<0,05.

Resultados

O tratamento com laser de arseneto de gálio e alumínio durante quatro semanas não produziu alterações nos níveis séricos de cálcio nos grupos irradiados em relação ao controle (Tabela 1). Tabela 1 – Níveis séricos de cálcio em ratos com lesão óssea na tíbia esquerda e submetidos à quatro semanas de tratamento com laser de arseneto de gálio e alumínio nas doses de 4, 6 e 10J. Teresina (PI), 2009.

Grupo Média ± EPM

Controle (n=15) 4 joules (n=10) 6 Joules (n=9) 10 Joules (n=10) 6,73 ± 1,17 9,37 ± 1,11 7,68 ± 0,42 7,41 ± 0,66 *p<0,05 em relação ao grupo controle.

Por outro lado, os níveis séricos de fósforo foram significativamente maiores nos grupos irradiados em relação ao não irradiado (p<0,05), mas não entre os grupos irradiados (Tabela 2). Tabela 2 - Níveis séricos de fósforo em ratos com lesão óssea na tíbia esquerda e submetidos à quatro semanas de tratamento com laser de arseneto de gálio e alumínio nas doses de 4, 6 e10J. Teresina (PI), 2009.

Grupo Média ± EPM

Controle (n=15) 4 joules (n=10) 6 Joules (n=9) 10 Joules (n=10) 5,468 ± 0,368 8,709 ± 0,407ª 7,772 ± 0,390ª 7,533 ± 0,684ª

ªp<0,05 em relação ao grupo controle (não irradiado).

Quanto aos efeitos da irradiação com laser sobre os níveis séricos de fosfatase alcalina, observou-se que o grupo irradiado com 6J apresentou níveis significativamente maiores (p<0,0001) em comparação com o grupo controle e com os demais grupos irradiados (Tabela 3). A análise da densidade mineral óssea das áreas lesadas mostrou que apesar de todos os grupos irradiados com laser terem resultados significativamente maiores de densidade que o grupo controle, o grupo de 4J teve melhores resultados que os outros e o grupo irradiado com 6J obteve resultados significativamente superiores aos de 10J.

Tabela 3 – Níveis séricos de fosfatase alcalina em ratos com lesão óssea na tíbia esquerda e submetidos a quatro semanas de tratamento com laser de arseneto de gálio e alumínio nas doses de 4, 6 e 10J. Teresina (PI), 2009.

Grupo Média ± EPM

Controle (n=15) 4 joules (n=10) 6 Joules (n=9) 10 Joules (n=10) 42,84 ± 3,339 4,407± 0,864b 206,6 ± 35,17ª 2,837± 0,526b ap<0,0001 em relação ao grupo controle (não irradiado). bp<0,0001 em relação ao grupo irradiado com laser de 6J.

A análise radiográfica mostrou, por meio da densidade mineral média da área lesada, maior densidade mineral no calo ósseo nos grupos irradiados com luz LBP. Dentre os grupos irradiados com LBP o que mostrou maior densidade foi o de 4J, onde 70% dos animais apresentavam maior densidade. O grupo irradiado com 6J mostrou maior densidade que irradiado com 10J, sendo a diferença observada estatisticamente significativa (Tabela 4).

Tabela 4 – Densidade média em área de falha óssea na tíbia esquerda de ratos submetidos a quatro semanas de tratamento com laser de arseneto de gálio e alumínio nas doses de 4, 6 e 10J. Teresina (PI), 2009.

Grupo Média ± EPM

Controle (n=15) 4 joules (n=10) 6 Joules (n=9) 10 Joules (n=10) 42,88 ± 0,81 66,07 ± 2,24a 56,33 ± 1,43b 48,72 ± 1,23b ap<0,0001 em relação ao grupo controle (não irradiado) bp<0,001 em relação ao grupo controle (não irradiado)

Discussão

Para se medir os resultados da irradiação laser no metabolismo ósseo foram utilizados marcadores bioquímicos, visto que estes são substâncias que retratam a formação ou absorção óssea. Dentre os marcadores de absorção óssea os principais são a fosfatase alcalina total, fosfatase alcalina óssea, osteocalcina e pró-peptídeo do colágeno tipo I (SARAIVA e CASTRO, 2002).

No presente estudo, os níveis séricos de cálcio avaliados nos grupos irradiados com laser de arseneto de gálio e alumínio não foram diferentes daqueles encontrados nos animais controle, enquanto os níveis séricos de fósforo foram maiores nos grupos irradiados quando comparados com o grupo controle. A formação do osso ocorre quando os osteoblastos depositam o osteóide, o qual mais tarde é mineralizado ao longo da frente de calcificação. Para ocorrer uma mineralização satisfatória é necessário uma concentração adequada de íons cálcio e fosfato, a presença de uma matriz calcificável, um agente nucleador e um controle por reguladores promotores e inibidores. A deposição está associada a vesículas envoltas por uma membrana que deriva da membrana plasmática dos osteoblastos (BROWNER, 2000).

Segundo Ross (1993), as vesículas da matriz localizadas a alguma distância das células onde deve ocorrer a mineralização rompem-se e provocam um aumento na concentração local de mineral capaz de iniciar o processo.

Young e Heath (2000) afirmam que o osso existe em duas formas principais, o osso entrelaçado e o osso lamelar, sendo o primeiro uma forma imatura com fibras colágenas dispostas de forma desorganizada no osteóide. Já o segundo é composto por faixas irregulares paralelas de colágeno dispostas em lâminas. O osso entrelaçado é o primeiro a ser formado durante o reparo de fraturas, pois é formado de maneira mais rápida; depois é remodelado e transformado em osso lamelar o qual é fisicamente mais forte e mais elástico. Logo após a fratura acontecer, no local começa-se a formar um coágulo sanguíneo que posteriormente será substituído por tecido colágeno altamente vascularizado (tecido de granulação) que progressivamente tornar-se-á mais fibroso. Ocorre então diferenciação de células mesenquimais em condroblastos que vão substituir o tecido de granulação por cartilagem hialina, formando assim o calo provisório, que posteriormente é fortalecido pela deposição de sais de cálcio na matriz cartilagínea. Ao mesmo tempo em que isso acontece células osteoprogenitoras no endósteo e

periósteo são ativadas e depositam uma rede de osso entrelaçado dentro e em volta do calo provisório. O calo provisório então cede lugar ao calo ósseo. Quando o osso entrelaçado une completamente o sítio de fratura, a união óssea é feita. O calo ósseo em seguida é remodelado para formar osso lamelar maduro, graças a influência das forças funcionais.

Uma das razões que poderia justificar a ausência de alteração dos níveis séricos de cálcio neste estudo seria o fato de que o cálcio possui um mecanismo de regulação fisiológica que estreita os limites do seu nível plasmático, não permitindo variações além de 2,4 mol/L, onde qualquer tendência de alteração da concentração plasmática deste íon é corrigida dentro de minutos a horas, em grande parte pela ação do paratormônio, de modo que os níveis séricos de cálcio e fósforo devem ser avaliados conjuntamente visto que as concentrações de um influenciam diretamente as do outro (GUYTON, 2002).

Embora a elevação dos níveis de fósforo nos animais dos grupos irradiados sugira que o processo de consolidação óssea encontrava-se em andamento de forma mais acentuada que nos animais controle, a alteração em um marcador bioquímico isolado deve ser interpretada com cautela, uma vez que este marcador não se constitui em padrão ouro para análise do processo de formação óssea.

Um dos marcadores bioquímicos de remodelação óssea mais usados atualmente é a fosfatase alcalina, cuja atividade depende da atividade dos osteoblastos, normalmente mensurada na forma de fosfatase alcalina total, a qual corresponde a soma de suas diversas isoformas. A fase da formação óssea onde a fosfatase alcalina é mais produzida é a de formação de matriz colágena, ou seja, antes da mineralização (CASTRO et al., 2005, SARAIVA e CASTRO, 2002; MATOS e SANTANA, 1996; SANTANA et al., 2009; VIEIRA, 1999).

Os resultados aqui obtidos demonstrando maior atividade de fosfatase alcalina no grupo irradiado com laser 6J sugerem maior efetividade do laser de arseneto de gálio e a alumínio no reparo ósseo nesta dose.

No estudo de Barushka, Yaakoby e Uron (1995) foi avaliado o efeito da irradiação laser no reparo ósseo em ratos que tiveram suas tíbias perfuradas com broca odontológica e submetidos posteriormente à incidência de luz de um laser de hélio-neônio de 3J, sendo observados no sexto dia maiores picos de fosfatase alcalina, acúmulo crescente de cálcio e maior preenchimento do canal intramedular com osso entrelaçado, progredindo daí para ossificação membranosa na

zona cortical. Além disso, observaram um incremento de cálcio até o décimo primeiro dia e que o menor pico de massa óssea ocorria no décimo segundo dia demonstrando, desta forma, que apesar da diminuição dos níveis de fosfatase alcalina sérica, o reparo ósseo progredia em suas fases, ressaltando ainda mais o papel da fosfatase alcalina na fase de deposição de matriz colágena, mesmo porque o trabalho também evidenciou um rápido acúmulo de osso neoformado e eficiente atividade osteoclástica na remodelação óssea da zona cortical durante a formação de osso compacto maduro, e ainda que o laser pode ter interferido não só nas células ósseas, osteoblastos e osteoclastos como também na formação de novos vasos sanguíneos, auxiliando assim de forma mais ampla o reparo tecidual.

Existem estudos que evidenciam diminuição do tempo de consolidação e melhor arranjo estrutural no calo ósseo provocados pelo laser, como o trabalho realizado por Cerqueira et al. (2007) mostrando resultados significativamente positivos com a dose de 4J em ovelhas submetidas a distração osteogênica, e por Liu et al. (2007) utilizando a dose de 10J em ratos. Enquanto em outros, tais resultados não foram vistos. Riso (2008), em estudo com laser de GaAlAs com comprimento de onda de 830 nm na dose de 4J em 30 ratos suspensos pela cauda durante todo o período de experimentação (15 dias), não observou resultados que mostrassem eficácia na terapia laser nos animais estudados.

As interações e efeitos da irradiação laser à nível intracelular são de fundamental importância para o processo de consolidação óssea. Desta forma, em estudo feito por Oliveira et al. (2008) avaliando o efeito da biomodulação usando laser de GaAIAs com comprimento de onda de 830nm e potência de 3J em células osteoblásticas foi observado intenso agrupamento de mitocôndrias em região perinuclear, o que sugere um possível estímulo à divisão celular, além de provocar alterações no formato da mitocôndria de filamentoso para granular.

Stein et al. (2005), através de cultura in vitro, mostraram a importância do LBE na proliferação e diferenciação de células osteoblásticas, demonstrando um incremento de 31 a 58% na contagem celular nas placas onde foi feito o uso do laser de hélio-neônio com comprimento de onda de 632 nm, provavelmente relacionado com efeito do laser na atividade mitogênica via indução do ciclo celular.

Em estudo realizado por Otremski et al. (2004) com pintos machos irradiados com laser de Hélio-Neônio (He-Ne) nas doses de 0,7, 1,5 e 3 J/cm2 não foi observada diferença significativa na análise radiológica em relação ao grupo controle, mas

houve pequeno retardo no reparo ósseo neste grupo, identificado pela análise histológica. Portanto, a literatura sustenta a hipótese de que com diferentes doses de laser obtém-se diferentes resultados no tempo de consolidação óssea, assim como proposto nesta pesquisa.

No presente estudo, a análise radiográfica utilizando o software Digora para medição da densidade mineral óssea, mostrou que a densidade mineral óssea na área lesada pela broca era maior nos animais irradiados com laser, evidenciando assim melhor consolidação nos grupo irradiado com laser. Dentre os grupos irradiados o que mostrou melhores resultados foi o de 4J, pois apresentou os maiores valores de densidade mineral média na área do calo ósseo; e o de 6J mostrou-se superior ao de 10J, por apresentar valores de densidade mineral média em área lesada maior que o grupo de 10J.

Renno et al. (2005) demonstraram que o uso do laser no comprimento de onda de 830 na dose de 10 J estimula proliferação osteoblástica, mas não a proliferação de células do osteossarcoma, enquanto o laser de 780 nm nas doses de 1, 5 e 10J provoca um decréscimo na proliferação de células osteoblásticas e um incremento no número de células do osteossarcoma, e que o laser no comprimento de onda de 670 nm nas doses 1, 5 e 10 J não provocou alteração na proliferação osteoblástica, embora na dose 5J provoque aumento na proliferação de células do osteossarcoma.

Conclusão

No presente estudo, conforme a análise dos resultados obtidos, por avaliação radiográfica, sugere-se que a irradiação com laser nas diferentes doses utilizadas favorece o processo de remodelação óssea, sendo encontrada melhor resposta no grupo de 4J, justificado pelo maior valor observado quando comparado com os outros grupos terapêuticos. Por outro lado, a análise bioquímica evidenciou aumento nos níveis séricos da fosfatase alcalina apenas no grupo irradiado com 6J. Logo, levando-se em consideração que os níveis séricos de fosfatase alcalina total sofrem influências de outros processos, além do metabolismo ósseo, e que está presente principalmente na primeira fase da consolidação óssea, os resultados levam a crer que a dose de 4J apresentou melhor efeito no reparo ósseo que as outras.

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