VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO, USANDO ETILENOGLICOL E SACAROSE

1 Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução - Faculdade de Veterinária 2 Laboratório de Biotecnologia Animal Aplicada - Centro de Biotecnologia

3 Departamento de Ciências Morfológicas - ICBS

Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Porto Alegre/RS, Brasil

VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS

IN VITRO, USANDO ETILENOGLICOL E SACAROSE

(VITRIFICATION OF IVMFC-DERIVED BOVINE EMBRYOS USING

ETHYLENE GLYCOL AND SUCROSE)

A.T.D. OLIVEIRA

_{, F. FORELL}

_{, C.M.O. MEDEIROS}

_,

R.F.F. LOPES

_{E J.L. RODRIGUES}

RESUMO

Apesar do conhecimento adquirido e das metodologias desenvolvidas ao longo dos últimos 30 anos de pesquisa na criobiologia, ainda continua sendo um desafio garantir a sobrevivência após a criopreservação dos embriões cultivados in

vitro em níveis similares aos obtidos com os produzidos in vivo. Dois experimentos foram conduzidos para comparar a

capacidade de soluções de desidratação e vitrificação compostas por etilenoglicol (EG) e sacarose (sac) em manter a viabilidade, após a criopreservação, de embriões bovinos produzidos in vitro. Blastocistos e blastocistos expandidos obtidos no sétimo (D7) e oitavo (D8) dias de cultivo foram divididos em 4 grupos, cada qual com uma solução de desidra-tação composta apenas por 3,6 M de EG ou acrescido de sacarose (0,1 M, 0,25 M ou 0,5 M). A desidradesidra-tação foi realizada na temperatura ambiente e, em seguida, todos os embriões foram submetidos à mesma solução de vitrificação (7,2 M de EG) e imersos em N₂ líquido. Após o reaquecimento e a diluição do crioprotetor, os embriões foram co-cultivados com células do

cumulus oophorus em TCM 199 acrescido de 10% de soro de vaca em estro. A avaliação das taxas de reexpansão e eclosão

foi realizada 72 horas após o início do cultivo in vitro. O acréscimo de sacarose na solução de desidratação não melhorou as taxas de reexpansão e de eclosão in vitro, tanto nos embriões D7 quanto nos D8, com exceção do grupo com 3,6 M EG + 0,5 M de sac, no qual a taxa de reexpansão foi superior aos demais grupos (p=0,0328). No segundo experimento, os embriões foram desidratados em 3,6 M de EG + 0,5 M sac e divididos em 4 grupos, de acordo com a solução de vitrificação empregada: apenas 7,2 M de EG ou acrescido de 0,25 M, 0,5 M ou 1,0 M de sac). Os blastocistos e blastocistos expandidos D7 que foram tratados com soluções de vitrificação contendo sacarose alcançaram taxas de reexpansão (p=0,0044) e eclosão (p=0,0001) estatisticamente superiores ao grupo vitrificado apenas usando 7,2 M de EG. Nos embriões D8, a vitrificação com 7,2 M de EG acrescido de 0,5 e 1,0 M de sac proporcionou taxas de eclosão superiores (p=0,0164) aos grupos sem ou com 0,1 M de sacarose. As taxas de reexpansão nos grupos com sacarose no meio de vitrificação (p=0,0179) foram superiores à obtida no grupo apenas com EG. Os resultados obtidos em ambos os experimentos indicam que soluções compostas por 7,2 M de EG suplementadas com sacarose, principalmente nas concentrações de 0,5 e 1,0 M, podem ser utilizadas com sucesso para vitrificar embriões bovinos produzidos in vitro.

PALAVRAS-CHAVE: Vitrificação. Etilenoglicol. Sacarose. Criopreservação. Embrião.

SUMMARY

Although of the knowledge acquired and techniques developed in the last 30 years of research in the cryobiology, still remain the challenge of support survival of IVMFC-derived bovine embryos after cryopreservation in the same level of the in vivo produced. Two experiments were designed to compare the survival of IVMFC-derived bovine embryos after cryopreservation using vitrification solution composed by ethylene glycol (EG) supplemented or not with sucrose (suc). First, D7 and D8 blastocysts and expanded blastocysts were divided in 4 groups. Each group was dehydrated with a

different solution, composed only with EG or supplemented with suc (0.1 M, 0.25 M or 0.5M). The dehydratation step was performed at room temperature and the embryos were vitrified in 7.2 M EG in PBS + 0.4% BSA and immersed in liquid nitrogen. After thawing and cryoprotectant dilution procedures, embryos were co-cultured with cumulus oophorus cells monolayer in TCM 199 supplemented with 10% of estrous cow serum, and their viability or hatching was recorded by re-expansion or hatching of the vitrified-warmed embryos at 72 hours. The re-re-expansion and hatching rates in the groups of D7 and D8 embryos dehydrated with EG and sucrose was not significantly different than only with EG. Except the re-expansion rates of D8 embryos dehydrated with 3.6 M EG + 0.5 M suc that was significantly higher than another groups (p=0.0328). In the second experiment, the embryos were dehydrated in 3.6 M EG + 0.5 M suc and divided in 4 groups with different vitrification solutions. The solutions were composed only by ethylene glycol or supplemented with sucrose (0.25 M, 0.5 M or 1.0 M). The re-expansion and hatching rates of D7 embryos exposed to vitrification solutions supplemented with sucrose were significantly higher than the embryos vitrified only with EG (re-expansion: p=0.0044; hatching: p=0.0001). In the D8 embryos, the hatching rates were significantly higher (p=0.0164) in the groups vitrified with 0.5 M or 1.0 M of sucrose than in the embryos vitrified without or with 0.1 M of sucrose in the vitrification solution. The re-expansion rates were signifi-cantly higher in the groups vitrified with ethylene glycol and sucrose than only with ethylene glycol (p=0.0179). The results obtained in both experiments support the conclusion that solutions with 7.2 M of ethylene glycol supplemented with sucrose are useful, mainly in 0.5 or 1.0 M, to vitrify IVMFC-derived bovine embryos.

KEY-WORDS: Cryopreservation. Vitrification. Sucrose. Ethylene glycol. Embryo.

INTRODUÇÃO

A criopreservação de genomas, principalmente em oócitos e embriões mamíferos nas fases de pré-implantação, vem sendo motivo de interesse da criobiologia nos últimos 30 anos. Desde o início, experimentos têm sido realizados para viabilizar curvas de resfriamento e de reaquecimento que permitam a sobrevivência embrionária e, ao mesmo tempo, preservem os princípios da praticidade, da simplicidade e da eficácia (Bertolini, 1994).

O domínio da criopreservação de embriões bovi-nos derivados das etapas de maturação, fecundação e cultivo in vitro é um passo decisivo no sucesso da manu-tenção e da difusão dos genomas produzidos, bem como na completa utilização dessa biotécnica nas estratégias de acasalamento e melhoramento animal. Entretanto, o des-conhecimento das reais necessidades metabólicas e a con-seqüente inadequação dos meios de cultivo propostos produzem alterações nas características morfológicas e bioquímicas dos embriões (Loskutoff et al., 1993; Avery & Greve, 1995). Embriões produzidos in vitro ou pré-expos-tos a condições de cultivo in vitro são mais sensiveis às lesões provocadas pela criopreservação. Essa sensibili-dade é afetada pela qualisensibili-dade embrionária e reflete-se bioquímicamente (Khurana & Niemann, 2000). A redução na atividade metabólica e na sobrevivência à criopreservação indicam a baixa tolerância dos embriões produzidos in vitro quando são submetidos a procedimentos de criopreservação (Leibo & Loskutoff, 1993; Niemann, 1995; Pollard & Leibo, 1993; Pollard & Leibo, 1994 e Agca et al., 1998). Esses obstáculos ainda não tornaram possível o desenvolvimento e a consolidação de

uma metodologia de criopreservação capaz de propiciar a sobrevivência in vitro e in vivo desses embriões em níveis satisfatórios.

A vitrificação tem sido proposta como a maneira mais adequada para proteger os embriões produzidos in

vitro das injúrias causadas pelos processos de

resfriamento/reaquecimento (Leibo & Loskutoff, 1993; Niemann, 1995). Entretanto, as taxas de sobrevivência embrionária obtidas com essa metodologia, ainda estão abaixo do desejado. Os esforços para aumentar a eficiên-cia do processo de vitrificação têm como um dos objetivos a identificação da composição ideal para a solução de vitrificação (Kuleshova et al., 1999). Os crioprotetores mais comumente usados em soluções crioprotetoras, incluem agentes como o DMSO, o etilenoglicol, o 1,2-propanediol e o glicerol (Turner et al., 2001). Esses agentes têm sido testados sozinhos ou em combinações para a vitrificação de embriões em várias espécies (Kuleshova et al., 1999). Todavia, apesar de ser um fraco formador de estado vítreo, o etilenoglicol tem sido o mais largamente utilizado em virtude da sua menor toxicidade (Miyamoto & Ishibashi, 1978; Kasai et al., 1990; Songsasen et al., 1995 e Sommerfeld & Niemann, 1999) e da sua penetração mais rápida nos embriões do que o glicerol e o 1,2-propanediol (Szell et al., 1989; Songsasen et al., 1995).

A escolha do crioprotetor mais adequado depende de vários fatores; um dos mais importantes é a toxicidade à célula criopreservada (Palasz et al., 2000). A adição de açúcares permite o uso de agentes permeáveis nas meno-res concentrações possíveis na solução de vitrificação, minimizando lesões advindas da toxicidade do agente crioprotetor permeável (Shaw et al., 1997). Os efeitos

be-néficos dos açúcares nas soluções de vitrificação têm sido mostrados (Tada et al., 1993; Saito et al., 1994 e Saha et al., 1996), porém ainda não está completamente claro qual o modo de ação dessas substâncias. Acredita-se que a associação de açúcares e crioprotetores penetrantes auxi-lia na desidratação de embriões pela estabilização da mem-brana plasmática das células criopreservadas (Anchordoguy et al., 1987; Kuleshova et al., 1999; Turner

et al., 2001). Um outro efeito decorrente da adição de

sacarose na solução de vitrificação é o aumento da proba-bilidade de formação do estado vítreo, o que elimina ou reduz a formação de cristais de gelo durante o resfriamento e reaquecimento do sistema (Rall, 1987; Arav, 1992).

Os experimentos realizados foram propostos com o objetivo de determinar as taxas de sobrevivência embrio-nária (reexpansão e eclosão) de embriões bovinos produ-zidos in vitro e expostos a soluções de desidratação e de vitrificação que contenham etileno glicol e sacarose.

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes e Meios

Solução salina tamponada de fosfato (D-PBS) e albumina sérica bovina (BSA) foram adquiridos do labora-tório Gibco (New York, EUA). Piruvato de sódio e etileno glicol foram adquiridos do Laboratório Merck (Darmstadt, Alemanha). O hormônio folículo estimulante (FSH) foi ob-tido da Vetrepharm Inc. (Folltropin®, Ontario, Canadá), enquanto a gonadotrofina coriônica humana (HCG) do la-boratório Organon (Profasi®, São Paulo, Brasil). A sacarose foi adquirida do laboratório Synth (Diadema, Brasil). To-dos os demais reagentes utilizaTo-dos nos experimentos fo-ram adquiridos da Sigma Chemical Company (St. Louis, EUA), sendo testados em cultivo celular pelo fornecedor. O meio utilizado na maturação in vitro (MIV) foi o TCM 199 acrescido de 10% de soro de vaca em estro (v/v), 0,22 mg/mL de piruvato de sódio, 0,5 mg/mL de sulfato de gentamicina, 2,2 mg/mL de bicarbonato de sódio, 1 µg/mL de 17 ß-estradiol, 0,5 µg/mL de FSH e 0,03 UI/mL de HCG. O meio para a fecundação in vitro (FIV) foi o TALP suplementado com 6 mg/mL de BSA, 0,11 mg/mL de piruvato de sódio, 5,6 µg/mL de heparina, 1,09 µg/mL de hipotaurina e 0,018 µg/mL de epinefrina. A composição do meio TALP foi descrita por Parrish et al. (1985).

O meio de cultivo foi o TCM 199 acrescido de 10% de soro de vaca em estro (v/v), 0,22 mg/mL de piruvato de sódio, 0,5 mg/mL de sulfato de gentamicina, 2,2 mg/mL de bicarbonato de sódio. O co-cultivo com células do cumulus

oophorus foi empregado no cultivo dos embriões

utiliza-dos nos experimentos.

Ovários

Ovários de fêmeas bovinas foram obtidos em abatedouro e transportados até o laboratório em solução de D-PBS acrescida de antibióticos a 27±6ºC por um perío-do de 2 a 8 horas. Os Complexos cumulus-oócito (CCOs) foram obtidos através da escarificação do córtex ovariano com um aparelho provido de lâminas paralelas. Com o au-xílio de uma lupa estereomicroscópica (Meiji®, MF-90) com luz transmitida e magnitude de 10 a 68 vezes, realizou-se a procura e a seleção dos oócitos. Os CCOs, classificados como categorias I, II e III segundo Loos et al. (1989), foram destinados à maturação.

Maturação In Vitro

Os oócitos selecionados foram lavados 3 vezes no meio para maturação e, após, transferidos para placas de cultivo com 4 gotas, contendo cada uma 100 µL de meio para maturação e cobertas por óleo mineral (Sigma, M8410). As placas foram levadas à estufa de cultivo celular com 10 a 20 oócitos por gota (atmosfera de 5% CO₂, 100% de umi-dade relativa do ar e 39ºC), onde permaneceram por 22 a 24 horas.

Fecundação In Vitro

A mesma partida de sêmen congelado de um reprodutor bovino da raça holandesa foi utilizada para todo o trabalho. Em cada repetição, uma palheta de sêmen foi descongelada em banho-maria a 39°C por 1 min. Após a avaliação da motilidade e do vigor, o conteúdo da palheta foi dividido e depositado no fundo de dois recipientes cônicos com 1 mL de meio sperm-talp (Parrish et al., 1986). Os recipientes foram incubados nas mesmas condições de maturação por 60 min para a separação dos espermatozóides viáveis pela técnica de “swim up” des-crita por Parrish et al. (1986). Ao final desse procedimento, a concentração espermática foi determinada em câmara de Neubauer. Ao término do período de maturação, os CCOs foram lavados 3 vezes e colocados em gotas de 100 µL do meio fert-talp, onde foram inseminados com 100.000 espermatozóides por gota, sendo então mantidos na incu-badora a 39ºC com atmosfera de 5% de CO₂ e 100% de umidade relativa por 18 a 20 horas.

Cultivo In Vitro

Após a fecundação in vitro, cada grupo de oócitos foi retirado do meio de fecundação e colocado em placas de Petri, contendo o meio para cultivo embrionário de onde, com o auxílio de uma pipeta de controle bucal, foram removidas as células do cumulus oophorus, deixando as estruturas parcialmente desnudas. Estas foram lavadas 3 vezes no meio de cultivo, e cada grupo foi transferido para

gota contendo 100 µL do mesmo meio, com algumas célu-las do cumulus oophorus. As estruturas permaneceram por mais 6 a 7 dias (D7 e D8) na incubadora a 39ºC, 5% CO₂ e 100% de umidade relativa do ar até que o desenvolvi-mento embrionário atingisse o estádio de blastocisto. Criopreservação

Após a avaliação morfológica, os blastocistos e blastocistos expandidos, produzidos in vitro nos dias 7 e 8 após a fecundação considerados de qualidade excelente ou muito boa, foram utilizados para a vitrificação ou para o congelamento, sendo distribuídos igualmente entre os tra-tamentos. Todas as soluções utilizadas foram mantidas à temperatura ambiente (22±4ºC) no momento da execução dos experimentos.

Experimento 1

Neste experimento, determinou-se a taxa de sobre-vivência embrionária in vitro após a criopreservação de embriões D7 e D8 desidratados previamente em uma solu-ção com 3,6 M de EG e diferentes concentrações de sacarose. Os embriões, em grupos de 2 a 7, foram mantidos durante 5 min em uma placa de Petri com 35 mm de diâmetro 5 mL de uma solução de desidratação, composta de 3,6 M de EG (tratamento 1) ou 3,6 M de EG + 0,1 M de Sac (tratamento 2) ou 3,6 M de EG + 0,25 M de Sac (tratamento 3) ou 3,6 M de EG + 0,5 M de Sac (tratamento 4). Em cada tratamento utilizado, foram realizadas 8 repetições para os embriões produzidos no dia 7 e 11 repetições para os obtidos no dia 8.

Após o período de desidratação, os embriões fo-ram pipetados para o interior de palhetas francesas de 0,25 mL contendo a solução de vitrificação composta de 7,2 M de EG em PBS + 0,4% de BSA. As palhetas foram seladas e permaneceram por dois minutos à temperatura ambiente antes da imersão em nitrogênio líquido.

Outro grupo de embriões (2 a 4 por grupo) perma-neceu nas gotas de cultivo (tratamento 5), sendo avaliado diariamente quanto ao seu desenvolvimento até o 11º dia de cultivo. Este grupo não foi submetido a nenhuma mani-pulação (grupo controle).

Experimento 2

Neste experimento, determinou-se a taxa de sobre-vivência embrionária in vitro após a criopreservação de embriões D7 e D8 vitrificados em solução de 7,2 M de EG e diferentes concentrações de sacarose. Grupos de 2 a 6 embriões foram submetidos durante 5 minutos a uma solu-ção de 3,6 M de EG + 0,5 M de Sac. A seguir, foram pipetados para o interior de palhetas francesas de 0,25 mL contendo uma solução de vitrificação composta de 7,2 M de EG

(tra-tamento 1) ou 7,2 M de EG + 0,25 M de Sac (tra(tra-tamento 2) ou 7,2 M de EG + 0,5 M de Sac (tratamento 3) ou 7,2 M de EG + 1,0 M de Sac (tratamento 4). As palhetas foram mantidas durante 2 minutos à temperatura ambiente e imersas em nitrogênio líquido.

Além dos embriões vitrificados, um grupo foi sub-metido ao congelamento (tratamento 5), de acordo com a metodologia descrita por Rodrigues et al. (1995). Neste tratamento, os embriões (2 a 6 por grupo) foram suspensos em uma solução de 3,6 M de EG durante 20 minutos à temperatura ambiente e envasados em palhetas francesas de 0,25 mL. Após esse período, foram colocados em um equipamento de congelamento programável (Biocool®, Systems Company) na temperatura de -7,0ºC por 2 min, sofrendo uma diminuição de temperatura da ordem de 0,3ºC por minuto até -11ºC. Nesta temperatura foi realizada a indução da cristalização do meio extracelular (“seeding”) e após oito minutos retomou-se a diminuição de 0,3ºC por minuto até -35ºC. Os embriões foram mantidos durante 10 minutos nessa temperatura e imersos em nitrogênio líqui-do.

Neste experimento também foram mantidos embriões em cultivo (tratamento 6) para o acompanhamento do seu desenvolvimento. A metodologia para este grupo foi a mesma descrita no experimento 1. Em cada tratamento utilizado foram realizadas 4 repetições para os embriões produzidos no dia 7 e 8 repetições para os obtidos no dia 8. No reaquecimento, as palhetas permaneceram no ar por 5 a 10 segundos e então foram colocadas em um banho-maria a 20ºC durante 20 segundos. O conteúdo de cada palheta foi expelido para uma placa de Petri contendo 5 mL da solução para diluição do crioprotetor, que, para embriões vitrificados, foi composta de 0,5 M de Sac e, para os congelados foi de 1,8 M de EG + 1,0 M de Sac. Durante 10 min os embriões permaneceram nessa solução, à tempe-ratura ambiente. Após três banhos em D-PBS + 0,4% de BSA, cada grupo de embriões foi colocado em uma das gotas com o mesmo meio de cultivo utilizado anteriormen-te, para o desenvolvimento até blastocisto, e incubado nas mesmas condições de atmosfera durante 72 horas. Ao término deste período, foi avaliada a sobrevivência embri-onária dos blastocistos e blastocistos expandidos coloca-dos em cultivo, taxas de reexpansão e eclosão.

Análise Estatística

Os dados obtidos nos experimentos foram analisa-dos pelo teste Qui-quadrado (χ2_{) com nível de significância} de α=0,05. Quando o teste de Qui-quadrado apresentou diferença estatística entre os tratamentos, realizou-se a análise dos resíduos do Qui-quadrado.

RESULTADOS

Os resultados de sobrevivência embrionária obti-dos no primeiro experimento, representaobti-dos pela taxa de reexpansão e eclosão, estão descritos nas Tabelas 1 e 2, respectivamente para os embriões bovinos D7 e D8 de cultivo.

Não observada diferença significativa nas taxas de reexpansão (p=0,2728) e eclosão (p=0,3468) entre os grupos apresentados na Tabela 1. O grupo controle desse primeiro experimento apresentou uma taxa de eclosão de 76,92% (40/52).

Os resultados mostrados na Tabela 2, no que diz respeito aos grupos em que a desidratação prévia foi rea-lizada com as soluções de 3,6 M de EG e 3,6 M de EG com sacarose nas concentrações de 0,1 M e 0,25 M, similares aos encontrados na Tabela 1. Entretanto, a solução de 3,6 M EG + 0,5 M de sac apresentou taxa de reexpansão superior as demais soluções (p=0,0328). Na taxa de eclosão, apesar de esta solução não mostrar diferença significativa em relação as demais, observá uma tendência de maior sobrevivência (p=0,0731) dos embriões a ela expostos. No segundo experimento, verificou-se a capacidade da adição de sacarose na solução de vitrificação em garantir a sobrevivência embrionária. A desidratação prévia foi reali-zada em uma solução de 3,6 M de EG + 0,5 M de sacarose em PBS. Na Tabela 3, pode-se observar os resultados refe-rentes à comparação da adição de sacarose à solução de vitrificação nos embriões produzidos no dia 7 de cultivo. Como pode observar na Tabela 3, houve diferença estatística entre os tratamentos testados, tanto para a taxa de reexpansão (p=0,0044) como para a taxa de eclosão (p=0,0001). Os embriões dos grupos submetidos ao congelamento e à vitrificação em solução de 7,2 M de EG acrescida de sacarose apresentaram taxas de reexpansão e eclosão similares entre si. Esses grupos apresentaram resultados de eclosão estatisticamente inferiores quando comparados ao grupo de embriões que não foi criopreservado. O grupo que foi vitrificado na solução de 7,2 M de EG sem a adição de sacarose foi o que apresentou as taxas de reexpansão e eclosão mais baixas, diferindo significativamente dos demais grupos de embriões vitrificados, congelados e do grupo controle.

Os resultados apresentados na Tabela 4 mostram que houve diferença estatística significativa entre os tra-tamentos (reexpansão: p=0,0179 e eclosão: p=0,0164). As soluções de vitrificação com 0,5 M e 1,0 M de sacarose foram eficientes na manutenção da sobrevivência embrio-nária da mesma forma que a solução de congelamento. O grupo controle, não submetido à criopreservação, foi dife-rente estatisticamente de todos os grupos de embriões criopreservados.

DISCUSSÃO

As concentrações de EG empregadas para garantir a vitrificação são altamente tóxicas e possibilitam tempos de equilíbrio na temperatura ambiente muito pequenos (Kasai et al., 1990; Rodrigues et al., 1995; Sommerfeld & Niemann, 1999; Kasai et al., 1992; e Zhu et al., 1993). Uma das estratégias para diminuir a toxicidade das altas con-centrações de crioprotetores necessárias para atingir o estado vítreo é o emprego de uma etapa prévia para a desi-dratação dos embriões (Rall, 1987). A eficácia do procedi-mento de desidratação em etapas foi comprovada em vári-os experimentvári-os (Kuwayama, 1995; Delval et al., 1996; e Nowshari & Brem, 1998).

O uso de solutos impermeáveis à membrana celu-lar, como a sacarose, na solução de desidratação e também na solução de vitrificação, associados a um agente permeável, permitem ao embrião perder água de uma forma mais rápida e, portanto, diminuir a ocorrência de uma inde-sejável formação de cristais de gelo durante os processos de resfriamento e reaquecimento (Rall, 1987; Arav, 1992). Entretanto, no experimento 1, não houve diferença signifi-cativa entre os grupos de desidratação com ou sem sacarose nas taxas de eclosão, tanto nos embriões D7 (Tabela 1) como nos D8 (Tabela 2). Apenas na taxa de reexpansão do grupo de embriões D8 (Tabela 2) submetido à solução de 3,6 M de EG + 0,5 M de sacarose houve uma melhora estatisticamente significativa. Apesar desta diferença não se ter refletido na taxa de eclosão deste grupo, houve uma tendência (p=0,0731) de superioridade em relação às demais. Isso demonstra que a presença de sacarose na solução de desidratação não garantiu melhor sobrevivência embrionária in vitro, de forma similar ao encontrado por outros autores (Saha et al., 1996). Por outro lado, ao realizar-se uma análise conjunta dos dois experimentos, fica evidenciada a influência decisiva da solução de vitrificação empregada (7,2 M de EG) sobre as baixas taxas de reexpansão e eclosão do experimento 1. No segundo experimento ficou claro que esta solução não garante a sobrevivência embrionária nos mesmos níveis das soluções acrescidas de sacarose (Tabelas 3 e 4).

Durante os experimentos, as soluções de vitrificação utilizadas foram observadas quanto a sua capacidade de manter o estado vítreo nas etapas de resfriamento e reaquecimento. Todas as soluções foram capazes de man-ter-se translúcidas no resfriamento, entretanto, na etapa de reaquecimento as soluções de 7,2 M EG e 7,2 M EG + 0,25 M sac tornaram-se opacas, indicando a formação de cristais de gelo. Apesar de existirem dúvidas quando ape-nas a inspeção visual é empregada para a avaliação da manutenção do estado vítreo (Rall, 1987), vários autores têm utilizado esse critério para a avaliação de suas

solu-ções (Fahy et al., 1984; Kasai et al., 1990; Ali & Shelton, 1993; Palasz et al., 1997). Segundo Ali & Shelton (1993) e Shaw et al. (1997), uma solução de EG só é capaz de manter o estado vítreo durante o resfriamento e aquecimento na concentração mínima de 8,0 M. Porém, quando se adiciona 1 M de sacarose, a completa vitrificação ocorre a partir de 5,5 M.

Com base em outros experimentos (Fahy et al., 1984; Palasz et al.; 1997) e nos dados apresentados na Tabela 4, pode inferir que a ação da sacarose na obtenção de taxas de eclosão superiores não está limitada apenas no auxílio da manutenção do estado vítreo pelo aumento da viscosidade da solução de vitrificação. Os embriões pro-duzidos no dia 7 (Tabela 3) submetidos à solução de 7,2 M EG + 0,25 M sac apresentaram taxas de reexpansão e eclosão similares aos tratamentos com 0,5 M e 1,0 M de sacarose, apesar de a solução tornar-se opaca durante o reaquecimento. Corroborando esta observação, Anchordoguy et al. (1987), Kuleshova et al., (1999) e Turner et al., (2001) afirmaram que o uso de sacarose ou outros açúcares como agentes crioprotetores é benéfico pela interação com a bicamada lipídica o que auxilia na preservação da integridade estrutural e funcional da mem-brana plasmática. A interação da molécula de sacarose com o grupo de fosfolipídeos é mais estável que a ligação da membrana com outros crioprotetores. Na Tabela 4, os re-sultados de reexpansão dos blastocistos e blastocistos expandidos D8 mantiveram-se similares nas soluções em que houve o acréscimo de sacarose. Entretanto, na taxa de eclosão os grupos com 0,5 M e 1,0 M de sac foram superiores ao com 0,25 M de sac.

Na análise deste trabalho devemos considerar ainda o tempo de cultivo dos embriões. Os embriões produzidos pelo cultivo in vitro apresentam um número de células muito variável, dependendo do sistema de produção utilizado (com ou sem elementos celulares, condições de atmosfera, meios, presença de soro, fatores de crescimento, etc.) (Bracke & Niemann, 1995; Shamsuddin et al., 1993; Avery & Greve, 1995; Iwasaki et al., 1990; e Sommerfeld & Niemann, 1999). Quando são utilizadas condições idênti-cas de cultivo, ocorre grande variação do número de célu-las dentro do mesmo estádio embrionário, dependendo do dia em que o embrião é produzido (Iwasaki et al., 1990; Van Soom et al., 1997). Essa diminuição no número de células dos embriões produzidos mais tardiamente pode ter con-tribuído para a menor sobrevivência (taxa de eclosão) no grupo vitrificado com a solução de 7,2 M EG + 0,25 M sac (Tabela 4). Uma menor proteção dessa solução de vitrificação em relação aos tratamentos 3 e 4 pode também ter contribuído para essa taxa de eclosão mais baixa. Efeito similar ocorreu no congelamento, em que as taxas de re-expansão (40%, 14/35) e eclosão (25,71%, 9/35) foram, mais

baixas nos embriões D8 (Tabela 4) do que nos D7, resulta-dos corroboraresulta-dos em outros experimentos (Sommerfeld & Niemann, 1999; Dinnyés et al., 1995; Dinnyés et al., 1996). De uma forma geral, analisando os dados das Ta-belas 3 e 4, observa-se que tanto para embriões D7 como D8 a presença de sacarose aumentou a sobrevivência em-brionária em comparação com a solução de 7,2 M de EG. Partindo do mesmo princípio, Tada et al. (1993) obtiveram aumento da sobrevivência de embriões murinos (2-célu-las) quando utilizaram sacarose na solução de vitrificação. Saito et al. (1994) e Saha et al. (1996) também melhoraram os índices de sobrevivência de embriões bovinos produzi-dos in vitro quando adicionaram um açúcar (trealose) na solução de vitrificação.

Ao longo do tempo o congelamento foi proposto também como um método de eleição para os embriões pro-duzidos in vitro. Pela sua alta permeabilidade, o EG tem sido usado com mais freqüência, principalmente nas con-centrações de 1,5 e 1,8 M. Os resultados relatados na lite-ratura para embriões produzidos in vitro têm sido bastan-te diversos (Okasaki et al., 1997; Semple et al., 1995; Cseh

et al., 1995; Sommerfeld & Niemann, 1999; Takagi et al.,

1994). Rodrigues et al. (1995) propuseram um aumento na concentração de EG para 3,6 M na tentativa de aumentar a viabilidade embrionária após o congelamento. Os autores obtiveram 73% (22/30) de eclosão após o congelamento de blastocistos expandidos D7 nessa solução, enquanto no grupo congelado com 1,5 M a taxa de eclosão foi de 50% (11/22). A análise estatística indicou não haver dife-rença significativa entre as duas concentrações de EG, apenas uma tendência de melhor sobrevivência na con-centração de 3,6 M. Sommerfeld & Niemann (1999) tam-bém utilizaram uma solução de 3,6 M EG para o congela-mento de embriões e compararam a influência do estádio embrionário. Os resultados indicaram uma maior sobrevi-vência nos embriões D7 do que nos D8 e o estádio de blastocisto expandido foi superior ao de blastocisto.

Nas Tabelas 3 e 4, podemos avaliar os resultados de congelamento com 3,6 M EG. Nos embriões D7, 50% (17/34) re-expandiram e 38,23% (13/34) eclodiram. Esses dados estão abaixo dos obtidos por Rodrigues et al. (1995) e Sommerfeld & Niemann (1999). Entretanto, esses autores agruparam os embriões de acordo com o estádio. No presente experimento, os estádios de blastocisto e blastocisto expandido foram distribuídos uniformemente entre os grupos.

A comparação entre a sobrevivência embrionária proporcionada pelo congelamento e a vitrificação tem sido o objeto de vários trabalhos (Dinnyés et al., 1995; Dinnyés

et al., 1996; Lane et al., 1998; Liu et al., 1996;

Mahmoudzadeh et al., 1994; Van Wagtendonk-de Leew et

expe-Tabela 1 - Sobrevivência in vitro de blastocistos e blastocistos expandidos bovinos produzidos in vitro (dia 7), após desidratação em 3,6 M EG e diferentes concentrações de sacarose e vitrificação em solução de 7,2 M de EG.

G rupo Blastocistos R e-expansão Eclosão N N (% ) N (% ) 3,6 M EG 32 6 (18,75) 1 (3,12) 3,6 M EG + 0,1 M Sac 30 5 (16,66) 1 (3,33) 3,6 M EG + 0,25 M Sac 36 10 (27,77) 3 (8,33) 3,6 M EG + 0,5 M Sac 32 3 (9,37) 0 (0)

Tabela 2 - Sobrevivência in vitro de blastocistos e blastocistos expandidos bovinos produzidos in vitro (dia 8), após a desidratação em 3,6 M EG e diferentes concentrações de sacarose e vitrificação em solução de 7,2 M de EG.

G r u p o B la s to c i s to s R e - e x p a n s ã o E c l o s ã o N N ( % ) N (% ) 3 ,6 M E G 4 6 ₈b _{( 1 7 ,3 9 ) 3 ( 6 ,5 2 )} 3 ,6 M E G + 0 ,1 M S a c 4 1 ₄b _{( 9 ,7 5 ) 2 ( 4 ,8 7 )} 3 ,6 M E G + 0 ,2 5 M S a c 4 6 ₃b _{( 6 ,5 2 ) 1 ( 2 ,1 7 )} 3 ,6 M E G + 0 ,5 M S a c 4 4 _{1 2}a _{( 2 7 ,2 7 ) 7 (1 5 ,9 1 )} a,b: números seguidos de letras desiguais na mesma coluna diferem significativamente na análise dos dados pelo teste de Qui-quadrado complementado pelo cálculo dos resíduos.

Tabela 3 - Sobrevivência in vitro de blastocistos e blastocistos expandidos bovinos (dia 7) produzidos in vitro, após desidratação em 3,6 M EG + 0,5 M de sacarose e vitrificação em solução de 7,2 M de EG e diferentes concentra-ções de sacarose .

Grupo Blastocistos Re-expansão Eclosão N N (% ) N (% ) Vitrificação 7,2 M EG 34 ₅b (14,71) ₅c (14,71) 7,2 M EG+0,25M Sac 36 ₁₉a _(52,78) 14b (38,89) 7,2 M EG+0,5M Sac 30 ₁₂a (40,00) ₁₂b (40,00) 7,2 M EG+1,0M Sac 37 ₂₀a (54,05) ₁₄b (41,18) Congelamento 3,6 M EG 34 ₁₇a (50,00) ₁₃b (38,23) Controle 38 -- -- ₂₈a (73,68)

a,b: números seguidos de letras desiguais na mesma coluna diferem significativamente na análise dos dados pelo teste de Qui-quadrado complementado pelo cálculo dos resíduos.

Tabela 4 - Sobrevivência in vitro de blastocistos e blastocistos expandidos bovinos (dia 8) produzidos in vitro, após desidratação em 3,6 M EG + 0,5 M de sacarose e vitrificação em solução de 7,2 M de EG e diferentes concen-trações de sacarose . G ru p o B la sto c is to s R e -e x p a n s ã o E c lo s ã o N N (% ) N (% ) V itr ific a ç ã o 7 ,2 M E G 3 2 ₅b (1 5 ,6 2 ) ₂c (6 ,2 5 ) 7 ,2 M E G + 0 ,2 5 M S a c 3 3 _{1 2}a (3 6 ,3 6 ) ₄c (1 2 ,1 2 ) 7 ,2 M E G + 0 ,5 M S a c 3 4 _{1 8}a _{(5 2 ,9 4 )} 1 1b (3 2 ,3 5 ) 7 ,2 M E G + 1 ,0 M S a c 3 4 _{1 7}a (5 0 ,0 0 ) _{1 2}b (3 5 ,2 9 ) C o n g e la m e n to 3 ,6 M E G 3 5 _{1 4}a (4 0 ,0 0 ) ₉b (2 5 ,7 1 ) C o n tr o le 3 8 -- -- _{2 8}a (7 3 ,6 8 )

a,b: números seguidos de letras desiguais na mesma coluna diferem significativamente na análise dos dados pelo teste de Qui-quadrado complementado pelo cálculo dos resíduos.

rimento, os grupos de embriões congelados, tanto os D7 como os D8, apresentaram viabilidade após o descongela-mento similar aos melhores grupos de embriões submeti-dos à vitrificação (Tabelas 3 e 4). Na grande maioria submeti-dos experimentos realizados, os resultados de sobrevivência embrionária têm sido similares entre embriões congelados e vitrificados. Agca et al. (1996) obtiveram taxas de pre-nhez similares para embriões congelados e vitrificados. Todavia, em outro experimento (Agca et al., 1998), utili-zando as mesmas soluções, a taxa de prenhez aos 40 dias foi superior nos embriões vitrificados em comparação aos submetidos ao congelamento.

A presença de um grupo de embriões não submeti-do à criopreservação permite identificar a capacidade submeti-dos embriões em sobreviver nas condições propostas para o seu cultivo. As taxas de eclosão de 76,92% (40/52) no ex-perimento 1 e 73,68% (28/38) no exex-perimento 2 ficam den-tro dos limites relatados pela literatura (Sommerfeld & Niemann, 1999; Saha et al., 1995; Saha et al., 1996; Delval

et al., 1996).

A presença de sacarose na solução de desidrata-ção composta por 3,6 M de EG em PBS + 0,4 % de BSA não influenciou significativamente as taxas de eclosão in vitro de blastocistos e blastocistos expandidos D7 e D8. En-tretanto, quando a sacarose foi adicionada na solução de vitrificação, principalmente nas concentrações de 0,5 M e 1,0 M, proporcionou sobrevivência embrionária (re-expan-são e eclo(re-expan-são) significativamente superior à solução de vitrificação composta apenas por 7,2 M de EG.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi desenvolvido com suporte finan-ceiro do Programa PROBRAL CAPES/DAAD e do Conse-lho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico(CNPq).

ARTIGO RECEBIDO: Maio/2003 APROVADO: Agosto/2003

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