Recongelação do sêmen de garanhões pantaneiros
Carmem Estefânia Serra Neto1 Zuccari; Daniela Brandão Nunes2; Felipe Alan Laxe de Paula3; Camila da Silva Ferreira3; Eliane Vianna da Costa e Silva4
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Departamento de Produção Animal – UFMS, Cx Postal 549, CEP: 79070-900 Campo Grande, MS. E- mail: zuccari@nin.ufms.br.
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Mestranda em Ciência Animal – UFMS. E- mail: nunesdb@nin.ufms.br.
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Bolsista Iniciação Científica/CNPq – UFMS.
4
Departamento de Medicina Veterinária – UFMS.
Resumo
As doses de sêmen eqüino congelado possuem, em geral, uma concentração de 400x106 espermatozóides/ml. Contudo, para inseminações sobre ou ao redor da papila útero-tubárica, concentrações bem inferiores têm sido usadas com sucesso. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a taxa de recuperação da motilidade e de células íntegras após submeter o sêmen ao fracionamento e a recongelação. Foram analisados 45 ejaculados provenientes de seis garanhões da raça Pantaneira, sendo 26 congelados com o diluidor Merck e 19 com meio M-9, em palhetas de 0,5 ml. As amostras foram descongeladas a 37°C/30 segundos e após cerca de 15 minutos, re-envasadas em palhetas de 0,25 ml e submetidas a dois tratamentos: TMTI – colocadas diretamente no vapor de N2 líquido / 20 minutos seguida de imersão e; TMTII – mantidas por 1 hora
sob refrigeração a 5°C, antes da recongelação conforme o mesmo procedimento do primeiro tratamento. As variáveis analisadas pós-1a. descongelação foram motilidade espermática (MOT1) e percentagem de células com membrana plasmática íntegra (INT1), avaliada pela coloração com diacetato de carboxifluoresceína+iodeto de propídio. Após a 2a. descongelação, além da MOT2 e INT2, calculou-se as taxas de recuperação da motilidade (RMOT) e do percentual de espermatozóides íntegros (RINT), utilizando-se uma regra de três simples. Os dados foram transformados em arcoseno (X/100) antes de serem submetidos à análise de variância utilizando o procedimento GLM do SAS, considerando como variáveis fixas: Tratamento (TMT I e II), Garanhão (G1...G6), Diluidor (D1 e D2) e a interação TMT*D. As médias foram comparadas por teste t de Student. Foi observado efeito de garanhão (p<0,05) para todas as variáveis estudadas e de diluidores (p<0,05) para MOT1, MOT2, INT2 e RINT. Não houve efeito significativo (p>0,05) da interação TMT*D em nenhuma das variáveis estudadas. A motilidade e percentagem médias de íntegros a 1a. descongelação foram de 39,56 ± 1,14% e 35,22 ± 1,13%, respectivamente. A motilidade e percentagem médias de espermatozóides íntegros alcançadas para os diferentes tratamentos foram significativamente maiores (p<0,05) para o TMTII: MOT2 = 12,00 ± 1,00 vs 14,78 ± 0,94% e INT2 = 9,69 ± 0,64 vs 13,44 ± 0,86%, para os tratamentos I e II, respectivamente. A taxa de recuperação da motilidade e do percentual de células íntegras foi significativamente superior (p<0,05) para o TMTII: RMOT = 29,85 ± 1,76
vs 37,54 ± 1,91% e RINT = 30,19 ± 2,61 vs 41,75 ± 3,13%, para os tratamentos I e II,
respectivamente. De acordo com os resultados conclui-se que a refrigeração do sêmen pré-recongelação foi benéfica para a preservação da qualidade seminal pós-2a. descongelação e resultou em melhor taxa de recuperação da motilidade e do percentua l de células com membrana plasmática íntegra.
Termos para Indexação: criopreservação, eqüino, sêmen.
Abstract
The doses of frozen equine semen have in general 400x106 sperm/ml. However, there have been used lower concentration to inseminate over or around the uterotubal junction successfully. The aim of this work was to evaluate the recovery rate of motility and the intact cells after fractioning and refreezing of the semen. 45 ejaculates from six Pantaneiro stallions have been analised, 26 frozen with the Merck semen extender and 19 with diluent M-9, in straws of 0.5 ml. The samples have been thawed at 37°C/30 seconds and after about 15 minutes they were repackaging in straws of 0.25 ml. Then they have been put under two treatments: TMTI – put directly on liquid N2 steam for 20
minutes, followed by imersion and; TMTII – kept under cooling at 5°C for an hour, before refreezing, as the same procedure of the first treatment. The analised variables after the first thawing were spermatic motility (MOT1) and percentage of cells with intact plasmatic membrane (INT1), evaluated by fluorescent stain (diacetate fluorescein+propidium iodide). After the second thawing, besides MOT2 and INT2, the motility recovery rate (RMOT) and percentage of intact cells (RINT) have been analised. The data were transformed in arsin (X/100) before being put to ANOVA utilizing the GLM of SAS procedure, considering fixed variables: treatment (TMT I and II), stallion (G1...G6), diluent (D1 and D2) and the interaction TMT*D. The averages were compared by t test of Student. There have been observed stallion effect (P<0.05) for all the studied variables and diluent effect (P<0.05) for MOT1, MOT2, INT2 and RINT. There have been no significant effect (P>0.05) of the interaction TMT*D in none of the analised variables. Motility and percentage averages of intact cells at first thawing were 39,56 ± 1,14% and 35,22 ± 1,13%, respectively. The motility and percentage averages of intact sperm obtained by the different treatments were significantly higher (P<0.05) for TMTII: MOT2 = 12,00 ± 1,00 vs 14,78 ± 0,94% and INT2 = 9,69 ± 0,64 vs 13,44 ± 0,86%, for the treatments I e II, respectively. The motility recovery rate and percentage of intact cells were significantly higher (P<0.05) for the TMTII: RMOT = 29,85 ± 1,76 vs 37,54 ± 1,91% and RINT = 30,19 ± 2,61 vs 41,75 ± 3,13%, for the treatments I e II, respectively. According with these results we may assume that the cooling semen pre-refreezing was useful for the preservation of seminal quality after the second thawing, leading to the better motility recovery rate and percentual of cells with integrity of plasmatic membrane.
Index Terms: cryopreservation, equine, semen.
Introdução
A criopreservação do sêmen eqüino representa uma importante ferramenta no melhoramento genético da espécie, pela maximização do uso de reprodutores superiores. Porém, alguns fatores impedem que o sêmen eqüino congelado possa ser utilizado em larga escala, dentre eles, a variação individual frente a criopreservação e o baixo rend imento de doses por ejaculado (MORRIS et al., 2003). As doses de sêmen eqüino congelado possuem, em geral, uma concentração de 400 x 106 espermatozóides/ml. Contudo, para inseminações artificiais (IA) sobre ou ao redor da junção útero-tubárica (JUT), concentrações bem inferiores têm sido usadas com sucesso. VAZQUEZ et al. (1998) foram os pioneiros na inseminação histeroscópica
empregando uma concentração de 3,8 x 106 espermatozóides frescos viáveis, obtendo uma taxa de prenhez de 30%. Para o sêmen congelado NIE et al. (2003) obtiveram uma variação de 33 a 50% de éguas prenhes, após seleção espermática em diferentes gradientes descontínuos. Para programas comerciais de IA na JUT com baixa concentração espermática, ALVARENGA et al. (2001), mediante o uso de histeroscopia, obtiveram 57,22% de gestação e NUNES et al. (2004) cerca de 61% de prenhez utilizando pipeta longa flexível, com concentrações espermáticas de 50 e 100 x 106, respectivamente. A produção de descendentes de garanhões geneticamente superiores já mortos poderá ser otimizada se o sêmen criopreservado puder ser fracionado após a descongelação e então recongelado. O objetivo do presente experimento foi avaliar a taxa de recuperação da motilidade e de células com membrana plasmática íntegra, após submeter o sêmen ao fracionamento e a recongelação.
Material e Métodos
Foram analisados 45 ejaculados provenientes de seis garanhões da raça Pantaneira, sendo 26 congelados com o diluidor Merck e 19 com o meio M-9, em palhetas de 0,5 ml. As amostras foram descongeladas a 37oC/30 segundos e após cerca de 15 minutos, re-envasadas em palhetas de 0,25 ml e submetidas a dois tratamentos: TMTI - colocadas diretamente no vapor de N2 líquido / 20 minutos seguida de imersão e; TMTII - mantidas por 1 hora sob refrigeração a 5oC, antes da recongelação conforme o mesmo procedimento do primeiro tratamento. As variáveis analisadas pós-1a descongelação foram motilidade espermática (MOT1) e percentagem de células com membrana plasmática íntegra (INT1), avaliada pela coloração com diacetato de carboxifluoresceína + iodeto de propídio. Após a 2a descongelação, além da MOT2 e INT2, calculou-se as taxas de recuperação da motilidade (RMOT) e do percentual de espermatozóides íntegros (RINT), utilizando-se uma regra de três simples. Os dados foram transformados em arcoseno (x/100) antes de serem submetidos à análise de variância utilizando o procedimento GLM do SAS, considerando como variáveis fixas: Tratamento (TMT I e II), Garanhão (G1...G6), Diluidor (D1 e D2) e a interação TMT*D. As médias foram comparadas por teste t de Student.
Resultados e Discussão
Foi observado efeito de garanhão (p< 0,05) para todas as variáveis estudadas e de diluidores (p< 0,05) para MOT1, MOT2, INT2 e RINT. Não houve efeito significativo (p>0,05) da interação TMT*D em nenhuma das variáveis estudadas. Os valores da motilidade e percentagem médias de íntegros a 1a. descongelação foram de 39,56 ± 1,14% e 35,22 ± 1,13%, respectivamente. A motilidade e percentagem médias de espermatozóides íntegros alcançadas para os diferentes tratamentos foram significativamente maiores (p< 0,05) para o TMTII: MOT2 = 12,00 ± 1,00 vs 14,78 ± 0,94% e INT2 = 9,69 ± 0,64 vs 13,44 ± 0,86%, para os tratamentos I e II, respectivamente (Fig. 1).
Figura 1. Percentagem média de motilidade (MOT2) e espermatozóides com membrana plasmática íntegra (INT2) após a segunda descongelação de acordo com os tratamentos: recongelação direta em N2 (TMT I) e refrigerado pré-recongelação (TMT II). (letras diferentes indicam diferença significativa pelo Teste t de Student em nível de 5%).
Ambos os valores de motilidade pós-1a. e 2a. descongelação foram inferiores aos encontrados por MCCUE et al. (2004) de 64,2 ± 7,7% após a 1a. descongelação e 45,7 ± 10,4% após a 2a. descongelação.
A taxa de recuperação da motilidade e do percentual de células íntegras foi significativamente superior (p< 0,05) para o TMTII: RMOT = 29,85 ± 1,76 vs 37,54 ± 1,91% e RINT = 30,19 ± 2,61 vs 41,75 ± 3,13%, para os tratamentos I e II, respectivamente (Fig. 2). McCue et al. (2004) obtiveram aproximadamente 70% de taxa de recuperação da motilidade espermática após a 2a descongelação, valor esse superior ao encontrado no presente trabalho.
Figura 2. Taxa de recuperação da motilidade (RMOT) e do percentual de espermatozóides com membrana plasmática íntegra (RINT) de acordo com os tratamentos: recongelação direta em N2 (TMT I) e refrigerado pré-recongelação (TMT II). (letras diferentes indicam diferença significativa pelo Teste t de Student em nível de 5%).Com a recongelação seminal será possível otimizar o rendimento de doses/ejaculado e estas serão empregadas em programas de reprodução assistida como a
b a b a 0 10 20 30 40 50 RMOT RINT TMT I TMT II b a b a 0 5 10 15 20 (%) MOT2 INT2 TMT I TMT II
inseminação artificial na JUT, transferência de embriões, transferência intrafalopiana de ovócitos e a fertilização in vitro (ALVARENGA, 2003).
Conclus ões
De acordo com os resultados conclui-se que a refrigeração do sêmen pré-recongelação foi benéfica para a preservação da qualidade seminal pós-2a descongelação e resultou em melhor taxa de recuperação da motilidade e do percentual de espermatozóides com membrana plasmática íntegra.
Referências Bibliográficas
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NIE, G.J., JOHNSON, K.E., WENZEL, J.G. Pregnancy outcome in mares following insemination deep in the uterine horn with low numbers of sperm selected by glass wool / Sephadex filtration, Percoll separationor absolute number. Animal Reproduction Science, v. 79, n. 1-2, p. 103-109, 2003.
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