UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE ENGENHARIA FLORESTAL
Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais e Ambientais
ENRAIZAMENTO in vitro de Eucalyptus cloeziana F.
Muell
ALEXSSANDRA JÉSSICA RONDON DE FIGUEIREDO
CUIABÁ – MT 2017
ALEXSSANDRA JÉSSICA RONDON DE FIGUEIREDO
ENRAIZAMENTO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F.
Muell
Orientador: Prof. Dr. André Luís Lopes da Silva Coorientador: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Curso de Pós-Graduação em Ciências Florestais e Ambientais, para obtenção do título de mestre.
CUIABÁ – MT 2017
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus pela presença constante em minha vida, e pelas inúmeras bênçãos que o Senhor derrama sobre mim e sobre a minha família.
À minha família, por tudo que representam na minha vida, mas principalmente à minha mãe, Wanderléa, por todo o amor, carinho, força que ela sempre me dá todos os dias. Não tenho palavras suficientes para agradecê-la por tudo, ela é o meu maior amor e a minha maior inspiração. Agradeço também a minha vó Olieta, por todo apoio, carinho e amor durante essa etapa. Ao meu namorado Marcelo, pelo imenso amor, carinho, apoio e ajuda durante toda essa etapa.
À Universidade Federal de Mato Grosso, ao curso de Engenhaia Florestal e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais e Ambientais, pelo suporte e pela oportunidade de realização do mestrado.
Á CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior) pela concessão da bolsa de estudo.
Ao meu querido orientador professor Dr. André Luís Lopes da Silva, pelos seus ensinamentos, constante apoio, ajuda, palavras de sabedoria, e mesmo com a orientação a distância me instruiu, aconselhou da melhor maneira possível, e sobretudo pela amizade construída ao longo do mestrado. Agradeço também ao professor Dr. Gilvano Ebling pela coorientação, ensinamentos e pelo apoio, e me ajudou muito também durante todo o mestrado, com toda a sua experiência e sabedoria. E ao professor Dr. Leandro Silva de Oliveira, por toda a ajuda, ensinamentos, generosidade, e pela presença na banca examinadora.
Agradeço imensamente aos meus amigos e irmãos de coração da FENF: Anatálya Ribeiro, Gabriela Tormen, Poliane Pierra, Tiago Siqueira e Rodrigo Adversi, sem vocês esse mestrado não seria o mesmo. Muito obrigada por todo o apoio, colaboração, carinho, pela amizade, pelas trocas de experiências, por todos os momentos que passamos juntos, sejam eles felizes, tristes ou de desesperos, que acabavam sendo superados com vocês ao meu lado. Tenho certeza que a nossa amizade
será para sempre, com muitos momentos regados a café, salgadinhos, bolos e muita prosa. Obrigada também a minha turma do mestrado, pela amizade e pela troca de experiência, todos são muito queridos para mim.
E a todos de que uma forma ou outra contribuíram para a realização desse trabalho, que ajudaram e me deram apoio.
SUMÁRIO RESUMO ... xix ABSTRACT ... xxi 1. INTRODUÇÃO ... 23 1.1. OBJETIVO GERAL ... 25 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 25 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 26 2.1. O GÊNERO Eucalyptus ... 26
2.2. A ESPÉCIE Eucalyptus cloeziana ... 28
2.3. PROPAGAÇÃO DE Eucalyptus ... 31
2.4. MICROPROPAGAÇÃO DE Eucalyptus ... 34
2.5. FASE DE ENRAIZAMENTO ... 39
2.5.1. Fatores que afetam o enraizamento ... 43
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 51
3.1. CARACTERIZAÇÃO GERAL ... 51
3.2. FONTE E ORIGEM DOS EXPLANTES ... 51
3.3. PREPARO DO MEIO DE CULTURA E CONDIÇÕES DE CULTIVO ... 52
3.4. MULTIPLICAÇÃO in vitro ... 56
3.5. MEIO DE ALONGAMENTO I ... 56
3.6. MEIO DE ALONGAMENTO II ... 57
3.7. EFEITOS DO pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE NO ENRAIZAMENTO ... 58
3.8. INFLUÊNCIA DE CARBOIDRATOS NO ENRAIZAMENTO ... 59
3.9. EFEITOS DO CARVÃO ATIVADO NO ENRAIZAMENTO ... 60
3.10. ENRAIZAMENTO ex vitro ... 61
3.11. ACLIMATIZAÇÃO ... 64
3.12. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS ... 65
4.1. EFEITOS DO pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE NO ENRAIZAMENTO in vitro DE E. cloeziana (BROTAÇÕES ADVINDAS DO MEIO DE ALONGAMENTO I) ... 66 4.2. EFEITO DO pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE NO ENRAIZAMENTO ex vitro DE E. cloeziana (BROTAÇÕES ADVINDAS DO MEIO DE ALONGAMENTO I) ... 68 4.3. EFEITOS DO pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE NO ENRAIZAMENTO in vitro DE E. cloeziana (BROTAÇÕES ADVINDAS DO MEIO DE ALONGAMENTO II) ... 78 4.4. EFEITOS DO pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE NO ENRAIZAMENTO ex vitro DE E. cloeziana (MEIO DE ALONGAMENTO II)...87 4.5. INFLUÊNCIA DE CARBOIDRATOS NO ENRAIZAMENTO in vitro DE BROTAÇÕES DE E. cloeziana. ... 94 4.6. INFLUÊNCIA DE CARBOIDRATOS NO ENRAIZAMENTO ex vitro DE E. cloeziana ... 99 4.7. EFEITOS DO CARVÃO ATIVADO NO ENRAIZAMENTO in vitro DE E. cloeziana. ... 103 4.8. EFEITOS DO CARVÃO ATIVADO NO ENRAIZAMENTO ex vitro DE E. cloeziana. ... 109 4.9. ACLIMATIZAÇÃO ... 114 4.9.1. Efeitos do pH e concentrações de sacarose no enraizamento de
E. cloeziana (brotações advindas do meio de alongamento I)... 114
4.9.2. Efeitos do pH e concentrações de sacarose no enraizamento de
E. cloeziana (brotações advindas do meio de alongamento II). ... 117
4.9.3. Influência de carboidratos no enraizamento de E. cloeziana.121 4.9.4. Efeitos do carvão ativado no enraizamento de E. cloeziana. 123 5. CONCLUSÕES ... 127 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 128 7. BIBLIOGRAFIA ... 130
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - COMPOSIÇÃO BÁSICA DO MEIO DE CULTURA WPM UTILIZADO PARA O CULTIVO in vitro DE Eucalyptus cloeziana. ... 53
Tabela 2 - COMBINAÇÕES DE ph E SACAROSE APLICADOS NO ENRAIZAMENTO in vitro DE Eucalyptus cloeziana. ... 59
Tabela 3 - DESCRIÇÃO DOS TRATAMENTOS EMPREGADOS NO ENRAIZAMENTO in vitro DE Eucalyptus cloeziana. ... 60
Tabela 4 - MEIOS DE ALONGAMENTO E ENRAIZAMENTO EMPREGADOS NO CULTIVO in vitro DE Eucalyptus cloeziana. ... 61
Tabela 5 - COMPOSIÇÃO DA SOLUÇÃO NUTRITIVA BÁSICA UTILIZADA NO CULTIVO ex vitro DE Eucalyptus cloeziana. ... 63
Tabela 6 - CONDIÇÕES DE CULTIVO DE Eucalyptus cloeziana DURANTE O PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO. ... 65
Tabela 7 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex
vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS
RAÍZES (CTR) E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA DURANTE 30 DIAS EM RELAÇÃO A DIFERENTES NÍVEIS DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE TESTADOS. ... 68
Tabela 8 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA, PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex vitro E NÚMERO DE RAÍZES INDUZIDOS EM BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana 30 DIAS APÓS CULTIVO EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA, AVALIANDO O EFEITO DE DIFERENTES COMBINAÇÕES DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. ... 69
Tabela 9 - COMPRIMENTO TOTAL E MÉDIO DE RAÍZES INDUZIDAS EM BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana 30 DIAS APÓS CULTIVO EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA AVALIANDO O EFEITO DE DIFERENTES COMBINAÇÕES DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. ... 71
Tabela 10 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE DE ENRAIZAMENTO
in vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS
RAÍZES (CTR), COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIO WPM CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE NÍVEIS DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE DURANTE 30 DIAS. ... 78
Tabela 11 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE
Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIO WPM DE ENRAIZAMENTO in vitro (30 DIAS) EM RELAÇÃO A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
SACAROSE. ... 79
Tabela 12 - PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO DE EXPLANTES DE
Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIO WPM DE ENRAIZAMENTO in vitro CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE NÍVEIS DE pH E
CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE DURANTE 30 DIAS. ... 80
Tabela 13 - NÚMERO E COMPRIMENTO TOTAL DE RAÍZES INDUZIDAS EM BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana 30 DIAS APÓS CULTIVO in
vitro EM MEIO WPM DE ENRAIZAMENTO AVALIANDO O EFEITO DE
DIFERENTES NÍVEIS DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. . 80
Tabela 14 - COMPRIMENTO MÉDIO DE RAÍZES DE EXPLANTES DE
Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIO WPM DE ENRAIZAMENTO in vitro CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE NÍVEIS DE pH E
Tabela 15 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE DE ENRAIZAMENTO
ex vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS
RAÍZES (CTR), COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA DURANTE 30 DIAS EM RELAÇÃO A DIFERENTES NÍVEIS DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE TESTADOS. ... 87
Tabela 16 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE
Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA DE
ENRAIZAMENTO ex vitro (30 DIAS) EM RELAÇÃO A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. ... 88
Tabela 17 - PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex vitro E NÚMERO DE RAÍZES INDUZIDOS EM BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana 30 DIAS APÓS CULTIVO EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA, AVALIANDO O EFEITO DE DIFERENTES COMBINAÇÕES DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. ... 89
Tabela 18 - COMPRIMENTO TOTAL E MÉDIO DE RAÍZES INDUZIDAS EM BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana 30 DIAS APÓS CULTIVO EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA AVALIANDO O EFEITO DE DIFERENTES COMBINAÇÕES DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. ... 90
Tabela 19 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA) PARA A PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO in vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR), E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIOS DE CULTURA DE ENRAIZAMENTO CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE SACAROSE E GLICOSE DURANTE 30 DIAS. ... 94
Tabela 20 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB%), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO in vitro (ENR%), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR) E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES DE EXPLANTES DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIOS DE CULTURA DE ENRAIZAMENTO CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE SACAROSE E GLICOSE DURANTE 30 DIAS. ... 95
Tabela 21 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA) PARA A PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR), E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA EM RELAÇÃO A DIFERENTES COMBINAÇÕES DE SACAROSE E GLICOSE DURANTE 30 DIAS. ... 100
Tabela 22 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB%), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex vitro (ENR%), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR) E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES DE EXPLANTES DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIOS DE CULTURA DE ENRAIZAMENTO CONTENDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE SACAROSE E GLICOSE DURANTE 30 DIAS. ... 100
Tabela 23 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA) PARA A PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO in vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR), E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM MEIOS DE CULTURA DE ALONGAMENTO (30 DIAS) E ENRAIZAMENTO (30 DIAS) CONTENDO OU NÃO CARVÃO ATIVADO. ... 103
Tabela 24 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB%), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO in vitro (ENR%), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR) E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES DE EXPLANTES DE E. cloeziana CULTIVADOS EM MEIOS DE CULTURAS DE ALONGAMENTO (30 DIAS) E ENRAIZAMENTO (30 DIAS) CONTENDO OU NÃO CARVÃO ATIVADO. ... 104
Tabela 25 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA) PARA A PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex vitro (ENR), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR), E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES (CMR) DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana CULTIVADOS EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA TESTANDO CARVÃO ATIVADO EM MEIOS DE CULTURA DE ALONGAMENTO (30 DIAS) E ENRAIZAMENTO (30 DIAS) CONTENDO OU NÃO CARVÃO ATIVADO. ... 110
Tabela 26 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (SOB%), PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO ex vitro (ENR%), NÚMERO DE RAÍZES (NR), COMPRIMENTO TOTAL DAS RAÍZES (CTR) E COMPRIMENTO MÉDIO DAS RAÍZES DE EXPLANTES DE E. cloeziana CULTIVADOS EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA TESTANDO CARVÃO ATIVADO EM MEIOS DE CULTURA DE ALONGAMENTO (30 DIAS) E ENRAIZAMENTO (30 DIAS) CONTENDO OU NÃO CARVÃO ATIVADO. ... 110
Tabela 27 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA APÓS OS PRIMEIROS 30 DIAS DE ACLIMATIZAÇÃO DE BROTAÇÕES DE
Eucalyptus cloeziana OBTIDAS NO ENRAIZAMENTO ex vitro EM
SISTEMA DE MINI-ESTUFA TESTANDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. ... 115
Tabela 28 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (% SOB) DAS MUDAS DE Eucalyptus cloeziana OBTIDAS A PARTIR DO EXPERIMENTO TESTANDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE pH E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE DURANTE TODAS AS FASES DE ACLIMATIZAÇÃO. ... 117
Tabela 29 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (% SOB) DAS MUDAS DE Eucalyptus cloeziana OBTIDAS A PARTIR DO EXPERIMENTO TESTANDO DIFERENTES COMBINAÇÕES DE CARBOIDRATOS DURANTE TODAS AS FASES DE ACLIMATIZAÇÃO. ... 121
Tabela 30 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA (% SOB) DAS MUDAS DE Eucalyptus cloeziana OBTIDAS A PARTIR DO EXPERIMENTO TESTANDO CARVÃO ATIVADO DURANTE TODAS AS FASES DE ACLIMATIZAÇÃO. ... 124
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - DISTRIBUIÇÃO NATURAL DE Eucalyptus cloeziana NA AUSTRÁLIA. Fonte: Boland et al. (2006). ... 29
Figura 2 - BROTAÇÕES ADVENTÍCIAS OBTIDAS EM MEIO DE MULTIPLICAÇÃO DE UM PROTOCOLO DE ORGANOGÊNESE INDIRETA DE Eucalyptus cloeziana (Barra = 1 cm). ... 52
Figura 3 – FLUXOGRAMA DO PROTOCOLO DE ENRAIZAMENTO in vitro E ex vitro DE Eucalyptus cloeziana. ... 55
Figura 4 - MULTIPLICAÇÃO in vitro DE EXPLANTES DE Eucalyptus
cloeziana. (A e B) MULTIPLICAÇÃO EM TUBOS DE ENSAIO DURANTE
30 DIAS. (B) MULTIPLICAÇÃO DOS EXPLANTES EM POTE PLÁSTICO AO FINAL DE 30 DIAS (Barras= 1 cm)... 56
Figura 5 - ALONGAMENTO in vitro DE EXPLANTES DE Eucalyptus
cloeziana, EM TUBOs DE ENSAIO (A e B) E EM POTE PLÁSTICO (C)
(Barras= 1,5 cm). ... 57
Figura 6 - MEIO DE CULTURA CONTENDO CARVÃO ATIVADO PARA O ALONGAMENTO in vitro DE EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana. (A e B) EXPLANTES ALONGANDO EM MEIO CONTENDO CARVÃO ATIVADO DURANTE 30 DIAS. (C) MEIO DE CULTURA PRONTO CONTENDO CARVÃO ATIVADO (Barras= 1 cm). ... 58
Figura 7 - MINI-ESTUFA UTILIZADA COMO SISTEMA DE ENRAIZAMENTO ex vitro DE BROTAÇÕES DE E. cloeziana SENDO MONTADA (A). MINI-ESTUFA PRONTA NA SALA DE CRESCIMENTO (B). ... 62
Figura 8 - DEMONSTRAÇÃO DO CULTIVO DE E. cloeziana EM COPOS PLÁSTICOS E DA RETIRADA PROGRESSIVA DAS TAMPAS (A) 30 DIAS
COM TAMPA; (B) 15 DIAS COM 25% DE ABERTURA; (C) 15 DIAS COM 75% DE ABERTURA E (D) AO FINAL DE 60 DIAS SEM TAMPA). ... 64
Figura 9 - EXPLANTES DE Eucalyptus cloeziana ENRAIZADOS ex vitro (A à H) EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA E PERTECENTES AO TRATAMENTO pH 5,8 COM 30 g.L-1 DE SACAROSE APÓS 30 DIAS (Barras= 1 cm). ... 72
Figura 10 - EXPLANTES DE E. cloeziana ENRAIZADOS in vitro DURANTE 30 DIAS E PERTENCENTES AOS TRATAMENTOS pH 3,8 E 30 g.L-1 de SACAROSE ( A à D) E pH 5,8 COM 30 g.L-1 de SACAROSE (E à H) (Barras= 1 cm). ... 82
Figura 11 - ENRAIZAMENTO ex vitro DE EXPLANTES DE E. cloeziana PERTENCENTES AOS TRATAMENTOS COM pH 3,8 E 30 g.L-1 DE SACAROSE (A À D)E pH 5,8 E 15 g.L-1 DE SACAROSE ( E à H) APÓS 30 DIAS (Barras= 1 cm). ... 91
Figura 12 - EXPLANTE DE E. cloeziana COM ALTA FORMAÇÃO DE CALOS NA BASE (Barra= 1 cm). ... 92
Figura 13 - ENRAIZAMENTO in vitro DE EXPLANTES DE Eucalyptus
cloeziana EM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE CARBOIDRATOS. (A à
D) TRATAMENTO 1- GLICOSE (15 DIAS) + SACAROSE (15 DIAS) COM FITORREGULADOR. (E à H) TRATAMENTO 4- GLICOSE + SACAROSE SEM FITORREGULADOR (30 DIAS) (Barras= 1cm). ... 96
Figura 14 - EXPLANTES DE E. cloeziana QUE ENRAIZARAM ex vitro EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA E PERTENCEM AOS TRATAMENTOS 1, COMPOSTO POR GLICOSE (15 DIAS) + SACAROSE (15 DIAS) COM FITORREGULADOR (A à D). TRATAMENTO 4, COMPOSTO POR GLICOSE + SACAROSE SEM FITORREGULADOR (30 DIAS) (E à H). (Barras= 1 cm). ... 102
Figura 15 - BROTAÇÕES DE Eucalyptus cloeziana enraizadas in vitro NOS TRATAMENTOS CONTENDO 2,5 g.L-1 DE CARVÃO ATIVADO NA FASE DE ALONGAMENTO E DE ENRAIZAMENTO (TRATAMENTO 1: A à D), E CONTENDO 2,5 g.L-1 DE CARVÃO ATIVADO SOMENTE NA FASE DE ALONGAMENTO (TRATAMENTO 2: E à H) APÓS 30 DIAS (Barras= 1 cm). ... 105
Figura 16 - BROTAÇÕES DE E. cloeziana enraizadas in vitro APÓS 30 DIAS E PERTENCENTES AO TRATAMENTO 3 (A à D), CONTENDO 2,5 g.L-1 DE CARVÃO ATIVADO SOMENTE NA FASE DE ENRAIZAMENTO (Barras= 1 cm). ... 106
Figura 17 - BROTAÇÕES DE E. cloeziana ENRAIZADAS APÓS 30 DIAS DE CULTIVO EM SISTEMA DE MINI-ESTUFA E PERTCENTES AO TRATAMENTO 1 ( A à D), CONTENDO 2,5 g.L-1 de CARVÃO ATIVADO NA FASE DE ALONGAMENTO E DE ENRAIZAMENTO (Barras= 1 cm). ... 111
Figura 18 - BROTAÇÕES DE E. cloeziana enraizadas APÓS O PERÍODO DE 30 DIAS E QUE PERTENCIAM AOS TRATAMENTOS 2, CONTENDO 2,5 g.L-1 DE CARVÃO SOMENTE NA FASE DE ALONGAMENTO (A à D), E 3, QUE CONTINHA 2,5 g.L-1 DE CARVÃO ATIVADO NA FASE DE ENRAIZAMENTO SOMENTE (E à H). (Barras= 1 cm). ... 112
Figura 19 - EXPLANTES DE E. cloeziana MORTOS DURANTE O PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO (Barras= 3 cm). ... 116
Figura 20 - EXPLANTES DE E. cloeziana SOBREVIVENTES APÓS O PERÍODO DE 30 DIAS DE ACLIMATIZAÇÃO EM LABORATÓRIO (A e B). ... 118
Figura 21 - MICROESTACAS DE E. cloeziana QUE SOBREVIVERAM DURANTE O PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO AO FINAL DE 90 DIAS EM LABORATÓRIO (Barra= 4 cm). ... 119
Figura 22 - ACLIMATIZAÇÃO DE MUDAS DE E. cloeziana COM SOMBRITE 50% EM CASA DE VEGETAÇÃO DURANTE 15 DIAS (A), E A PLENO SOL APÓS 30 DIAS (B) (Barra= 10 cm). ... 120
Figura 23 - EXPLANTES DE E. cloeziana QUE SOBREVIVERAM ATÉ OS 60 DIAS DO PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO EM LABORATÓRIO (A e B) (Barras= 5 cm). ... 122
Figura 24 - MUDAS DE E. cloeziana SOBREVIVENTES APÓS 90 DIAS DE ACLIMATIZAÇÃO EM LABORATÓRIO (A), E SOBREVIVENTES APÓS O PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO EM CASA DE VEGETAÇÃO COM SOMBRITE 50% DURANTE 15 DIAS (B) E A PLENO SOL APÓS 30 DIAS (C). (Barras= 5 cm). ... 123
Figura 25 - MUDAS DE E. cloeziana SOBREVIVENTES DURANTE O PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO EM LABORATÓRIO. (A) PRIMEIROS 30 DIAS; (B) MUDA DE E. cloeziana SOBREVIVENTE AO FINAL DE 60 DIAS E (C) ALGUMAS MUDAS DE E. cloeziana SOBREVIVENTES AO FINAL DE 90 DIAS (Barras= 6 cm). ... 124
Figura 26 - MUDAS DE E. cloeziana ACLIMATIZADAS EM CASA DE VEGETAÇÃO. (A) PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO EM SOMBRITE A 50% DURANTE 15 DIAS. (B) PERÍODO DE ACLIMATIZAÇÃO A PLENO SOL DURANTE 20 DIAS (Barras= 10 cm). ... 125
xix RESUMO
FIGUEIREDO, A. J. R. Enraizamento in vitro de Eucalyptus cloeziana F. Muell. 2017. (Mestrado em Ciências Florestais e Ambientais) – Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá-MT. Orientador: Prof. Dr. André Luís Lopes da Silva. Coorientador. Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani. Dentre as espécies de Eucalyptus utilizadas no setor florestal, o E.
cloeziana destaca-se pela alta qualidade da madeira, possibilitando o uso
no setor madeireiro, industrial e construção civil. Porém, a expansão dos plantios comerciais tem sido prejudicada pois a espécie é pouco responsiva à rizogênese. O objetivo do trabalho foi estabeleber uma metologia da fase de enraizamento in vitro e ex vitro que irá promover a formação de raízes adventícias em Eucalyptus cloeziana. Explantes de um protocolo de micropropagação através da organogênese indireta foram utilizados como fonte de propágulos, e submetidos a multiplicação em meio de cultura WPM contendo 0,50 mg.L-1 de BAP e 0,05 mg L-1 de ANA. A etapa de alongamento foi realizada em dois meios de cultura, o primeiro suplementado com 0,05 mg.L-1 de BAP, 0,1 mg.L-1 de ANA e 0,1 mg.L-1 de AIB, com metade da concentrações de sais do meio WPM. O segundo continha 0,1 mg.L-1 de ANA e 0,1 mg.L-1 de AIB, com 2,5 g.L-1 de carvão ativado. O primeiro experimento de enraizamento in vitro e ex vitro foi realizado com explantes do primeiro meio de alongamento, e composto por quatro ajustes de pH (3,8; 4,8; 5,8 e 6,8) e três concentrações de sacarose (0, 15 e 30 g.L-1). O segundo experimento possuía as mesmas condições do anterior, mas os explantes utilizados foram submetidos ao segundo meio de alongamento. O terceiro testou carboidratos e suas combinações (T1= glicose (15 dias) + sacarose (15 dias) com fitorregulador (0,1 mg.L-1 de AIB e 0,2 mg.L-1 de ANA); T2= glicose (15 dias) + sacarose (15 dias) sem fitorregulador; T3= glicose + sacarose com fitorregulador, mesma concentração do tratamento 1 (30 dias); T4= glicose + sacarose sem fitorregulador (30 dias). O quarto objetivou avaliar o efeito do carvão ativado (2,5 g.L-1) no alongamento e no enraizamento. Ao final de 30 dias foram avaliadas a porcentagem de sobrevivência, enraizamento, número e comprimento total e médio das raízes. O enraizamento ex vitro foi realizado em sistema de mini-estufa durante 30 dias e ao final as mesmas variáveis da fase anterior foram analisadas. A aclimatização foi realizada inicialmente em laboratório e depois finalizada em casa de vegetação, nessa fase foi avaliada a porcentagem de sobrevivência. No primeiro experimento, nenhum explante enraizou in vitro, e em condições ex vitro os melhores resultados foram obtidos em pH 5,8 com 30 g.L-1 de sacarose. No segundo as maiores taxas de enraizamento foram obtidas com pH 3,8 e 30 g.L-1 de sacarose e pH 5,8 com 15 g.L-1 e 30 g.L-1 de sacarose. No terceiro, os melhores tratamentos para o enraizamento foram, glicose (15 dias) + sacarose (15 dias) com fitorregulador e 15 g.L-1 de glicose + 15 g.L-1 de sacarose sem fitorregulador (30 dias). No experimento testando carvão ativado, se sobressaiu o tratamento contendo 2,5 g.L-1 desse componente
xx
no alongamento e no enraizamento. Levando em consideração a dificuldade da espécie E. cloeziana na formação de raízes adventícias, os resultados obtidos se mostram promissores. Na aclimatização, resultados satisfatórios foram obtidos no experimento testando carvão ativado nas fases de alongamento e enraizamento.
Palavras-chave: Rizogênese, micropropagação, pH, carboidratos, carvão ativado.
xxi
ABSTRACT
FIGUEIREDO, A. J. R. In vitro rooting of Eucalyptus cloeziana F. Muell. 2017. Dissertation (Master of Forestry and Environmental Sciences) – Federal University of Mato Grosso, Cuiabá-MT. Advisor: Prof. Dr. André Luís Lopes da Silva. Co-advisor. Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani.
Among the Eucalyptus species used in the forest sector, E. cloeziana stands out for high quality of the wood, making it possible to use it in the timber, industrial and civil construction sectors. However, the expansion of commercial plantations has been hampered because the species is little responsive to rhizogenesis. The aim of the work was to establish an in vitro and ex vitro rooting phase methodology that will promote the formation of adventitious roots in Eucalyptus cloeziana. Explants of a micropropagation protocol through indirect organogenesis were used as source of propagules, and submitted to multiplication in WPM culture medium containing 0.50 mg.L-1 of BAP and 0.05 mg L-1 of NAA. The elongation step was performed in two culture media, the first one supplemented with 0.05 mg.L-1 of BAP, 0.1 mg.L-1 of NAA and 0.1 mg.L-1 of IBA, with half of salt concentrations of WPM medium. The second contained 0.1 mg.L-1 of NAA and 0.1 mg.L-1 of IBA, with 2.5 g.L-1 of activated charcoal. The first in vitro and ex vitro rooting experiment was performed with explants from the first elongation medium, and composed of four pH adjustments (3.8, 4.8, 5.8 and 6.8) and three concentrations of sucrose ( 0, 15 and 30 g.L-1). The second experiment had the same conditions as the previous one, but the explants used were submitted to the second elongation medium. The third one tested carbohydrate and their combinations (T1 = glucose (15 days) + sucrose (15 days) with phytoregulator (0.1 mg.L-1 of IBA and 0.2 mg.L-1 of NAA); T2 = (15 days) + sucrose (15 days) without phytoregulator, T3 = glucose + sucrose with phytoregulator, same concentration of previous treatment (30 days), T4 = glucose + sucrose without phytoregulator (30 days). The fourth tested the effect of activated charcoal (2.5 g.L-1) on the elongation and rooting. After 30 days, percentage of survival, rooting, number and total and average roots length were evaluated. The ex vitro rooting was performed in a mini-greenhouse system for 30 days and the same variables from the previous phase were analyzed. Acclimatization was initially conducted in laboratory and then finished in greenhouse, at that stage, the percentage of survival was evaluated. In the first experiment, no explants rooted in vitro, and under ex vitro conditions the best results were obtained at pH 5.8 with 30 g.L-1 of sucrose. In the second, the highest rooting rates were obtained with pH 3.8 and 30 g.L-1 and pH 5.8 with 15 g.L-1 and 30 g.L-1 sucrose. In the third, the best treatments were glucose (15 days) + sucrose (15 days) with phytoregulator and 15 g.L-1 glucose + 15 g.L-1 sucrose without phytoregulator (30 days). In the test of activated charcoal, the treatment containing 2.5 g.L-1 of this component in the elongation and rooting was the best. Taking into account the difficulty of E. cloeziana in the formation of adventitious roots, the results obtained are promising. In the acclimatization,
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satisfactory results were obtained in the experiment testing activated charcoal in the elongation and rooting phases.
Key words: Rhizogenesis, micropropagation, pH, carbohydrates, activated charcoal.
23 1. INTRODUÇÃO
O grande potencial das espécies de Eucalyptus para produção de madeira e uso nas indústrias florestais promoveu o seu domínio na silvicultura brasileira. Devido a sua importância no setor florestal, elevou-se o número de estabelecimentos de plantios comerciais em todo o mundo, e diante do seu valor econômico, a silvicultura clonal mostra-se como uma alternativa para aprimorar as qualidades desses plantios. A utlização de técnicas de propagação vegetiva tem possibilitado muitos benefícios na área florestal, proporcionando a formação de plantios clonais mais produtivos, associados à progressos na melhoria da qualidade da madeira e seus subprodutos.
Dentre as inúmeras espécies de Eucalyptus, uma vem se destacando no âmbito florestal pelo seu potencial na produção de carvão, uso em serrarias e construção civil, o Eucalyptus cloeziana. Esse sucesso está ligado à excelente qualidade tecnológica da sua madeira, como alta densidade e grande durabilidade (ALMEIDA et al., 2007). Esses fatores aumentaram o interesse nessa espécie, que se adapta muito bem às regiões tropicais e subtropicais (TRUEMAN et al., 2013).
No entanto, a expansão de plantios comerciais tem sido limitada devido a alguns problemas encontrados na sua propagação clonal. A espécie é considerada recalcitrante ao enraizamento adventício (ALFENAS et la., 2009), o que atrapalha no avanço da produção de mudas clonais, pois os índices de sucesso nessa etapa ainda são baixos.
Diante dos problemas encontrados, e como uma nova forma de clonagem, a micropropagação, aparece como uma alternativa para contornar as adversidades quando outras técnicas de propagação clonal não apresentam resultados satisfatórios para determinadas espécies. A etapa de enraizamento é crucial para garantir o sucesso da micropropagação, pois a formação de um sistema radicial funcional, é uma das principais razões para o desenvolvimento de uma muda completa para futuro estabelecimento de plantios.
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Os maiores obstáculos relacionados aos eventos envolvidos no processo de rizogênese in vitro e ex vitro situam-se na dificuldade de isolar e caracterizar os fatores que os controlam, em virtude da sua complexidade e da alta interação entre eles. Assim sendo, alguns pontos básicos devem ser analisados quando se pretende desenvolver uma metodologia para o enraizamento.
Diversos autores sugerem que a variação do pH influencia a disponibilidade de um componente ou um nutriente, com um efeito subsequente na produção de raízes. Ademais, há relatos sobre o efeito do pH no enraizamento in vitro, que está relacionado com a ação de auxinas e com a absorção de nutrientes que interferem nesse processo (KLERK et al. 2008; BENNETT et al. 2004). Metabolicamente, a iniciação da raiz requer alta energia e um fornecimento contínuo de açúcares livres no meio para o seu crescimento vigoroso (ASSIS e TEIXEIRA, 1998). Para espécies lenhosas que apresentam dificuldades de enraizar, como o caso do E.
cloeziana, outras substâncias podem ser adicionadas ao meio de cultura, a
fim de aumentar a porcentagem de enraizamento e a qualidade das raízes, e o carvão ativado é um exemplo delas (FUKUDA, 2012).
Apesar de alguns pesquisadores afirmarem que o enraizamento
in vitro é desnecessário sob o ponto de vista econômico e em relação a
qualidade do sistema de raízes, para algumas espécies é considerado fundamental. Dessa forma, uma possibildade seria submeter as brotações a uma fase de indução in vitro, seguida de uma etapa de alongamento em substrato, condição ex vitro, em razão de que raízes mais curtas geralmente estão em fase de crescimento ativo, sendo mais adequadas ao transplante, por motivos de facilitar o manuseio, o pegamento e o posterior desenvolvimento ex vitro das plantas (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; WOODHEAD e BIRD, 1998; SILVA et al., 2008).
Visto isso, desvendar esses fatores que influenciam o enraizamento, pode ser um passo fundamental para conseguir avanços na formação de raízes adventícias de E. cloeziana, e consequentemente a obtenção de mudas clonais que serão utilizadas em futuros plantios da espécie.
25 1.1. OBJETIVO GERAL
Estabelecer uma metodologia da fase de enraizamento tanto in
vitro quanto ex vitro que irá promover a formação de raízes adventícias de Eucalyptus cloeziana.
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito de diferentes ajustes de pH e concentrações de sacarose na indução e características de desenvolvimento de raízes;
Verificar se fatores como carvão ativado, BAP e luz envolvidos no processo de micropropagação, terão influência na fase de enraizamento;
Avaliar o efeito de diferentes fontes de carboidratos e suas combinações na formação de raízes adventícias.
26 2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O GÊNERO Eucalyptus
O gênero Eucalyptus possui mais de 700 espécies, subdivididas em 8 subgêneros, e pertence à família Myrtaceae. É nativo da Austrália, porém ocorre nos territórios das Filipinas, Ihas Timor e Nova Guiné (LADIGES et al., 2003; BOLAND et al., 2006). Foi introduzido no Brasil em 1824, quando as primeiras mudas foram plantadas no Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Em 1904 passou a ser plantado com fins comerciais por Edmundo Navarro de Andrade, a fim de atender a demanda de madeira que seriam destinadas a construção de ferrovias (ZANUNCIO et al., 1991; CASTRO et al., 2016). Grandes plantações comerciais começaram a ser estabelecidas a partir de 1966 devido a Lei dos Incentivos Fiscais do governo brasileiro para o reflorestamento, com a expansão da indústria siderúrgica, que utiliza carvão vegetal, e da indústria de papel e celulose (SANTOS et al., 2002; GRATTAPAGLIA, 2008).
No Brasil, as espécies do gênero Eucalyptus ocupam área plantada de cerca de 5,60 milhões de hectares, o que representa 71,9% do total, e estão localizados principalmente nos Estados de Minas Gerais (24%), São Paulo (17%) e Mato Grosso do Sul (15%). Sendo que nos últimos 5 anos, o crescimento da área de eucalipto foi de 2,8% a.a. (IBÁ, 2016). Este fato se deve ao rápido crescimento, boa adaptabilidade a vários ambientes, alta produtividade e aplicabilidade da sua madeira para diversos fins. Por consequência, os esforços depositados nesse setor são crescentes a fim de se estabelecer florestas de usos múltiplos, voltadas para suprir a demanda de madeira tanto do mercado nacional quanto internacional, que é utilizada para energia, celulose, serraria e outras finalidades, para substituir o uso de madeiras de florestas nativas. Esses reflorestamentos acabam proporcionando benefícios, como a diminuição da pressão sobre as reservas nativas (SANTOS et al., 2002; MARTINS et al., 2005).
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Graças aos avanços na área de biotecnologia associado às técnicas convencionais de melhoramento genético, o potencial de produção do Eucalyptus tem sido aumentado para o uso em escala comercial. Características como melhor forma, maior densidade, maior quantidade de fibras e resistência a pragas e doenças, a seca, ao frio ou a salinidade, aliadas à adaptabilidade as condições climáticas do Brasil, aumentaram consideravelmente a sua produtividade (ARAÚJO et al., 2004; BERTI, 2010). Além de se aproximarem das espécies arbóreas nativas devido a sua alta qualidade, as espécies de eucaliptos prestam um serviço ambiental que pouco se comentava antes, a captura de carbono atmosférico (ZORZ, 2016).
Por ter se tornado um dos gêneros mais explorados nas regiões tropicais e subtropicais, o Eucalyptus tem merecido atenção especial na silvicultura clonal. A importância das espécies de eucalipto nesse tipo de programa resulta principalmente de interesses econômicos, das experiências adquiridas na silvicultura em várias condições ambientais, do domínio da tecnologia para as mais diversas aplicações, do uso dos produtos advindos das árvores, da existência de grande variabilidade genética das populações para os mais variados propósitos comerciais, pela razoável facilidade de propagação vegetativa, aliadas às características de rápido crescimento (XAVIER et al., 2001; ASSIS; MAFIA, 2007).
O Brasil se manteve mais uma vez na liderança no ranking global em relação à produtividade florestal no ano de 2014. A produtividade média dos plantios brasileiros de eucalipto atingiu 36 m³/ha.ano, nos últimos cinco anos, a produtividade do eucalipto aumentou em uma taxa de 0,7% a.a. (IBÁ, 2016), o que concretiza o sucesso da indústria brasileira de base florestal. Por esse motivo, grandes empreendimentos consumidores de madeira estão cada vez mais interessados em investir nesse tipo de plantio. Diante disso, é imprescindível a realização de ensaios de espécies de eucaliptos para conhecimento de suas características, e então promover o uso comercial para determinado setor florestal.
28 2.2. A ESPÉCIE Eucalyptus cloeziana
Eucalyptus cloeziana F. Muell. tem uma ampla distribuição
natural no leste do estado de Queensland, ocorrendo em quatro regiões geográficas distintas: litoral sul e norte (precipitação anual > 1400 mm) e interior sul e norte (precipitação anual < 700 mm), em altitudes variando de 70 a 380m no sul e próximo a 900m nas chapadas de Atherton, no norte. A temperatura média máxima nesses locais fica em torno de 29°C e a temperatura média mínima varia entre 9 e 12°C (TURNBULL, 1979; MOURA et al., 1993; BOLAND et al., 2006).
A principal área de ocorrência é no distrito de Gympie, no sudeste do estado, em torno de 26º de latitude, por isso a espécie também é conhecida por Gympie messmate, sua sinonímia, onde apresenta seu melhor desenvolvimento, com indivíduos atingindo até 55 m de altura e diâmetro à altura do peito (DAP) até dois metros e uma excelente forma. Contudo, em outros locais de sua distribuição natural, o mesmo não acontece, pois ocorrem desde pequenas árvores tortuosas com menos de 10 m de altura até árvores com 20-35 m, de forma variável (MOURA et al., 1993; HALL et al., 1995; FONSECA et al., 2010).
O melhor desenvolvimento ocorre em solos argilosos e profundos de origem vulcânica, no entanto, se dá também em solos de profundidade média e arenosos derivados de granito (NGUGI et al., 2004; FONSECA et al., 2010). Ngugi et al. (2003) relataram um crescimento satisfatório de procedências do litoral norte e sul testados em sítos que têm uma precipitação anual superior a 1200 mm na Austrália, Brasil e República do Congo (Figura 1). Segundo os mesmos autores, as grandes diferenças de precipitação, temperatura, geologia e solos entre estes habitats sugerem que a espécie tenha um alto nível de variabilidade genética. E. cloeziana é o único representante do subgênero Idiogenes, por não se encaixar facilmente nos outros subgnêneros estabelecidos devido a sua estrutura de opérculo único (PRYOR et al., 1967; STOKOE et al., 2001).
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FIGURA 1 - DISTRIBUIÇÃO NATURAL DE Eucalyptus cloeziana NA AUSTRÁLIA. FONTE: BOLAND et al. (2006).
A espécie possui tronco ereto, com casca persistente, brandamente sulcada, de cor marrom-escura e escamosa. Possui flores brancas, pequenas, com estames brancos, formando botões globosos de opérculo indistinto. O fruto é uma cápsula, globoso, de cerca de 10 mm de diâmetro, com 3-4 valvas levemente salientes, contendo sementes escuras (BOLAND et al., 2006; CLARKE et al., 2009).
De acordo com Golfari et al. (1978), E. cloeziana é uma espécie considerada de introdução recente no Brasil, iniciando-se há cerca de 50 anos atrás (1970), e até o momento, muitas introduções foram feitas por órgãos públicos, universidades e companhias privadas. As primeiras coletas foram feitas sem a preocupação de separar as sementes por matrizes, porém as coletas mais recentes foram obtidas de indivíduos selecionados em sua região de ocorrência, e introduzidas na forma de progênies, para avaliação genética da descendência dessas matrizes (MOURA, 2003).
No Brasil, tem-se observado melhor desenvolvimento desta espécie em regiões subtropicais como o sudeste e o sul (LORENZI et al., 2003). Nos chapadões do alto Vale do Jequitinhonha, MG, E. cloeziana
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supera todas as demais espécies de Eucalyptus testadas. E. cloeziana tem demonstrado bom desempenho, tanto em regiões de mata como de Cerrado (Savana) onde, segundo Moura e Guimarães (1988) foram registrados crescimentos em volume iguais a 35 m3/ha/ano, destacando-se materiais procedentes de Kennedy, assim como também na região nordeste do pais onde plantios das procedências de Gympie e Paluma tiveram desenvolvimento satisaftório (SOUZA et al., 1992; MOURA, 2003).
E. cloeziana vem sendo plantado desde 1992 em escala comercial e em
teste de introdução de espécies, progênies e procedências, nos mais diversos tipos de solo do litoral norte da Bahia (ARAÚJO et al., 2004).
É uma espécie rústica e de rápido crescimento, sua madeira tem coloração castanho-amarelada, é forte, dura e extremamente durável, qualidades estas que a colocam como espécie potencial em programas de florestamento e reflorestamento destinado à produção de madeira para diversos usos (MOURA et al., 1993; LORENZI et al., 2003; BERTI, 2010). Segundo Boland et al. (1991) é uma madeira altamente resistente à deterioração em contato com o solo ou em condições úmidas, mal ventiladas. Dentre os principais usos da madeira de E. cloeziana, destacam-se aqueles para construção civil, dormentes, postes, telhados, pórticos, decks (paisagismo), muros de arrimo, cercas, pisos e painéis (PEREIRA et al., 2000; BOLAND et al., 2006; PALUDZYSZYN FILHO et al., 2006). Diante da exposição de toda a sua característica, o E. cloeziana é considerado uma das espécies candidatas para o estabelecimento de plantios comerciais, com objetivo de produção de madeira.
Dentre as espécies plantadas para fins energéticos comerciais, o Eucalyptus cloeziana vem se destacando principalmente por sua alta densidade (0,60 g/cm³), superior a de outras espécies plantadas, tais como
E. urophylla e E. grandis e algumas procedências de E. camaldulensis
(ALBINO; TOMAZELLO FILHO, 1985; CHEN et al., 2010, COUTO et al., 2011), refletindo em um carvão mais denso. Além disso, apresentam altos teores de carbono fixo e baixos teores de cinzas no processo de carbonização, requisitos imprescindíveis para esse fim (GONÇALVES et al., 2010). No Brasil, o plantio da espécie está sendo voltado para este setor e para a produção de madeira, portanto, as áreas mais extensas de plantios
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estão nas regiões onde há empresas que produzem carvão para atender o setor siderúrgico, como no estado de Minas Gerais (OLIVEIRA, 2014).
Apesar dos avanços na silvicultura clonal, problemas na produção de mudas e propagação clonal por estacas (Alfenas et al. 2009) tem limitado o estabelecimento e expansão de plantações comerciais de E.
cloeziana. Na produção de mudas a partir de sementes, o E. cloeziana
apresenta restrições, pois mesmo produzindo grandes quantidade de semente sua germinação é baixa e as mudas de difícil trato em viveiro, tendo grande sensibilidade à repicagem (MOURA e GUIMARÃES, 2003). Outro fator limitante é a recalcitrância ao enraizamento adventício de estacas e microestacas da espécie, o que corresponde ao principal entrave na expansão dos plantios (ALFENAS et al., 2009, OLIVEIRA et al., 2016). Diante disso, maiores estudos relacionados à propagação de Eucalyptus
cloeziana devem ser realizados, de forma a atender aos programas de
melhoramento genético que consequentemente irão suprir a demanda dos plantios comerciais (OLIVEIRA, 2014).
2.3. PROPAGAÇÃO DE Eucalyptus
A propagação vegetativa ou propagação assexual baseia-se na obtenção de mudas geneticamente idênticas à planta-matriz a partir de diferentes órgãos vegetativos, formando então o clone. Fato esse, que somente é possível devido à capacidade que células, tecidos ou órgãos possuem para regenerar novas plantas, em razão da sua totipotência. Nessa metodologia, a mitose é o processo responsável pelo controle, desenvolvimento e crescimento das plantas, na qual é mantida a identidade genética da planta matriz (HARTMANN et al., 2011, XAVIER et al., 2013). A silvicultura clonal atua como um fator importante nos programas de melhoramento de espécies florestais, pois é uma alternativa para a obtenção de indivíduos que apresentam características genéticas superiores, com o completo uso do seu material genético, principalmente em situações onde a semente é um fator limitante. Além disso, permite a retenção do potencial genético do material elite selecionado, incluindo os componentes não aditivos da variação genética, que não estão
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relacionados com os efeitos de seleção em uma nova geração (SOUZA JUNIOR e WENDLING, 2003; XAVIER et al., 2013).
Em termos gerais as vantagens da propagação vegetativa são: uniformidade dos plantios, resistências a doenças, adaptações dos clones específicos para determinados sítios e aumento da produção de madeira em quantidade e qualidade desejáveis para determinados fins, e a obtenção destes em um curto período de tempo, em comparação com plantios oriundos de mudas produzidas por sementes (XAVIER e COMÉRIO, 1996; CAMPINHOS et al., 1999; ALFENAS et al., 2009, XAVIER et al., 2013).
O desenvolvimento da clonagem com espécies puras e de híbridos interespecíficos do gênero Eucalyptus, por meio do enraizamento de estacas, foi o marco inicial para a propagação vegetativa assumir posição de destaque e despertar o interesse de empresas e pesquisadores (TITON et al., 2003).
A silvicultura clonal com Eucalyptus é umas das mais evoluídas e se encontra bem estabelecida, e os resultados verificados em campo têm levado à sua implementação de forma intensiva em diferentes regiões do mundo (XAVIER et al., 2013). No Brasil, a propagação vegetativa de
Eucalyptus passou por consideráveis mudanças, sua implementação
ocorreu em meados da década de 70, pelo método da estaquia, e até hoje é uma estratégia praticada por empresas florestais (IKEMORI, 1975; WENDLING, 2002; ASSIS e MAFIA, 2007).
Entre os métodos em escala comercial de propagação clonal, a estaquia é a principal técnica utilizada na silvicultura clonal intensiva de
Eucalyptus. A estaquia é ainda, a técnica da qual se têm o maior domínio
e conhecimento científico, representando um dos maiores avanços tecnológicos na área florestal. É o processo de propagação vegetativa que consiste em colocar um segmento caulinar, foliar ou radicular em meio adequado para o enraizamento e desenvolvimento da parte aérea e da raiz, visando à formação de uma muda (ALMEIDA et al., 2007; XAVIER et al., 2013).
No entanto algumas ressalvas devem ser feitas devido a algumas desvantagens ou limitações que essa técnica possui, como o risco
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de estreitamento excessivo da base genética dos plantios clonais, a não ocorrência de ganhos genéticos adicionais a partir da primeira geração de seleção, a dificuldade de obtenção de enraizamento em plantas não juvenis (ASSIS, 1997; XAVIER et al., 2013). O que se torna um problema grande para algumas espécies que já apresentam baixa predisposição ao enraizamento, como o Eucalyptus cloeziana (ROTUNDO, 1993; ALFENAS et al., 2009).
Devido à importância do gênero Eucalyptus no cenário da silvicultura clonal, surgiu a partir da década de 90 a técnica da miniestaquia, que é uma variação da estaquia convencional. Este processo proporcionou a minimização de algumas dificuldades encontradas no processo de produção de mudas de certos clones e espécies, principalmente no que se refere ao enraizamento (ALFENAS et al., 2009; XAVIER et al., 2013).
A miniestaquia consiste na utilização de brotações de plantas propagadas pelo método da estaquia convencional ou própria miniestaquia como fonte de propágulos vegetativos. O êxito dessa técnica na propagação vegetativa de Eucalyptus deve-se, em parte, ao conhecimento do processo de maturação que geralmente afeta as espécies lenhosas, de acordo com o seu desenvolvimento ontogênico (ALMEIDA et al., 2007b; WENDLING e XAVIER, 2001). Atualmente a técnica mais empregada na silvicultura clonal pelas empresas florestais é a miniestaquia, todavia muitas empresas já estão aplicando a cultura de tecidos para a produção massal de genótipos selecionados através de sucessivas gerações (WATT et al., 2003; XAVIER et al., 2013), bem como promover o rejuvenescimento do tecido vegetal (ALFENAS et al., 2009). De acordo com Grattapaglia e Machado (1998), a propagação vegetativa in vitro pode ser considerada a aplicação mais prática da cultura de tecidos e aquela de maior impacto.
Algumas das espécies de eucalipto mais cultivadas no mundo, como Eucalyptus camaldulensis, E. grandis e E urophylla são produzidas a partir de estacas (CUNHA et al., 2009; WU et al., 2011; XAVIER et al., 2010; DUTRA et al., 2009). No entanto, muitas plantações de eucalipto são consideradas difíceis de propagar via estacas. Nesse cenário está incluso o Eucalyptus cloeziana (TRUEMAN et al., 2013; ASSIS et al., 2004; ALMEIDA et al., 2007).
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Na micropropagação, a alta taxa de multiplicação acelera os programas de propagação clonal e possibilita a clonagem de híbridos e espécies de Eucalyptus de alto valor e difícil enraizamento, nesse caso, enquadra-se o E. cloeziana (ALMEIDA, 2006; XAVIER et al., 2013). Na busca por alternativas para a melhoria do enraizamento no processo de produção de mudas clonais de Eucalyptus, a micropropagação via proliferação de gemas axilares, tem sido recomendada como técnica de rejuvenescimento e/ou revigoramento de clones selecionados (XAVIER et al., 2001; TITON et al., 2002; GOMES e CANHOTO, 2003; BRONDANI et al., 2009; XAVIER et al., 2009, OLIVEIRA, 2014).
Diante do exposto, a micropropagação apresenta-se como uma ferramenta de grande utilidade no setor florestal, contornando as dificuldades encontradas por meio do uso das técnicas convencionais de propagação vegetal, em razão de possibilitar a formação e manutenção de microjardins clonais, permitindo a propagação de genótipos de interesse (OLIVEIRA et al., 2012). Com o aprimoramento da técnica de estaquia, por intermédio da mini e microestaquia, possibilitou avanços consideráveis no processo de produção de mudas clonais de Eucalyptus, principalmente no que se refere à maximização dos índices de enraizamento (XAVIER et al., 2001).
Há ainda poucos estudos relacionados à propagação vegetativa de Eucalyptus cloeziana. Em relação à técnica de miniestaquia, Almeida et al. (2007b) verificaram altas taxas de enraizamento de miniestacas de 7 clones da espécie. Trueman et al. (2013) constatou ao estudar E. cloeziana, que temperaturas por volta de 33°C foram eficazes ao proporcionar um maior número de miniestacas pelas minicepas e aumentar os percentuais de enraizamento das mesmas.
2.4. MICROPROPAGAÇÃO DE Eucalyptus
De acordo com Ferreira et al. (1998), a micropropagação consiste na produção de plantas idênticas à planta mãe pela capacidade natural de multiplicação vegetativa das espécies. Baseia-se no fato de qualquer célula ou organismo ser totipotente, ou seja, conter no seu núcleo
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toda a informação genética necessária à regeneração de uma planta completa.
A micropropagação envolve a produção de plantas a partir de órgãos, tecidos ou células (explantes), que são cultivados in vitro sob condições assépticas em meios contendo nutrientes adequados e condições ambientais controladas (BRONDANI et al., 2012; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; PAIVA e GOMES, 1995). Ainda segundo Hartmann et al. (2011), a micropropagação compreende o cultivo asséptico de partes das plantas em condições controladas de nutrição, umidade, luz e temperatura.
A propagação in vitro permite que um grande número de plantas possam ser obtidas a partir de alguns explantes em um curto período de tempo e dentro de uma pequena área (NEHRA et al., 2005; GEORGE et al., 2008). Tais técnicas são particularmente valiosas para programas de melhoramento que visam maximizar ou manter o valor genético, favorecendo novos desenvolvimentos e melhoria dos métodos de clonagem de genótipos selecionados de árvores maduras em sistemas clonais (WATT et al., 2003; BRONDANI et al., 2012)
O eucalipto é o gênero florestal que mais possui estudos de micropropagação (DUTRA et al., 2009), e as técnicas de cultivo de tecidos e órgãos podem se tornar uma alternativa econômica e adequada em relação aos métodos clássicos de propagação vegetativa de eucalipto. Além de oferecerem a possibilidade de propagação de árvores selecionadas de todas as idades, possibilitam a limpeza clonal e, em razão da alta taxa de multiplicação, aceleram os programas de propagação vegetativa, condições estas, de grande valia para a propagação vegetativa de híbridos de Eucalyptus de alto valor e de difícil enraizamento pelos métodos convencionais (CHAPERON, 1987; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).
Ainda segundo Chaperon (1987), recomenda-se o uso da micropropagação de eucalipto em circunstâncias onde outras técnicas de propagação vegetativa não apresentam resultados satisfatórios para determinadas espécies, quando a árvore selecionada não pode ser rejuvenescida por meio da promoção de brotações basais e quando se
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deseja aumentar a taxa de propagação e abreviar o tempo para seu uso comercial.
A micropropagação de eucalipto pode ser realizada via proliferação de gemas axilares, organogênese e embriogênese somática (XAVIER et al., 2013). Dentre essas técnicas, a proliferação de gemas axilares provenientes de explantes obtidos tanto de plântulas como de material adulto, corresponde ao método mais utilizado na propagação in
vitro de espécies de eucalipto (XAVIER et al., 2010; BRONDANI et al.,
2012; OLIVEIRA et al., 2013).
Tem-se utilizado como fonte de explantes para inoculação in
vitro matrizes cultivadas em ambiente protegido, mini ou microjardim clonal,
brotações epicórmicas de árvores adultas, brotações de árvores decepadas ou ainda de galhos podados (DUTRA et al., 2009). Podem ser utilizados também propágulos provenientes de sementes germinadas in
vitro, devido a dificuldade em se obter material de plantas adultas, livre de
microrganismos e de serem responsivas à propagação em condições controladas, conforme exposto em diversos trabalhos (OLIVEIRA et al., 2013).
Alguns autores citam vários fatores que podem influenciar diretamente a micropropagação de Eucalyptus, tais como: o estado fisiológico da planta matriz, tipo de explante, tamanho do explante, estação do ano, reguladores de crescimento, meios de cultura, fonte carboidratos, pH, agentes gelificante e sucessivos subcultivos (GEORGE et al., 2008; HARTMANN et al., 2011; BORGES et al., 2012).
A micropropagação pode ser dividida em fases já padronizadas as quais são: seleção e desinfestação prévia dos propágulos escolhidos como explantes com o intuito de minimizar possíveis contaminações nas etapas seguintes; estabelecimento in vitro em meio nutritivo e condições assépticas; multiplicação dos propágulos mediante sucessivas subculturas; alongamento das brotações; enraizamento que pode ser in vitro e/ou ex
vitro e finalmente a aclimatização em ambiente ex vitro (MURASHIGE,
1974; DUTRA et al., 2009; BORGES et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011, OLIVEIRA, 2014).
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O estabelecimento in vitro tem início com o manejo das plantas matrizes e a seleção dos explantes mais adequados para a micropropagação e termina com a obtenção de uma cultura livre de contaminação e bem adaptada às condições in vitro (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; BORGES et al., 2012).
Os meios de cultura utilizados na micropropagação fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro (CALDAS et al., 1998). O meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) tem sido um dos mais utilizados na micropropagação de Eucalyptus e seus híbridos (BRONDANI et al., 2011). Além do meio de cultura MS, o meio WPM (Woody Plant Medium) (LLOYD e MCCOWN, 1980), desenvolvido especialmente para o cultivo in
vitro de espécies lenhosas, também é utilizado para Eucalyptus e muitas
espécies florestais. Entretanto, outros meios de cultura como o JADS (CORREIA et al., 1995) também tem sido empregados.
Assim que estabelecidos in vitro, os explantes são induzidos a multiplicarem em sucessivos subcultivos. Essa etapa de multiplicação caracteriza-se pela produção de um grande de número de gemas, através da quebra da dominância apical e promoção da multiplicação das brotações axilares (WATT, 2013; OLIVEIRA, 2014). A multiplicação é determinada pelo balanço adequado dos reguladores de crescimento, sendo os mais utilizados, as citocininas e as auxinas (DUTRA et al., 2009; XAVIER et al., 2013). No geral utiliza-se a citocinina 6-benzilaminopurina (BAP) e as auxinas, ácido α-naftalenoacético (ANA), ácido indolacético (AIA) e o ácido indolbutírico (AIB) na multiplicação in vitro de Eucalyptus. As concentrações desses fitorreguladores variam de acordo com a metodologia adotada, porém, nessa fase a concentração de citocininas deve ser maior que a auxina.
Quando se adota a micropropagação via proliferação de gemas axilares, é realizada a fase de multiplicação seguida de uma fase de alongamento in vitro (XAVIER et al., 2013). Essa fase é adicionada também em função do genótipo e de materiais genéticos de difícil propagação in
vitro, eventualmente é necessária uma fase de alongamento em meio de
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O alongamento in vitro é necessário para a obtenção de brotações com tamanho adequado para a fase de enraizamento in vitro ou
ex vitro (OLIVEIRA et al., 2013; XAVIER et al., 2013). Essa etapa é
estimulada por alterações no balanço hormonal, redução na concentração de citocininas utilizadas na fase de multiplicação, e aumento das auxinas (DUTRA et al., 2009). Há também a redução das concentrações dos sais dos meios de cultura (ARYA et al., 2009, BRONDANI et al., 2009).
O enraizamento, que pode ser tanto in vitro quanto ex vitro caracteriza-se pela indução de raízes adventícias em brotações alongadas, a partir de gemas na fase de multiplicação e alongamento, visando à obtenção de plantas completas para posterior transplante e aclimatização para as condições ex vitro (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; OLIVEIRA et al., 2013).
A fase final, a aclimatização, é considerada crítica, uma vez que essa mudança ambiental implica em estresses fisiológicos que podem resultar em grandes perdas do material micropropagado (DUTRA et al., 2009; LIMA, 2010; OLIVEIRA et al., 2013). A aclimatização é realizada em ambiente sombreado, onde as plantas ficam por um período variável de 15-30 dias e, posteriormente, são levadas para área de pleno sol, onde ocorre a rustificação e o crescimento (DUTRA et al., 2009).
Ainda há poucos relatos sobre a micropropagação de
Eucalyptus cloeziana. Oliveira (2014) descreveu pela primeira vez, um
protocolo de organogênese indireta de E. cloeziana a partir de calos induzidos em explantes juvenis, e também via proliferação de gemas axilares obtendo resultados promissores. Oliveira et al. (2015), desenvolveram um método de clonagem ao selecionar árvores adultas desta espécie pela técnica de micropropagação, ao promover a reversão ao estado juvenil e então obter um índice satisfatório de enraizamento. Zorz (2016) também desenvolveu um protocolo efetivo de micropropagação de
E. cloeziana através da organogênese indireta, avaliando a interação de
fitorreguladores em tecidos juvenis, atingindo resultados convincentes nas distintas etapas estabelecidas.
39 2.5. FASE DE ENRAIZAMENTO
O desenvolvimento do sistema radicial a partir da formação de raízes adventícias em plantas propagadas vegetativamente sob condições
in vitro, é um processo de grande complexidade envolvendo fatores
endógenos e exógenos que ainda não estão completamente elucidados (SOUZA e PEREIRA, 2007).
No enraizamento in vitro, as raízes são induzidas em meio de cultura sob condições laboratoriais, sendo em última fase, as plantas transplantadas para substratos e acondicionadas em casa de vegetação para a aclimatização. Neste caso, tem-se melhor controle das condições de cultura obtendo-se elevados percentuais de enraizamento (LEITZKE et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2013).
Muitos autores consideram a etapa de enraizamento in vitro não apropriada (NEWELL et al., 2003; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; WENDLING et al., 2006; BRONDANI, et al., 2012) devido ao aumento nos custos da produção na micropropagação, e também à dificuldade de plantar no solo explantes já enraizados. Alguns ainda acrescentam que as raízes formadas ex vitro são mais adequadas e funcionais do ponto de vista morfogênico (WENDLING et al., 2006).
No entanto, o enraizamento in vitro apresenta algumas vantagens, tais como, aumentar consideravelmente os explantes de tamanho durante a fase de enraizamento in vitro, já que muitas vezes as microestacas são caracterizadas como pequenas e vulneráveis no final do programa de micropropagação (KEVERS et al., 1997). Além disso, alguns autores correlacionam a compensação na perda de água durante a aclimatização com o número de raízes formadas in vitro devido ao mau funcionamento dos estômatos nessa fase (MOHAMMED e VIDAVER, 1991; DE KLERK, 2002; SEELYE et al., 2003). Outros descrevem que o desempenho ex vitro está relacionado com as raízes formadas no enraizamento in vitro (VAN TELGEN et al., 1992;DIAZ-PEREZ et al., 1995). No enraizamento ex vitro, as brotações alongadas são enraizadas diretamente no substrato. De acordo com Grattapaglia e Machado (1998) e Wendling et al. (2006) a rizogênese ex vitro proporciona
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redução de custo de mão-de-obra e economia de espaço na sala de crescimento, energia elétrica e meio de cultura. Quanto à qualidade, o método ex vitro tende a produzir um sistema radicular mais completo e funcional, com maior número de raízes secundárias.
O enraizamento adventício é uma etapa essencial na propagação vegetativa de espécies lenhosas economicamente importantes (FETT-NETO et al., 2001), e o enraizamento in vitro dessas espécies lenhosas é dependente do seu genótipo. Diferentes espécies, híbridos e até mesmo diferentes clones da mesma linhagem parental podem requerer diferentes condições de cultivo, conforme demonstrado pela variedade de protocolos publicados para enraizamento de microestacas de espécies de
Eucalyptus e híbridos (SOUZA e PEREIRA, 2007; DUTRA et al., 2009).
Em plantas cultivadas in vitro, as raízes adventícias podem ser formadas, na fase de alongamento, a partir de células de parênquima localizadas nas partes aéreas (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). De acordo com Takahashi et al. (2003), raízes consideradas adventícias e laterais se originam no periciclo do hipocótilo ou de raízes, respectivamente, com o primórdio radicular crescendo através da endoderme e tecidos corticais. Estas podem ser induzidas por danos mecânicos ou na sequência de regeneração de cultura de tecidos de brotos. Há pelo menos dois caminhos através dos quais podem se formar as raízes adventícias, ou que podem ser induzidas a formar: pela organogênese direta de células estabelecidas, como o câmbio; ou a partir de calos (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; LI et al., 2009).
O enraizamento adventício trata-se de um processo de rediferenciação, em que as células pré-determinadas mudam a sua trajetória morfogenética para atuar como células-mãe para os primórdios das raízes. Esse processo de enraizamento consiste em três fases fisiológicas sucessivas, mas interdependentes, com exigências diferentes, e são fases de indução, de iniciação e de expressão. A fase de indução compreende eventos moleculares e bioquímicos sem mudanças visíveis. A fase de iniciação é caracterizada por divisões celulares e organização de primórdios radiculares. A fase de expressão caracteriza-se por crescimento da intra-haste de primórdios radiciais e emergência da raiz (KEVERS et al.,
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1997; GRATTAPAGLIA e MACHADO 1998; CORRÊA et al., 2004; LI et al., 2009; HARTMANN, et al., 2011).
A rizogênese é um processo fundamental na propagação clonal de espécies e híbridos de Eucalyptus que visam aumentar o seu potencial econômico, principalmente no cultivo in vitro, pois são as raízes que irão proporcionar fixação eficiente no substrato e boa absorção de água e nutrientes do solo. A fim de avaliar melhor o enraizamento bem sucedido, é necessário prestar muita atenção não só para porcentagem de enraizamento de microestacas, mas também para outros parâmetros, como quantidade e comprimento de raízes e cinética de enraizamento, todos os quais são de relevância para o estabelecimento adequado de florestas clonais (CORRÊA et al., 2004).
De acordo com Souza e Pereira (2007) e Pijut et al. (2011) entre os principais fatores relacionados ao enraizamento de plantas cultivadas in
vitro, destacam-se os níveis de auxina endógena, o meio de cultura, a
presença de reguladores de crescimento e carboidratos, a nutrição mineral, o pH, a presença de poliaminas e substâncias como carvão ativado e compostos fenólicos, as condições ambientais de crescimento das plântulas in vitro, dentre outros.
Normalmente, a composição do meio de cultura e o tipo e concentrações de auxina são as variáveis que mais influenciam o enraizamento. A influência da composição dos meios de cultura no processo de enraizamento adventício in vitro, está relacionada à concentração de sais minerais empregados no preparo do mesmo e a presença de reguladores vegetais (SOUZA e PEREIRA, 2007).
De maneira geral, o uso de meios de cultura menos concentrados tem permitido melhores resultados no enraizamento in vitro. A diluição destes para ½ e até ¼ da concentração desses componentes tem possibilitado melhores resultados para muitas espécies (MCCOWN, 1988; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). A redução da concentração de sais minerais do meio demonstrou ser importante para induzir a rizogênese in vitro de brotações de E. torelliana x Corymbia citriodora (SHARMA; RAMAMURTHY, 2000). Cheng et al. (1992) verificaram menor porcentagem de enraizamento, e estas raízes com comprimentos menores,
