A A Empresa. Empresa executora de P,D&I e fornecedora de leveduras

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A Empresa

Empresa executora de P,D&I e fornecedora de leveduras

A Empresa

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Bio4 Soluções Biotecnológicas Curitiba – PR www.bio4.com.br

Localização

Minas Gerais Rio de Jneiro São Paulo Paraná Santa Catarina Rio Grande do Sul

Área de Atuação

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(7)

Anthony van Leeuwenhoek (1680) Antoine-Laurent Lavoisier (1789)

“Nada se cria,

nada se perde,

tudo se

transforma"

C₆H₁₂O₆ 2CO₂+ 2CH₃CH₂OH Louis Pasteur(1860) Teoria da geração espontânea? Emil Christian Hansen (1883) Saccharomyces carlsbergensis

Um pouco de história

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Figura 02. Patente de processo de elaboração de cerveja

a

b

Figura 03.(a) Primeiro livro de L. Pasteur (b) Diferentes formas de microrganismos 1

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Lager

Saccharomyces pastorianus

Levedura de baixa fermentação

Capacidade de fermentar a melibiose

Ale

Saccharomyces cerevisiae

Levedura de alta fermentação

-Definição Clássica Definição Moderna Aromas Limpo Neutro Floral Malte Limpo Neutro Frutado Fenólico Temperatura _9-14o_C _16-26_o_C

Lager x Ale

(10)

Brett

Brettanomyces lambicus Brettanomyces bruxellensis Brettanomyces claussenii

Brettanomyces bruxellensis Trois

Fungo não formador de esporos e células ovais e alongadas

Definição Clássica

Morfologia

Aromas

4-etil fenol – Band-Aid

4-etil guaiacol – Madeira Mofada Estábulo Cavalo Temperatura _18-26o_C Brettanomyces lambicus Brettanomyces bruxellensis

Brettanomyces sp.

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Ocular Objetiva Micrométrico Macrométrico Filtro Charriot Diafragma Microscópio óptico Microscópio eletrônico Célula Morta Célula Viva

Microscópio

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Colônia Lisa

Colônia rugosa

Grau de Floculação Teste (15 o_{C) 12 horas}

Baixa 20% Média 50% Alta 80%

Floculação

20%

Fe

rm

en

to

Morfologia

(13)

Oxigênio

Inóculo

Nutrientes

Temperatura

Assepssia

Variáveis de Processo

(14)

1 a_Etapa Limpeza de Superfícies 2a _{Desinfecção de} Superfícies P ro ce ss o d e A ss ep ss ia Sistema CIP Enxague

Limpeza = Solução NaOH 1-2%

Sanitização = Solução de Ác. Peracético 0,2-0,3%

Porque a superfície externa tem

polimento melhor que a interna?

Superfície

(15)

Cuidado com:

Mármore, cimento, Pedra.

Cuidado com: Alumínio, resina fenólica.

0 5,5 7 8,5 14 Sujidade inorgânica Sujidade orgânica

Ácido Neutro Alcalino

pH

(16)

Groseira Rugosa Lisa Brilhante

Rugosidade

Limpeza

(17)

ÁGUA DE PROCESSO ÁGUA DE PROCESSO Á G U A D E P R O C E S S O Á G U A D E P R O C E S S O

AÇÃO

QUÍMICA

TEMPO DE

CONTATO

AÇÃO

MECÂNICA

TEMPERA-TURA

Limpeza

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Variáveis

Temperatura do mosto Vazão e pressão de O₂ Aplicação do O₂ 24 48 72 96 120 144 168 192 12,5o_P 1o_P Tempo (h) G ra vi d ad e ---5 ppm ____9ppm

Cinética de fermentação com diferentes concentrações de oxigênio dissolvido 2

Oxigênio

(19)

Tabela 01. Solubilidade do oxigênio ( mg O₂/L) do ar em água e mosto em diferentes temperaturas e para oxigênio puro, todos e pressão atmosférica. 3

Volume de Mosto (L) Vazão de O₂(L/min) Duração (min) Gravidade Inicial (o_P) Oxigênio Disolvido (ppm) 6359,49 (40bbl) 6 40 12,5 5,00 2384,80 (15 bbl) 6 45 13,2 5,42 2384,80 (15 bbl) 12 75-80 25,5 5,50 1589,87 (10 bbl) 6 35 12,3 5,85 6359,49 (40bbl) 7 40 12,3 6,20 2384,80 (15 bbl) 7 40 12,7 6,54 1589,87 (10 bbl) 7 35 12,5 7,20 1589,87 (10 bbl) 6 30 14,4 8,10 1589,87 (10 bbl) 7 30-40 12,0 8,25

Tabela 02. Amostras de níveis de oxigênio dissolvido em microcervejarias. 2

(20)

les is higher when

Diferentes na produção de álcool superior e acetato de isoamila em experimentos utilizando aeração ou açido linoleico. 4

0,7 mg/L 5-8 mgO₂/L 0,7 mg/L 5-8 mgO₂/L Experimento 19o_C 1,5x107_{cel/mL (91,04%)} pH = 5,34-5,3

(21)

C

₄₇

H

_6,3

O

₃₃

N

₈

P

_1,2

S

_3,5

Sais

₁

Glicose Piruvato Acetaldeído Etanol CO₂ _PDC ADH Mg+2 Zn+2 Zn+2 Mg+2 Mg+2 Mg+2 Magnésio e Zinco

1. Requerido para reações de fosforilação oxidativa, síntese de ATP, síntese de DNA e regulação da informação genética;

2. Representa 0,3% da massa celular;

3. Importante no metabolismo fermentativo:

Vitaminas

1. Requerido como co-fatores das reações enzimáticas;

Biotina: reações de carboxilação > síntese de aminoácidos Ácido pantotênico: forma coenzima A

Ácido nicotínico: nicotinamida para síntese de ATP Tiamina (vitamina B): reações de carboxilação

Levedura

(22)

• A adesão celular Floculação de levedura; Ca+ + Ca+ +

Floculação

20%

Fe

rm

en

to

Fatores que influenciam a floculação • pH,

• temperatura, etanol

• Oxigenação

• disponibilidade de cálcio 5

(23)

Tabela 03. Classificação dos aminoácidos do mosto de acordo com o seu consumo pela levedura.7

Concentração de dicetonas vicinais no final da fermentação7

Amnoácidos

(24)

glicose piruvato acetaldeído acetato Acetil-CoA etanol

Ésteres de ácidos graxos

alfa-ceto isovalerato

alfa-isopropil malato

Alfa -ceto isocaproato

Ácidos graxos cadeia media Malonil-CoA Acetil-CoA Fenilalanina Fenilpiruvato Fenilaldeído Feniletanol Valina 2-oxoisovalerato Isoaldeído Álcool isoamilico Acetato de etila Acetato de feniletanol Acetato de isoamila glicólise fermentação Catabolismo aminoácidos ramificados Biosentese leucina Catabolismo fenilalanina Zn Mg Zn Mg Zn

Produção de ésteres durante a fermentação. 7

(25)

Temperatura Lager 9-14 o_C Ale 16-26 o_C Composto Limite de Percepção Temperatura de fermentação 19 o_C ₂₄o_C _Aroma

Etanol 1,4% ABV 4,74% ABV 5,04% ABV Doce

1-Propanol 600 ppm 23,78ppm 22,76 ppm

Acetato de etila 30 ppm 22,51 ppm 33,45 ppm Frutado,

solvente

Álcool isoamílico 70 ppm 108,43 ppm 114,92 ppm Banana

Diacetil Total 150 ppb 7,46 ppb 8,23 ppb Manteiga

2,3 - Pentadiona 900 ppb 5,09 ppb 3,17 ppb

Acetaldeído 10 ppm 7,98 ppm 152,19 ppm Maça Verde

Cromatografia gasosa comparando duas cervejas com mesmo mosto e levedura ALE, fermentada em duas temperaturas

(26)

Cálculo de células viáveis para uma adequada taxa

de inoculação

Microcervejaria

CUIDADO

!

Inóculo

(27)

Qual a taxa de inóculo mais indicada?

Limpeza

Viabilidade e Vitalidade

Tempo de fermentação

Produção de aromas

Variáveis

Resultado

0,5.10

6 _cel/mL/

o

_P

1.10

6 _cel/mL/

o

_P

Ex.: 12

o

_P

C

₂

= 12*0,5 = 6.10

6 _cel/mL

Ex.: 12

o

_P

C

₂

= 12*1 = 12.10

6 _cel/mL

Ale

_Lager

Densidade Inicial

Cálculo

(28)

Ex. Para um volume de brassagem de 10 hL de uma cerveja do tipo ALE

e mosto com 12

o

_{P de concentração.}

ALE

Taxa de inóculo (TI) = 0,5 x 10

6

_cel/mL/

o

_{P (0,75 x 10}

6

_cel/mL/

o

_{P (WHITE}

, C., 2010))

Densidade da cerveja (OG) = 12

o

_{P (1,045 g/mL)}

Concentração de fermento (CF) = TI x OG = 0,5 x 10

6

_cel/mL/

o

_{P x 12}

o

_P

CF = 6x10

6

_cel/mL

Volume da brassagem (VB) = 10 hL = 1.000.000 mL

Concentração de fermento (CF) = 6x10

6

_cel/mL

Quantidade de fermento (QF) = CF x VB = 6x10

6

_{cel/mL x 1.000.000 mL}

QF = 6.000.000.000.000 = 6 trilhões

(29)

Amostra in natura Amostra por plaqueamento Avaliação da morfologia das colônias Isolamento das diferentes colônias Extração do DNA dos isolados Amplificação do DNA por PCR

1 ª Etapa – isolamento e extração de DNA

(30)

Extração de DNA

2 ª Etapa – amplificação do DNA

ATCG TAGC A G T C Primer Enzima Ciclo de aquecimento A G T C A G T C Ciclo de resfriamento

Seleção de leveduras

(31)

3 ª Etapa – eletroforese

DNA amplificado Gel de eletroforese

+

-Seleção de leveduras

(32)

4 ª Etapa – banco genético

(33)

pH

S.G (A.T.).

Células Vivas

o_Gl

Meio YPD 2% Açucar Total

Sacarose Maltose Maltotriose

5 ª Etapa – screening inicial

L1 L2 L3 L4 L5 L6 10-1₁₀-2 ₁₀-3₁₀-4₁₀-5

A. Control B. 40 °C C. 0.5 M NaCl D. 200 g L-1 glucose E. 190 g L-1 sucrose

2 days 2 days 2 days 2 days 2 days

Controle 2 dias 40o_C 2 dias 0,5 M NaCl 2 dias 200 g/L Gli 2 dias 190 g/L Suc 2 dias

Seleção de leveduras

(34)

6 ª Etapa – Caracterização bioquímica

fermentação em escala piloto (ciclos de fermentação)

Estufa

30 O_C

Módulo

Parâmetros microbiológicos: Viabilidade, brotamento, cel/mL, Biomassa úmida e seca

Monitoramento de variáveis:

Temperatura, pH, CO₂ , Brix

Análise do Mosto/Vinho:

ART, Nitrogênio, Teor Alcoólico (alc. superiores, metanol) e Glicerol

HPLC e GC Inóculo da cepa isolada Teor Alcoólico

Seleção de leveduras

(35)

Ultra Freezer

-80 °°°°C

Estufa

Fermento SuperYeast

Manutenção das Leveduras Cultivo de Leveduras

Shaker Biorreator Controle de Qualidade Viabilidade celular Concentração celular Coloração de GRAM Câmara Lamínula Contaminação (UFC/mL) Teste para melibiose Petit mutant

+

-Cariotipagem genética Fingerprinting da levedura Banco genético de leveduras

(36)

Metabolismo/Genoma X Aplicação no processo

pH S.G (A.T.). Células Vivas o_Gl

Seleção de leveduras

(37)

Densidade Real (mg/mL) Turbidez (EBC)

Extrato Original (% p/p) Turbidez 0oC (EBC)

Extrato Aparente (% p/p) Teste Forçado (Shelf Life)

Extrato Real (% p/p) Oxigênio Dissolvido (mg/L)

Álcool (% p/p) Polifenóis Totais na Cerveja (mg/L)

Álcool (% v/v) Acidez Total (mg/L)

Cor (EBC) Gluten em Bebidas (ELISA) (ppm)

pH Atenuação Real (%)

Calorias (Kcal/100mL) Açúcar Total (g/L)

Amargor (IBU) Açúcares Redutores Totais (g/L)

Dicetonas Vicinais Totais (mg/L) Cromatografia Gasosa (sob consulta) Teste de Pasteurização

Análises Físico-Químicas

Análises Microbiológicas

Serviço de Análises-ISO17025

ContagemdeLevedurasCâmaradeNEUBAUER(ContagemeViabilidade)

ContagemTotaldeBactériasemAnaerobiose deCerveja(Morfologia+GRAM)(UFC/mL) ContagemTotaldeBactériasemAerobiosedeCerveja(Morfologia+GRAM)(UFC/mL) ContagemTotaldeBactériasemAnaerobiose deFermento(Morfologia+GRAM)(UFC/mL) ContagemTotaldeBactériasemAerobiosedeFermento(Morfologia+GRAM)(UFC/mL) Plaqueamentoleveduras(MorfologiaeContagem)

PetitMutantTeste AnálisedeFloculação

IdentificaçãodeLevedurasSelvagens AnálisedeLevedurasdoTipoLAGERxALE AnálisedeLevedurasNãoSaccharomyces

(38)

Referências Bibliográficas

1) Pasteurs, L. Studies on fermentation. The diseases of beer. Theis causaes and the means of preventing them. London. Macmillan & Co, 1879.

2) White, C; Zainasheff, J. Yeast - The Practical Guide to Beer Fermentation. Brewers Publication, 2010.

3) Briggs, D. E.; Boulton, C. A.; Brookes, P. A.; Stevens, R. Brewing Science and practice. Woodhead Publishing Limited and CRC Press LLC, 2004.

4) Bonciu, C. RESEARCH CONCERNING THE INFLUENCE OF LINOLEIC ACID ADDITION IN WORT

COMPARING WITH WORT AERATION. Innovative Romanian Food Biotechnology Vol. 4, Março, 2009.  5) Sim, L.; Groes, M.; Olesen, K.; Henriksen, A. Structural and biochemical characterization of the N-terminal domain of flocculin Lg-Flo1p from S. pastorianus reveals a unique specificity for

phosphorylated mannose. FEBS Journal, Denmark, 2010

6) Brown, A.K.; Hammond, J.R.M. FLAVOUR CONTROL IN SMALL-SCALE BEER FERMENTATIONS. Brewing Research International, Surrey, UK, vol 42, 2005.

7) C. Lekkas,1 G. G. Stewart,1 A. Hill,1 B. Taidi,2 and J. Hodgson2

1. The Importance of Free Amino Nitrogen in Wort and Beer. . International Centre of Brewing and Distilling (ICBD)

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A Empresa

A Empresa

Localização

Área de Atuação

“Nada se cria,

nada se perde,

tudo se

transforma"

Um pouco de história

Lager x Ale

Brettanomyces sp.

Microscópio

Colônia Lisa

Colônia rugosa

Floculação

Fe

rm

en

to

Morfologia

Oxigênio

Inóculo

Nutrientes

Temperatura

Assepssia

Variáveis de Processo

Porque a superfície externa tem

polimento melhor que a interna?

Superfície

pH

Rugosidade

Limpeza

AÇÃO

QUÍMICA

TEMPO DE

CONTATO

AÇÃO

MECÂNICA

TEMPERA-TURA

Limpeza

Variáveis

Oxigênio

C

47

H

6,3

O

33

N

8

P

1,2

S

3,5

Sais

1

Levedura

Floculação

Fe

rm

en

to

Amnoácidos

Cálculo de células viáveis para uma adequada taxa

de inoculação

Microcervejaria

CUIDADO

!

Inóculo

Qual a taxa de inóculo mais indicada?

Limpeza

Viabilidade e Vitalidade

Tempo de fermentação

Produção de aromas

Variáveis

Resultado

0,5.10

6

cel/mL/

₄₇

_6,3

₃₃

₈

_1,2

_3,5

₁

_cel/mL/

_P

_cel/mL/

_P

_P

₂

_cel/mL

_P

₂

_cel/mL

_Lager

_{P de concentração.}

_cel/mL/

_{P (0,75 x 10}

_cel/mL/

_{P (WHITE}

_{P (1,045 g/mL)}

_cel/mL/

_{P x 12}

_P

_cel/mL

_cel/mL

_{cel/mL x 1.000.000 mL}