PROGRAMA DE PÓS-GRAUDAÇÃO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA
MÔNICA BERGAMO LOPES
Efeitos Bioquímicos da radiação infravermelha na pele humana: Espectroscopia Raman Confocal
São José dos Campos 2016
Efeitos Bioquícos da Radiação infravermelha na Pele Humana: Espectroscopia Raman Confocal
Dissertação de mestrado apresentada no Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Biomédica, como
complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Airton Abrahão Martin
São José dos Campos 2016
A radiação infravermelha tipo A (IRA:760-1440nm) é um dos principais componentes da luz solar. Aproximadamente 30% da energia solar que atinge a superfície terrestre é composta por IRA. Na literatura existem poucos estudos com uma análise cuidadosa da relevância clínica da irradiação IRA na pele humana. Alguns trabalhos mostram que além dos seus efeitos térmicos, o infravermelho possui também a capacidade de induzir respostas biológicas independentes do aumento da temperatura. Estudos mostraram que, a irradiação de fibroblastos da pele humana por IRA pode induzir a expressão de enzimas como as metaloproteinases da matriz (MMPs), que causam degradação de fibras colágenas e elásticas da derme, contribuindo, a longo prazo, para o fotoenvelhecimento. No entanto, na literatura a maioria dos experimentos são em modelos animais ou com cultura de células de fibroblastos. Poucos experimentos são realizados in vivo, e a maioria destes através de biópsia e preparos da pele para posterior análise, o que pode alterar a constituição bioquímica da amostra, comprometendo resultados do estudo. Pelos nossos conhecimentos, não há experimentos em humanos, in vivo, em tempo real, sem manipulação da pele para sua análise, que possam contribuir para elucidar os reais efeitos da radiação infravermelha tipo A na pele humana.
No presente trabalho, 25 mulheres com idade entre 20-30 anos, pele fototipo II e III de Fitzpatrick, foram divididas em grupo A e B. No grupo A, 15 voluntárias tiveram a região do antebraço exposta a IRA, por 60 minutos em 2 intervalos de 30 minutos cada. Usando espectroscopia Raman Confocal, analisou-se o conteúdo dos principais aminoácidos do colágeno (prolina e hidroxiprolina), antes (T0), após 30 minutos (T30) e após 60 minutos (T60) da radiação. No grupo B, 10 voluntárias tiveram pele irradiada com IRA por 30 minutos, e usando Raman mediu-se também prolina e hidroxiprolina após 48 horas. No primeiro grupo, a densidade de energia de IRA usada foi a equivalente a 1 dia inteiro de exposição ao sol na cidade de São José dos Campos (SP), num dia de céu claro, sem nuvens, no inverno (cerca de 432J/cm2). No segundo grupo, a densidade de energia corresponde a cerca de 5 horas de exposição na primavera, na mesma cidade (cerca de 342J/cm2 de IRA). Através da espectroscopia Raman Confocal, análise comparativa de médias dos picos de prolina-hidroxiprolina não encontrou alterações estatisticamente significativas no grupo A nem no grupo B. Porém, análises individuais mostraram que no grupo A, em 50% das voluntárias houve diminuição da intensidade do pico de prolina-hidroxiprolina em T60, em 25% nada ocorreu e em 25% houve aumento. No grupo B, em 57% houve diminuição de colágeno, em 28% nada ocorreu e em 14% houve aumento dos picos estudados.
Palavras-chave: Radiação infravermelha. Colágeno. Fotoenvelhecimento. Raman Confocal.
ABSTRACT
Infrared radiation type A (IRA: 760-1440nm) is a major component of sunlight. Approximately 30% of the solar energy that reaches the earth's surface is composed of IRA. In the literature there are few studies with a careful analysis of the clinical relevance of IRA radiation on human skin. Some studies show that besides its thermal effects, the IR has also the capacity to induce biological responses independent of temperature rise. Studies have shown that irradiation of human skin fibroblasts IRA can induce the expression of enzymes such as matrix metallo proteinases (MMPs) that cause degradation of collagen and elastic fibers of the dermis, thereby contributing in the long term, to photoaging. However, in the literature almost all experiments were done in animal models or fibroblast cell culture. Just a few experiments are performed in vivo, and among these,all of them through biopsy and skin preparation for further analysis, which can alter the biochemistry of the sample, compromising study results. To the best of our knowledge, no experiments were performed in humans, in vivo, in real time, without manipulation of the skin for analysis, which could help to elucidate the effects of infrared radiation type A in human skin. In this study, 25 women aged 20-30 years old, skin type II Fitzpatrick, were divided in two groups: A and B.In group A, 15 volunteers had their forearm skin exposed to IRA for 60 minutes in 2 intervals of 30 minutes each. Using Confocal Raman spectroscopy, the content of dermis collagen (proline and hydroxyproline) was analysed before (T0), after 30 minutes (T30) and after 60 minutes (T60) of IRA radiation. In group B, 10 volunteers were irradiated with IRA for 30 minutes, and Raman analysis were made after 48 hours. In the first group, the IRA energy density used was equivalent to an entire day of sun exposure in São José dos Campos (SP), in a cloudless day during winter (about 432J / cm2). In the second group, the energy density used was equivalent to 5 hours of exposure during spring time, at the same city, same conditions (about 342J/cm2 of IRA). Means comparison showed no statistical differences in collagen before and after irradiation neither for group A nor for group B. However, individual analysis showed that in group A, in 50% of the volunteers, the intensity of the peak proline-hydroxyproline at T60 was lower than in T0, in 25% no changes were found, and in 25% we found increase. In Group B there was a decrease of collagen in 57% of volunteers, in 28% nothing occurred and in 14% there was an increase of studied peaks.
Figura 1 - Figura ilustrativa das camadas da epiderme ... 14
Figura 2 - Figura ilustrativa das camads da derme ... 15
Figura 3 - Estrutura do colágeno.Colágeno tipo I ... 18
Figura 4 - Pele com sinais de fotoenvelhecimento e cronoenvelhecimento ... 19
Figura 5 - Comparação entre pele jovem crono e fotoenvelhecida ... 20
Figura 6 - Esquema do espectro solar ... 21
Figura 7 - Esquema de gaus de penetração IR na pele ... 22
Figura 8 - Esquema dos estados de energia e espalhamento RAMAN ... 24
Figura 9 - Mecanismo de produção de espécies reativas de oxigênio pela IRA... 26
Figura 10 - Esquema da metodologia do grupo A ... 30
Figura 11 - Esquema da metodologia do grupo B ... 30
Figura 12 - Foto aparelho Raman ... 31
Figura 13 - Foto da sala de realização das medias e aparelho Raman ... 32
Figura 14 - Espectro da lâmpada IR usada no experimento... 32
Figura 15 - Exemplo espectro Raman em grupo A ... 35
Figura 16 - Exemplo espectro Raman da derme de uma das voluntárias ... 36
Figura 17 – Exemplo 1 espectro Raman grupo A ... 37
Figura 18 – Exemplo 2 espectro Raman grupo A ... 38
Figura 19 – Exemplo 2 espectro Raman grupo A ... 38
Figura 20 – Exemplo 1 espectro Raman grupo B ... 39
Figura 21 - Exemplo 2 espectro Raman grupo B ... 39
Figura 22 - Esquema gráfico das porcentagens finais grupo A ... 40
Figura 23 - Esquema gráfico das porcentagens finais grupo B ... 41
Figura 24 - Espectro da média do grupo A. ... 42
Tabela 1 - Energia e identificação dos principais modods vibracionais do colágeno da derme humana ... 34
C-C Carbono-Carbono DE Densidade de Energia
INPE Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais IR Radiação Infravermelha
IRA Radiação Infravermelha Tipo A MMP Metalo Proteinase da matriz
MMP1 Enzima Metalo Proteinase da matriz Tipo 1 O-P-O Oxigênio-Fósforo-Oxigênio
ROS Espécies reativas de oxigênio
TIMP-1 Inibidor tecidual específico da MMP-1 UV Radiação Ultravioleta
VIS Radiação solar da Luz Visível µm Micrômetro
1 INTRODUÇÃO ... 10 2 OBJETIVO ... 12 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 13 3.1 Epiderme ... 13 3.2 Derme ... 14 3.3 Hipoderme ... 16 3.4 Fibras colágenas ... 16 3.5 Envelhecimento cutâneo ... 18 3.6 Espectro solar ... 20
3.7 Espectroscopia Raman Confocal ... 22
3.8 Estudos preliminares ... 24
4 METODOLOGIA ... 28
4.1 Comitê de ética ... 28
4.2 População de estudo ... 28
4.3 Preparo das voluntárias ... 29
4.3.1 Metodologia grupo A ... 29
4.3.2 Metodologia grupo B ... 30
4.4 Obtenção dos espectros e da radiação infravermelha... 31
4.5 Cálculo da dose de radiação ... 32
5 ANÁLISE DE DADOS ... 34
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 37
7 CONCLUSÔES ... 44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 45
ANEXO I - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 48
1 INTRODUÇÃO
A pele humana atua como barreira externa protetora do organismo. Está em contato direto com fatores ambientais tais como vento, poluição e radiação solar. Os efeitos deletérios da radiação ultravioleta (UV) na pele humana foram objeto de inúmeras pesquisas no passado.
Além da radiação ultravioleta, a pele humana está exposta a outros tipos de radiação, como a infravermelha (IR) e a luz visível (VIS). A energia da radiação solar é formada por 6.8% de UV, 38,9% de VIS e 54,3% de IR (AKHALAYA et al, 2014). Além da sua prevalência no espectro solar, a radiação infravermelha é também utilizada no tratamento de doenças auto imune e inflamatórias (MEFFERT; BUCHHOLTZ; BRENKE,1990), como coadjuvante no tratamento de algumas doenças malignas (DEES, 2002) e como auxiliar nos processos de cicatrização de feridas (DANNO et al, 2001; HORWITZ; BURKE; CARNEGIE, 1999). Porém, a radiação infravermelha não pode ser considerada inócua ao ser humano. Em alguns estudos observou-se que a radiação infravermelha tipo A (IRA: 760-1440nm) pode penetrar mais profundamente na pele, levar a produção de radicais livres (DARVIN, 2010) e atuar nos fibroblastos da derme aumentando a expressão de genes que ativam enzimas como a matalo proteinase da matriz tipo 1(MMP1). Esse tipo de enzima é responsável pela degradação proteolítica do colágeno da derme e pelo decréscimo na síntese de novo colágeno, o que a longo prazo, pode contribuir para o fotoenvelhecimento (KRUTMAN; SCHROEDER, 2009).
Embora altamente prevalente no espectro solar, até o momento, não existe um consenso sobre qual dose de radiação infravermelha pode causar efeitos deletérios a pele humana. Existem poucos estudos com humanos, in vivo, com técnicas analíticas, em tempo real, não invasivas, testando doses ambientais de infravermelho, semelhante as quais estamos expostos em nosso cotidiano.
Uma técnica que oferece todas as vantagens acima descritas é a espectroscopia Raman Confocal. Esta técnica permite identificar e caracterizar, em tempo real, as alterações bioquímicas decorrentes dos processos degenerativos de tecidos vivos. Além de alta sensibilidade e especificidade, não é invasiva e pode ser utilizada no estudo dos principais constituintes da pele, como lipídeos, proteínas e
água. O efeito Raman constitui-se no espalhamento da luz após interação com vibrações moleculares do material. O espectro vibracional reflete os arranjos moleculares, ou os grupos funcionais da pele anlisada. A espectroscopia Raman Confocal é uma técnica fotônica de alta resolução que pode proporcionar, em poucos segundos, informações químicas e estruturais de quase qualquer material, composto orgânico ou inorgânico permitindo assim sua identificação. Não há necessidade de preparação do material, nem mesmo ocorre alteração em sua superfície. Desta forma, neste trabalho usamos a espectroscopia Raman Confocal para detectar os efeitos de doses ambientais da radiação infravermelha na derme humana.
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos bioquímicos da radiação infravermelha no colágeno da derme, usando espectroscopia Raman Confocal in vivo.
3 REVISÃO DE LITERATURA
A pele é dividida em: epiderme, derme e hipoderme.
3.1 Epiderme
Camada mais externa, compacta, semi permeável, perfurada apenas por poros dos folículos pilossebáceos e glândulas. Espessura varia entre 0,06mm (face) e 1,3 mm (palma das mãos). Não apresenta rede vascular, sendo nutrida pela permeação dos nutrientes oriundos da derme por capilaridade. Sua principal função é de barreira protetora contra ambiente externo e retenção de conteúdo interno como água, eletrólitos e nutrientes. Seus principais componentes celulares são os queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans. É constituída por 4 camadas distintas: camada basal ou germinativa, estrato espinhoso, estrato granuloso e estrato córneo (Figura 1).
Camada Basal- É a camada mais profunda da epiderme, delimitando-se com a mebrana basal. É constituída habitualmente por única camada de queratinócitos que possuem citoplasma basófilo e núcleos grandes, alongados, ovais e hipercromáticos, em contínua divisão mitótica.
Camada Espinhosa ou Malpighiana- Situa-se logo acima da camada basal e é formada por 5 a 10 camadas de queratinócitos com configuração poliédrica, achatando-se progressivamente em direção à superfície, com seus maiores eixos paralelos a esta. As células espinhosas estão unidas mecanicamente entre si e às células basais subjacentes por meio de pontes intercelulares denominadas desmossomos, estruturas complexas que conferem à pele resistência a traumas mecânicos.
Camada Granulosa- É composta por 1 a 3 camadas achatadas de queratinócitos com formato losangular e citoplasma repleto de grânulos de querato-hialina, que dão origem à filagrina, importante componente do envelope das células corneificadas.
Na pele da região palmoplantar, há uma camada adicional entre as camadas granulosa e córnea denominada estrato lúcido. Suas células são anucleadas e
formam uma faixa clara e homogênea, fortemente coradas pela eosina à microscopia óptica.
Camada Córnea- É a camada mais superficial da pele, formada por diversas camadas de queratinócitos. Sua espessura é variável de acordo com a topografia anatômica, sendo maior na região palmar e plantar.
Figura 1 - Figura ilustrativa das camadas da epiderme
Fonte: Slidesharecdn, 2016.
3.2 Derme
Camada conjuntiva que forma a parte estrutural do tegumento do corpo humano. Mais espessa no dorso de homens que na parte anterior do corpo das mulheres. Cerca de 70 a 80% do peso da derme é constituído pelas fibras colágenas. A interface entre derme e epiderme é feita pela membrana basal, que apresenta rede de fibras colágenas e antígenos que auxiliam no processo de defesa contra os microorganismos e agentes externos. Os fibroblastos são as células em maior número
nesta camada. A função principal dos fibroblastos é sintetizar proteínas da matriz extracelular, como colágeno, fibronectina, elastina e proteoglicanos, além das enzimas de sua degradação, como a colagenase, elastase e outras metaloproteinases da matriz (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).
A derme é dividida em duas regiões: a papilar (superficial) e a reticular (profunda) . A derme reticular forma a maior parte da derme (Figura 2).
A derme papilar é delgada e possui fina rede de fibras elásticas perpendiculares à camada basal, composta por elastina e fibrilas especiais de colágeno, que se inserem na membrana basal e penetram profundamente na derme.
A derme reticular apresenta tecido denso constituído pelos colágenos tipos I e III, além de fibras elásticas dispostas paralelamente à superfície. Nessa camada, fibras colágenas e elástica formam fibrilas multiderecionais, conferindo a derme resistência a tensão. Além dos vasos sanguíneos, linfáticos, e dos nervos, também são encontradas na derme as seguintes estruturas, derivadas da epiderme: pêlos, glândulas sebáceas e sudoríparas, e unhas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).
Existe ainda a derme perianexial, com a mesma estrutura da derme papilar, mas localiza-se em torno dos anexos cutâneos. Constituída de colágeno tipo VII e XVII.
Figura 2 - Figura ilustrativa das camads da derme
Nota: Corte histológico da pele, onde podem ser observadas as duas camadas da derme com as papilas dérmicas penetrando na epiderme
3.3 Hipoderme
A hipoderme ou panículo adiposo é a camada mais profunda da pele e está organizada em lóbulos de gordura divididos por septos fibrosos compostos de colágeno, por onde correm vasos sanguíneos, linfáticos e nervos. Une a derme à fáscia profunda subjacente, absorve choques e funciona como isolante térmico.
3.4 Fibras colágenas
As fibras colágenas são constituídas pela proteína colágeno, denominação que na verdade se refere a uma família de pelo menos 20 moléculas que têm várias características em comum (Figura 3). Colágeno é a maior classe de proteína fundamental insolúvel presente no tecido conjuntivo, representa 30% do total de proteínas presentes no corpo humano. Sintetizado e secretado por células do tecido conjuntivo, principalmente pelos fibroblastos, células do tecido ósseo e do tecido cartilaginoso. A proteína mais comum desta família é o colágeno tipo I. As fibras colágenas são formadas por colágeno tipo I associado a quantidades menores de colágenos de outros tipos moleculares.
As moléculas de colágeno tipo I associadas a moléculas de outros tipos formam fibrilas visíveis ao microscópio eletrônico. As fibrilas se reúnem em fibras de calibres bastante diversos, visíveis ao microscópio ótico. As fibras, por sua vez, podem se reunir em feixes. As fibras colágenas existentes nos diversos locais do organismo têm composição química ligeiramente diferente entre si devido à presença dos vários outros tipos de moléculas de colágeno que se associam ao colágeno tipo I e por outras glicoproteínas, glicosaminoglicanas e proteoglicanas. Esta composição molecular diferenciada resulta nas características próprias de espessura e organização das fibras nestes diferentes locais do organismo (HARRIS, 2005).
Possuímos cerca de 20 tipos de cadeias combinadas para produzir diferentes tipos de colágeno. Os mais importantes neste estudo são:
grandes tensões, como nos tendões, na derme e nos ossos, mas também presente em estruturas como a córnea. Este tipo forma fibras e feixes de colágeno da derme reticular.
Colágeno Tipo III: Abundante no tecido conjuntivo frouxo, encontrado na artéria aorta, nos pulmões, nos intestinos, fígado e no útero. Constitui juntamente com o tipo I, as fibras da derme reticular.
Colágeno Tipo VII: Está localizado na junção dermo-epitelial e nas células corioaminióticas.
Colágeno Tipo XVII: Abundante na junção dermo-epidermal. Como todas as proteínas, o colágeno tem 4 níveis estruturais.
nível primário: uma sequência linear de aminoácidos, unidos por ligações peptídicas;
secundário: conformação em alfa hélice, mantida por ligações de hidrogênios entre aminoácidos próximos;
terciário: arranjo tridimensional da cadeia peptídica estabilizadas por interações entre grupos de aminoácidos distantes e
quaternário: arranjo entre 3 cadeias polipeptídicas em estrutura tridemensional que constitue uma proteína ativa. Se uma proteína perde essa estrutura tridimensional, perde também suas propriedades, processo este conhecido como desnaturação.
A sequência de aminoácidos no colágeno é predominantemente formada por glicina- “aminoacido X”- prolina ou glicina, “aminoácido X”- hidroxiprolina. Sendo assim, neste trabalho, analisou-se justamente a prolina e hidroxiprolina como representativos quantitativos do colágeno da derme.
Figura 3 - Estrutura do colágeno.Colágeno tipo I
Nota: (A) Sequência tripeptídica que se repete: glicina-X –prolina ou glicina-X- hidroxiprolina. (B e C) Hélice de colágeno, com estrutura helicoidal anti-horária e três resíduos por volta. (D) Tripla hélice de colágeno chamada de tropocolágeno. (E)Tripla hélice em corte sagital Gly: glicina; Pro: prolina; hidroxi-pro:hidroxiprolina
Fonte: EBAH, 2016.
3.5 Envelhecimento cutâneo
O envelhecimento cutâneo é um fenômeno biológico complexo, dependente de fatores intrínsecos como hereditariedade, raça, hormônios, patologias, bem como de fatores extrínsecos como a umidade, temperatura, poluição ambiental, stress, cigarro e exposição solar (figura 4).
O envelhecimento intrínseco ou cronológico relaciona-se à genética do indivíduo, ao surgimento de doenças e expressões de genes.A pele cronoenvelhecida é suave e geralmente sem máculas, existem linhas de expressão mais finas e superficiais. Histologicamente há achatamento da interface dermo-epidérmica e desestruturação do tecido dérmico, com diminuição da matriz extracelular e fragmentação das fibras elásticas (figura 5), além de diminuição da síntese de colågeno pelos fibroblastos.
O fotoenvelhecimento ou envelhecimento extrínseco está ligado a fatores ambientais e ao estilo de vida tais como poluição, tabagismo, alcoolismo e
principalmente exposição à radiação solar. A pele fotoenvelhecida mostra perda de tônus e elasticidade, aumento da fragilidade, áreas de púrpura causadas pela fraqueza dos vasos sanguíneos e lesões benignas, como ceratoses e telangiectasias. Colágeno e elastina são produzidos mais lentamente pelos fibroblastos, e a capacidade de organização dessas proteínas também muda, ocasionando diminuição em cerca de 20 a 80% na espessura da derme e menores taxas de reparação tecidual.
Figura 4 - Pele com sinais de fotoenvelhecimento e cronoenvelhecimento
Nota: Pele de caminhoneiro exposto ao sol do lado esquerdo (do paciente) e não exposta ao sol do lado direito
Fonte: Extra, 2015
A grande maioria dos estudos avaliam os efeitos da radiação ultravioleta no fotoenvelhecimento. Pouco se sabe sobre os efeitos da radiação infravermelha e também da luz visível no fotodano. As ondas eletromagnéticas do IR têm como principal característica a transmissão de calor, causando vasodilatação e eritema. Alguns trabalhos demostraram que a radiação infravermelha pode causar ativação de enzimas responsáveis pela degradação do colágeno e diminuição na sua síntese. Estes efeitos ocorrem independentemente do aumento de temperatura provocado pela radiação (PIAZENA; KELLEHER, 2010).
Figura 5 - Comparação entre pele jovem crono e fotoenvelhecida
Nota: A figura da pele cronoenvelhecida, mostra achatamento e adelgaçamento da derme e perda papilas dérmicas. Na pele fotoenvelhecida há agregação de elastina amorfa na superfície da derme conhecida como elastose.
Fonte: Costa et al., 2012
3.6 Espectro solar
A principal fonte diária de exposição ao IR é a luz solar. O espectro solar que atinge a Terra varia entre 290 a 3000nm e inclue a radiação ultravioleta (UVC 100-280nm; UVB 290-320nm; UVA 320-400nm), a luz visível (400-760nm) e a radiação infravermelha (760-3000nm). A radiação IR é dividida em tipo A IRA (760-1440nm), IRB (1440-3000nm) e IRC (3000nm a 1mm) (Figura 6).
Figura 6 - Esquema do espectro solar
Nota: Espectro solar que atinge a Terra e seus respectivos comprimentos de onda em nanômetros(nm) Fonte: Segurança..., 2013
Os efeitos negativos da radiação solar na pele humana são geralmente associados a exposição a radiação ultravioleta. Entretanto, a pele é predominantemente exposta a radiação infravermelha. A radiação UV contribui com 6,8% da energia solar (0,5% UVB; 6.3% UVA), a luz visível com 38.9% e o espectro IR com 54,3% da energia solar total. A radiação IRA penetra até o tecido subcutâneo, mas sua maior absorção ocorre na derme (figura 7), enquanto a IRC é completamente absorvida na epiderme e causa aumento de temperatura cutânea (SCHIEKE; SCHROEDER; KRUTMANN, 2003).
Figura 7 - Esquema de gaus de penetração IR na pele
Nota: Ilustração de como a maior parte da radiação IRA ocorre na derme, onde se encontram as fibras colágenas e elásticas
Fonte Schieke, Schroeder e Krutmann, 2003
Em contraste com a detalhada caracterização da resposta ao ultravioleta, pouco se sabe sobre os efeitos moleculares e sobre as respostas biológicas consequentes a irradiação da pele humana com IR. O que se sabe é que os fibroblastos da derme apresentam uma resposta tempo e dose dependente a este tipo de radiação causando a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mitocôndria, desencadeando cascata de diversos sinalizadores, em nível celular, como a ativação de fatores de transcrição celular que causam lesão da matriz extracelular da derme, bem como a indução de proteinases, como a metalo proteinase da matriz (MMP), que modificam proteínas estruturais da derme, como o colágeno e a elastina contribuindo para o processo de envelhecimento prematuro da pele. Durante a exposição a radiação IRA ocorre aumento da temperatura da pele , que se maior que 39 graus Celsius pode atuar sinergicamente aos radicais livres, ativando algumas MMP (AKHALAYA et al., 2014).
3.7 Espectroscopia Raman Confocal
O fenômeno de espalhamento inelástico da luz foi primeiramente postulado por Smekal em 1923 (SMEKAL, 1923) e descrito pela primeira vez em 1928 por Raman e
Krishnan após uma série de experimentos que consistiam na iluminação de diferentes meios (sólidos, líquidos e gasosos) utilizando uma lâmpada de mercúrio. A luz espalhada pela amostra era analisada por um espectrógrafo e apresentava algumas linhas e bandas diferentes do espectro da luz da lâmpada de mercúrio. Estas diferenças apresentavam deslocamentos simétricos de frequência em relação às linhas da radiação incidente, polarização independente da frequência de excitação e o número de linhas que apareciam no lado de maior comprimento de onda eram mais intensas e numerosas do que as linhas que apareciam no lado oposto à linha da radiação incidente (RAMAN; KRISHNAN, 1928). Desta forma Raman concluiu que as frequências deslocadas representavam as frequências de oscilação das moléculas da amostra dependentes de suas ligações químicas e geometria. Este novo fenômeno de espalhamento foi chamado efeito Raman. A espectroscopia Raman mede o espalhamento inelástico de uma radiação monocromática que incide sobre uma molécula. O uso do laser como radiação incidente é baseado no fato de ter pouca divergência e polarização linear. O efeito Raman é um mecanismo que segue o princípio de conservação de energia. Se o fóton da radiação incidente possui mesma energia que o fóton espalhado pela amostra, a radiação espalhada apresenta freqüência igual à da radiação incidente (espalhamento Rayleigh); se o fóton incidente perde energia ao interagir com as moléculas da amostra então a radiação espalhada aparecerá no espectro com menor frequência (espalhamento Stokes) onde a diferença entre a energia incidente e a espalhada é absorvida pela amostra que sofre uma transição para níveis vibracionais mais altos; se o fóton incidente interage com as moléculas da amostra já no estado excitado pode receber energia deixando as moléculas em níveis de energia mais baixos (espalhamento anti-Stokes) (LINDON; TRANTER; HOLMES, 2000)(Figura 8).
Figura 8 - Esquema dos estados de energia e espalhamento RAMAN
Fonte: Autor.
A técnica de espectroscopia Raman in vivo permite identificar e caracterizar, em tempo real, as alterações bioquímicas decorrentes dos processos degenerativos de tecidos vivos. Além de alta sensibilidade e especificidade, não é invasiva e pode ser utilizada no estudo dos principais constituintes da pele, como lipídeos, proteínas e água. O efeito Raman constitui-se no espalhamento da luz após interação com o material, alterando suas vibrações moleculares. O espectro vibracional fornece a impressão digital da amostra, ou seja, reflete seus grupos funcionais .
3.8 Estudos preliminares
Estudos preliminares apontam que a radiação IRA pode causar mudanças na transcrição primária de fibroblastos da derme (CALLES et al., 2010). A radiação infravermelha pode causar aumento da expressão de genes que codificam a metalo proteinase da matriz tipo 1(MMP-1), através da expressão de RNA mensageiro. Esse aumento não acompanhado do aumento concomitante da expressão do seu inibidor tecidual da metalo proteinase da matriz (TIMP-1), causa destruição de fibras colágenas e formação de rugas, marcadores clínicos do fotoenvelhecimento (GRETHER et al., 2002).
Outros estudos mostram que a IRA reduz a expressão do colágeno tipo I, através da redução do estímulo do fator de crescimento transformador beta 1, beta 2 e beta 3 na pele humana (KIM et al., 2006).
Trabalhos relatam também que a radiação infravermelha pode induzir angiogênese na pele humana através do aumento da expressão do fator de crescimento endotelial vascular. Angiogênese tem alta relevância funcional no fotoenvelhecimento (YANO; OURA; DETMAR, 2002).
O mecanismo de ação pelo qual a radiação infravermelha causa o fotoenvelhecimento começou a ser investigado há quase 20 anos. Em 1982, Lorraine Kligman (EUA) foi a primeiro a relacionar a radiação infravermelha curta (760-1440nm) com o fotoenvelhecimento. Desde então, estudos indicam que a produção intramitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) representaria o passo inicial de toda sinalização induzida pela IRA. A radiação que induz expressão genética é consequência da sinalização retrógrada iniciada dentro da mitocôndria, causando alteração nos níveis de cálcio intracitoplasmático, ativando proteína quinases, que atingem o núcleo da célula e afetam a transcrição de genes (KRUTMANN; SCHROEDER, 2009). Além disso, após exposição ao IR, a citocromo-c-oxidase, (enzima da cadeia respiratória localizada na membrana interna da mitocôndria), pode absorver a energia da radiação IRA, alterando o status redutor da cadeia respiratória, o que pode levar a formação de ROS como oxigênio singlete, radical ânion superóxido e peróxido de hidrogênio (SCHIEKE; SCHROEDER; KRUTMANN, 2003) (Figura 9).
Figura 9 - Mecanismo de produção de espécies reativas de oxigênio pela IRA
Nota: A radiação IRA tem receptores mitocondriais que levam a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e causam sinalização retrógrada para o núcleo da célula ativando enzimas que degradam fibras colágenas,
elásticas (MMP-1) e inibem a nova síntese de colágeno(Col1)
Fonte: Grether-Beck et al., 2014.
Schieke et al. em 2002, irradiaram fibroblastos de pele humana in vitro, com uma densidade de energia de 200-1200J/cm2, com irradiância de 3300W/m2, por 10-60 minutos e observaram aumento da expressão de MMP1. Schroeder et al. em 2007 irradiaram fibroblastos de pele humana in vitro com 30-360J/cm2, irradiância de 1050 W/m2 por 57 minutos e observaram aumento de produção de ROS e da expressão de MMP-1.
Em 2010, Darvin et al. irradiaram pele humana in vivo com 342J/cm2 de IRA, por 30min encontrando diminuição de beta caroteno e licopeno. Em 2008 Schroeder et al. mostraram que apenas uma dose de radiação IR pode causar aumento de produção de ROS em cultura de fibroblastos humano. Em 2008 Schroeder et al. irradiaram pele humana in vivo com 360-720 J/cm2 e após 24 e 48 h, através de biópsias observaram aumento da expressão de MMP1 e diminuição do conteúdo de antioxidantes em 80% das voluntárias, em 20% nada ocorreu (SCHROEDER et al., 2008). Darvin et al. em 2010 observaram diminuição de carotenóides após 306J/cm2 por 30 min in vivo e aumento na formação de radicais livres na pele de porcinos com 190J/cm2 de IRA, com irradiância de 1700 e 1050 W/m2 respectivamente.
Algumas considerações devem ser feitas em relação a estudos in vivo e in vitro. - A radiação que atinge tecidos in vivo sofre redução por mecanismos de
absorção e espalhamento. Desta forma doses de IR usadas em cultura de fibroblastos não geram os mesmo efeitos quando aplicadas em tecidos vivos. - A irradiância encontrada na superfície terrestre pelo sol, é no máximo, 20-40mW/cm2 nos trópicos (BAROLET; CHRISTIAENS; HAMBLIN, 2016). Assim, para simular resultados in vivo, os estudos com IRA não deveriam ultrapassar muito essa dose de irradiância.
Na literatura, quase não são descritos estudos com humanos, usando doses ambientais de radiação IR, testando a irradiância encontrada na superfície terrestre fornecida pelo sol.
Diversos pesquisadores têm mostrado interesse na espectroscopia Raman Confocal para obter, in vivo, a informação detalhada sobre a composição molecular da pele e para a determinação, os gradientes de concentração moleculares no que diz respeito à profundidade diferente no interior da pele (CASPERS et al., 1998). Esta técnica também tem sido aplicada com sucesso para investigar os efeitos de formulações cosméticas, a sua permeabilidade, a variação do fator de hidratação natural relacionado com a hidratação da pele e propriedades de pele humana (TEIXEIRA et al., 2012; TOSATO et al., 2014). Através da espectroscopia Raman Confocal é possível investigar a modulação bioquímica resultante da radiação solar, a partir da superfície da pele até a derme profunda, com alta resolução espacial (~ 2 mm) em minutos.
Neste contexto, o presente estudo visa a caracterização por Espectroscopia Raman Confocal da derme humana, após radiação IRA, numa dose correspondente à quantidades ambientais presentes na cidade de São José dos Campos, e verificar se ela é prejudicial ou não.
4 METODOLOGIA
4.1 Comitê de ética
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba, CAAE 06033912.2.0000.0077, seguindo as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa envolvendo seres humanos, aderindo a Declaração de Princípios Helsínquia.
4.2 População de estudo
Foram selecionadas 25 voluntárias consideradando os critérios de exclusão e inclusão seguintes:
Critérios de inclusão:
1. Faixa etária entre 20 e 40 anos; 2. Sexo feminino;
3. Ausência de patologias na pele; 4. Fototipo II e/ou III;
5. Sem imperfeições na região do antebraço ;
6. Não utilzar cosméticos na região por no mínimo 30 dias; 7. Assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Critérios de exclusão:
1. Histórico de doenças de pele; 2. Diabetes;
4.3 Preparo das voluntárias
Os experimentos foram realizados no laboratório de espectroscopia vibracional da UNIVAP, em São José dos Campos. Todas as voluntárias assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, e responderam ao questionário alimentar e cotidiano (ANEXOS 1 e 2). Após limpeza do antebraço com álcool a 70%, a pele das voluntárias foi marcada com fita adesiva em área de 1cm x 1cm e analisada por 30 minutos utilizando um laser de baixa potência (25 mW) do sistema Raman confocal, até a profundidade de 124 micrômetros. A temperatura da pele foi controlada com termômetro sem contato Rytec Schlender Messtechnik, antes, durante, e após cada etapa do experimento, nunca ultrapassando 38-39 graus Celsius e sem causar desconforto a voluntária. A sala onde o experimento foi realizado foi mantida com temperatura controlada entre 20-23 graus Celsius e umidade relativa entre 35-40%.
As 25 voluntárias foram divididas em 2 grupos. Grupo A, com 15 voluntárias, e grupo B com 10 voluntárias. Metodologias distintas foram aplicadas.
4.3.1 Metodologia grupo A
Análise Raman inicial, na pele marcada do antebraço foi realizada antes de qualquer irradiação e chamada de T0. Após, a mesma região foi submetida ao foco de uma luz infravermelha tipo A de potência de 120 mW, a uma distância de 25 cm da pele, num ângulo de 90 graus, durante 30 minutos.
Após este período, a mesma região foi novamente analisada por mais 30 minutos utilizando o laser de baixa potência do sistema Raman confocal e denominada de T30.
Por último, nova exposição a luz infravermelha com mesma densidade de energia por 30 minutos, e última análise Raman (chamada de T60) foi realizada (Figura 10). A densidade de energia final (T60) foi de 432 J/cm2.
Figura 10 - Esquema da metodologia do grupo A
Nota: T0: pele sem exposição ao IR, IRA: infravermelho tipo A, T30: Raman realizado 30 minutos após exposição ao IR e T60: Raman realizado após segunda exposição de 30 minutos de IRA
Fonte: Autora.
4.3.2 Metodologia grupo B
Análise Raman inicial, na pele marcada do antebraço das voluntárias foi realizada e chamada de T0. Após, a mesma região foi submetida a irradiação de uma luz infravermelha tipo A de potência de 190 mW , a uma distância de 25 cm da pele, num ângulo de 90 graus, durante 30 minutos. Após 2 dias (48h) as voluntárias voltaram ao laboratório e nova leitura de Raman foi feita e chamada de T48 (Figura 11).
Figura 11 - Esquema da metodologia do grupo B
Nota: T0: pele sem exposição ao IR, T48: Raman realizado 48 horas após exposição ao IRA
4.4 Obtenção dos espectros e da radiação infravermelha
Para as análises bioquímicas da pele humana utilizou-se o espectrômetro Raman Confocal, da River Diagnostics, modelo 3510, específico para análises em pele humana com um microscópio invertido (Figura 12) montado em uma sala climatizada (Figura 13). O espalhamento Raman foi detectado usando um detector Peltier resfriado (-70 Celsius) e com laser de excitação a 785nm de potência na amostra de 24 mW. As medidas foram realizadas antes (T0), depois (T30) e 60 minutos (T60) de radiação infravermelha no grupo A, e em T0 e T48 no grupo B. Os espectros Raman foram coletadas nas regiões de impressão digital (400-1800cm-1), nos seguintes intervalos de profundidade: 0-24; 24-60; 60-80 e 80-124 µm (profundidade correspondente a derme) com um incremento de profundidade de 2, 4, 10 e 4 micrômetros, respectivamente.
Figura 12 - Foto aparelho Raman
Figura 13 - Foto da sala de realização das medias e aparelho Raman
Nota: Equipamento acoplado ao software onde são obtidos os espectros Raman.
Fonte Autora.
Para a radiação infravermelha utilizou-se uma lâmpada Philips Infrared PAR 38E que emite IRA com pico de intensidade maior em 1000nm e IRB 1400nm.
Figura 14 - Espectro da lâmpada IR usada no experimento
Nota: Observar maior intensidade do pico em 1000nm(IRA) conforme mostra seta vermelha Fonte: Autora.
4.5 Cálculo da dose de radiação
De acordo com dados do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE), a densidade de energia infravermelha tipo A (IRA) na cidade de São José dos Campos,
num dia de sol sem nuvens, no inverno é de aproximadamente 430 J/cm2. No verão, em dezembro, esse valor chega próximo a 880J/cm2. Densidade de energia de 342 J/cm2 pode ser atingida facilmente após 4-5 horas de exposição ao sol no verão, das 9 as 13h no dia 23 de dezembro, por exemplo.
5 ANÁLISE DE DADOS
Primeiramente, todos os dados foram pré-processados, corrigindo a linha de base e realizando a normalização vetorial com auxílio do software Minitab (Minitab ® 15.1.1.0). Os dados na forma de espectros foram transcritos em tabelas do software Excel (Microsoft ® Excel 2002), sendo criada uma tabela para cada paciente.
Posteriormente, realizou-se a análise de cluster para cada voluntária, a fim de determinar os espectros pertencentes a região da derme. Neste trabalho,os espectros da derme foram analisados, mais especificamente, os picos de prolina e hidroxiprolina, por serem estes os aminoácidos mais abundantes no colágeno da derme. Mediu-se também os efeitos na fenilalanina e na amida tipo I. Conforme mostra tabela 1,as vibrações dos picos em 856 e 920 cm−1 são atribuídos ao anel de prolina, e o pico em 875 cm−1 ao anel da hidroxiprolina. A banda em 938 cm−1 corresponde ao estiramento da ligação C–C do esqueleto colagênico. Fenilalanina corresponde ao pico em 1005 cm-1 a amida tipo I ao pico em 1664 cm1(Figuras 15 e 16).
Tabela 1 - Energia e identificação dos principais modods vibracionais do colágeno da derme humana
Fonte: Autora.
Posteriormente, usando o software Origin Pro 8.5 fez-se a média dos espectros T0, T30 e T60 de todas as voluntárias e para T0 e T48 .
Frequência em cm-1 ,com desvio padrão de 3 Identificação 856-920 Prolina 875 Hidroxiprolina 1005 Fenillanina 1156 e 1530 Carotenóides 1206 Amida III 1664 Amida I
Por último, usando o mesmo sotware Origin Pro 8.5 calculou-se a média final das voluntárias e os dados foram colocados em gráficos.
Análise estatística foi feita, através do student’s test , com 95% de intervalo de confiança. Foi feita análise estatística usando o software SPSS 18.
Figura 15 - Exemplo espectro Raman em grupo A
Nota: T0 significa antes da exposição a radiação IRA, T30, significa 30 minutos após e T60, 60 minutos após a exposição. Eixo Y intensidade arbitraria e eixo x deslocamento Raman. Observar que neste caso houve diminuição progressiva dos picos de prolina e hidroxiprolina após a exposição a radiação infravermelha.
Figura 16 - Exemplo espectro Raman da derme de uma das voluntárias
Nota: T0 significa antes da exposição a radiação IR, T48, significa 48 horas após a exposição. Observar que neste caso houve diminuição progressiva dos picos de prolina hidroxiprolina fenilalanina e amida I , 48 horas após a exposição a radiação infravermelha.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho analisou os efeitos imediatos e após 48 horas de exposição a radiação IRA, numa densidade de energia de 432J/cm2 e 342 J/cm2 . Estes valores foram escolhidos por representarem a DE de IRA encontrados na cidade de São José dos Campos- SP num dia inteiro de sol sem nuvens, no dia 23 junho de 2015 - 432J/cm2 e numa manhã inteira no dia 21 de setembro de 2015- 342J/cm2. Através da espectroscopia Raman Confocal, a pele irradiada foi analisada em tempo real, sem biópsia, o que permite que o tecido irradiado continue interagindo com o resto do organismo mesmo após o término do protocolo experimental. Como Raman Confocal analisa as alterações moleculares que precedem as alterações histopatológicas, neste experimento mediu-se os efeitos imediatos da radiação (T30 e T60) no colágeno da derme. Além disso, tendo em vista que estudos mostram que a maior ativação da MMP-1 ocorre 48h após a irradiação com IRA (SCHIEKE et al., 2002), mediu-se também a alteração no colágeno encontrada 48 horas após irradiação infravermelha.
As figuras 17, 18 e 19 a seguir representam exemplos de espectros encontrados no grupo A .
Figura 17 – Exemplo 1 espectro Raman grupo A
Nota: Nesta voluntária observou-se diminuição na intensidade do pico em T30 e T60, comparando com T0.
Figura 18 – Exemplo 2 espectro Raman grupo A
Nesta voluntária observou-se aumento da intensidade do pico em T60, como mostra pico em azul, em maior intensidade que pico representado em preto (T0)
Fonte: Autora.
Figura 19 – Exemplo 2 espectro Raman grupo A
Nota: Nesta voluntária não se observa diferença significativa entre T0 (em preto) e T60 (em azul),com discreta diminuição em T30 (em vermelho)
Fonte: Autora.
Figura 20 – Exemplo 1 espectro Raman grupo B
Nota: Aqui houve diminuição na intensidade do pico de prolina-hidroxiprolina (setas) em T48, trepresentado em vermelho, quando comparado com T0, representado em preto
Fonte: Autora.
Figura 21 - Exemplo 2 espectro Raman grupo B
Nesta voluntária não se observa diferença significativa entre T0 e T48, como mostram setas e picos em preto e vermelho
Fonte: Autora.
No grupo A, das 15 voluntárias, 2 foram excluídas por má qualidade dos espectros obtidos após o processamento. No grupo B, o mesmo ocorreu com o espectro de 3 voluntárias. Foi realizada a análise da média dos espectros de cada voluntária, e observada individualmente a relação de aumento ou diminuição no pico
de prolina-hidroxiprolina, entre T0 e T30; T30 e T60; T0 e T60, no grupo A, e entre T0 e T48 no grupo B e os resultados são descritos na figura 22:
Figura 22 - Esquema gráfico das porcentagens finais grupo A
Fonte: Autora.
Na análise do grupo B, em 2 voluntárias não houve diferença significativa entre T0 e T48; em 1 houve discreto aumento em T48 e em 4 delas houve diminuição do pico de prolina-hidroxiprolina em T48 quando comparado com T0. Esquematicamente: após 48 horas de exposição a 342J/cm2 de IRA, em 14,2% houve aumento; em 57,1% diminuição e em 28,5% nada ocorreu, como mostra a figura 23:
Figura 23 - Esquema gráfico das porcentagens finais grupo B
Nota: Esquema gráfico dos resultados obtidos no grupo B após 48 horas de exposição a IRA
Fonte: Autora.
Usando o programa Origin Pro 8.5 fez-se a média de todas as voluntárias, e neste estudo encontramos que, na média, no grupo A, não houve diferença significativa entre T0 e T60 quando analisou-se o efeito imediato no colágeno da derme humana após exposição a 432J/cm2 de radiação infravermelha tipo A, conforme mostra figura 24.
Figura 24 - Espectro da média do grupo A.
Observa-se em destaque, que na media, não houve diferença significativa nos picos de prolina e hidroxiprolina da derme, entre T0 e T60
Fonte: Autora.
Entretanto, ao usar a média do espectro das voluntárias do grupo B observa-se diminuição no pico analisado após 48 horas de exposição.
Figura 25 - Espectro final da média do grupo B
Nota: Observa-se em destaque, que na média, houve diminuição nos picos de prolina e hidroxiprolina da derme, entre T0 e T48
Fonte: Autora.
A Figura 24 mostra o espectro Raman da derme da pele, antes e após a irradiação IRA do grupo A e a figura 25 do grupo B. Não foram observadas diferenças espectrais significativas para o grupo A de voluntárias. No entanto, para as voluntárias do grupo B, os espectros medidos após 48 horas de irradiação diminuiram de intensidade em relação a diferentes modos de vibração, em particular, prolina e hidroxiprolina. Assim, pode ser entendido que a quantidade de proteína diminuiu e, mais especificamente, a quantidade de colágeno diminuiu após a irradiação de IRA. Este efeito retardado corrobora o resultado encontrado por Schieke et al., em 2002, quando encontraram que a maior ativação da MMP-1 ocorre cerca de 48h após a irradiação de fibroblastos in vitro com IRA.
Outros modos vibracionais são em menor grau representativos de colágeno. Por exemplo: pico a 1005 cm-1, correspondente ao anel simétrico de fenilalanina. Neste modo vibracionail não houve diferença estatisticamente significativa nos picos Raman no grupo A nem no B.
Outra intensidade de banda Raman a 1664 cm-1, correspondente a amida I, mostra intensidade maior em T0 comparada com T48 no grupo B.
Picos Raman de carotenóides da pele, originados pela vibração de estiramento da ligação simples de C-C a 1156 cm-1 e pela vibração de estiramento da dupla ligaçao C=C a 1530 cm-1, não mostram alteração após a irradiação. Este resultado difere do encontrado por Darwin et al., em 2013, que irradiaram pele de voluntárias com 190mW/cm2 de IRA e encontraram diminuição de beta caroteno e licopeno 30 minutos após irradiação.
7 CONCLUSÔES
Podemos concluir primeiramente que a espectroscopia Raman Confocal é uma ferramenta eficiente para detectar alterações moleculares na derme após exposição ao IRA.
Após irradiação da pele humana com doses semelhantes as doses ambientais as quais estamos expostos em nosso cotidiano, encontramos diminuições individuais no conteúdo de prolina e hidroxiprolina da derme.
Na média, 48 horas após a exposição a 342J/cm2 de IRA ocorre diminuição do conteúdo de prolina e hidroxiprolina da derme.
Desta forma, concluímos que além da proteção contra a radiação ultravioleta, é também importante se considerar a proteção da pele contra a radiação infravermelha do sol.
Na literatura faltam estudos como este, que avaliem os efeitos da exposição ao IRA, in vivo, em tempo real, de forma analítica, num nível bioquímico, ao mesmo tempo que testem doses ambientais da radiação infravermelha. Posteriores trabalhos devem ser realizados, com diferentes protocolos, testando outras densidades de energia do infravermelho, em outros intervalos de tempo entre exposição da pele e medição de Raman, avaliando também os efeitos sinérgicos do infravermelho com a luz visível no colágeno da derme, para melhor elucidar a relação entre IRA e fotoenvelhecimento.
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ANEXO I - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Prezado(a) Voluntário(a):
Você está sendo convidado(a) a participar de um avaliação da sua pele. Leia atentamente, verificando, se você concorda em participar deste estudo. Fique à
vontade para esclarecer todas as suas dúvidas a respeito do teste que será realizado. Você receberá uma cópia assinada deste consentimento.
Finalidade:
A finalidade deste estudo é avaliar as reações da luz infravermelha na pele humana da região do antebraço, através de um aparelho chamado microespectroscopia Raman confocal.
Reações indesejáveis:
A luz infravermelha poderá causa um pequeno aumento de temperatura, ou seja, calor na pele que será estudada. Sabendo disto a temperatura da pele será monitorada pelo pesquisador com a ajuda de um termômetro, sem contato físico. ATENÇÃO: Caso, durante o procedimento, haja algum desconforto térmico no local, você deverá informar o pesquisador, e este irá afastada a luz infravermelha para diminuir o calor. Caso aconteça alguma agressão à pele durante o experimento ou após o experimento, você será levado ao hospital mais próximo e terá garantia de atendimento médico.
Metodologia:
Primeiramente, a região do antebraço selecionada será limpa com álcool a 70% e analisada por 30 minutos utilizando um laser de baixa potência (25 mW) do sistema Raman confocal. Após esta análise, a mesma região ficará sob o foco de uma luz infravermelha durante 30 minutos. Após este período, a mesma região será novamente analisada por mais 30 minutos utilizando o laser de baixa potência (25 mW) do sistema Raman confocal. Após nova exposição ao infavermelho e última medição Raman.O experimento será realizado no Laboratório de Espectroscopia
Vibracional Biomédica da UNIVAP. Durante as medidas, as pessoas deverão ter seus olhos e outras partes do corpo protegidas da luz infravermelha. Essa metodologia é superficial e o tempo para o experimento será de 2 horas e 30 minutos aproximadamente.
Cuidados a serem observados durante o estudo:
É importante, para a realização do teste que haja alguns preparativos, como por exemplo, nos 30 dias antes do estudo o voluntário não deverá utilizar cosméticos e nem perfumes, principalmente na região a ser estudada – antebraço.
Critérios para seleção de voluntários: a) Critérios de Exclusão:
Os voluntários selecionados não devem possuir histórico de doenças de pele e/ou alergias não devem apresentar histórico de hipersensibilidade a produtos cosméticos e/ou à luz solar. Além disso, não deve apresentar doenças metabólicas como diabetes mellitus descompensado, fazer uso de imunossupressores ou corticoterapias. Também não serão selecionados os fumantes, as grávidas ou as lactantes. Não serão selecionados voluntários menores de 20 anos e maiores de 40 anos.
b) Critérios de Inclusão:
Serão selecionados 20 voluntários sexo feminino, com idade entre 20 a 40 anos. Estes deverão ter o tipo de pele estudada, ou seja, do fototipo II ou II.Os voluntários devem assinar o termo de consentimento livre e esclarecido antes da execução das análises, ter plena autonomia para aceitar participar do teste e comparecer ao Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento da UNIVAP no dia e horário determinado para as avaliações. Os voluntários devem ser saudáveis e com a pele sem imperfeições na região do antebraço.
Procedimento do estudo:
Os voluntários serão orientados a posicionar o antebraço com a palma da mão direcionada para cima (supinação). Primeiramente, a região do antebraço selecionada
será analisada por 30 minutos utilizando um laser de baixa potência (25 mW) do sistema Raman confocal. Após esta análise, a mesma região ficará sob o foco de uma luz infravermelha durante 30 minutos. A luz será focalizada, por meio de um cilindro de plástico reforçado, uma luz infravermelha com uma potência controlada por um Dimer® (controlador de intensidade), para 190 mW/cm2 numa distância de 25cm da pele com um ângulo de 90 graus do antebraço (perpendicular), por 30 minutos Após este período, a mesma região será novamente analisada por mais 30 minutos utilizando o laser de baixa potência (25 mW) do sistema Raman confocal. Mais uma exposição a luz infravermelha por 30 minutos sera feita e última medição Raman por 30 minutos.A voluntário será orientado, antes do início deste procedimento, a não olhar na direção da luz infravermelha, além de receber as devidas proteções para os olhos e lábios, através de óculos protetores e máscaras descartáveis.
ANEXO II- FORMULÁRIO COMPLEMENTAR
Com o intuito de tentar entender possíveis diferenças de resultados encontrados entre as voluntárias, bem como avaliar os níveis de stress, as voluntárias foram também interrogadas sobre seus hábitos alimentares, atividade física e auto avaliação do nível de stress, com as seguintes perguntas:
1 - Com qual frequêncis se alimenta de frutas, legumes e verduras? 2 - Em média, quantos litros de água ingere por dia?
3 - Pratica atividade física? Se sim ,com qual frequência?
4 - Como classificaria de 0 a 10 o seu nível de stress? (0=sem stress até 10= muito stress)
