De acordo com dados do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE), a densidade de energia infravermelha tipo A (IRA) na cidade de São José dos Campos,
num dia de sol sem nuvens, no inverno é de aproximadamente 430 J/cm2. No verão, em dezembro, esse valor chega próximo a 880J/cm2. Densidade de energia de 342 J/cm2 pode ser atingida facilmente após 4-5 horas de exposição ao sol no verão, das 9 as 13h no dia 23 de dezembro, por exemplo.
5 ANÁLISE DE DADOS
Primeiramente, todos os dados foram pré-processados, corrigindo a linha de base e realizando a normalização vetorial com auxílio do software Minitab (Minitab ® 15.1.1.0). Os dados na forma de espectros foram transcritos em tabelas do software Excel (Microsoft ® Excel 2002), sendo criada uma tabela para cada paciente.
Posteriormente, realizou-se a análise de cluster para cada voluntária, a fim de determinar os espectros pertencentes a região da derme. Neste trabalho,os espectros da derme foram analisados, mais especificamente, os picos de prolina e hidroxiprolina, por serem estes os aminoácidos mais abundantes no colágeno da derme. Mediu-se também os efeitos na fenilalanina e na amida tipo I. Conforme mostra tabela 1,as vibrações dos picos em 856 e 920 cm−1 são atribuídos ao anel de prolina, e o pico em 875 cm−1 ao anel da hidroxiprolina. A banda em 938 cm−1 corresponde ao estiramento da ligação C–C do esqueleto colagênico. Fenilalanina corresponde ao pico em 1005 cm-1 a amida tipo I ao pico em 1664 cm1(Figuras 15 e 16).
Tabela 1 - Energia e identificação dos principais modods vibracionais do colágeno da derme humana
Fonte: Autora.
Posteriormente, usando o software Origin Pro 8.5 fez-se a média dos espectros T0, T30 e T60 de todas as voluntárias e para T0 e T48 .
Frequência em cm-1 ,com desvio padrão de 3 Identificação 856-920 Prolina 875 Hidroxiprolina 1005 Fenillanina 1156 e 1530 Carotenóides 1206 Amida III 1664 Amida I
Por último, usando o mesmo sotware Origin Pro 8.5 calculou-se a média final das voluntárias e os dados foram colocados em gráficos.
Análise estatística foi feita, através do student’s test , com 95% de intervalo de confiança. Foi feita análise estatística usando o software SPSS 18.
Figura 15 - Exemplo espectro Raman em grupo A
Nota: T0 significa antes da exposição a radiação IRA, T30, significa 30 minutos após e T60, 60 minutos após a exposição. Eixo Y intensidade arbitraria e eixo x deslocamento Raman. Observar que neste caso houve diminuição progressiva dos picos de prolina e hidroxiprolina após a exposição a radiação infravermelha.
Figura 16 - Exemplo espectro Raman da derme de uma das voluntárias
Nota: T0 significa antes da exposição a radiação IR, T48, significa 48 horas após a exposição. Observar que neste caso houve diminuição progressiva dos picos de prolina hidroxiprolina fenilalanina e amida I , 48 horas após a exposição a radiação infravermelha.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho analisou os efeitos imediatos e após 48 horas de exposição a radiação IRA, numa densidade de energia de 432J/cm2 e 342 J/cm2 . Estes valores foram escolhidos por representarem a DE de IRA encontrados na cidade de São José dos Campos- SP num dia inteiro de sol sem nuvens, no dia 23 junho de 2015 - 432J/cm2 e numa manhã inteira no dia 21 de setembro de 2015- 342J/cm2. Através da espectroscopia Raman Confocal, a pele irradiada foi analisada em tempo real, sem biópsia, o que permite que o tecido irradiado continue interagindo com o resto do organismo mesmo após o término do protocolo experimental. Como Raman Confocal analisa as alterações moleculares que precedem as alterações histopatológicas, neste experimento mediu-se os efeitos imediatos da radiação (T30 e T60) no colágeno da derme. Além disso, tendo em vista que estudos mostram que a maior ativação da MMP-1 ocorre 48h após a irradiação com IRA (SCHIEKE et al., 2002), mediu-se também a alteração no colágeno encontrada 48 horas após irradiação infravermelha.
As figuras 17, 18 e 19 a seguir representam exemplos de espectros encontrados no grupo A .
Figura 17 – Exemplo 1 espectro Raman grupo A
Nota: Nesta voluntária observou-se diminuição na intensidade do pico em T30 e T60, comparando com T0.
Figura 18 – Exemplo 2 espectro Raman grupo A
Nesta voluntária observou-se aumento da intensidade do pico em T60, como mostra pico em azul, em maior intensidade que pico representado em preto (T0)
Fonte: Autora.
Figura 19 – Exemplo 2 espectro Raman grupo A
Nota: Nesta voluntária não se observa diferença significativa entre T0 (em preto) e T60 (em azul),com discreta diminuição em T30 (em vermelho)
Fonte: Autora.
Figura 20 – Exemplo 1 espectro Raman grupo B
Nota: Aqui houve diminuição na intensidade do pico de prolina-hidroxiprolina (setas) em T48, trepresentado em vermelho, quando comparado com T0, representado em preto
Fonte: Autora.
Figura 21 - Exemplo 2 espectro Raman grupo B
Nesta voluntária não se observa diferença significativa entre T0 e T48, como mostram setas e picos em preto e vermelho
Fonte: Autora.
No grupo A, das 15 voluntárias, 2 foram excluídas por má qualidade dos espectros obtidos após o processamento. No grupo B, o mesmo ocorreu com o espectro de 3 voluntárias. Foi realizada a análise da média dos espectros de cada voluntária, e observada individualmente a relação de aumento ou diminuição no pico
de prolina-hidroxiprolina, entre T0 e T30; T30 e T60; T0 e T60, no grupo A, e entre T0 e T48 no grupo B e os resultados são descritos na figura 22:
Figura 22 - Esquema gráfico das porcentagens finais grupo A
Fonte: Autora.
Na análise do grupo B, em 2 voluntárias não houve diferença significativa entre T0 e T48; em 1 houve discreto aumento em T48 e em 4 delas houve diminuição do pico de prolina-hidroxiprolina em T48 quando comparado com T0. Esquematicamente: após 48 horas de exposição a 342J/cm2 de IRA, em 14,2% houve aumento; em 57,1% diminuição e em 28,5% nada ocorreu, como mostra a figura 23:
Figura 23 - Esquema gráfico das porcentagens finais grupo B
Nota: Esquema gráfico dos resultados obtidos no grupo B após 48 horas de exposição a IRA
Fonte: Autora.
Usando o programa Origin Pro 8.5 fez-se a média de todas as voluntárias, e neste estudo encontramos que, na média, no grupo A, não houve diferença significativa entre T0 e T60 quando analisou-se o efeito imediato no colágeno da derme humana após exposição a 432J/cm2 de radiação infravermelha tipo A, conforme mostra figura 24.
Figura 24 - Espectro da média do grupo A.
Observa-se em destaque, que na media, não houve diferença significativa nos picos de prolina e hidroxiprolina da derme, entre T0 e T60
Fonte: Autora.
Entretanto, ao usar a média do espectro das voluntárias do grupo B observa-se diminuição no pico analisado após 48 horas de exposição.
Figura 25 - Espectro final da média do grupo B
Nota: Observa-se em destaque, que na média, houve diminuição nos picos de prolina e hidroxiprolina da derme, entre T0 e T48
Fonte: Autora.
A Figura 24 mostra o espectro Raman da derme da pele, antes e após a irradiação IRA do grupo A e a figura 25 do grupo B. Não foram observadas diferenças espectrais significativas para o grupo A de voluntárias. No entanto, para as voluntárias do grupo B, os espectros medidos após 48 horas de irradiação diminuiram de intensidade em relação a diferentes modos de vibração, em particular, prolina e hidroxiprolina. Assim, pode ser entendido que a quantidade de proteína diminuiu e, mais especificamente, a quantidade de colágeno diminuiu após a irradiação de IRA. Este efeito retardado corrobora o resultado encontrado por Schieke et al., em 2002, quando encontraram que a maior ativação da MMP-1 ocorre cerca de 48h após a irradiação de fibroblastos in vitro com IRA.
Outros modos vibracionais são em menor grau representativos de colágeno. Por exemplo: pico a 1005 cm-1, correspondente ao anel simétrico de fenilalanina. Neste modo vibracionail não houve diferença estatisticamente significativa nos picos Raman no grupo A nem no B.
Outra intensidade de banda Raman a 1664 cm-1, correspondente a amida I, mostra intensidade maior em T0 comparada com T48 no grupo B.
Picos Raman de carotenóides da pele, originados pela vibração de estiramento da ligação simples de C-C a 1156 cm-1 e pela vibração de estiramento da dupla ligaçao C=C a 1530 cm-1, não mostram alteração após a irradiação. Este resultado difere do encontrado por Darwin et al., em 2013, que irradiaram pele de voluntárias com 190mW/cm2 de IRA e encontraram diminuição de beta caroteno e licopeno 30 minutos após irradiação.
7 CONCLUSÔES
Podemos concluir primeiramente que a espectroscopia Raman Confocal é uma ferramenta eficiente para detectar alterações moleculares na derme após exposição ao IRA.
Após irradiação da pele humana com doses semelhantes as doses ambientais as quais estamos expostos em nosso cotidiano, encontramos diminuições individuais no conteúdo de prolina e hidroxiprolina da derme.
Na média, 48 horas após a exposição a 342J/cm2 de IRA ocorre diminuição do conteúdo de prolina e hidroxiprolina da derme.
Desta forma, concluímos que além da proteção contra a radiação ultravioleta, é também importante se considerar a proteção da pele contra a radiação infravermelha do sol.
Na literatura faltam estudos como este, que avaliem os efeitos da exposição ao IRA, in vivo, em tempo real, de forma analítica, num nível bioquímico, ao mesmo tempo que testem doses ambientais da radiação infravermelha. Posteriores trabalhos devem ser realizados, com diferentes protocolos, testando outras densidades de energia do infravermelho, em outros intervalos de tempo entre exposição da pele e medição de Raman, avaliando também os efeitos sinérgicos do infravermelho com a luz visível no colágeno da derme, para melhor elucidar a relação entre IRA e fotoenvelhecimento.
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