ANÁLISE DO GENE DA A-FABP (PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ÁCIDOS
GRAXOS DOS ADIPÓCITOS) EM SUÍNOS¹
SEQUENCE ANALYSIS OF PIG ADIPOCYTE FATTY ACID-BIDING PROTEIN (A-FABP) GENE
KLEIBE DE MORAES SILVA2, SIMONE E. F. GUIMARÃES3, PAULO SÁVIO LOPES3, DANIELLE ASSIS DE FARIA4, PRISCILA VENDRAMINI SILVA5, ISABELA FONSECA6
1 Financiamento: CAPES, CNPq e FAPEMIG
2 Estudante de Mestrado em Genética e Melhoramento Animal – UFV (kleibe@ig.com.br) 3
Professor do Departamento de Zootecnia – UFV
4 Zootecnista Mestre em Zootecnia – UFV
5 Estudante de Graduação em Bioquímica – UFV – Bolsista IC CNPq 6
Estudante de Graduação em Zootecnia – UFV
RESUMO
As FABPs (proteínas de ligação de ácidos graxos) são parte de uma família composta de oito proteínas envolvidas no transporte de ácidos graxos da membrana celular até sítios de oxidação e síntese. Devido a suas propriedades fisiológicas, tais foram sugeridas estar associadas ao aumento no conteúdo de gordura intramuscular, melhorarando a qualidade de carne suína. O objetivo foi seqüênciar regiões do gene da A-FABP (proteína de ligação de ácidos graxos dos adipócitos), e comparar tais seqüências na busca de polimorfismos entre as raças Piau e comercial (constituinte da geração parental de um cruzamento F2) e comparar com as seqüências depositadas no “GenBank”. O DNA foi extraído de sangue pela técnica de fenol:clorofórmio e os “primers” foram desenhados segundo referências encontradas no “GenBank” para o gene e para a espécie. Após a amplificação dos fragmentos, o conteúdo da reação foi purificado por meio do kit de purificação de DNA e seqüenciado pela técnica de terminação em cadeia por ddNTP (dideoxinucleotídios) utilizando-se o seqüenciador “ABI PRISM 310”. A comparação das seqüências de nucleotídeos entre as raças de suínos e a referência foi realizada pelo programa ClustalX e pode-se verificar que não existe nenhum polimorfismo de nucleotídeos nos fragmentos seqüenciados. Possivelmente, o efeito no conteúdo de gordura intramuscular não seja devido a ação do gene A-FABP, e sim de um ou mais genes ligados, não sendo possível usá-lo como marcador genético nesta população.
PALAVRAS-CHAVE Conteúdo de gordura intramuscular, Gene Candidato
ABSTRACT
The FABPs (fatty acid-biding proteins) are part of a family composed by eight intracellular proteins that transport fatty acids from cell membrane to sites of fatty acid oxidation and synthesis. Due to their physiologic properties, the fatty acid-binding proteins were suggested to be associated with the increase in the intramuscular fat content, what could improve the pork quality. The objective of this paper was to analyze DNA fragments of the A-FAPB gene and compare these sequences to find polymorphisms between the Piau swine breed and commercial lines (parental generation of the F2 crossbred), and also compare these sequences with the one in GenBank. The DNA was extracted from blood by treatment with phenol:chloroform. The primers were made according to the reference found in the
GenBank for this gene and this specie. After the fragment amplification, the reaction mixture was purified by a DNA purification kit. The purification products were sequenced with the ddNTP (dideoxinucleotidies) terminal chain technique, using the ABI PRISM 310 platform. The sequences comparisons between the swine breeds and the GenBank reference were made by the ClustalX program that showed no nucleotide polymorphism in the analyzed fragments between the breeds. Therefore, the effects on Intramuscular fat contend are not due to the A-FABP gene in this population but maybe closely linked genes. In practice, it is not possible to use it as genetic marker in this population.
KEYWORDS Candidate gene, Intramuscular fat contend
INTRODUÇÃO
Tradicionalmente, os programas de melhoramento têm focalizado seus objetivos na taxa de crescimento e no conteúdo de carne magra na carcaça, o que tem levado a um decréscimo no conteúdo de gordura intramuscular abaixo do nível ótimo (BEJERHOLM e BARTON-GADE, 1986). O conteúdo de gordura intramuscular (CGIM) é um dos maiores determinantes para a qualidade de carne, responsável pela sua suculência e textura, e de grande influência na aceitação do produto pelos consumidores.
A melhoria para CGIM através da seleção é difícil devido a mensuração em vivo na carcaça. Entretanto a seleção por marcadores ou por genes candidatos é uma estratégia promissora para seleção em qualidade (MEUWISSEN e GODDARD, 1996).
Os genes H-FABP e A-FABP (proteína de ligação de ácidos graxos no coração e nos adipócitos, respectivamente) podem afetar o CGIM, com impacto limitado sobre a espessura de toucinho, permitindo assim a seleção para aumento da gordura intramuscular. O gene da H-FABP expressa predominantemente em células do músculo cardíaco e esquelético. Já o gene da A-FABP se expressa quase que exclusivamente nos adipócitos. Este está localizado no cromossomo 4 e possui três íntrons e quatro éxons perfazendo 8.144 pb (BERNLOHR et al., 1984).
O objetivo em realizar este estudo foi seqüênciar e comparar as seqüências dos fragmentos de DNA que incluem os quatro éxons do gene da A-FABP com as seqüências contidas no GenBank e verificar a existência de polimorfismos de nucleotídeos nos suínos estudados.
MATERIAL E MÉTODOS
Neste trabalho foi utilizado DNA de dois machos varrões da raça naturalizada Piau e 16 fêmeas da linhagem comercial Large White/Landrace/Piétrain, os quais são membros da geração parental de um cruzamento divergente F2. O DNA dos animais foi extraído a partir de células brancas sanguíneas, por purificação com Fenol:clorofórmio, após tratamento com proteinase K como descrito por SAMBROOK et al. (1989). As soluções de DNA foram diluídas a 25 ng/mL em tampão contendo 10mM de Tris-HCl pH 8,0 e 1 mM de EDTA pH 8,0.
Foram desenhados quatro pares de “primers”, cada um contendo na região amplificada um dos “éxons” do gene. Os “primers” foram desenhados utilizando-se o programa “WebPrimers” (http://alces.med.umn.edu/bin/webprimers). Foram utilizados como base as seqüências depositadas no “GenBank”
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) sob acesso Y16039. A amplificação dos fragmentos foi feita utilizando um volume final de 20 mL contendo basicamente 4,0 pmoles de cada “primer”, 0,2 mM de cada dNTP, MgCl2 em diferentes concentrações, 50 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl, 1 unidade de Taq DNA polimerase e 25 hg de DNA. O programa de amplificação consistiu dos três passos básicos: desnaturação, anelamento e extensão do fragmento, sendo que a concentração de MgCl2 na reação de PCR e a temperatura de anelamento dos primers no termociclador foram alteradas para diminuir a amplificação inespecífica ou aumentar o rendimento da reação. Os resultados das amplificações foram visualizados em géis de poliacrilamida a 8%, corados com nitrato de prata.
Para a purificação dos fragmentos amplificados de DNA foram usados aproximadamente 100 mL da reação de amplificação com o kit “GFX PCR DNA and Gel Purification kit (Amershan Pharmacia Biotech Inc.)”, seguindo o protocolo do produto. Após o procedimento de purificação, o DNA foi quantificado em espectrofotômetro “GeneQuant II (Amershan Pharmacia Biotech Inc.)” através de leitura de absorbância em A260.
Para a reação de sequenciamento foram feitas misturas de amostras do DNA das fêmeas de linhagem comercial, chamadas de “mix” (DNA amplificado de quatro fêmeas por “mix”) para cada um dos fragmentos, sendo os varrões Piau C e J seqüenciados individualmente. As reações de sequenciamento foram baseadas na técnica de terminação cadeia de ddNTPs, descrita por SANGER et al. (1977). O DNA foi seqüenciado utilizando-se o “ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Apllied Biosystems)” de acordo com as instruções do fabricante.
Após a reação de sequenciamento, o DNA foi precipitado pela adição de 80 mL de isopropanol a 75% e os tubos deixados à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida foi centrifugado a 15.000 g por 20 minutos e o sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado com 250 mL isopropanol a 75%, centrifugado a 15.800 g por 5 minutos e seco a temperatura ambiente. O pelete foi ressuspendido em 15 mL de “Formamida Hi-Di (PE Apllied Biosystems)”, desnaturado a 95 ºC por cinco minutos e mantido no gelo até a sua aplicação no sequenciador “ABI PRISM 310”. O resultado do sequenciamento foi analisado e alinhado por meio do programa ClustalX
(http://www-igbcm.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na figura 1 é apresentado parte do terceiro fragmento seqüenciado a partir do gene da A-FABP suína dos animais analisados. Como pode ser observado pelo alinhamento das seqüências, não foi encontrada nenhuma divergência nas bases nitrogenadas entre os animais analisados, bem como entre estes e a seqüência de referência depositada no GenBank. Isso ocorreu não somente para o fragmento exemplificado, incluído no éxon 3, mas para todos os fragmentos seqüenciados. GERBENS et al., (1998) estudando o papel da A-FABP no acréscimo de gordura intramuscular em suínos Duroc não observou nenhuma variação genética nas seqüências expressas. Porém foi encontrado um marcador do tipo microssatélite com nove alelos que se diferenciavam pelo número de repetições (CA)n. Esses alelos consistiam de 19, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29 e 33 unidades de repetição. Os alelos que estavam em maior freqüência eram: 22 (A1), 33 (A2) e 19 (A3). Esses alelos resultaram em seis classes genotípicas, sendo que destes o genótipo A1A3 apresentou maior significância para CGIM. GERBENS et al., (2000) com o objetivo de confirmar o resultados do trabalho acima, não encontrou nenhum efeito do A-FABP para CGIM em uma população F2 oriunda do cruzamento de suínos da raça chinesa Meishan e suínos de raça européia.
NECHTELBERGER et al. (2001) também não encontrou influência significativa do gene A-FABP para gordura intramuscular em suínos Large White, Piétrain e Landrace de uma população austríaca e sugere que esse marcador genético não seja utilizado para seleção assistida naquelas populações. O mesmo autor comenta que a falta de associação do gene da A-FABP e conteúdo de gordura intramuscular seja devido a um desequilíbrio de ligação entre o gene estudado e um ou mais loci influenciando o conteúdo de gordura intramuscular.
Possivelmente, o efeito para CGIM não seja do gene da A-FABP, uma vez que não houve variação na seqüência codificadora, o que é corroborado pelo QTL identificado por GERBENS et al., (1998).
FIGURA 1: Homologia entre os animais analisados para parte do éxon 3 do gene da A-FABP em suínos.
CONCLUSÕES
Em conformação com os resultados obtidos com outras populações, não foram encontrados polimorfismos nas seqüências de nucleotídeos no gene da A-FABP nestes animais. Possivelmente, o efeito no conteúdo de gordura intramuscular não seja do gene da A-FABP, e sim de genes fortemente ligados a ele. Portanto, o gene estudado não poderá ser usado como marcador genético nesta população.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. BEJERHOLM, C., BARTON-GADE, P.A.. Effect of intramuscular fat level on eating quality in pig meat. In Proceedings of the 32nd European Meeting of Meat Research Workers, 1986, Belgian, 389 – 391.
2. BERNLOHR, D.A., ANGUS, C.W., LANE, M.D. et al. Expression of specific mRNAs during adipose differentiation identification of an mRNA encoding a homologue of myelin P2 protein. Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5468-5472.
3. GERBENS, F.; JANSEN, A.; VAN ERP, A.J. et al. The adipocyte fatty acid-binding protein locus: characterization and association with intramuscular fat content in pigs. Mamm Genome, v 9, p.1022-6, 1998.
4. GERBENS, F.; DE KONING, D.J.; HARDERS, F.L. et al. The effect of adipocyte and heart fatty acid-binding protein genes on intramuscular fat and backfat content in Meishan crossbred pigs.Journal of Animal Science, v. 78, n.3, p.552-9, 2000.
5. MEUWISSEN, T. H. E., GODDARD, M. E. The use of marker haplotypes in animal breeding schemes. Genet. Sel. Evol.,v. 28, p.161-176, 1996.
