Receptores A3A modulam o comportamento e o sistema serotoninérgico
no zebrafish: Mediação pela via do óxido nítrico
Anderson Manuel Herculano Caio Maximino Domingos Wanderley Picanço-Diniz Evander de Jesus Oliveira Batista Karen Renata Matos Oliveira Monica Gomes Lima Suéllen de Nazaré da Silva
INTRODUÇÃO
As vias adenosinérgicas, nitrérgicas e serotonérgicas representam importantes substratos do comportamento tipo-ansiedade, e constituem alvos farmacológicos em potencial. Considerando a relação entre A3A-R e a via PKG-GMPc-NO na regulação da função e localização de SERT, bem como a relação entre níveis extracelulares de serotonina e comportamento de medo e ansiedade, procurou-se entender se a manipulação desse receptor de adenosina poderia impactar o comportamento defensivo nos modelos comportamentais de zebrafish, e se esses impactos foram devido a efeitos na modulação nitrérgica de captação de serotonina.
OBJETIVOS
Avaliar o papel do receptor A3A na modulação do comportamento tipo-ansiedade e níveis extracelulares de serotonina (5-HT) no cérebro no paulistinha (Danio rerio) e possível mediação por canais de cálcio do tipo L e pelo sistema nitrérgico.
MÉTODOS
140 paulistinhas adultos da linhagem longfin do tipo selvagem foram alojados por pelos menos duas semanas em condições-padrão antes da realização dos experimentos. Depois de pré-tratamento com veículo, verapamil (bloqueador de canais de cálcio tipo L; 5mg/kg, i.p.), L-NAME (bloqueador das NOSs; 5mg/kg, i.p.), ou fluoxetina (bloqueador do SERT; 1 mg/kg), os animais foram tratados com veículo ou IB-MECA (agonista A3A; 0,1mg/kg i.p.) e tranferidos para
o compartimento central de um tanque claro e escuro (15 cm X 10 cm X 45 cm) para aclimatação de 3 min. Após esse intervalo, as portas que delimitam o compartimento foram removidas, permitindo livre exploração por 15 min. Foram avaliados tempo no compartimento claro, latência para entrada no claro, quadrantes cruzados, entradas no compartimento claro, nado errático, congelamento, tigmotaxia, e avaliação de risco. No teste de mergulho no tanque novo os animais foram transferidos para o aparato (15 cm x 25 cm x 20 cm) brevemente depois do pré-tratamento e pré-tratamento. Ao animal foi permitido explorar livremente o tanque novo por 6 minutos. Foram avaliados tempo no topo, quadrantes cruzados, nado errático, congelamento, tempo no homebase, habituação. Após o teste, 0,5ml de fluido extracelular foi extraído, removendo rapidamente um cérebro do crânio e incubando-o em 2ml de TBS 50mM (pH 7,4) contendo NaCl 90mM, CaCl2 2,5mM, glutationa 1mM por 30 min a 4ºC. Esse fluido foi misturado com 0,5ml de solução de eluição, filtrado através de membrana de 0,22μm e então injetado em sistema de HPLC-ECD para determinação de 5-HT; esses valores foram corrigidos pelos níveis de proteína, analisados pelo ensaio de Bradford.
Os resultados foram analisados através de ANOVAs de uma via seguidas de pós-teste de Tukey, ou testes de Kruskal-Wallis para dados; os resultados para latência foram analisados através do teste de Mantel-Cox. Para todas as análises, foram considerados estatisticamente significativos.
RESULTADOS
O IB-MECA aumentou o tempo no compartimento claro (F2, 27 = 74,9, p < 0,0001), diminuiu a latência para entrada (χ²gl = 2 = 14,07, p = 0,0009) e a frequência de avaliação de risco (Hgl = 3 = 9,876, p = 0,0075), sem alteração nas outras medidas. O efeito do IB-MECA sobre o tempo no compartimento claro foi bloqueado por pré- tratamento com verapamil (F1, 32 = 11,5 p = 0,0019), L-NAME (F1, 28 = 6,81, p = 0,0144) e fluoxetina (F1, 27 = 16,66, p = 0,0004). Esses efeitos foram acompanhados de diminuição nos níveis de 5-HT extracelular no cérebro do animal, um efeito que foi bloqueado pelo pré-tratamento com verapamil ou L-NAME (F4, 19 = 7,876, p = 0,0013).
No Teste do Tanque Novo, a maior dose do IB-MECA aumentou o tempo no topo (F[2, 31] =15.47, p < 0.0001), ambas aumentaram a habituação (F[2, 31] = 28.69, p < 0.0001). Não foram observados efeitos motores (H[3] = 2.681, NS). A menor dose aumentou o nado errático (H[3]
= 19.41, p < 0.0001) e a duração do congelamento (F[2, 31] = 5.05, p = 0.0131;), enquanto a maior dose aumentou o tempo no homebase (F[2, 31] = 6.463, p = 0.0048;). O efeito do IB-MECA sobre o tempo no topo foi bloqueado pelo pré-tratamento com L-NAME (F[1, 28] = 20.34, p = 0.0001), porém não foi bloqueado pelo pré-tratamento com verapamil (F[1, 28] = 0.7534, NS) e fluoxetina (F[1, 28] = 5.63, p = 0.0248).
CONCLUSÕES
A ativação do receptor A3A pelo IB-MECA reduz o comportamento tipo-ansiedade por um mecanismo dependente de receptores DHP, óxido nítrico e SERT. A diminuição nos níveis extracelulares de 5-HT, de forma dependente de cálcio e óxido nítrico, sugere uma modulação da recaptação. A via cálcio-NOS-SERT parece mediar o efeito ansiolítico do IB-MECA. A redução da escototaxia (teste de preferência claro/escuro) pelo IB-MECA perece ser dependente de canais de cálcio tipo L, óxido nítrico e SERT, porém o mesmo não acontece na geotaxia ou distribuição vertical (teste do tanque novo), onde a via do IB-MECA parece ser dependente de óxido nítrico sintase e independente de canais de cálcio tipo L e SERT.
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