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FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE II
Instruções de Uso
APRESENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DA FAMÍLIA
Código Descrição
MDR172 Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR172 - 10 placas
CDR5 Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR5 - 1 x 5 mL CDR50 Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR50 - 1 x 50 mL
CDR1D Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado - CDR1D - 1 x 1 mL
ABSG Reagente Controle Antilinfócito B IgG - ABSG - 1 x 1 mL ABSM Reagente Controle Antilinfócito B IgM - ABSM - 1 x 1 mL FB2-100 Reagente de Isolamento (separação) - FB2-100 - 1 x 10 mL
PC1-500 Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato - PC1-500 - 1 x 500 mL
NS Reagente Controle Negativo - NS - 1 x 1 mL
USO PRETENDIDO
A Placa para Tipagem de HLA Terasaki é uma placa de poliestireno com 60, 72 ou 96 poços contendo anticorpos alo ou monoclonais conhecidos contra
antígenos HLA. Cada poço contém 1 µL de um antissoro específico ou anticorpo monoclonal e 5 µL de óleo mineral. Cada placa contém um controle positivo e um negativo. Para uso na determinação de antígenos HLA classe II na superfície da
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célula através da metodologia de microlinfocitotoxicidade dependente de
complemento.
Os controles ABSG, ABSM e NS são usados para testar a pureza das
preparações celulares. Podem também ser usados em combinação para identificar a contaminação de preparo de células.
Os complementos CDR5, CDR50 e CDR1D são utilizados em ensaios de citotoxicidade dependentes de complementos para determinar os antígenos HLA
de Classe II da superfície celular.
O componente FB2-100 (Fluorobeads B) fornece um procedimento simples para o isolamento de Linfócitos B para uso em testes de tipagem HLA classe II
usando corantes fluorescentes.
O componente PC1-500 (PBS/Citrato) é um reagente para ser usado no
método de isolamento Fluorobeads B (FB2-100).
Esses materiais são para uso em laboratório de imunologia na tipagem HLA.
Através desse teste determina-se a compatibilidade HLA entre indivíduos e, por isso, esse teste é denominado de teste de histocompatibilidade.
PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO DO PRODUTO
Os linfócitos viáveis são incubados com uma mistura de anticorpos ligados a
um complemento. Se o linfócito possuir um antígeno reconhecido por um anticorpo específico, a porção FAB do anticorpo se liga ao antígeno, formando um
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complexo antígeno-anticorpo. Após a formação desses complexos, com a fração
C1q e o Ca++ do complemento, ligam-se à porção FC do anticorpo.
Um anticorpo IgM é necessário para ligar uma molécula C1q, ou dois
anticorpos IgG são necessários para ligar uma molécula C1q. A ligação C1q inicia a cascata do sistema complemento, a qual induz a uma lise da célula com o
complexo antígeno-anticorpo. Em uma reação negativa os linfócitos se mantêm viáveis. Em uma reação positiva os linfócitos estão mortos.
COMPONENTES FORNECIDOS E NÃO FORNECIDOS
Código Material Fornecido Materiais necessários, mas não fornecidos
1) 10 placas de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR172; 2) Worksheets identificando a especificidade de cada anticorpo monoclonal;
3) Instruções de uso.
1) Microsseringas HLA (micro dispensadores/dosadores); 2) Insta-Seal (OLI cat. TIS250U) lâminas cobertas ou lâminas de vidro e óleo mineral (Vaseline);
3) Reagentes corantes e fixadores:
- Para teste de exclusão de corante: eosina-Y (base sódica) e formaldeído, ou Stain-Fix (cat. SF-500 da One
4 MDR172
Lambda);
- Para teste fluorescente: FluoroQuench AO/EB (cat. # FQAE-500 da One Lambda).
4) Eliminação da Hemoglobina:
- De soro bovino liofilizado: EDTA PBS a 5%; azida sódica a 1%.
- De células vermelhas totais: solução salina; EDTA PBS a 5%; solução azida a 1%.
5) Solução a 1% de tinta: soro albumina bovino (BSA); EDTA PBS 5%; azida sódica; tinta preta de caligrafia Higgins; 6) Solução 5% EDTA (dissódico) PBS;
7) Solução estoque de Brometo de etídio (EB): água destilada; PBS;
8) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA);
- Solução stock: Dissolva 10 mg de CFDA em 1 mL de acetona num tubo de vidro. Armazene a –20°C em tubos de Beckman. - Solução de trabalho: Use uma das seguintes:
Preparado em PBS a pH 7,2: Acrescente 30 μl de solução stock CFDA a 5 mL de PBS (pH 7,2). Armazene a 2–5°C durante um período máximo de 1 semana.
Preparado em PBS a pH 5,5: Acrescente 30 μl de solução stock CFDA a 5 mL de PBS (pH 5,5). Armazene a 2–5°C durante um período máximo de 1 semana.
CDR-5
1) 1 frasco com 5 mL de Complemento de Coelho para HLA Classe II;
2) Instruções de uso.
Não aplicável.
CDR-50
1) 1 frasco com 50 mL de
Complemento de Coelho para HLA Classe II;
2) Instruções de uso.
Não aplicável.
CDR-1D
1) 1 frasco com 5 mL de Complemento de Coelho para HLA Classe II
Liofilizado;
2) Instruções de uso.
Não aplicável.
ABSG
1) 1 frasco com 1 mL de Reagente Controle Antilinfócito B IgG;
2) Instruções de uso.
Não aplicável.
ABSM
1) Reagente Controle Antilinfócito B IgM - ABSM - 1 x 1 mL;
2) Instruções de uso.
5 NS
1) 1 frasco com 1 mL de Reagente Controle Negativo;
2) Instruções de uso.
Não aplicável.
Código Material Fornecido Materiais necessários, mas não fornecidos
FB2-100 1) 1 frasco com 10 mL de Reagente de Isolamento (separação);
2) Instruções de uso.
1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou equivalentes);
2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 mL e 1,5 mL, com tampas;
3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific, Nº de Catálogo 9249); 4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%; 5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente); 6) Aspirador ou pipetas descartáveis;
7) Reagente PBS/Citrato:
- Número de catálogo OLI PC1-500, ou - Reagente PBS/Citrato
(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g de citrato trissódico dihidratado e 2,5 g de ácido cítrico em 90 mL de água destilada. Perfaça um volume final de 100 mL. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 mL de 10X citrato a 90 mL de PBS. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)
- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30 minutos para inativar o complemento. Armazene a uma temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e congele a –20°C; - Solução de trabalho: Adicione 5 mL de solução stock de HIFCS a 95 mL de meio de McCoy ou equivalente.
PC1-500 1) 1 frasco com 500 mL de Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato; 2) Instruções de uso.
1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou equivalentes);
2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 mL e 1,5 mL, com tampas;
3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific Nº de Catálogo 9242); 4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%; 5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente); 6) Aspirador ou pipetas descartáveis;
6 7) Reagente PBS/Citrato:
- Número de catálogo OLI PC1-500, ou - Reagente PBS/Citrato
(1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g de citrato trissódico dihidratado e 2,5 g de ácido cítrico em 90 mL de água destilada. Perfaça um volume final de 100 mL. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
(2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 mL de 10X citrato a 90 mL de PBS. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5°C.
8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS)
- Solução stock: Aqueça o FCS a 56°C durante 30 minutos para inativar o complemento. Armazene a uma temperatura entre 2 a 5°C ou aliquote e congele a –20°C; - Solução de trabalho: Adicione 5 mL de solução stock de HIFCS a 95 mL de meio de McCoy ou equivalente.
Instrumentos Necessários e Não Fornecidos
Microscópio de contraste de fase, que poderá ser invertido e com fluorescência, dependendo da metodologia utilizada para separação de linfócitos. Em caso de dúvidas, sempre consulte a Biometrix Diagnóstica.
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA, UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ
A validade e as condições de armazenamento e transporte de cada um dos produtos pertencentes a esta família estão indicados a seguir:
Código do
produto Informações sobre transporte
Temperatura de armazenamento
MDR172 Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco. -65°C ou inferior CDR-5 Os produtos devem ser transportados congelados,
7 CDR-50 Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco. -65°C ou inferior CDR-1D Os produtos devem ser transportados refrigerados,
acondicionados com gelo reciclável. 2°C-8°C ABSG Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco. -20°C ou inferior. ABSM Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco. -20°C ou inferior. NS Os produtos devem ser transportados congelados,
acondicionados com gelo seco. -20°C ou inferior. FB2-100 Os produtos devem ser transportados refrigerados,
acondicionados com gelo reciclável. 2°C-8°C PC1-500 Os produtos devem ser transportados refrigerados,
acondicionados com gelo reciclável. 2°C-8°C
Caso o material esteja congelado, somente descongelar o que será imediatamente utilizado. Se necessário, aliquotar o conteúdo em tubos de menor
volume. Esse volume deve ser determinado por cada laboratório, pois é dependente da rotina de cada um.
PRECAUÇÕES
Somente para uso em diagnóstico in vitro.
Cuidados especiais: quando manusear o produto, utilizar luvas descartáveis. Descartar se houver descongelamento prematuro.
CUIDADO: Todos os produtos de origem sanguínea devem ser tratados como potencialmente infecciosos. A fonte de material do qual esse produto foi derivado foi dada como negativa quando testada de acordo com os requerimentos para
8 testes pela FDA. Nenhum método de teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitirão agentes infecciosos.
Não existem padrões Americanos que indiquem potência ou especificidade.
CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA OBJETO DO DIAGNÓSTICO
Por se tratar de material para teste diagnóstico, que envolve amostra de origem sanguínea humana, manipular como material potencialmente infeccioso.
PROCESSO DE MEDIÇÃO
Coleta e Preparo da Amostra
a. Sangue armazenado por menos de 24 horas: coloque 15-20 mL de sangue
total em heparina de sódio (1000 unidades/10 mL de sangue) em tubo “Vacutainer”, tampa verde.
b. Sangue armazenado por mais de 24 horas: coloque 15-20 mL de sangue
total em tubo “Vacutainer” ACD ou CPDA.
c. Não use heparina de lítio. IMPORTANTE: o sangue deve ser armazenado
horizontalmente entre 22 e 25°C. Não refrigere.
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a. Centrifugue o sangue citrificado ou heparinizado por 10 minutos a 400 g.
b. Colete a camada tamponada e dilua em volume igual de PBS (fosfato salino tamponado); misture bem.
c. Espalhe o máximo de 2 mL da mistura da camada tamponada/PBS sobre 1,5 mL de Ficoll-Hypaque em tubos de 5 mL e centrifugue por 10 minutos a
1000 x g.
d. Colete aproximadamente 1 mL da interfase de cada tubo e transfira para
tubos tipo “Fisher”. Centrifugue por 1 a 1 ½ minuto a 3000 x g em uma centrífuga do tipo “Fisher”.
e. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o concentrado em PBS. Centrifugue
por 1 min a 1000 x g (isso remove a maioria das plaquetas).
f. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o concentrado em PBS, e então,
adicione 1 gota de trombina (100 unidades/mL). Misture.
g. Coloque os tubos para girar em uma roda vertical a 8 RPM ou inverta os
tubos por 2-5 minutos, ou até que apareçam agregados brancos.
h. Centrifugue por 3 minutos a 1000 x g em uma centrífuga do tipo “Fisher” e
transfira o sobrenadante para limpar os tubos “Fisher”. Os agregados remanescentes podem ser poupados para o procedimento de isolamento de monócitos. Centrifugue o sobrenadante por 1 minuto a 1000 x g.
i. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o concentrado por 1 minuto a 1000 x g. Repita.
j. Ressuspenda o concentrado em meio de McCoy e ajuste as células para uma concentração de 2x106 células/mL de linfócitos totais para tipagem.
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Separando/Isolando Linfócitos B
Atualmente, existem diferentes procedimentos para o isolamento de
linfócitos B, sendo que os mais utilizados são:
a. Através da observação empírica, notou-se que os linfócitos B têm a
tendência de se aderir às superfícies sólidas, enquanto que os linfócitos T são relativamente não aderentes. Com isso, o uso da técnica de aderência
em lã de nylon ainda pode ser usado por alguns laboratórios, sendo que a viabilidade em células não frescas é bem baixa, dificultando no processo de
tipagem de classe II.
b. Através do processo onde pérolas imunomagnetizadas se ligam aos linfócitos (T ou B) e, dessa forma, através da atração magnética esses
linfócitos são isolados das demais células presentes na amostra. (FluoroBeads específicas para linfócito T ou B).
Seguem explicações mais detalhadas sobre as técnicas a seguir:
Detalhes de Cada Técnica
1. Microtécnica do Canudo com Lã de Nylon - as proporções dadas abaixo são
para coluna capaz de manusear até 10 x 106 células/mL:
a. Feche uma das saídas de um canudo plástico, flexível e transparente (0,6 x 12-14 cm) em ângulo de 45°;
b. Proceda com um bom retalhamento de 0,1g de lã de nylon esfregado, encharcando-o em HBSS ou PBS em uma placa de Petri;
c. Encha ¾ do canudo com HBSS ou PBS. Então, usando a ponteira de uma pipeta, gradualmente e uniformemente, coloque a lã de nylon dentro do
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canudo para uma altura de aproximadamente 6 cm. Nesse estágio a coluna
pode ser armazenada a 4°C por até 2 semanas;
d. Corte ou perfure o lado selado do canudo fazendo uma abertura de
aproximadamente 2 mm;
e. Lave a lã de nylon com 5 mL HBSS ou PBS e então com 5 mL de meio
contendo HIFCS a 5%;
f. Quando o meio cobrir a lã de nylon, gire o canudo para a posição
horizontal e incube por 30 min a 37°C. Alternativamente, use meio pré-aquecido (morno);
g. Adicione 0,5 mL de suspensão de linfócitos purificados (procedimento
descrito acima) em HIFCS a 5% ao topo da coluna e permita às células se moverem por todo o percurso dentro da lã. Uma boa separação de células T
e B depende da pureza da preparação de linfócitos iniciais, portanto, a suspensão deverá ser isenta de granulócitos e plaquetas;
h. Adicione aproximadamente 0,2 mL de HIFCS a 5% ao topo da coluna para prevenir ressecamento. Deixe a coluna deitada e incube a 37°C por 30 min;
i. Para recuperar os linfócitos T, realize duas lavagens (8 mL cada) com HIFCS a 5% morno (37°C) gotejando através da coluna que deverá estar na posição vertical. O eluente contém células T não aderentes;
j. Para recuperar as células B aderentes, adicione 1,5 mL de HIFCS a 5% à coluna e, repetidamente, esprema o canudo. Continue essa etapa até que 8
mL do meio tenham sido usados;
k. Centrifugue ambas as suspensões de células T e B por 5 min a 1000 x g e
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l. Ressuspenda as células em quantidade mínima de meio (ex. 0,5 mL),
verifique a viabilidade, conte as células e ajuste a concentração para 2x106
células/mL;
m. Na média, esse procedimento deverá fornecer uma recuperação de 80-90% das células.
2. Isolamento de Linfócitos B (Puros) Através de Pérolas Imunomagnetizadas –
Fluorobeads B (One Lambda, Inc.):
Este procedimento leva menos de 10 minutos para ser completado e é realizado totalmente em temperatura ambiente. O reagente de separação
Fluorobeads B é composto de partículas imunomagnéticas acopladas a anticorpo monoclonal (CD19) específico para o linfócito B. Essas pérolas se ligam
seletivamente aos linfócitos B e, então, são isoladas com o auxílio de um magneto (FBAMAG6 + 6 – One Lambda, Inc.).
3. Isolamento a Partir de Sangue Total:
a. Dispense 5 mL de sangue em um tubo de 15 mL. b. Adicione 5 mL de PBS/Citrato 1X e misture por inversão.
c. Antes do uso, ressuspenda completamente as FluoroBeads B. Agite em
Vortex por 10 segundos.
d. Adicione 100 µL de FluoroBeads T à amostra de teste. Tampe imediatamente
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e. Agite delicadamente o tubo através de rotação por 5 minutos à temperatura
de 22-25°C para permitir que as pérolas se liguem às células B (não exceder 5 minutos). Pode ser usada rotação manual ou mecânica.
f. Destampe o tubo e coloque-o em um separador magnético por 5 minutos. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Então,
remova tubo do magneto.
g. Adicione 2-3 mL de PBS/Citrato 1X (PC1-500). Agite o tubo para a
ressuspensão das pérolas.
h. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 1 minuto. i. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Então,
remova o tubo do magneto.
j. Repita essa etapa de lavagem somente com o PBS/Citrato 1X outras duas
vezes.
k. Siga com os procedimentos de identificação e marcação da célula conforme
descrito a seguir, ou ressuspenda as células (beads) em 0,5 mL de meio McCoy ou equivalente, com 5% HIFCS.
Procedimento de Marcação e Concentração da Célula A. Pelo método CFDA:
1. Destampe e coloque o tubo em um separador magnético por 1 minuto. Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células (beads) com PBS. Repita
essa etapa duas vezes.
2. Adicione 0,5 mL de CFDA (solução de trabalho, pH 5,5) e misture.
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4. Repetir etapa 1.
5. Ressuspenda as células em 0,5 mL de meio McCoy ou equivalente, com 5% HIFCS.
6. Adicione 1 µL de suspensão celular a um poço branco de uma placa Terasaki. Verifique a contagem de células através de um microscópio de
fluorescência. Ajuste a concentração para 2 x 106/mL (2.000 células por
poço).
7. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5 mL e armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até 2 dias antes de serem aplicadas nas placas para o teste.
B. Método do FQAE – FluoroQuench (corante) com Brometo de etídeo e
Laranja de acridina:
1. Transfira 1 µL de células (beads/pérolas) para um poço branco de uma placa
Terasaki.
2. Adicione 5 µL de FQAE (cat. OLI # FQAE-500) ao poço.
3. Verifique a contagem da célula através de um microscópio de fluorescência. Ajuste, remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Então, remova o tubo do magneto.
4. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5 mL e armazenadas horizontalmente a 2-5°C por até dois dias antes de serem aplicadas nas
placas para o teste.
Após esse procedimento, teremos células B prontas para tipagem HLA de
15 Observação: o protocolo a seguir é um protocolo recomendado, partindo-se do pressuposto de que o laboratório estará utilizando a metodologia do FQAE como corante das células. Os tempos de incubação podem variar dependendo da força de tipagem dos reagentes e/ou complemento utilizado. (A One Lambda sugere 30 minutos com o anticorpo e 60 minutos com o complemento, nas placas de tipagem de HLA).
Procedendo Com o Teste
Devido à resistência de cada reagente, tome os cuidados necessários quando
dispensar as células e os reagentes. Não toque o fundo dos poços com as agulhas das seringas.
Descongele as placas à temperatura ambiente (20-25°C) por 15 minutos e use-as em até 1 hora após a retirada do freezer. Agite o tubo contendo sua
amostra por inversão – não agite através do procedimento de pipetagem repetitiva. 1. Para cada poço adicione 1 µL de uma suspensão de linfócitos B (2 x 106
células/mL) para as placas de tipagem HLA, usando uma seringa de 50 µL conectada a um dispensador de repetição.
2. Misture as micro-gotas, usando um misturador eletrostático ou um arame.
3. Incube as placas à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 60 minutos para as placas monoclonais e avance para a etapa # 6.
Para placas com alosoro, incube por 30 minutos a 20-25°C.
4. Adicione 5 µL de complemento DR (CDR-5, CDR-50 ou CDR1D) a cada
16 Observação: Placas Monoclonais (LMT ou SMT): Não é necessária esta etapa de
adição de complemento de coelho e esse período de incubação. Da etapa (4)
avance diretamente para a etapa (6).
5. Em cada poço adicione 5 µL de FQAE.
6. As placas podem ser lidas de imediato ou então poderão ser armazenadas
a 2-5°C por até dois dias.
Célula morta ocorrerá em qualquer poço teste onde o antígeno HLA na
superfície da célula é reconhecido pelo seu anticorpo anti-HLA conjugado. Para teste de fluorescência, os linfócitos negativos (vivos) aparecem verdes, e os
linfócitos positivos (mortos) aparecem vermelhos (quando usando corante fluorescente da One Lambda com laranja de acridina e brometo de etídio –
FQAE-500).
Avaliação Microscópica dos Testes
A contagem da reação é feita pela estimativa de percentual de células mortas. Se houver linfócitos mortos no controle negativo, o percentual de células mortas
nos poços restantes deve ser ajustado de acordo. O padrão ASHI de leitura é:
Score % de células mortas Interpretação
1 0 - 10 % Negativo
2 11 - 20 % Negativo duvidoso 4 21 - 50 % Positivo fraco
6 51 - 80 % Positivo
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0 --- Ilegível
As frequências fenotípicas para HLA de classe I variarão de modo diferente nas diferentes populações (caucasoides, negroides, orientais, etc.). Referência 4.
CALIBRAÇÃO DO PROCESSO
Não existe procedimento de calibração para a metodologia em questão.
CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS
Não existe cálculo para a obtenção dos resultados da medição. O resultado é feito pelo “score” da reação pela estimativa de percentual de células mortas
realizada pela leitura microscópica.
LIMITAÇÕES DO PROCESSO
Dificuldades na separação celular e contaminação da preparação de linfócitos com células vermelhas, leveduras, monócitos, plaquetas ou granulócitos
podem causar resultados errôneos.
Cabe, ainda, salientar que resultados errôneos podem ocorrer quando
concentrações de células estão acima ou abaixo do nível aceitável. A contaminação bacteriológica ou a mudança no pH de reagentes monoclonais podem causar reações falso negativas.
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Certos antígenos HLA frequentemente exibem especificidades fracas. Estes
são chamados antígenos de reação cruzada e são detalhados por antígenos e anticorpos de cada placa na folha guia de reação modelo que acompanha a placa.
CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE
Uma amostra com tipagem previamente conhecida deverá ser utilizado anterior ao início dos testes de rotina para averiguar a confiabilidade do novo lote de placa recebido no laboratório. Somente utilizar as placas dentro de seu prazo de
validade.
Caso o laboratório queira testar a pureza de suas preparações celulares ou
ainda em combinação identificar a contaminação da preparação de células, os Controles da One Lambda poderão ser utilizados conforme explicados abaixo:
NS = O soro controle normal é usado para determinar o fundo de células mortas. Esse soro é proveniente de soro humano do sexo
masculino que não tenha sofrido transfusão com sangue AB negativo.
ABSM, ABSG, ABSMD = Os controles antilinfócitos B são usados para determinar a pureza dos linfócitos B. Os controles antilinfócitos B são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos
aos linfócitos B sem reatividade contra granulócitos, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. (OBS.: O
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teste de células com leucemia crônica linfocitária, nas placas LCT30D
da One Lambda.)
AGSM, AGSMD = Os controles antigranulócitos são utilizados para determinar a pureza dos granulócitos. Esses controles são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos granulócitos,
mas sem reatividade contra linfócitos B, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste.
AMSM, AMSMD = Controles antimonócitos são usados para determinar a pureza de monócitos. Os controles antimonócitos são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a
monócitos, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, linfócitos T, plaquetas e células vermelhas do sangue teste.
ATSG, ATSM, ATSMX, ATSMD = Controles antilinfócitos T que são utilizados para determinar a pureza de linfócitos T. Os controles
antilinfócitos T são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a linfócitos T, mas sem reatividade contra granulócitos,
linfócitos B, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. OBS.: O ATSMX é o único controle anti-T para ser utilizado com células isoladas com FluoroBeads T.
ALSG, ALSM = Controle antilinfócitos totais são usados para determinar a reatividade do complemento. Esse controle é feito com
anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos humanos. OBS.: não utilize ALSG como controle para teste
20 VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS
Estes dados não estão disponíveis para a metodologia em questão.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
A. Potência e especificidade:
Os reagentes-teste foram precisamente caracterizados por triagens
sequenciais sorológicas separadas. Os painéis de amostras de referência de linfócitos congelados foram usados em duas triagens separadas.
Dois terços de todos os reagentes selecionados são fortes, com reatividade HLA específica claramente definida (com 70% de índice de força), permitindo não
mais que 10% de reações falso positivas e 15% de reações falso negativas. O restante - um terço de reagentes - não foram de encontro com esse critério, mas foram exaustivamente investigados quanto à sua utilidade quando usados para
sustentar outros anticorpos bem-definidos.
Anticorpos multiespecíficos foram usados somente se anticorpos não
monoespecíficos são disponíveis para uma especificidade em particular. Anticorpos multiespecíficos foram escolhidos com o mesmo desempenho característico para
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painel de linfócitos frescos preparados foi utilizada para confirmar e validar a força
do soro e sua especificidade.
As análises foram feitas usando técnicas computadas no Eighth International
Histocompatibility Workshop em 1980. (referência 4).
B. Controle Negativo
O antissoro do controle negativo é originário de um sangue saudável
humano masculino do tipo AB, o qual não possui reatividade citotóxica em testes com doadores de linfócitos selecionados ao acaso. Esse controle é usado para determinar a viabilidade do linfócito.
C. Controle Positivo:
O controle positivo é um anticorpo monoclonal com ação fortemente citotóxica
aos linfócitos humanos. Esse controle é usado para determinar a atividade de complemento.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
TERASAKI PI, BERNOCO F., PARK MS, OZTURK G, IWAKI Y. Microdroplet testing for HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol 69:103-120, 1978.
DANILOVS J, TERASAKI PI, PARK MS, AYOUB G. B lymphocyte isolation by thrombin nylon wool. In Histocompatibility Testing. Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA 287-288, 1980.
22 ASHI Laboratory Manual, 2nd ed. Edited by Zachary, Andrea A. and Teresi, Gary, p. 199, 1990.
TERASAKI PI, Ed., Histocompatibility Testing. Los Angeles, CA, 1980.
NIKAEIN A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3rd Edition, ASHI, Lenexa, KS.
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360 Tel.: (41) 2108-5250 Fax: (41) 2108-5252 DDG: 0800-7260504 E-mail: biometrix@biometrix.com.br Website: www.biometrix.com.br CNPJ: 06.145.976/0001-39 INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
One Lambda, Inc. 21001 Kittridge Street Canoga Park – CA - EUA
REGISTRO ANVISA NÚMERO
80298490001
23
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: 09302336
REVISÕES
Revisão Descrição da Alteração Data
00 Elaboração 09/2006
01
Formatação, layout, produtos descontinuados, alteração nas condições de armazenagem e
transporte, inclusão das denominações comerciais de cada item da família, inclusão de número de registro e alteração de Responsável
Técnica
02/2011
02 Alteração do DDG 09/2012
03 Revisão ortográfica e gramatical, formatação,
