CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA (CCET)
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Mantas de fibras poliméricas biodegradáveis obtidas por
Solution Blow Spinning como modelo biomimético de casulos
de Rostchildia sp.
Carolina Lima de Almeida
Orientador: Prof. Dr. José Daniel Diniz Melo
Co-orientador: Prof. Dr. Eliton Souto de Medeiros
Janeiro, 2021
Mantas de fibras poliméricas biodegradáveis obtidas por Solution
Blow Spinning como modelo biomimético de casulos de
Rostchildia sp.
Carolina Lima de Almeida
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais.
Janeiro, 2021 Natal – UFRN
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Almeida, Carolina Lima de.
Mantas de fibras poliméricas biodegradáveis obtidas por Solution Blow Spinning como modelo biomimético de casulos de Rostchildia sp / Carolina Lima de Almeida. - 2021.
91 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, Natal, RN, 2021. Orientador: Prof. Dr. José Daniel Diniz Melo.
Coorientador: Prof. Dr. Eliton Souto de Medeiros.
1. Biomimetismo - Dissertação. 2. Fibras - Dissertação. 3. Policaprolactona - Dissertação. 4. Poli(ácido lático) - Dissertação. I. Melo, José Daniel Diniz. II. Medeiros, Eliton Souto de. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 621.3.027.2
Carolina Lima de Almeida
Mantas de fibras poliméricas biodegradáveis obtidas por Solution
Blow Spinning como modelo biomimético de casulos de
Rostchildia sp.
Dissertação de mestrado apresentada a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais.
Natal, janeiro de 2021.
______________________________________________ Prof. Dr. José Daniel Diniz Melo
UFRN
______________________________________________ Prof. Dr. Eliton Souto de Medeiros
UFPB
______________________________________________ Profª. Drª. Maria Carolina Burgos Costa do Nascimento
Dedico este trabalho aos meus pais, que não mediram esforços para me ajudar a chegar até aqui.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por permitir que eu viva tudo isso de uma maneira tão engrandecedora, aprendendo coisas novas em cada passo dessa jornada. Aos meus pais, que desde sempre me incentivaram a ir atrás dos meus sonhos e fizeram de tudo para que eu conseguisse. Aos meus irmãos, por se fazerem presente durante esse tempo, aliviando os estresses e medos. Ao professor Cláudio Romero, que para mim é apenas “tio Cacau”, e a sua esposa, minha “tia Betinha”, que me hospedaram, me fizeram companhia e me deram muitos conselhos durante esse mestrado em Natal, que contou com muitas idas e vindas de carro e ônibus.
Um agradecimento mais do que especial ao meu marido, Josinaldo, por ter sido a pessoa que esteve comigo todos os dias durante essa jornada, que me apoiou, que ouviu todas as minhas angústias e medos, que comemorou comigo nas vitórias, e o mais importante, esteve ao meu lado todo o tempo, sempre tentando me ajudar.
Minha vida acadêmica foi marcada por muitas pessoas brilhantes, e hoje eu agradeço ao professor José Daniel, meu orientador, que mesmo sendo uma pessoa muito ocupada, não mediu esforços para me ajudar todas as vezes que precisei, o senhor, mesmo não tão próximo devido as circunstâncias, foi um exemplo de organização e dedicação em minha vida. Ao professor Eliton Medeiros, que faz parte da minha vida já há um bom tempo, por todos os ensinamentos, conselhos e puxões de orelha, que sempre me empurraram para frente, eu sou extremamente grata. A Lucas, que acredito que faça parte de todos os agradecimentos das pessoas que fazem o LAMAB, pois ele sempre está lá para ajudar a todos, inclusive a mim, estando comigo desde antes do início deste mestrado.
Agradeço à CAPES, por todo o apoio financeiro e pela compreensão em relação ao momento que vivemos diante da pandemia, concedendo a extensão do prazo para conclusão deste trabalho, para que assim fosse possível conclui-lo da melhor forma possível. A UFRN, por ter se tornado uma segunda casa para mim em Natal, me fazendo sentir prazer em estar presente e admirando ainda mais sua
estrutura, seus alunos e seus professores, aos quais também agradeço todo o ensinamento e ajuda.
Por fim, muito obrigada a todos que direta ou indiretamente me ajudaram para que esse trabalho fosse concluído, vocês fizeram diferença em minha vida.
RESUMO
O estudo da biomimética tem despertado grande interesse em vários campos da ciência, como por exemplo em aplicações médicas. Neste trabalho mantas de fibras poliméricas biodegradáveis foram produzidas com propriedades compatíveis com as encontradas em casulos da mariposa Rothschildia sp. Inicialmente, o casulo foi estudado através das técnicas de termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e ensaios mecânicos de tração. Os resultados indicaram uma estrutura composta por fibras de fibroína em uma matriz de sericina, além da presença de hidroxiapatita. As mantas foram produzidas a partir de fibras de policaprolactona (PCL) e poli(ácido lático) (PLA), que apresentam estrutura química semelhante a fibroína, com a adição de hidroxiapatita (HA). A técnica de Solution Blow Spinning (SBS), ou fiação por sopro em solução, foi utilizada para a produção das fibras poliméricas com uma matriz multibicos e um coletor giratório. Após o processo de fiação, as mantas foram prensadas a quente, com temperatura de processamento e quantidade de camadas variando em cinco grupos, para formar uma matriz de PCL e produzir uma estrutura equivalente a do casulo. As mantas também foram caracterizadas por DSC, FTIR, MEV e ensaios mecânicos de tração. A composição química das mantas de PCL e PLA foi equivalente a encontrada no casulo, bem como a morfologia fibrosa resultante do processamento por SBS. As imagens de MEV confirmaram a formação de uma fase matriz de PCL que une as fibras de PLA após o processo de prensagem. A resistência mecânica a tração das mantas variou de acordo com a quantidade de camadas e temperatura de processamento utilizada. Os melhores resultados foram obtidos para mantas com seis camadas de PCL e PLA com HA, processadas em prensa à quente em temperatura de 90 °C, por 30 min. Apesar da resistência mecânica das mantas produzidas terem sido menores que a do casulo, os resultados indicaram que este material apresenta potencial para ser utilizado em meio biológico.
ABSTRACT
There has been great interest in the study of biomimetics for several fields of science, such as medical applications. In this work, biodegradable polymeric fiber mats were produced with properties compatible with those found in cocoons of the moth Rothschildia sp. Initially, the cocoon was studied using techniques of thermogravimetry (TG), differential scanning calorimetry (DSC), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), scanning electron microscopy (SEM) and mechanical tensile tests. The results indicated a structure composed of fibroin fibers in a sericin matrix, in addition to hydroxyapatite. The mats were produced from polycaprolactone (PCL) and poly (lactic acid) (PLA) fibers, which have a chemical structure comparable to fibroin, with the addition of hydroxyapatite (HA). Solution Blow Spinning (SBS) technique was used to produce the polymeric fibers with a multi-nozzle matrix and a rotating collector. After the spinning process, the mats were hot pressed, with processing temperature and number of layers varying in five groups, to form a PCL matrix and produce a structure equivalent to that of the cocoon. The mats were also characterized by DSC, FTIR, SEM and mechanical tensile tests. The chemical composition of the PCL and PLA mats were equivalent to that found in the cocoon, as well as fibrous morphology resulting from the SBS processing. SEM images confirmed the formation of a PCL matrix phase that binds the PLA fibers after the hot press processing. Tensile strength of the mats varied according to the number of layers and processing temperature used. The best results were obtained for mats with six layers of PCL and PLA with the addition of HA, processed in a hot press at 90 ° C, for 30 min. Although the strength of the mats produced were lower than that of the cocoon, the results indicated that this material has a potential to be used in biological media.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mariposa do gênero Rothschildia sp. ... 24
Figura 2 - Foto do casulo em seu habitat natural, ainda no período de crisálida ... 25
Figura 3 - Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de um scaffold de Policaprolactona (PCL)(IPT, 2019) ... 27
Figura 4 - Desenho esquemático do aparelho utilizado no método de SBS... 28
Figura 5 - Esquema da formação do cone (OLIVEIRA et al., 2013) ... 28
Figura 6 - Estrutura química do PCL (OLIVEIRA et al., 2013) ... 30
Figura 7 - Estrutura química do PLA (OLIVEIRA et al., 2013) ... 31
Figura 8 - Representação da estrutura cristalina da hidroxiapatita (“Hydroxyapatite Ca5(OH)(PO4)3.”, 2020) ... 32
Figura 9 - Corpos de prova utilizado para o ensaio de tração do casulo ... 35
Figura 10 - Matriz Multibicos (RAMOS, 2017) ... 37
Figura 11 - Bomba de infusão com três seringas com soluções diferentes no mesmo processo de fiação ... 37
Figura 12 - Processo de fiação completo, sistema de infusão, sistema de ejeção das fibras e sistema de coleta ... 38
Figura 13 - As 6 camadas das mantas posicionadas umas sobre as outras, antes do processo de prensagem ... 41
Figura 14 - A chapa de alumínio inferior à esquerda, a chapa de alumínio superior ao meio e o peso adicionado em cima da chapa superior à direita ... 41
Figura 16 - Imagem do casulo ainda fechado, após ser retirado do seu habitat
natural ... 44
Figura 17 - Imagem da manta PCL/2PLA+HA após o processo de fiação e de retirada do coletor ... 45
Figura 18 - Imagem de uma região da manta de PCL obtida via SBS ... 46
Figura 19 - Imagem de uma região da manta de PLA obtida via SBS ... 46
Figura 20 - Imagem de uma região da manta de PLA+HA obtida via SBS ... 47
Figura 21 - Imagem de uma região da manta de PCL/2PLA+HA obtida via SBS ... 47
Figura 22 - Imagem das mantas obtidas via SBS. (a) PCL; (b) PLA; (c) PLA+HA; (d) PCL/2PLA+HA... 48
Figura 23 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra CAS, linha amarela referente a perda de massa em % e linha preta a DTG ... 48
Figura 24 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra PCL... 49
Figura 25 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra PLA ... 50
Figura 26 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra PLA+HA ... 51
Figura 27 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra PCL/2PLA+HA ... 51
Figura 28 - Curva de DSC obtida para a amostra CAS ... 52
Figura 29 - Curva de DSC obtida para a amostra PCL ... 53
Figura 30 - Curva de DSC obtida para a amostra PLA ... 54
Figura 31 - Curva de DSC obtida para a amostra PLA+HA ... 55
Figura 32 - Curva de DSC obtida para a amostra PCL/2PLA+HA... 55
Figura 33 - Gráfico obtido no ensaio de FTIR da amostra CAS ... 56
Figura 35 - Espectro de FTIR obtido da amostra PLA ... 58
Figura 36 - Espectro de FTIR obtido da amostra PLA + HA ... 58
Figura 37 - Espectro de FTIR obtido da amostra PCL/2PLA+HA ... 59
Figura 38 - Imagens de MEV da amostra CAS na região externa ... 60
Figura 39 - Imagem de MEV da região interna do casulo ... 61
Figura 40 - Imagem de MEV da região da borda do casulo ... 62
Figura 41 - Imagens de MEV de um rompimento de fita no casulo ... 62
Figura 42 - Espectro de EDS obtido das partículas encontradas nos casulos ... 63
Figura 43 - Espectro de EDS obtido das fibras encontradas nos casulos ... 64
Figura 44 - Imagem de MEV da manta PCL/2PLA+HA com destaque para aglomerado de HA ... 65
Figura 45 - Imagem de MEV da manta PCL/2PLA ... 66
Figura 46 - Imagens de MEV das amostras: (a) FIB1, (b) FIB2, (c) FIB3, (d) FIB4 e (e) FIB5 ... 68
Figura 47 - Imagens de MEV da amostra FIB1 ... 69
Figura 48 - Imagens de MEV da amostra FIB2 ... 70
Figura 49 - Imagens de MEV da amostra FIB3 ... 71
Figura 50 - Imagens de MEV da amostra FIB4 ... 71
Figura 51 - Imagens de MEV da amostra FIB5 ... 72
Figura 52 - Gráfico obtido no ensaio de tração da amostra CAS04 ... 74
Figura 53 - Gráfico obtido no ensaio de tração da amostra FIB1.4 ... 76
Figura 55 - Gráfico obtido no ensaio de tração da amostra FIB3.4 ... 79
Figura 56 - Gráfico obtido no ensaio de tração da amostra FIB4.2 ... 80
Figura 57 - Gráfico obtido no ensaio de tração da amostra FIB5.4 ... 82
Figura 58 - Curvas obtidas para as amostras do grupo FIB1, FIB2, FIB3, FIB4 e FIB5 ... 83
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Parâmetros para produção das soluções Tabela 2 - Especificações das mantas produzidas
Tabela 3 – Descrição dos protocolos usados na prensagem
Tabela 4 – Resultados obtidos no ensaio de tração das amostras do casulo Tabela 5 – Resultados obtidos no ensaio de tração das amostras do grupo FIB1 Tabela 6 – Resultados obtidos no ensaio de tração das amostras do grupo FIB2 Tabela 7 – Resultados obtidos no ensaio de tração das amostras do grupo FIB3 Tabela 8 – Resultados obtidos no ensaio de tração das amostras do grupo FIB4 Tabela 9 – Resultados obtidos no ensaio de tração das amostras do grupo FIB5
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CAS – Casulo
DSC – Calorimetria Exploratória Diferencial
FTIR – Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier HA – Hidroxiapatita
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura PCL – Policaprolactona
PLA – Poli (ácido lático) SBS – Solution Blow Spinning TG – Análise Termogravimétrica
LISTA DE SÍMBOLOS
°C – Graus Celsius cm - centímetro
m² - metros ao quadrado mg - miligrama
MPa – Mega Pascal
KBr – Brometo de Potássio Kg – Quilograma kN – Kilonewton kV – Kilonolt Pa - Pascal Tc – Temperatura de cristalização Tg – Temperatura de transição vítrea Tm – Temperatura de fusão
SUMÁRIO
RESUMO ... 8
ABSTRACT ... 9
LISTA DE FIGURAS ... 10
LISTA DE TABELAS ... 14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 15
LISTA DE SÍMBOLOS ... 16 1. Introdução ... 19 2. Revisão Bibliográfica ... 22 2.1. Nanotecnologia e Biomimetismo ... 22 2.2. Rothschildia sp. ... 23 2.3. Nanofibras poliméricas ... 26
2.3.1. Solution Blow Spinning...27
2.3.2. Nanofibras de policaprolactona e poli(ácido lático) ...29
2.3.3. Nanofibras contendo hidroxiapatita ...31
3. Materiais e Métodos... 33
3.1. Materiais ... 33
3.2. Métodos ... 33
3.2.1. Caracterizações do casulo ...33
3.2.1.1. Termogravimetria (TG) ... 33
3.2.1.2. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) ... 33
3.2.1.3. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 34
3.2.1.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 34
3.2.1.5. Ensaio Mecânico de Tração ... 34
3.2.2. Produção das mantas biomiméticas por SBS ...35
3.2.2.2. Sistema de Ejeção e Coleta de fibras ... 36
3.2.2.3. Processo de fiação por SBS ... 38
3.2.2.4. Prensagem ... 40
3.2.3. Caracterização dos casulos e das mantas biomiméticas ...42
3.2.3.1. Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ... 42
3.2.3.2. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ... 42
3.2.3.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 43
3.2.3.4. Ensaio Mecânico por tração ... 43
4. Resultados e Discussão ... 44
4.1. Aspecto visual ... 44
4.2. Termogravimetria dos casulos ... 48
4.3. Calorimetria exploratória diferencial - DSC ... 52
4.4. Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier - FTIR ... 56
4.5. Microscopia eletrônica de varredura - MEV... 59
4.5.1. MEV do casulo ...59
4.5.2. MEV das fibras produzidas por SBS ...64
4.5.3. MEV pós prensagem ...66 4.6. Ensaio de tração ... 72 4.6.1. Casulos ...73 4.6.2. Mantas ...74 5. Conclusão ... 84 Trabalhos Futuros ... 85 Referências ... 86
1. Introdução
Uma parte do estudo da nanotecnologia envolve a pesquisa de materiais existentes na natureza, com a intenção de reproduzir sinteticamente suas propriedades e características. A Biomimética é a ciência que estuda esse tipo de reprodução (VINCENT et al., 2006; WHITESIDES, 2005).
O biomimetismo não implica em simplesmente imitar a natureza com o objetivo de desenvolver exatamente o mesmo material. Trata-se de estudar o objeto em questão e a partir daí gerar uma ideia de como formular um novo material com propriedades semelhantes àquele já conhecido, como por exemplo, quando a morfologia de uma teia de aranha é aplicada em algum outro material, visando que esse novo material apresente as mesmas propriedades mecânicas encontradas na teia (VINCENT et al., 2006).
Essa “inspiração” pode surgir de vários lugares, como por exemplo das estruturas formadas pelos animais para protegê-los ou auxiliá-los no processo de caça. As borboletas e mariposas estão na ordem Lepidoptera dos insetos, mais especificamente na Família Saturniidae e gênero Rothschildia sp., que abrange mariposas encontradas na região nordeste do Brasil e despertam interesse pela estrutura de seus casulos, que protegem a larva dos predadores durante o processo de crisálida, mas que também influencia diretamente no desenvolvimento estrutural da mariposa. Em geral, os casulos são formados por fibras unidas como fitas, umas sobre as outras, e com a presença da hidroxiapatita (GODÉ; NOBRE, 2015; MEDEIROS; NETO, 2003; NUNES; PRESTES; SIMA-, 2004; ZHANG et al., 2013).
Um desafio para a engenharia de tecidos é reproduzir uma organização que se assemelhe àquela do ambiente natural ao qual o material é aplicado. No caso do tecido ósseo, a estrutura fibrosa que o colágeno forma em duas dimensões, associado a presença da hidroxiapatita, fornece o suporte para o crescimento celular. Esta estrutura é também observada no casulo da Rothschildia sp. Com a morfologia apropriada, a estrutura estará adequada ao favorecimento da proliferação celular e regeneração dos tecidos (CRUZ-MAYA et al., 2019; PALMIERI et al., 2019).
As nanofibras são muito utilizadas na bioengenharia, para o desenvolvimento de materiais bioativos, ou seja, que exercem uma função positiva no corpo, como o reparo de tecidos, visto que sua elevada área superficial gera uma maior interação com as células. Outras propriedades das nanofibras são também de grande interesse na engenharia de tecidos, como seu baixo peso específico, elevada razão de aspecto e pequenos diâmetros, podendo ser produzidas com a incorporação de nanopartículas (BABITHA et al., 2017; HUANG et al., 2003).
O método mais conhecido para obtenção dessas fibras é a eletrofiação, que usa voltagens elevadas para obtenção de estruturas a partir de, por exemplo, um polímero em solução. Uma técnica alternativa à eletrofiação é a de Solution Blow Spinning (SBS) (MEDEIROS et al., 2009). As fibras são produzidas a partir de uma corrente de gás pressurizado, sem o uso de voltagens, e gera um volume final de fibras obtidas maior do que no processo de eletrofiação (RAMOS, 2017; SILVA; OLIVEIRA; MEDEIROS, 2015). O equipamento consiste em dois bicos concêntricos, sendo o bico interno por onde a solução polimérica é bombeada e o bico externo por onde passa uma corrente de ar pressurizado, que gera uma força suficiente para superar a tensão superficial da solução ejetada, que é estirada em direção ao coletor. Durante o percurso que essa solução faz até chegar ao coletor, seu solvente evapora e apenas as fibras atingem o alvo (SILVA; OLIVEIRA; MEDEIROS, 2015; MEDEIROS, 2009).
Diversos estudos têm sido realizados com alguns polímeros para a obtenção de fibras a partir do SBS e um dos polímeros mais estudados é o poli(ácido-lático) (PLA). O PLA é um poliéster, biodegradável em meios biológicos e majoritariamente hidrofóbico. Devido a essas características, este polímero é atrativo para várias aplicações na área médica, como um biomaterial, atuando no corpo humano de maneira temporária, sendo degradado pelo próprio corpo (DRUMOND; WANG; MOTHÉ, 2004; REZENDE et al., 2005).
Alguns outros polímeros, assim como a Policaprolactona (PCL), também se mostram interessantes para aplicações médicas, pois trata-se de um poliéster, também com características hidrofóbicas e de biodegradabilidade, que é normalmente utilizado combinado com outros tipos de biomateriais. Além disso, o PCL apresenta propriedades térmicas distintas do PLA que favorecem a produção de compósitos. A união desses dois polímeros, PLA e PCL, com a formação de uma
manta a partir da união de suas fibras, apresenta características biodegradáveis e de biocompatibilidade (GARCÍA RUEDA, et al., 2017; LUIZA; LEMOS; ALEGRE, 2017).
Esses polímeros, PLA e PCL, apesar de serem biocompatíveis, não são bioativos, ou seja, não exercem uma função ativa no corpo. Entretanto, as características das fibras podem ser combinadas com as de um material bioativo, para promover, por exemplo, a regeneração tecidual ou aceleração do crescimento celular. Esse material bioativo pode ser um componente inorgânico, como no caso da hidroxiapatita, principal componente do osso, que atua como osteocondutor, ou seja, favorece o crescimento celular ósseo no local onde for aplicado (PORSANI et al., 2018).
O objetivo deste trabalho é produzir e caracterizar mantas nanofibrosas poliméricas biodegradáveis com propriedades térmicas e mecânicas compatíveis com as encontradas em casulos da mariposa Rothschildia sp.
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Nanotecnologia e Biomimetismo
A nanotecnologia se refere à toda tecnologia empregada na escala nanométrica. Portanto, na nanociência e na nanotecnologia, os materiais estão separados de acordo com seu tamanho, situados entre as grandes moléculas e as menores estruturas químicas que possam ser produzidas (WHITESIDES, 2005).
O campo da nanotecnologia é um dos mais pesquisados e explorados atualmente, principalmente devido as propriedades dos materiais em pequena escala. Na área dos materiais poliméricos, o uso da nanotecnologia apesar de não ser recente, vem crescendo a cada dia. Algumas áreas são bem exploradas, como a liberação controlada de fármacos, uso de polímeros em catalisadores para células a combustível, eletrofiação de nanofibras e nanocompósitos. A engenharia de tecidos, por sua vez, pode unir a tecnologia dos materiais nanométricos, com aplicações biológicas, que possam ser capazes de reparar ou substituir a função de um determinado tecido (CHAHAL; KUMAR; HUSSIAN, 2019; PAUL; ROBESON, 2008).
A nanotecnologia pode ser usada diretamente na medicina regenerativa, como alternativa para reparar, substituir e acelerar o crescimento de células e tecidos que possam ter sofrido algum tipo de dano. A nanoengenharia permite que um biomaterial específico possa ser projetado para determinada aplicação, seja um reparo do tecido de um órgão ou uma reconstituição óssea, por exemplo, acelerando ou até mesmo tornando possível um processo de recuperação de um indivíduo. Estudos apontam que o uso da nanotecnologia no controle das propriedades físico-químicas e biológicas de um biomaterial produz resultados melhores do que técnicas convencionais. O potencial de crescimento nessa área é enorme por tratar-se de uma “medicina personalizada” (LOWE et al., 2019; SAHLE et al., 2019).
O estudo de materiais nanométricos baseados em produtos já existentes, cuja funcionalidade é conhecida e desenvolvida pela natureza há muito tempo, vem crescendo e sendo aprofundando. O Biomimetismo é ainda recente em pesquisas, porém, o homem vem se espelhando em criações da natureza há mais de 3000 anos, visto que essas criações apresentam uma variedade muito grande de
estruturas funcionais específicas (VINCENT et al., 2006; ZHOU, 2009). Neste campo, a natureza serve de inspiração para o desenvolvimento de novas tecnologias (VINCENT, 2009).
Com o avanço da nanotecnologia, a biomimética também avançou, atingindo a nanoescala, combinando a engenharia molecular encontrada na natureza, com projetos sintéticos, desenvolvidos por pesquisadores, com a intenção de atingir padrões e características já provados pela natureza (BAR-COHEN, 2005; SARIKAYA et al., 2003).
No desenvolvimento de um material biomimético, conhecer o material desenvolvido pela natureza é o primeiro passo para entender e projetar algo que se aproxime ao desejado. As tentativas de réplicas simples e de forma direta não costumam funcionar, pois o meio usado para desenvolver de forma sintética não é o mesmo que a natureza usou durante anos para desenvolver tal estrutura (VINCENT, 2009; VINCENT et al., 2006).
A busca por inspiração pode vir de qualquer lugar, como por exemplo o local em que pretende-se aplicar o biomaterial, ou até mesmo na fauna e flora de um determinado local. Os animais por sua vez, são grandes projetistas de estruturas capazes de protegê-los dos perigos ao seu redor, estruturas que podem também ser usadas para facilitar a vida dos seres humanos.
2.2. Rothschildia sp.
No Reino Animalia, a maior Classe encontrada é a dos insetos, com estimativa de mais de 30 milhões de espécies, sendo mais de um milhão de espécies vivas descritas. Dentro da Classe dos insetos, encontra-se a Ordem Lepidoptera, que inclui as borboletas e mariposas (GODÉ, 2015; MEDEIROS, 2003).
Nesta Ordem, encontram-se as mariposas da Família Saturniidae, com 18 espécies, conhecidas por suas antenas plumosas e asas coloridas, que podem ser encontradas em toda a América do Sul, sendo algumas apenas encontradas na Guiana, Amazônia e sudeste e nordeste do Brasil. Nesta família pode-se encontrar o gênero Rothschildia sp., mariposas com hábitos noturnos, asas em tons de castanho e áreas transparentes (Figura 1) (GODÉ, 2015; NUNES, 2004).
Figura 1 - Mariposa do gênero Rothschildia sp.
Esse gênero possui 24 espécies conhecidas, das quais quatorze são encontradas no Brasil. Entre suas principais características estão olhos grandes, mandíbula saliente, antenas quadripectinadas e áreas transparentes nas asas. Durante o estágio de crisálida, ou seja, o tempo em que a larva passa dentro do casulo até se transformar em uma mariposa, elas tecem casulos formados de seda, cuja estrutura é bastante resistente (NUNES, 2004).
Os casulos protegem as larvas de eventuais ataques dos predadores ao mesmo tempo em que auxiliam na atividade metabólica, bem como mantêm a temperatura ideal para o seu desenvolvimento e possui função antibacteriana (Figura 2) (ZHANG et al., 2013).
Figura 2 - Foto do casulo em seu habitat natural, ainda no período de crisálida
O casulo do gênero Rothschildia sp. é um compósito formado por fibras de fibroína unidas umas às outras por uma matriz de sericina, que possui várias funções, sendo uma delas a de proteger a larva de possíveis impactos. Portanto, trata-se de um material com a resistência mecânica necessária para esta aplicação (ZHANG et al., 2013).
O potencial da fibroína tem sido estudado na forma de scaffolds para a reconstituição de tecidos, pois trata-se de uma proteína composta por duas cadeias, com parte amorfa e parte cristalina, e suas fibras possuem diâmetros que variam de 10 a 25 μm. A fibroína é um material biodegradável e biocompatível, que apresenta uma estrutura com elevada resistência mecânica (ARAÚJO; OLIVEIRA JÚNIOR; ARANHA, 2018; FAROKHI et al., 2019; RAMÍREZ, 2016; SILVA, 2019; ZHANG; BAUGHMAN; KAPLAN, 2008).
O segundo material presente nos casulos é a sericina, que também é uma proteína, com grandes grupos polares, cuja função na seda que compõe o casulo é de unir as fibras de fibroína. A sericina protege contra os raios UV, vento, chuva e baixas temperaturas (MIGUEL; ÁLVAREZ-LÓPEZ, 2020; WU et al., 2019).
Devido a essas características presentes no casulo da mariposa Rothschildia sp., tal organização estrutural se torna de interesse no desenvolvimento de materiais biomiméticos com potencial uso na engenharia de tecidos. O objetivo é produzir uma estrutura com fibras ligadas umas as outras por outro material,
gerando benefícios que se assemelhem aos que o casulo proporciona, como a proliferação acelerada das células, que leva a larva a se tornar uma mariposa em poucos dias (ZHANG et al., 2013).
2.3. Nanofibras poliméricas
Fibras poliméricas têm seu tamanho dependente de muitas características intrínsecas do polímero em questão, com por exemplo sua massa molar, e o método utilizado para sua obtenção. Quando essas fibras possuem diâmetros nanométricos, passam a ser consideradas nanofibras. Com isso, o material apresenta algumas características interessantes, como elevada área superficial, grande razão de aspecto e melhoria na resistência mecânica, que aliadas a formação da fibra tornam-se interessantes e com aplicações extremamente importantes na medicina (HUANG et al., 2003; SILVA et al., 2015).
A partir da união dessas fibras é possível produzir uma malha, com grande área superficial resultante da estrutura de fibras com poros entre elas. A engenharia de tecidos é um campo interdisciplinar que se aplica ao desenvolvimento de estruturas biológicas, que aceleram a cura de danos biológicos devido a sua estrutura fornecer melhor suporte para migração de células, melhor adesão e proliferação. Essas malhas, ou mantas, apresentam uma morfologia muito parecida com estruturas em que se encontram as células do nosso corpo, como na estrutura do osso. Quando obtidas de materiais biodegradáveis e biocompatíveis, tornam-se excelentes alternativas para substituição de tecidos vivos, visando a cura de danos de maneira mais eficiente (ALCOBIA, 2013; WANG et al., 2013).
Vários biomateriais têm sido utilizados para produção de nanofibras, associando resistência mecânica e resposta biológica. Como exemplo desses materiais, o colágeno é uma opção que permite vários tipos de morfologias, arranjos estruturais, porosidade, entre outras propriedades de extrema importância na produção de scaffolds como biomateriais. No entanto, o colágeno é um material que após o processamento não consegue manter sua estrutura helicoidal, como no DNA, por exemplo, dificultando sua biocompatibilidade e suas propriedades biomecânicas. Como alternativa para o uso do colágeno, polímeros biodegradáveis, como o
poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) e policaprolactona (PCL) têm sido considerados (CHAHAL; KUMAR; HUSSIAN, 2019; CRUZ-MAYA et al., 2019).
Figura 3 - Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de um scaffold de Policaprolactona (PCL)(IPT, 2019)
As fibras poliméricas são comumente obtidas pelo método de electrospinning ou eletrofiação, que utiliza altas voltagens, mas o volume produzido é pequeno, tornando um método caro para a indústria. Porém, nanofibras também podem ser obtidas através do método de Solution Blow Spinning (SBS), que segue basicamente o mesmo arranjo, mas não utiliza voltagem e permite produzir em escala comercial, tornando-se mais viável para a indústria (SILVA et al., 2015).
2.3.1. Solution Blow Spinning
Na técnica de Solution Blow Spinning (SBS), ou fiação por sopro em solução, desenvolvida por Medeiros em 2009, ao invés de utilizar altas voltagens, como no método de electrospinning, utiliza uma fonte de gás comprimido, que através do bombeamento de uma solução polimérica, em contato com a corrente de
gás pressurizado, gera um estiramento das cadeias poliméricas, resultando na obtenção de fibras finas (FERREIRA, 2017; RAMOS, 2017; SILVA; OLIVEIRA; MEDEIROS, 2015; SILVA, 2019; MEDEIROS, 2009).
No processo SBS são necessários uma fonte de gás comprimido, um regulador de pressão, uma bomba de injeção para a solução polimérica, e bicos concêntricos, que são a matriz da fiação e o coletor das fibras. A solução polimérica é bombeada através do bico interno, enquanto o ar passa pelo bico externo. A força do ar pressurizado deve superar a tensão superficial da solução polimérica, que se desprende do bico em formato de cone, proveniente da diferença de velocidade entre o fluxo da solução e do gás, seguindo seu caminho até chegar ao coletor. Enquanto a solução percorre o caminho da ponta do bico até o coletor, o solvente evapora e as fibras são formadas (Figuras 4 e 5) (JAYASINGHE; QURESHI; EAGLES, 2006; MARTÍNEZ-SANZ et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2013; SILVA; OLIVEIRA; MEDEIROS, 2015).
Figura 4 - Desenho esquemático do aparelho utilizado no método de SBS
Na produção das fibras, algumas variáveis no sistema influenciam diretamente na morfologia. Essas variáveis são: a distância de trabalho, que consiste na distância entre a ponta do bico e o coletor; a geometria do coletor, que influencia na disposição das fibras umas em relação as outras; a movimentação do coletor, que geralmente é utilizado em movimentos rotacionais, sendo a rotação por minuto também uma variável; a temperatura, pois em maiores temperaturas o solvente conseguirá evaporar mais rapidamente; a umidade, evitando o acúmulo de água nas mantas; a pressão com que o gás é pressurizado; e por fim, a protrusão do bico interno em relação ao bico externo (FERREIRA, 2017; OLIVEIRA et al., 2013; RAMOS, 2017).
Para produção da solução polimérica a ser utilizada no SBS, a escolha do solvente é de extrema importância, pois cada polímero possui seu parâmetro de solubilidade em diferentes solventes, podendo gerar misturas que a olho nu parecem soluções, mas o polímero não tenha sido completamente dissolvido, prejudicando o método, ou resultar em casos em que a solução não apresente a viscosidade correta para a fiação. Essa interação entre o polímero e o solvente pode também alterar as propriedades da fibra.
A viscosidade está diretamente ligada a concentração da solução, e essa variação da concentração gera fibras de morfologias diferentes. Existe um intervalo de viscosidade cuja técnica consegue produzir fibras. Em soluções abaixo do limite inferior desse intervalo, ou seja, em soluções muito diluídas, as fibras formadas são descontínuas, inviabilizando o processo. No caso de soluções muito viscosas, provavelmente a solução não conseguirá nem atingir o bico, ou por entupir a agulha ou por falta de força da bomba de injeção (ALCOBIA, 2013; MATTOSO et al., 2012).
2.3.2. Nanofibras de policaprolactona e poli(ácido lático)
Os biomateriais quando produzidos sob a forma de fibras, adquirem características como maior superfície de contato e melhores propriedades mecânicas.
O poli(ácido lático) (PLA) e a policaprolactona (PCL) são polímeros sintéticos biodegradáveis e biocompatíveis, ou seja, podem entrar em contato com o corpo humano sem apresentar riscos. Com essas duas características, muitos estudos são
realizados visando aplicações desses materiais, aliados a outras propriedades ou, como no caso, outras morfologias, que potencializem determinada aplicação.
O PCL é obtido através da polimerização por abertura do anel da Ɛ-caprolactona, formando um poliéster alifático linear. É considerado hidrofóbico e possui grau de cristalinidade em torno de 50%. Sua temperatura de transição vítrea é em torno de - 60 °C, e sua fusão ocorre a aproximadamente 60 °C. A biodegradabilidade desse polímero é lenta. Devido a essas características, o PCL é um material bastante explorado para o uso na área médica. Apesar do PCL e do PLA não serem miscíveis, o PCL consegue agregar ao PLA algumas características mecânicas importantes, como a ductilidade (Figura 6) (LEMOS et al., 2017).
Figura 6 - Estrutura química do PCL (OLIVEIRA et al., 2013)
O PLA também é um poliéster hidrofóbico, devido a presença do CH3 em sua estrutura química, que pode ser obtido a partir do ácido lático de duas formas, por policondensação ou por abertura do anel láctico, este último produzindo um PLA com maior massa molar do que o obtido por policondensação (JESUS, 2019; VROMAN; TIGHZERT, 2009). Esse ácido lático pode ser obtido de fontes renováveis, como o milho, a cana-de-açúcar e a batata. O PLA possui uma temperatura de transição vítrea em torno de 60 °C, ou seja, o PCL estaria em processo de fusão quando o estágio de amolecimento do PLA começasse. A temperatura de fusão do PLA é de aproximadamente 180 °C e suas propriedades mecânicas indicam que se trata de um termoplástico não tão flexível, com resistência a tração em torno de 32 MPa. Por isso, o interesse no uso dos dois combinados, o PLA e o PCL, aliando características de ambos (Figura 7) (LUIZA;
LEMOS; ALEGRE, 2017; MARTÍNEZ-SANZ et al., 2015; VROMAN; TIGHZERT, 2009).
Figura 7 - Estrutura química do PLA (OLIVEIRA et al., 2013)
As fibras de PLA e PCL, já foram produzidas tanto pelo método de Electrospinning, quanto pelo Solution Blow Spinning. Como visto, o método utilizado pelo SBS apresenta algumas vantagens em relação ao seu precursor, e portanto, será o método utilizado no presente trabalho (MATTOSO et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2013; RAMOS, 2017).
2.3.3. Nanofibras contendo hidroxiapatita
Materiais inorgânicos podem ser incorporados a nanofibras poliméricas, de acordo com as propriedades requeridas pela aplicação final do biomaterial. No entanto, é preciso avaliar se o material em questão é seguro para o ambiente final e analisar quanto a sua bioabsortividade, bem como o método a ser utilizado para incorporar o material inorgânico (GOES et al., 2012).
A hidroxiapatita é o principal componente inorgânico do osso, correspondendo entre 65% e 70% da sua composição em massa. Outros componentes presentes no osso, como por exemplo o colágeno, se organizam em forma de fibrilas, o que implica em algumas propriedades específicas e que
influenciam diretamente no crescimento rápido do osso em duas direções, ou seja, a morfologia é facilitadora da osteointegração (PALMIERI et al., 2019).
A hidroxiapatita não é somente um biomaterial, mas é também considerada um material bioativo, ou seja, exerce uma integração biológica no tecido onde for implantada. Atualmente é muito utilizada no tratamento de doenças periodontais, preenchendo falhas ósseas, com aplicação também em cirurgias ortopédicas, como recobrimento de implantes em caso de fratura, por exemplo, acelerando o tempo de recuperação (CARLO et al., 2007).
Estudos anteriores indicaram o uso de hidroxiapatita como suporte para ação de drogas anticancerígenas, devido a sua boa capacidade de adsorver moléculas de maneira prolongada (COSTA et al., 2009). Sua estrutura química é: Ca10(PO4)6(OH)2, e a razão de cálcio/fósforo é de 1,67. Possui densidade de 3,16 Kg/m³ e parâmetros de rede: a = b = 0,9423 nm e c = 0,6875 nm, com estrutura cristalina hexagonal (Figura 8) (COSTA et al., 2009).
Figura 8 - Representação da estrutura cristalina da hidroxiapatita (“Hydroxyapatite
Ca5(OH)(PO4)3.”, 2020)
A hidroxiapatita sintética é bem parecida com a encontrada de forma natural, tanto quimicamente quanto em relação a sua cristalografia. Ela pode ser obtida de duas formas: hidroxiapatita densa ou porosa. A densa é fabricada em blocos ou grãos, e por isso apresentam uma dificuldade maior em estimular o crescimento interno do tecido. Já o outro tipo, possui uma estrutura porosa e permite o crescimento interno do tecido ósseo (MAIA et al., 2010).
3. Materiais e Métodos
3.1. Materiais
Os casulos utilizados neste trabalho foram obtidos na região de Nova Palmeira – PB e os polímeros - PCL e PLA - da Ingeo-NatureWorks (2003D). A Hidroxiapatita usada na manta foi obtida da LB Laborclin. Para produção das soluções foram utilizados os seguintes solventes: clorofórmio grau analítico obtido da Labsynth (Labsynth Produtos para Laboratórios Ltda, Diadema, SP, Brasil) e acetona grau analítico obtida da Vetec (Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasil).
3.2. Métodos
3.2.1. Caracterizações do casulo 3.2.1.1. Termogravimetria (TG)
A análise termogravimétrica dos casulos (CAS) foi realizada em um equipamento DTG-60H da Shimadzu (Shimadzu Corp.), em um porta amostra de platina, utilizando como parâmetros uma atmosfera de argônio com fluxo de 50 ml/min e taxa de aquecimento de 10 °C/min. A faixa de temperatura utilizada na análise foi da temperatura ambiente até 1000 °C. A massa utilizada nesse ensaio foi de 7,4 mg.
3.2.1.2. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
As análises de DSC nos casulos foram realizadas em um equipamento TA60 da Shimadzu, sob atmosfera de nitrogênio com fluxo de 50 ml/min, utilizando porta amostras de alumínio. O primeiro aquecimento foi da temperatura ambiente até 250 °C sob taxa de aquecimento de 40 °C/min, com posterior resfriamento até uma temperatura por volta de 40 °C, com taxa de 10 °C/min e por fim, um segundo aquecimento até a temperatura de 250 °C, com taxa de aquecimento de 10 °C/min. A massa da amostra usada foi de 2,6 mg.
3.2.1.3. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) A análise foi realizada em um equipamento FTIR IRAffinity-1 da Shimadzu. No preparo da amostra foi preciso raspar o casulo, de forma a fornecer 1,5 mg de pó, que foi triturado e homogeneizado com 150 mg de Brometo de Potássio (KBr) em um almofariz de ágata. Esse pó foi prensado na forma de pastilha em uma prensa a vácuo durante 10 min. Previamente ao ensaio, foi realizado um background no equipamento utilizando uma pastilha de KBr puro. A varredura no ensaio foi de 400 cm-1 a 4000 cm-1.
3.2.1.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A morfologia microscópica dos casulos foi observada utilizando um microscópio eletrônico de varredura modelo LEO 1430 da Zeiss (Carl Zeiss, Alemanha) e a metalização das amostras foi feita com ouro em um equipamento EMITECH K550X. As imagens foram realizadas a uma voltagem de 10 KV e 15 KV, com ampliações variando de 100x a 7000x e com aplicação do Sistema de Energia Dispersiva (EDS) do equipamento.
3.2.1.5. Ensaio Mecânico de Tração
Ensaios de tração foram realizados nos casulos utilizando uma máquina de tração da marca INSTRON modelo 3365 com célula de carga de 5 kN. Foram testados sete corpos de prova (CAS01, CAS02, CAS03, CAS04, CAS05, CAS06 e CAS07) para os casulos com dimensões em torno de 30 mm no comprimento, 10 mm na largura e 0,4 mm na espessura, esta última dependente da espessura natural dos casulos. Não foi possível seguir uma norma pré-estabelecida, pois os casulos não possuíam tamanho suficiente para que fossem cortados corpos de prova de acordo os padrões em norma (Figura 9).
Figura 9 - Corpos de prova utilizado para o ensaio de tração do casulo
3.2.2. Produção das mantas biomiméticas por SBS
3.2.2.1. Preparo das soluções
Três tipos de soluções foram produzidos utilizando o solvente clorofórmio e acetona em uma proporção de 3:1 (Clorofórmio/Acetona), como mostrado na Tabela 1. Considerando o aspecto visual, a dissolução dos polímeros no solvente ocorre em 4 h de agitação, porém, no tipo de solução que continha HA, essa observação a olho nu se tornava mais difícil. Portanto, para esses casos, o tempo de agitação foi de 12 a 24h, com o objetivo de garantir a solubilidade do polímero no solvente. Todas as soluções foram mantidas sob agitação em temperatura ambiente. Na Tabela 1 estão apresentadas as quantidades de polímeros, material inorgânico e solventes utilizados em cada solução, bem como a nomenclatura utilizada em cada uma delas.
No caso da solução PLA+HA, a proporção em massa de 10% diz respeito à quantidade de material sólido total presente na amostra, ou seja, a quantidade total de PLA e HA. O material final é apenas a manta e a quantidade pensada de HA em relação ao PLA após o processo de fiação foi de (1:9). Portanto, para obter essa concentração, mas agora em relação a solução total, adicionou-se 1% em massa de HA e 9% de PLA, totalizando assim os 10% em massa na solução, que após o processo, resultou em 10% de HA e 90% de PLA. Durante o processo de fiação o
solvente evapora, restando apenas o material sólido que fora adicionado na solução inicial, agora na forma de fibra.
Tabela 1 – Parâmetros para produção das soluções
Nomenclatura Concentração em massa do polímero Solvente Tempo de agitação PCL 18% de PCL Clor/Acet 3:1 4h
PLA 10% de PLA Clor/Acet 3:1 4h
PLA + HA 10% (9% de PLA e 1% de HA) Clor/Acet 3:1 12-24h
A solução de PCL foi produzida com uma concentração maior (18%) do que a de PLA considerando que, em testes anteriores, uma solução de PCL a 10% apresentou uma baixa viscosidade, não gerando fibras durante o processo do SBS. Com o aumento da concentração e consequentemente da viscosidade, foi possível obter as fibras. Todas as soluções foram mantidas resfriadas enquanto não estavam sendo usadas no processo de fiação.
3.2.2.2. Sistema de Ejeção e Coleta de fibras
O sistema de ejeção usado neste trabalho permite a fiação com três soluções diferentes ao mesmo tempo, de maneira que as fibras sejam coletadas umas sobre as outras de forma dispersa, ao invés de criar camadas, caso fossem produzidas separadamente.
A matriz utilizada é formada por três bicos internos e excêntricos ao bico externo, que é alimentado com o ar comprimido. Essa matriz multibicos pode ser observada em detalhes na Figura 10 (RAMOS, 2017).
Cada bico é alimentado por uma seringa, totalizando três seringas, que são acionadas igualmente pela mesma bomba de infusão da marca INSIGHT (INSIGHT LTDA., Brasil) (Figura 11). Em cada seringa é adicionada uma solução diferente.
Figura 10 - Matriz Multibicos (RAMOS, 2017)
Figura 11 - Bomba de infusão com três seringas com soluções diferentes no mesmo processo de fiação
Para a coleta das fibras, foi utilizado um recipiente rotatório de coleta, com forma geométrica semelhante a um tronco de cone e fundo plano, revestido de papel
alumínio para facilitar a retirada da manta após a finalização do processo (Figura 12). O coletor foi fixado a um motor para controlar sua rotação com velocidade de 180 rpm.
Figura 12 - Processo de fiação completo, sistema de infusão, sistema de ejeção das fibras e sistema de coleta
3.2.2.3. Processo de fiação por SBS
As soluções foram mantidas em refrigerador até o início do processo de fiação. No caso da solução com HA (PLA+HA), suas partículas foram dispersas durante 480 s na cuba de um ultrassom da marca Cristófoli (Cristófoli Biossegurança, Brasil). A partir das 3 soluções produzidas, foram fiados cinco tipos de mantas, descritas na Tabela 2. As mantas fiadas de PLA e PCL puros, foram produzidas para determinar a viabilidade de produção das fibras desses polímeros, bem como para poder caracterizá-las posteriormente. As demais mantas foram obtidas a partir das soluções produzidas anteriormente.
Tabela 2 – Especificações das mantas produzidas:
Nomenclatura Solução Volume total Tempo
PCL 1 PCL 10 mL 1 h e 20 min
PLA 1 PLA 10 mL 1 h e 20 min
PLA+HA 1 PLA + HA 10 mL 1 h e 20 min
PCL/2PLA+HA 1 PCL + 2 PLA+HA 30 mL 1 h e 20 min
PCL/2PLA 1 PCL + 2 PLA 30 mL 1 h e 20 min
A matriz multibicos, como dito anteriormente, possui 3 bicos concêntricos, onde três soluções diferentes podem passar. A manta PCL/2PLA+HA consiste na aplicação de 10 mL da solução de PCL, injetada por um bico e 20 mL de PLA+HA, que é dividido nos outros dois bicos restantes. Para a amostra PCL/2PLA ocorre da mesma forma, 10 mL de PCL por um bico e 20 mL de PLA divididos nos outros dois bicos.
Os cinco tipos de amostras foram fiadas seguindo os mesmos parâmetros no processo de produção das fibras por SBS, definidos a partir de trabalhos anteriores (RAMOS, 2017) e em testes realizados no presente estudo. Os parâmetros foram:
• Distância do bico ao coletor: 25 cm;
• Diâmetro do fundo da bacia rotatória: 20 cm; • Distância de protusão do bico: 1,5 cm; • Rotação do coletor: 180 rpm;
• Taxa de injeção: 7,5 ml/h; • Pressão no bico: 20 psi;
Todas as mantas foram produzidas seguindo o mesmo protocolo com os mesmos parâmetros, mas no caso da produção das mantas PCL, PLA e PLA+HA, não foi necessário usar a matriz multibicos, pois se trata de apenas um tipo de
material, uma manta simples. Nesse caso, essa manta foi produzida utilizando um bico único, seguindo exatamente o mesmo procedimento explicado no tópico anterior (3.2.2.2.). No caso da fiação das mantas PCL/2PLA+HA e PCL/2PLA, a matriz utilizada é a multibicos, seguindo os mesmos procedimentos e os mesmos parâmetros, apenas com o objetivo de fiar as 3 soluções ao mesmo tempo, para obter a mesma dispersão para todas.
3.2.2.4. Prensagem
Para atingir a morfologia encontrada no casulo, que apresenta “fitas” formadas por fibras, as mantas fiadas foram prensadas. A escolha de utilizar o PCL não foi apenas por ser um material biocompatível, mas também por apresentar uma temperatura de fusão em torno de 60 °C, portanto, menor que a do PLA, que é de aproximadamente 150°C. Neste caso, em uma prensagem a quente, com temperaturas acima de 60 °C, o PCL fundirá em torno das fibras de PLA e da HA, atuando como matriz, e formando essas “fitas” encontradas nos casulos. Como a temperatura de fusão do PLA está em torno de 150 °C, o limite de temperatura para a prensagem foi definido em 90 °C (FENNI et al., 2019).
No processo de prensagem foram usados dois protocolos diferentes de tempo e temperatura, também variando amostras com e sem a presença de HA, que para melhor entendimento foi organizado em 5 grupos. O grupo 1 foi chamado de FIB1 e consiste em 6 camadas da manta PCL/2PLA+HA, que foram prensadas durante 60 minutos a 60 °C, sendo retirada a pressão logo que retiradas da estufa. Os grupos seguintes (FIB2, FIB3, FIB4 e FIB5) foram todos mantidos na estufa a 90 °C por 30 minutos, porém, eram mantidos sob pressão por mais 30 minutos ao retirar da estufa, variando apenas o número de camadas e a presença ou não de HA na composição das mantas, como indicado na Tabela 3 a seguir.
A chapa utilizada para realizar a pressão necessária foi a mesma em todos os protocolos, portanto a pressão não variou. Com uma massa de 2,750kg, em uma área de 0,014m², foi gerada uma pressão de 1,925 kPa (Figura 14).
Tabela 3 – Descrição dos protocolos utilizados para a prensagem
Grupo Manta Número de
camadas Temperatura da estufa Tempo na estufa Tempo na t. Ambiente
FIB1 PCL/2PLA+HA 6 60°C 60 min 0 min
FIB2 PCL/2PLA+HA 6 90°C 30 min 30 min
FIB3 PCL/2PLA 6 90°C 30 min 30 min
FIB4 PCL/2PLA+HA 5 90°C 30 min 30 min
FIB5 PCL/2PLA 5 90°C 30 min 30 min
Figura 13 - As 6 camadas das mantas posicionadas umas sobre as outras, antes do processo de prensagem
Figura 14 - A chapa de alumínio inferior à esquerda, a chapa de alumínio superior ao meio e o peso adicionado em cima da chapa superior à direita
3.2.3. Caracterização dos casulos e das mantas biomiméticas
3.2.3.1. Termogravimetria (TG)
A análise termogravimétrica das mantas foi realizada em um equipamento DTG-60H da Shimadzu (Shimadzu Corp.), em porta amostra de platina, sob atmosfera de argônio com fluxo de 50 ml/min e taxa de aquecimento de 10 °C/min. A faixa de temperatura utilizada na análise foi da temperatura ambiente até 1000 °C. As massas utilizadas nos ensaios variaram de 1,04 a 3,90 mg.
3.2.3.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
As análises de DSC nas mantas foram realizadas seguindo os mesmos parâmetros aplicados para a análise do casulo, para fins de comparação. O equipamento de DSC utilizado foi o de modelo TA60 da Shimadzu. Os ensaios foram realizados sob atmosfera de nitrogênio com fluxo de 50 ml/min, utilizando porta amostras de alumínio. O primeiro aquecimento foi da temperatura ambiente até 250 °C sob taxa de aquecimento de 40 °C/min, com posterior resfriamento até uma temperatura por volta de 40 °C, com taxa de 10 °C/min e um segundo aquecimento até a temperatura de 250 °C, com a mesma taxa. As massas das amostras variaram entre 3,0 e 4,1 mg.
3.2.3.3. Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) O equipamento foi o mesmo utilizado para o casulo, o FTIR IRAffinity-1 da Shimadzu. As amostras foram preparadas também da mesma forma, triturando e homogeneizando 1,5 mg da manta com 150 mg de KBr, em um almofariz de ágata, sendo prensado em forma de pastilha durante 10 min, utilizando uma prensa a vácuo. A varredura do ensaio também foi de 400 cm-1 a 4000 cm-1.
3.2.3.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A morfologia microscópica das mantas foi observada utilizando um MEV modelo TM3000 da Hitachi (Chiyoda, Tóquio, Japão), e a metalização das amostras foi feita com ouro em um equipamento EMITECH K550X. As imagens foram realizadas a uma voltagem de 15 KV e ampliações variando de 50x a 1500x.
3.2.3.5. Ensaio Mecânico por tração
Os ensaios de tração das mantas foram realizados pós prensagem, utilizando uma máquina de tração da marca INSTRON modelo 3365 com célula de carga de 5 kN, assim como para o casulo. Foram ensaiados 23 corpos de prova, sendo 7 que seguiram o protocolo FIB1 e 4 amostras em cada um dos outros 4 grupos restantes (FIB2, FIB3, FIB4 e FIB5). Todas as amostras foram cortadas nas mesmas dimensões usadas nos ensaios dos casulos, visto que o objetivo foi comparar as propriedades presentes no casulo com as obtidas nas mantas, ou seja, 30 mm no comprimento e 10 mm na largura (Figura 15).
4. Resultados e Discussão 4.1. Aspecto visual
O primeiro resultado obtido para o casulo e as mantas foi com relação ao aspecto visual. O casulo possui um tamanho que varia em torno de 6 cm, uma coloração amarronzada, com um formato oval e bastante resistente a compressão, como pode ser visto na Figura 16.
Figura 16 - Imagem do casulo ainda fechado, após ser retirado do seu habitat natural
Após fiar 10 mL de solução, uma manta com formato circular foi obtida, devido ao fundo circular do coletor, como pode ser visto na Figura 17. Devido ao pequeno volume fiado, a manta ainda apresentou transparência e flexibilidade.
Figura 17 - Imagem da manta PCL/2PLA+HA após o processo de fiação e de retirada do coletor
Foram obtidas imagens de uma pequena região de cada amostra, com a intenção de compará-las e de se observar a formação das suas fibras. A amostra PCL (Figura 18), também apresentou as características de transparência e flexibilidade da manta de PLA.
Na imagem referente à amostra de PLA (Figura 19), observa-se a diferença em relação à densidade de fibras, que é menor do que o observado na amostra de PCL, bem como uma melhor dispersão dessas fibras, sem concentração em determinadas áreas.
Figura 18 - Imagem de uma região da manta de PCL obtida via SBS
Figura 19 - Imagem de uma região da manta de PLA obtida via SBS
Nas Figuras 20 e 21, referentes as amostras PLA+HA e PCL/2PLA+HA respectivamente, áreas com concentração de partículas de hidroxiapatita não foram observadas, indicando que o processo utilizado para dispersar as partículas na solução, antes da fiação, foi eficaz.
Figura 20 - Imagem de uma região da manta de PLA+HA obtida via SBS
Figura 21 - Imagem de uma região da manta de PCL/2PLA+HA obtida via SBS
As 4 mantas produzidas são apresentadas na Figura 22. De acordo com a imagem, as fibras formadas são curtas e estão dispersas de maneira aleatória em todas as amostras. A densidade de fibras foi maior na amostra PCL, devido a sua solução possuir maior concentração (18%) do que as demais (10%) (Figura 22).
Figura 22 - Imagem das mantas obtidas via SBS. (a) PCL; (b) PLA; (c) PLA+HA; (d) PCL/2PLA+HA
4.2. Termogravimetria
Na Figura 23, as curvas de TG obtidas no ensaio da amostra do casulo (CAS) são apresentadas, referentes ao casulo da mariposa Rostchildia sp.. A curva amarela é referente a perda de massa em porcentagem (eixo esquerdo), e a curva preta é referente a sua derivada primeira (eixo direito).
Figura 23 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra CAS, linha amarela referente a perda de massa em % e linha preta a DTG
Observa-se na curva da primeira derivada de perda de massa (curva preta) dois picos mais intensos: o primeiro, por volta de 70 °C, provavelmente está relacionado a perda de água proveniente de umidade, que é completamente eliminada em 150 °C, onde também é possível observar a presença de um pequeno pico; o segundo pico, que inicia um pouco antes dos 300 °C e vai até próximo a 375 °C, está relacionado a quebra de ligações peptídicas presentes na fibroína, uma proteína que pode fazer parte da composição do casulo, que foi também investigada nas análises de FTIR. Esta perda de massa em questão, também observada por volta dos 300 °C na curva de perda de massa (curva amarela), diz respeito a degradação dessa proteína, indicando que esse material possui uma boa resistência térmica (NOGUEIRA, 2009; RAMÍREZ, 2016).
Na Figura 24 é mostrado o resultado de termogravimetria do PCL, indicando perda de massa que inicia-se por volta de 300 °C até aproximadamente 430 °C, característico da degradação térmica deste polímero. Na curva obtida para o PLA (figura 25), a temperatura de início da degradação também é de aproximadamente 300 °C e o processo estende-se até temperaturas em torno de 350 °C (AMBROSIO-MARTÍN et al., 2014; SIQUEIRA et al., 2018).
Figura 25 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra PLA
Essa similaridade ocorre devido aos dois polímeros possuírem estruturas químicas semelhantes. Portanto, a energia necessária para que haja a quebra de ligações químicas é praticamente a mesma para os dois polímeros (AMBROSIO-MARTÍN et al., 2014; SIQUEIRA et al., 2018).
Nos resultados dos ensaios de TG realizados nas amostras PLA+HA e PCL/2PLA+HA (Figuras 26 e 27) é possível identificar o mesmo comportamento térmico visto nas amostras de PCL e PLA. Não houve perda de massa referente à HA, devido a esse composto inorgânico possuir temperatura de degradação térmica acima do limite superior do ensaio (DOS SANTOS et al., 2019).
Todos as curvas obtidas indicam que não houve mudança na estrutura química do material em questão após o processo de fiação e o comportamento térmico obtido está de acordo com o que é relatado na literatura.
Figura 26 - Gráfico obtido no ensaio de TG da amostra PLA+HA
4.3. Calorimetria exploratória diferencial - DSC
Após a análise de TG do casulo, na qual foi determinada sua temperatura de início de degradação térmica, análises de DSC foram realizadas para entender melhor as transformações térmicas que ocorrem nesse material.
Na Figura 28, referente a amostra CAS, observa-se um pico endotérmico por volta de 70 °C, assim como visto na TG, que pode indicar a retirada de algum resíduo presente na parte externa do casulo, mas que não faz parte da composição química deste material. Em torno de 150°C percebe-se um pequeno desnível, característico da evaporação da água. Como sua temperatura de degradação ocorre a partir de 280 °C, não houve necessidade de realizar o ensaio até maiores temperaturas, portanto, como o ensaio de DSC foi realizado até 250 °C, não foi possível observar mais picos característicos, indicando assim sua boa estabilidade térmica (ARAÚJO; OLIVEIRA JÚNIOR; ARANHA, 2018).
Para as análises realizadas nas mantas, a primeira amostra foi a de PCL, curva vermelha na Figura 29, apresentando um pico endotérmico expressivo por volta de 60 °C. Este pico está relacionado com a temperatura de fusão (Tm) da Policaprolactona, como já esperado. Portanto, os resultados dessa análise indicam que as propriedades térmicas do PCL foram mantidas mesmo após o processamento por SBS (FRANÇA et al., 2018; JANA et al., 2014).
Para a amostra de PLA (Figura 30), a análise de DSC apresenta dois picos característicos: um exotérmico e um endotérmico. O primeiro pico (exotérmico), em torno de 110 °C, observado durante o segundo aquecimento, provém do processo de cristalização (Tc) do material, visto que o poli(ácido lático) é um polímero semicristalino. Já o segundo pico (endotérmico), que surge por volta de 145 °C, é característico da fusão (Tm) desse polímero. Não foi possível observar com nitidez nesse ensaio o deslocamento da linha base que indicaria onde ocorre a transição vítrea (Tg) do polímero, devido a relaxação das tensões nas cadeias poliméricas, que no caso do PLA seria em torno de 60 °C. A partir desse ensaio foi possível confirmar, assim como para a amostra PCL, que o processo de fiação utilizando a técnica do SBS não alterou as propriedades térmicas encontradas no PLA, bem como reafirmar sua boa estabilidade quando em contato com temperaturas elevadas (SHUHUA et al., 2014).
Figura 30 - Curva de DSC obtida para a amostra PLA
A curva de DSC obtida para a amostra PLA+HA (Figura 31) é bem parecida com a da amostra PLA, pois trata-se do mesmo polímero. Dessa forma, os picos correspondentes a Tc e a Tm do PLA estão presentes por volta das mesmas temperaturas já encontradas na análise da amostra de PLA. As principais diferenças foram: a presença da Tg, observada a partir do deslocamento da linha base, em torno de 55 °C e a intensidade dos picos. O aumento dessa intensidade pode ser explicado devido a uma quantidade de massa maior do polímero usada para o ensaio, mas como essa diferença no presente trabalho foi bem pequena, exatos 0,60 mg, uma outra explicação seria a presença de hidroxiapatita na amostra ter atuado como agente de nucleação, aumentando a presença de estruturas cristalinas (RAMOS, 2017).
Para a análise de DSC da amostra PCL/2PLA+HA, ou seja, com a presença dos dois polímeros e da hidroxiapatita, observa-se um comportamento bem semelhante ao encontrado para a amostra PLA+HA, com exceção de um pequeno desnível da curva em torno de 75 °C, provavelmente proveniente da fusão do PCL, que por estar em quantidade pequena, não apresentou um pico bem definido (Figura 32).
Figura 31 - Curva de DSC obtida para a amostra PLA+HA
4.4. Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier - FTIR
O espectro de FTIR obtido de amostras dos casulos está apresentado na Figura 33. Picos característicos de fibroína confirmam a presença desse material na amostra. A banda de absorção em 1650 cm-1 é da Amida I (N-H), em torno de 1500 cm-1 é a banda da Amida II (N-H) e por volta de 1230 cm-1 observa-se a presença da banda da Amida III (C-N), características da fibroína. Observa-se ainda o pico referente a ligação O-H (MONTANHA, 2012; NIU et al., 2010; RAMÍREZ, 2016).
Como dito anteriormente, este trabalho visa reproduzir sinteticamente as características e propriedades encontradas na união da fibroína e sericina, utilizando o PLA, PCL e a HA. Análise de FTIR foi também realizada nas mantas com a intenção de comprovar, juntamente com as análises térmicas, que o processo de fiação das amostras não alterou a composição química do material.
Figura 33 - Gráfico obtido no ensaio de FTIR da amostra CAS
Analisando o espectro obtido na amostra PCL (Figura 34), e comparando com a literatura, observa-se a presença do principal pico, referente a ligação C=O, em 1750 cm-1. Também de forma bastante intensa e característica da estrutura química do PCL, por volta de 3000 cm-1, observa-se dois picos bem próximos
