UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(1)

Avaliação da eficácia do tratamento específico com Benznidazol na

progressão da doença de Chagas Experimental e a correlação entre a

eficácia do tratamento nos modelos canino e murino

AUTOR: Ivo Santana Caldas

.ORIENTADORA: Profa Maria Terezinha Bahia CO-ORIENTADOR: Paulo Marcos da Matta Guedes

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Biológicas, área de concentração:

Imunobiologia de Protozoários.

Ouro Preto 2008

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Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

C145a Caldas, Ivo Santana.

Avaliação da eficácia do tratamento específico com Benznidazol na progressão da doença de chagas experimental e a correlação entre a eficácia do tratamento nos modelos canino e murino [manuscrito] / Ivo Santana Caldas. – 2008.

123 f.: il., color; graf., tabs.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Terezinha Bahia. Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.

1. Tripanossoma Cruzi - Teses. 2. Quimioterapia - Teses. 3. Chagas, Doença de - Teses. 4. Cão - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto.

II. Título.

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CALDAS, I.S. DEDICATÓRIA

III

Dedico a meus pais pela confiança, amor e dedicação. Aos meus irmãos Sérgio e Walace pelo apoio, a Daniela por todo amor, e a todos que fizeram parte desta etapa da minha vida.

(4)

CALDAS, I.S. AGRADECIMENTOS

IV

À Professora Maria Terezinha Bahia, pela excelente orientação a mim oferecida, pela paciência nos momentos difíceis e principalmente pela grande amizade.

Ao Paulo Marcos da Matta Guedes, meu co-orientador, pelos conhecimentos passados, amizade e pelos bons momentos vividos.

À adorada Vanja Maria Veloso, que me acompanhou desde o início da iniciação científica, e que hoje a considero como uma segunda mãe, tão grande meu carinho.

À Professora Marta de Lana, pela amizade e exemplo de grande pesquisadora. À professora Cláudia Martins Carneiro e à Maria Xavier pelos ensinamentos e ajuda nos experimentos de histopatologia, e pela amizade.

A todos os alunos de iniciação científica do laboratório de Doença de Chagas, especialmente Geovam e Lívia, que sempre estiveram presentes e ofereceram qualquer ajuda necessária para realização deste trabalho.

A todos os colegas do Curso de Pós-Graduação.

Aos funcionários do Biotério e a todos que auxiliaram, direto ou indiretamente, na realização deste trabalho.

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CALDAS, I.S. RESUMO

V

Neste trabalho foi avaliado o benefício do tratamento precoce da doença de Chagas experimental na diminuição das lesões cardíacas de cães e camundongos inoculados com cepas sensíveis (Be-78), parcialmente sensíveis (Y, ABC e AAS) e resistentes (VL10) ao Benznidazol. Em adição, foi avaliada a influência do tratamento específico na evolução dos anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG1 e IgG2 (cães) e IgG1, IgG2a e IgG2b (camundongos) na tentativa de identificar um novo marcador sorológico para ser utilizado no controle de cura da doença de Chagas. O tratamento com Benznidazol previniu a inflamação e a fibrose no miocárdio de todos os cães e camundongos experimentalmente infectados que alcançaram a cura parasitológica, exceto nos cães inoculados com a cepa Y do T.cruzi, que apresentaram fibrose. Entre os cães tratados e não curados o tratamento induziu a diferentes padrões de resposta: (1) não foi observada redução da inflamação e nem da fibrose no tecido cardíaco dos animais inoculados com as cepas ABC e VL10, (2) redução das lesões cardíacas dos cães não curados inoculados com a cepa AAS. De forma diferente, o tratamento específico não foi capaz de diminuir a intensidade de inflamação no miocárdio de nenhum camundongo tratado e não curado inoculado com as cepas ABC, AAS e VL10, entretanto preveniu a fibrose entre os animais inoculados com a cepa VL10. Os resultados da dosagem de anticorpos específicos mostraram que a intensidade da inflamação no miocárdio dos animais inoculados com as diferentes cepas do T. cruzi e não tratados pode ser correlacionada com os níveis de IgG1 nos dois modelos experimentais usados neste estudo. Foi observado que quanto maior é o infiltrado inflamatório no miocárdio de camundongos e cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do T.cruzi, maiores são os níveis de IgG1 detectados no soro. O tratamento específico induziu uma redução nos níveis de todas as classes e subclasses de imunoglobulinas avaliadas. Entretanto a negativação da sorologia foi observada apenas nos animais tratados e curados, nos tratados que não alcançaram a cura parasitológica os níveis de todas as classes e subclasses de imunoglobulinas avaliadas atingiram níveis próximos ao observado nos soros dos animais controle infectado.

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CALDAS, I.S. ABSTRACT

VI

In this present work, it was evaluated the benefit of precocious Benznidazole (Bz) treatment of experimental Chagas disease in reduce cardiac lesions in dogs and mice previously inoculated with sensitive (Be-78), partially sensitive (Y, ABC and AAS) and resistant (VL-10) strains of Trypanosoma cruzi. In addition, it was also evaluated the interference of this specific Bz treatment on the standard of mice (IgG, IgG1 and IgG2) and dogs (IgG1, IgG2a and IgG2b) antibodies in the attempt to correlate them with suggestive circulating markers of cure criteria during Chagas disease. Bz treatment was able to prevent inflammation and fibrosis in heart from infected dogs and mice that reached parasitological cure, except in those treated dogs inoculated with Y strain of T.

cruzi that presented cardiac fibrosis. Among Bz treated and not cured dogs, it was

observed: (i) no reduction on the inflammation and fibrosis in those animals inoculated with ABC and VL-10 strains; (ii) reduction on cardiac lesions in those inoculated with AAS strain. On the other hand, in murine model, the specific treatment was not able to reduce the inflammation intensity in those mice treated and not cured previously infected with ABC, AAS and VL-10 strains. In this case, Bz effectively prevented cardiac fibrosis in all mice inoculated with VL-10 strain. Interestingly, serological investigation demonstrated a close relation between high levels of IgG1 and intensity of cardiac inflammation in all not-treated animals (dogs and mice) when they were infected with different T. cruzi strains. The specific Bz treatment induced a significant reduction in levels all immunoglobulins investigated. However, a negative serological data was just observed in those treated and cured animals while similar results were observed between immunoglobulins from those treated and not-cured and infected control animals. Our data suggest that specific Benznidazole treatment prevents cardiac lesions in animals that reached parasitological cure and circulating immunoglobulins appears as promising markers of “cure criteria” during experimental Chagas disease.

(7)

CALDAS, I.S. SUMÁRIO

VII

Sumário

1 - Introdução...1

1.1 - A doença de Chagas e o Trypanosoma cruzi...2

1.2 - Quimioterapia da doença de Chagas...3

1.3 - Variabilidade intraespecífica do Trypanosoma cruzi...6

.1.4 - Avaliação da eficácia do tratamento com Benznidazol...8

1.5 - Modelos experimentais utilizados no estudo da doença de Chagas...13

2 - Justificativa...15

3 - Objetivos

.

...18

3.1 - Objetivo Geral...19

3.2 - Objetivos Específicos...19

4 - Animais, material e métodos...20

4.1 - Delineamento Experimental...21

4.2 - Cepas de Trypanosoma cruzi...21

4.3 - Polimorfismo das formas tripomastigotas das cepas estudadas...22

4.4 - Animais...22

4.5 - Inoculação dos animais e confirmação da infecção...23

4.6 - Infectividade...23

4.7 - Curva de parasitemia...24

4.8 - Mortalidade...24

4.9 - Droga e esquema de tratamento...24

4.10 - Controle de cura...25

4.10.1 - Exames parasitológicos...25

4.10.1.1. Hemocultura (Hc)...25

4.10.1.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)...26

4.10.2 - Exames sorológicos...28

4.11 - Necrópsia e coleta do material...29

4.12 - Histopatologia...30

4.12.1 - Técnica de Hematoxilina & Eosina (H&E)...30

4.12.2 - Técnica de Tricrômico de Masson...31

4.13 - Análise estatística...33

5 - Resultados...34

5.1 - Parâmetros Biológicos...35

5.1.1 - Polimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas...35

5.1.2 - Curvas de parasitemia...35

5.1.3 - Determinação da susceptibilidade ao Benznidazol...38

5.1.3.1 - Resultado do tratamento específico de camundongos inoculados com as cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do T.cruzi...38

5.1.3.2 - Resultado do tratamento específico com Bz de cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do T.cruzi...39

(8)

CALDAS, I.S. SUMÁRIO

VIII

5.2.1 - Cinética de Imunoglobulina G (IgG) e isotipos (IgG1, IgG2a e IgG2b), nos soros de camundongos inoculados com as cepas Be-78, ABC, AAS e VL10

do T.cruzi.......41

5.2.2 - Influência da quimioterapia específica com Bz na produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG1, IgG2a e IgG2b no soro de camundongos infectados pelo o T.cruzi.....42

5.2.3 - Cinética de Imunoglobulina G (IgG) e isotipos (IgG1 e IgG2), nos soros de cães inoculados com as cepas do T.cruzi estudadas...49

5.2.4 - Influência da quimioterapia específica com Bz na produção de anticorpos no soro de cães infectados com o T.cruzi....50

5.3 - Necrópsia e histopatologia...56

5.3.1 - Análise histopatológica do miocárdio de camundongos e do átrio direito de cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi.....56

5.3.2 - Influência do tratamento com Benznidazol na evolução das lesões cardíacas de camundongos inoculados com as cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi.....57

5.3.3 - Influência do tratamento com Benznidazol na evolução das lesões cardíacas de cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi.....63 5.3.3.1 - Avaliação macroscópica...63 5.3.3.2 - Análise histopatológica...64

6 - Discussão

.

...74

7 - Conclusões...91

8 - Referências Bibliográficas...94

(9)

CALDAS, I.S. LISTA DE ABREVIATURAS

IX Be-78 Cepa Berenice-78 Bz Benznidazol Nfx Nifurtimox

DNA Ácido desoxirribonucléico EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

ELISA .Enzyme-Linked Immunosorbent Assay HAI Hemaglutinação indireta

Hc Hemocultura

IFI Reação de imunofluorescência indireta IFN-γ Interferon gama

IgG Imunoglobulina G IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5 IL-10 Interleucina 10 kDNA .DNA do cinetoplasto LIT Liver infusion tryptose

LMCo .Lise mediada pelo complemento NO Óxido nítrico

OPD Ortofenilenodiamino pb Pares de bases

PBS Salina tamponada com fosfato

PBS-Tween Salina tamponada com fosfato acrescida de 0,05% Tween-20 PCR .Reação em cadeia da polimerase

pH .Potencial hidrogeniônico PP Parasitemia patente PPP .Período pré-patente SFB .Soro fetal Bovino Th1 T helper tipo 1 Th2 .T helper tipo 2 TC Tratado e curado TNC Tratado e não curado

(10)

CALDAS, I.S. LISTA DE GRÁFICOS

X

Gráfico 1 - Polimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas observadas durante

pico de parasitemia da infecção de camundongos Swiss inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Berenice-78, Y, ABC, AAS e VL10 do

Trypanosoma cruzi...35

Gráfico 2 - Curvas de parasitemia realizadas em camundongos Swiss inoculados com

5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Berenice-78, ABC, AAS e VL10 do

Gráfico 3 - Curvas de parasitemia obtidas de cães inoculados com 2000 tripomastigotas

sanguineos/kg de peso corporal das cepas Berenice-78, Y, ABC, AAS e VL10 do

Gráfico 4 - Percentagem de testes sorológicos e parasitológico e/ou molecular –

hemocultura e PCR – positivos realizados no sangue de camundongos swiss inoculados com as cepas Berenice-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi seis meses após o tratamento com 100 mg de Benznidazol por Kg de peso corporal... 38

Gráfico 5 - Percentagem de testes sorológicos e parasitológico e/ou molecular –

hemocultura e PCR – positivos realizados no sangue de cães inoculados com as cepas Berenice-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi seis meses após o tratamento com 7mg de Benznidazol por Kg de peso corporal...40

Gráfico 6 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG1, IgG2a e

IgG2b determinados através da ELISA nos soros de camundongos inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma

cruzi...41

Gráfico 7 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG determinados através da ELISA

nos soros de camundongos inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...43

Gráfico 8 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG1 determinados através da ELISA

nos soros de camundongos inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol

(11)

XI

sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...44

Gráfico 9 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG2a determinados através da

ELISA nos soros de camundongos inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...45

Gráfico 10 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG2b determinados através da

ELISA nos soros de camundongos inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...47

Gráfico 11 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG e subclasses IgG1, IgG2a e

IgG2b, aos seis meses após término do tratamento com Bz, determinados através da ELISA nos soros de camundongos infectados com cepas do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Bz e curados...48

Gráfico 12 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG1 e IgG2

determinados através da ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas

sanguíneos das cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi...50

Gráfico 13 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG determinados através da ELISA

nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...51

Gráfico 14 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG1 determinados através da

ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...53

(12)

XII

Gráfico 15 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG2 determinados através da

ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados e CNI controle não infectado...54

Gráfico 16 - Níveis médios de anticorpos da classe IgG e subclasses IgG1e IgG2, aos

seis meses após o término do tratamento com Bz, determinados através da ELISA nos soros de cães infectados com cepas do Trypanosoma cruzi e tratados ou não com o Benznidazol, sendo CI controles infectados, TNC tratados com Benznidazol e não curados, TC tratados com Benznidazol e curados, CNI controle não infectado...55

Gráfico 17 - Presença de inflamação e fibrose na área cardíaca de camundongos e de

cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi e que foram mantidos sem o tratamento específico com Benznidazol, sendo: CNI – animais não infectados...57

Gráfico 18 - Inflamação na área cardíaca dos camundongos inoculados com as cepas

Be-78, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi, que foram tratados com Benznidazol e não curados (TNC), tratados e curados (TC), infectados mantidos sem tramento (CI) e não infectados (CNI)...58

Gráfico 19 - Fibrose na área cardíaca dos camundongos infectados com as cepas

Be-78, ABC, AAS e VL10 do T.cruzi, que foram tratados com Bz e não curados (TNC), tratados e curados (TC), infectados mantidos sem tramento (CI) e não infectados (CNI)...61

Gráfico 20 - Inflamação na área cardíaca dos cães inoculados com as cepas Be-78, Y,

ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi, que foram tratados com Benznidazol e não curados (TNC), tratados e curados (TC), infectados mantidos sem tramento (CI) e não infectados (CNI)...66

Gráfico 21 - Fibrose no átrio direito dos cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC,

AAS e VL 10 do Trypanosoma cruzi, que foram tratados com Benznidazol e não curados (TNC), tratados e curados (TC), infectados mantidos sem tramento (CI) e não infectados (CNI)...70

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CALDAS, I.S. LISTA DE FIGURAS

XIII

Figura 1 - Imagem visualizada pela objetiva de 40× e capturada através de

microcâmera Leica DM 5000 B sendo processada por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3, onde a inflamação foi determinada por meio da quantificação do número de núcleos celulares, marcados em azul, presentes no campo de área correspondentea 74931 µm2... 31

Figura 2 - Imagens visualizadas pela objetiva de 40× e capturadas através de

microcâmera Leica DM 5000 B sendo processadas por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3, onde a imagem sem processamento está representada em A, a quantificação da área ocupada por colágeno em B, a área ocupada por músculo cardíaco em C e a ocupada por branco em D...33

Figura 3 - Imagens obtidas de lâminas com cortes de coração coradas pela hematoxilina

e eosina, de camundongos inoculados com as cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do

Figura 4 - Imagens obtidas de lâminas com cortes de coração coradas pelo tricrômico

de Masson, de camundongos inoculados com as cepas Be-78, ABC, AAS e VL10 do

Figura 5 - Imagens obtidas de lâminas com cortes de átrio direito coradas pela

hematoxilina e eosina, de cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi...67

Figura 6 - Imagens obtidas de lâminas com cortes de átrio direito coradas pelo

Tricrômico de Masson, de cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi...71

(14)

CALDAS, I.S. LISTA DE TABELAS

XIV

Tabela 1 - Aumento da massa cardíaca, esplenomegalia e linfadenopatia nos cães

infectados com as com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS ou VL10 do Trypanosoma cruzi e tratados com Benznidazol e nos animais dos grupos controle infectado e não infectado...64

Tabela 2 - Miocardite nos cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10

do Trypanosoma cruzi. (C) controle infectado, (TNC) tratados com Bz e não curados e (TC) tratados com Benznidazol e curados...65

Tabela 3 - Porcentagem de tecido fibroso e tecido muscular cardíaco nos cães

inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi. (C) controle infectado, (TNC) tratados com Benznidazol e não curados e (TC) tratados com Benznidazol e curados...69

Tabela 4 - Fibrose no átrio direito dos cães inoculados com as cepas Be-78, Y, ABC,

AAS e VL10 do Trypanosoma cruzi. (C) controle infectado, (TNC) tratados com Benznidazol e não curados e (TC) tratados com Benznidazol e curados...73

(15)

(16)

CALDAS, I.S. INTRODUÇÃO

2

1.1 - A doença de Chagas e o Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma das mais importantes doenças parasitárias das Américas do Sul e Central. Estima-se que existam cerca de 13 milhões de pessoas infectadas com o T.cruzi e que 40 milhões encontram-se em áreas de risco (WHO, 2005).

A infecção pelo T. cruzi é naturalmente iniciada na camada dérmica ou mucosa conjuntival por tripomastigotas metacíclicas depositadas junto com fezes ou urina de triatomíneos durante o seu repasto sangüíneo. Entretanto, o T. cruzi pode ser transmitido ao homem por mecanismos alternativos, normalmente, transfusão sanguínea, transmissão congênita, infecção acidental de laboratório, transplante de órgãos e transmissão oral (Brener et al., 1987).

As manifestações clínicas da fase aguda da doença iniciam 6 a 10 dias após a inoculação, podendo permanecer por 6 a 8 semanas. Freqüentemente, certas manifestações de porta de entrada podem estar presentes na conjuntiva ocular ou na pele. As manifestações sistêmicas podem incluir a febre, edema, linfadenopatia, alterações eletrocardiográficas, e aumento da área cardíaca (Brener, 1987).

Contudo, a taxa de mortalidade é baixa durante a fase aguda, ocorrendo usualmente por miocardite ou meningoencefalites (Barrett et al., 2003). Este primeiro estágio da doença é sucedido por uma infecção crônica, no qual os parasitos são escassos, e dificilmente detectados por métodos parasitológicos. Os pacientes normalmente são assintomáticos, e cerca de 60% a 70% permanecem neste estado, conhecido como forma indeterminada da fase crônica da doença, pelo resto de suas vidas (Barrett et al., 2003). Todavia, a evolução da forma indeterminada para a forma sintomática da doença de Chagas crônica é outra possibilidade freqüente, que geralmente ocorre 10-20 anos após a fase aguda, em uma lenta e progressiva evolução (Dias et al., 1992), onde 15-30% evoluem para as formas cardíaca e/ou digestiva da doença. O escasso parasitismo durante a fase crônica, o prolongado período latente que precede a morbidade e a intrigante existência de diferentes formas clínicas sugere a autoimunidade como base da patologia chagásica crônica (Kierszenbaum et al., 1999). Entretanto, a demonstração de antígenos de T. cruzi ou de parasitos por técnicas de imunohistoquímica, ou de fragmentos de DNA do T. cruzi pela reação em cadeia da

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3

polimerase (PCR) em tecidos inflamados do miocárdio sugerem que antígenos do parasito podem ser necessários para iniciar e por manter o processo inflamatório (Tarlenton, 2003). Assim, para alguns autores a presença do parasito é importante na perpetuação da inflamação na fase crônica, enquanto para outros, devido à intensidade das lesões crônicas com escassos parasitos, outros processos como o de autoimunidade também seriam importantes na gênese da miocardite fibrosante que ocorre na fase crônica da infecção pelo T.cruzi (Lopes et al., 1975; Tafuri 1979; Rossi et al.,1990).

Em observações transversais tem sido demonstrada que a prevalência de anormalidades eletrocardiográficas aumenta com a idade, sendo mais frequentes entre a quarta e a quinta década de vida (Maguire et al., 1983). Entretanto, recentemente tem sido relatada a ocorrência de alta taxa de anormalidades eletrocardiográficas associada à infecção pelo T. cruzi em crianças de 7 a 12 anos no Brasil (Andrade et al., 1998). Neste estudo a prevalência de anormalidades eletrocardiográficas foi de 11,3% (16 em 131) entre as crianças soropositivas e 3,5% (10 em 282) entre as soronegativas. Os autores também relataram que cinco casos incidentes foram diagnosticados após 36 meses de acompanhamento entre as crianças soropositivas (Andrade et al., 1998). Também na Argentina Sosa Estani et al. (1998) mostraram anormalidades (hemibloqueio anterior esquerdo ou bloqueio do ramo direito do feixe de Hiss) eletrocardiográficas em um estudo realizado com 101 crianças com 6 a 12 anos de idade. Estes dados indicam a existência de áreas endêmicas com particular progressão da doença, e reforçam a importância da realização do diagnóstico e tratamentos precoces.

1.2 - Quimioterapia da doença de Chagas

O tratamento etiológico da doença de Chagas mediante ensaios clínicos controlados,

começou a ser investigadoa partir da década de 60, quando ocorreu uma padronização da

metodologia terapêutica pelo Grupo de estudos para o tratamento da doença de Chagas em 1962, e foi demonstrado que em esquemas terapêuticos de longa duração, os nitrofuranos são ativos na doença de Chagas em camundongos (Brener, 1962). No entanto, o tratamento específico para a doença de Chagas permanece insatisfatório, sendo ainda hoje baseado nos nitrofuranos, Benznidazol (Bz) (Rochagan, Rodanil, Roche) ou Nifurtimox (Nfx) (Lampit, Bayer, recentemente descontinuado)

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4

desenvolvidos empiricamente três décadas atrás. O Nifurtimox atua via redução de grupos nitro em radicais nitroânionicos instáveis, que reagem para produzir metabólicos de oxigênio reduzido altamente tóxico (ânion superóxido e peróxido de hidrogênio) (Docampo, 1990). O Benznidazol parece atuar via diferentes mecanismos (stress redutivo), que envolve modificação covalente de macromoléculas por nitro reduções intermediárias (Docampo, 1990). Tanto o Nfx quanto o Bz atuam sobre o genoma do T.

cruzi, e os dois fármacos inibem a síntese de DNA, RNA e proteínas além de

acelerarem a degradação dessas macromoléculas (Stoppani, 1999). Além disso, ambas as drogas apresentam frequentemente efeitos adversos incluindo anorexia, vômitos, polineuropatia periférica e dermopatia alérgica, provavelmente devido ação direta dos radicais nitroaniônicos formados, (Stoppani, 1999) pela geração de radicais livres oxigenados (Docampo et al., 1981; Docampo, 1990) e/ou danos causados pela produção de derivados nitrosos e da hidroxilamina, de citotoxicidade conhecida (Stoppani, 1999).

Os resultados do tratamento etiológico de pacientes chagásicos provenientes de diferentes países, e mesmo de diferentes áreas geográficas de um mesmo país, são frequentemente contraditórios. Esses resultados controversos relatados na literatura em relação à eficácia do tratamento da doença de Chagas com Nifurtimox ou Benznidazol podem ser conseqüência da falta de padronização da metodologia utilizada nas diferentes triagens clínicas, como: (1) o esquema terapêutico utilizado, especialmente relacionado ao tempo de tratamento; (2) a metodologia usada para a definição de cura parasitológica; (3) a falta de uma definição clínica precisa que possa ser associada a um claro benefício do tratamento (Guedes et al., 2006).

Entretanto, quando são consideradas as triagens clínicas de acordo com a fase em que o tratamento foi realizado, ou seja, transmissão congênita, fase aguda, fase crônica recente ou crônica tardia, é claramente demonstrado que quanto mais rápido o diagnóstico é definido e o tratamento iniciado, maior a chance de sucesso terapêutico.

Vários estudos têm demonstrado que o tratamento com Nifurtimox ou Benznidazol mostra pequena ou nenhuma atividade quando realizado na fase crônica da doença de Chagas, com índices de cura variando entre 0% e 19,1% (Ferreira, 1990; Viotti et al., 1994; Lauria-Pires et al., 2000; Suasnábar et al, 2000; Braga et al., 2000). Contudo, considerando o risco de falha cardíaca e morte durante a fase crônica, o tratamento com drogas tripanocidas pode ser importante na prevenção e na progressão

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5

de lesões severas no miocárdio. De acordo com Viotti et al. (1994) e Suasnábar et al. (2000) o tratamento de indivíduos chagásicos com Benznidazol durante a fase crônica induz a uma diminuição da progressão de alterações eletrocardiográficas, em relação aos não tratados. Além disso, os indivíduos tratados apresentam a negativação da sorologia ou mostram um decréscimo dos níveis de anticorpos mais frequentemente que os não tratados. Entretanto, Lauria-Pires et al. (2000) mostraram que a infecção é persistente após o tratamento, e que alterações eletrocardiográficas progressivas são observadas tanto em indivíduos tratados como naqueles não tratados, e usando métodos moleculares mostraram que os níveis de parasitemia não foram significantemente diferentes entre os chagásicos crônicos tratados e não tratados. De acordo com os autores estes achados e as progressivas alterações clínicas observadas em ambos os grupos de pacientes indicam que o tratamento de infecção crônica parece não induzir a

nenhum benefício (Lauria-Pires et al., 2000, Braga et al., 2000).

Correntemente, triagens clínicas realizadas em diferentes países mostram evidências de sucesso na quimioterapia com Benznidazol entre crianças e adolescentes. Adicionalmente, é demonstrado que o tratamento com Benznidazol, apesar de distante do ideal, conduz a benefícios concretos quanto realizados em fases recentes da doença. Triagens clínicas realizadas na Argentina e no Brasil mostraram índices de 62 a 87% de cura parasitológica em crianças tratadas com Benznidazol (Andrade et al., 1996; Sosa-Estani et al., 1998; Silveira et al., 2000; Striger, 2004; Andrade et al., 2004). Estes estudos demonstraram que a negativação da sorologia ocorreu de forma consistente e persistente, sugerindo a ausência do parasito nos indivíduos tratados e considerados curados (Andrade et al., 2004; Sosa-Estani et al., 1998; Striger et al., 2004). De acordo com Andrade et al. (2004) o tratamento efetivo, nesta fase da doença, pode prevenir a progressão da doença e as suas complicações, porque o eletrocardiograma realizado no final do tratamento e durante o período de avaliação pós-tratamento, mostrou 1 (1,7%) caso incidente de bloqueio completo do ramo direito do feixe de Hiss no grupo tratado com Benznidazol, e 4 (6,9%) no grupo placebo. Contudo, Silveira et al. (2000) obtiveram apenas 8,35% de cura entre 12 crianças de 7 a 12 anos após o tratamento com Benznidazol realizado durante a fase crônica indeterminada da doença de Chagas. Durante a avaliação clínica longitudinal (avaliação durante 8 a 20 anos) foi observada

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uma evolução clínica para as formas cardíacas ou digestivas da doença em 4 (33,3%) dos pacientes tratados (Silveira et al., 2000).

De acordo com Guedes et al. (2006) a eficácia do tratamento com Benznidazol observada na maioria das triagens clínicas realizadas com crianças e adolescentes sugere a necessidade de regular avaliação sorológica de crianças e adolescentes, e reforça a recomendação do tratamento com Benznidazol de crianças infectadas pelo T.

cruzi como uma política de saúde pública nos países endêmicos.

Também as triagens clínicas realizadas durante a fase aguda da infecção mostram altos níveis de cura parasitológica, sendo observado índices variando entre 40% a 76% de cura parasitológica, definida pela negativação da sorologia e dos testes parasitológicos (Shikanai-Yasuda et al., 1990; Andrade et al., 1992; Bahia-Oliveira, 2000; Cançado et al., 2002). De acordo com Cançado et al. (2002) e Bahia-Oliveira et

al. (2000), a soro-conversão negativa ocorre entre 11 a 12 meses para 50% dos

pacientes, e 14 meses após o tratamento todos os indivíduos curados apresentam testes sorológicos negativos.

Assim, o tratamento de pacientes chagásicos em ambas as fases da doença com os quimioterápicos convencionais (Bz e Nfx) tem fornecido resultados distintos, principalmente quando triagens terapêuticas de diferentes áreas geográficas são comparadas. Um dos fatores que contribui para os diferentes resultados obtidos com o tratamento da doença humana seria o tipo de cepa do parasito predominante em algumas áreas geográficas (Andrade et al., 1992). Foi sugerido que a resistência natural do T.

cruzi aos nitroderivados, Nfx e Bz, seria a explicação para os baixos índices de cura

detectados em pacientes chagásicos tratados, pois foram descritas diferenças na susceptibilidade de cepas do parasito a estes quimioterápicos (Brener et al., 1976; Filard & Brener, 1987).

1.3 - Variabilidade intraespecífica do Trypanosoma cruzi

A correlação das características biológicas entre populações do T. cruzi em camundongos e a sua susceptibilidade ao Benznidazol foi inicialmente verificada por Andrade et al. (1974). Baseando em estudos realizados com diferentes cepas do parasito os autores estabeleceram três Tipos ou Biodemas do T. cruzi: Tipo ou Biodema I, Tipo

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ou Biodema II e Tipo ou Biodema III. Posteriormente Andrade et al. (1985) trataram camundongos infectados com cepas do T.cruzi classificadas nos três Tipos com Benznidazol e Nifurtimox. Os autores mostraram que aquelas cepas do Tipo I eram altamente sensíveis, as do tipo II exibiam moderada ou alta susceptibilidade, e as do tipo III eram altamente resistentes a ambas as drogas.

Mais recentemente, nosso grupo mostrou a correlação entre a divergência filogenética entre populações do T.cruzi e a sua susceptibilidade a agentes quimioterápicos in vivo (Toledo et al., 2003 e 2004). Vinte clones representativos da diversidade filogenética total T. cruzi, incluindo os genótipos 19 e 20 (T. cruzi I) e os genótipos 32 e 39 (T. cruzi II) (Miles et al., 1980, Tibayrenc & Ayala, 1988; Anonymous, 1999) foram analisados. Os resultados demonstraram diferenças importantes entre estoques de T. cruzi que poderiam ser utilizadas como marcadores de comportamento biológico. Membros do grupo T. cruzi I foram altamente resistentes, enquanto membros do grupo T. cruzi II foram susceptíveis ou parcialmente resistentes ao Benznidazol.

Considerando os dados da literatura pode ser verificado que mais de 100 diferentes cepas do T. cruzi, obtidas de várias fontes e origens geográficas, tiveram sua susceptibilidade a ambos, Benznidazol e Nifurtimox, ou apenas ao Benznidazol, determinadas em camundongos experimentalmente infectados (Andrade et al., 1985; Filardi & Brener, 1987; Andrade et al., 1992; Toledo et al., 1995 e 1997). Estas cepas foram classificadas como “sensíveis”, quando o índice de cura obtido nos animais tratados fica compreendido entre 67% a 100%, “parcialmente sensíveis” quando o índice de cura varia entre 34 a 66%, e “resistentes” quando os animais tratados apresentavam taxas de cura variando entre 0 a 33%. Cinquenta e seis por cento destas cepas foram consideradas sensíveis ao Benznidazol, 16,8% foram parcialmente sensíveis, e 27,2% foram resistentes. Considerando as cepas sensíveis e as parcialmente sensíveis a percentagem observada seria de 72,8% que corresponde ao índice médio de cura observado em pacientes tratados durante a fase aguda da infecção.

Camandaroba et al. (2003) determinaram a susceptibilidade ao Benznidazol de sete clones isolados da cepa Colombiana, altamente resistente ao Benznidazol, e previamente classificada como Biodema ou tipo III (Andrade & Magalhães, 1996), e T.

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sugerindo uma predominância de clones altamente resistentes nesta cepa. De acordo com os autores estes resultados indicam que aparentemente a possibilidade de cura é mínima para pacientes infectados com este Biodema. A resposta à quimioterapia com Benznidazol foi também investigada por Campos et al. (2005) para quatro clones isolados da cepa do T. cruzi 21SF (Biodema Tipo I, T. cruzi II). A variação de 30% a 100% na taxa de cura de populações clonadas de cepas pertencentes ao grupo T. cruzi II sugerem que esta seja uma das explicações para a alta variação da resposta a quimioterapia da doença de Chagas com Benznidazol ou Nifurtimox por cepas desta linhagem genética.

As falhas no tratamento de pacientes infectados com cepas do grupo T. cruzi I podem ser devido à resistência de cepas deste tipo genético a drogas anti-chagásicas (Camandaroba et al., 2003). Concordância entre resultados obtidos em pacientes e camundongos infectados com a mesma cepa já foram descritos (Andrade et al., 1992; Filardi & Brener, 1987). Também, o T. cruzi I (Cepa Colombiana), que é totalmente resistente ao Benznidazol no modelo murino (Camandaroba et al., 2003), também foi altamente resistente em cães (Guedes et al., 2002). Estes resultados podem sugerir que o tratamento de pacientes infectados com cepas T. cruzi II podem ter maior sucesso.

Neste contexto é importante a realização de estudos experimentais para a avaliação do benefício do tratamento específico da doença de Chagas na evolução das lesões cardíacas em animais infectados com cepas parcialmente resistentes e resistentes ao Benznidazol, em comparação a grupos de animais infectados com cepas sensíveis e a grupos controle infectados e não tratados.

1.4 - Avaliação da eficácia do tratamento com Benznidazol

Para a avaliação da resposta ao tratamento específico da doença de Chagas duas categorias de testes são utilizados, incluindo métodos sorológicos e parasitológicos. Os testes parasitológicos são baseados na demonstração do parasito por hemocultura, xenodiagnóstico, ou testes moleculares (PCR). Enquanto os testes sorológicos avaliam a presença de anticorpos específicos por métodos imunológicos, como a hemoaglutinação indireta, imunofluorescência indireta, e enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Martins-Filho et al., 2002). Krettli e Brener (1982)

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detectaram no soro de pacientes chagásicos dois tipos de anticorpos com diferentes atividades funcionais: anticorpos líticos, e anticorpos da sorologia convencional. Os anticorpos líticos podem ser detectados pela lise mediada pelo complemento (Kretlli et

al., 1979, Galvão et al., 1993). De acordo com Krettli et al., (1978) os anticorpos líticos

gradualmente desaparecem da circulação após o tratamento efetivo. Baseado nos resultados da sorologia convencional e LMCo Krettli et al. (1982) propuseram a divisão dos pacientes tratados em três subgrupos: (1) tratados e não curados com sorologia convencional e LMCo positivos; (2) “dissociados” com sorologia convencional positiva e LMCo negativa; (3) curado, com ambos os testes negativos.

Apesar disso, o uso de marcadores sorológicos e parasitológicos para avaliar a efetividade de drogas tripanocidas o estabelecimento do critério de cura em seguida ao tratamento específico permanecem inconclusivos. Entretanto, a cura efetiva da infecção requer resultados negativos para os testes clínicos, parasitológicos e sorológicos após longo período de monitoramento.

Considerando estas premissas, triagens clínicas demonstraram que a sorologia convencional gradualmente se torna negativa após o tratamento efetivo da doença de Chagas congênita. A avaliação sorológica após o tratamento com Benznidazol ou Nifurtimox mostram uma negativação dos testes sorológicos entre 2 a 24 meses após o tratamento, e quanto mais tarde o tratamento for iniciado maior o tempo necessário para a negativação da sorologia (Blanco et al., 2000; Schijman et al., 2003). Por outro lado, a negativação da parasitemia é mais rapidamente detectada por PCR do que por métodos sorológicos (Russomando et al., 1998; Schijman et al., 2003). Schijman et al. (2003) mostraram que a negativação da PCR ocorre antes ou ao mesmo tempo da observada nos testes sorológicos.

De forma similar, após um tratamento efetivo, realizado durante a fase aguda da infecção, a negativação da sorologia convencional pode ser observada entre 11 a 12 meses após o tratamento (Cançado, 2002). Em concordância com estes dados Bahia-Oliveira et al. (2000) mostraram que a negativação dos testes parasitológicos (hemocultura e xenodiagnóstico) e a soroconversão negativa (sorologia convencional e LMCo) foi observada em 40% (10 de 25) dos pacientes tratados durante a fase aguda, 28% (7 pacientes) foram considerados dissociados, e 32% (8 pacientes) foram não curados. Interessantemente, durante 14 a 30 anos de avaliação clínica destes pacientes

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foram observadas a incidência de anormalidades eletrocardiográficas em 2 (28%) indivíduos dissociados (Bahia-Oliveira et al., 2000), mostrando que os indivíduos dissociados devem ser avaliados com critério para a definição da cura parasitológica. A mesma resposta aos marcadores parasitológicos e sorológicos utilizados para avaliar a efetividade do tratamento da quimioterapia na doença humana foram observadas em alguns estudos experimentais. Utilizando o cão como modelo experimental, Guedes et

al. (2002) mostraram que a negativação da hemocultura e da PCR após o tratamento

com Benznidazol, e a negativação dos testes sorológicos (sorologia convencional e LMCo) ocorre em torno de seis meses após o tratamento com Benznidazol, realizado durante a fase aguda da infecção. Um padrão similar foi observado no modelo murino, usando a citometria fluxo para a detecção de anticorpos anti-T. cruzi (Toledo et al., 2004).

O conceito de que a negativação da sorologia após o tratamento corresponde a cura parasitológica, especialmente em indivíduos tratados durante as fases aguda e crônica recente, é suportada por estudos recentes realizados em diferentes países, os quais mostram uma significante redução dos níveis de anticorpos após o tratamento com Benznidazol em crianças (fase crônica recente), enquanto as crianças não tratadas (grupo controle) não apresentaram alteração significante dos níveis de anticorpos (Andrade et al, 1996; Sosa Estani et al., 1998; Streiger et al, 2004). De acordo com Andrade et al. (1996) a diferença entre os níveis de anticorpos específicos entre as crianças tratadas e não tratadas era detectada seis meses após o tratamento. A soroconversão negativa foi observada em 55,8% e 64% das crianças tratadas no terceiro e no sexto ano de acompanhamento, respectivamente (Andrade et al., 2004). Na Argentina Sosa-Estani usando a sorologia convencional para avaliar a efetividade do tratamento em crianças detectou 11,3% de negativação da sorologia em crianças tratadas com Benznidazol, e o decréscimo da média geométrica dos títulos de anticorpos foi observada nos 40 meses de acompanhamento (Sosa-Estani et al., 1998). Streiger et

al. (2004) usando sorologia convencional (HAI, IFI e ELISA) mostraram que a

soroconversão negativa foi observada em um tempo médio de 3,5 anos em crianças tratadas entre 1 e 6 anos de vida, e de 8 anos naquelas tratadas com 7 a 14 anos. Também em estudos experimentais foi observado um decréscimo dos níveis de anticorpos em cães tratados com Benznidazol durante a fase crônica recente da doença

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11

de Chagas entre o quinto e o sexto mês após o tratamento, e a soroconversão negativa da sorologia convencional da LMCo (Guedes et al, 2002 e 2004).

Estes achados mostram a importância da padronização da sorologia para o controle de cura após o tratamento específico da doença de Chagas, sendo importante avaliar também a evolução das subclasses de imunoglobulinas da classe IgG como marcadores de cura parasitológica.

A utilização dos testes parasitológicos, hemocultura e xenodiagnóstico, para a monitorização da eficácia terapêutica são limitados, estes métodos são demorados (cerca de 120 dias de avaliação), laborioso, inconfortáveis para os pacientes e de baixa sensibilidade (Brener et al., 2000). A recente introdução da PCR para a detecção do DNA mitocondrial do T. cruzi em amostras de sangue de pacientes chagásicos abriu a possibilidade de sua utilização na detecção da falha terapêutica. Galvão et al. (2003) mostrou que o T. cruzi pode ser detectado pela PCR em 39,6% das crianças tratadas com Benznidazol, em contrapartida a 64,2% de positividade no grupo placebo. Sendo que os pacientes não tratados têm 1,6 vezes mais chance de permanecer com a PCR positiva em relação ao grupo controle. Outros estudos mostraram a eficácia da PCR em detectar a falha terapêutica em crianças tratadas com Benznidazol (Silveira et al., 2000; Solari et al., 2001). Estes estudos mostram que a PCR pode ser um importante instrumento para a detecção mais precoce da falha terapêutica em crianças tratadas durante a fase crônica recente da doença de Chagas, entretanto, é importante ressaltar o principio de que o valor do teste parasitológico é verdadeiro apenas em resultados positivos, pois nenhum deles apresenta 100% de sensibilidade.

Todavia, após o tratamento etiológico da fase crônica de longa duração o critério de cura baseado na negativação da sorologia é difícil, porque a soroconversão negativa usualmente ocorre apenas em uma pequena percentagem de indivíduos vários anos após o tratamento, sendo necessário um longo tempo de avaliação (Galvão et al., 1993; Suasnábar et al. 2000; Cançado, 2002). Em triagens clínicas realizadas no Brasil e na Argentina, avaliações longitudinais de 5 a 15 anos mostraram que a soroconversão negativa ocorre entre 3 a 10 anos após o tratamento no pacientes curados (Cançado, 2002, Suasnábar et al. 2000). Entretanto, Ferreira (1990) mostrou que nos pacientes tratados com Benznidazol e curados a negativação da sorologia ocorre em um período de 24 meses após o tratamento. Interessantemente, todos os indivíduos curados neste

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12

estudo apresentavam 5 a 18 anos, sugerindo que o tratamento foi realizado durante a fase crônica recente da doença.

Por outro lado, testes parasitológios (hemocultura e xenodiagnóstico) positivos indicam a persistência de parasitos circulantes e representam um marcador definitivo de falha terapêutica. Entretanto, estes testes apresentam um baixo valor preditivo negativo, devido a sua baixa sensibilidade. Contudo, uma alta correlação é observada entre os resultados da PCR e dos testes sorológicos para o diagnóstico da doença de Chagas, sugerindo que a PCR pode ser efetivo para a avaliação da falha terapêutica em indivíduos que receberam o tratamento específico (Gomes et al., 1999). Brito et al. (2001) comparou a PCR com o xenodiagnóstico para a avaliação de pacientes chagásicos crônicos após a quimioterapia com Benznidazol e Nifurtimox e observou que a PCR era negativa em 65% dos indivíduos tratados, enquanto o xenodiagnóstico foi negativo em 83% dos casos. Outros autores, usando diferentes protocolos, mostraram que a PCR é significantemente mais sensível para detectar a falha terapêutica em relação aos métodos tradicionalmente usados, como a hemocultura e o xenodiagnóstico (Lauria-Pires et al., 2000; Castro et al., 2002; Zulantay et al., 2004). De acordo com Brito et al. (2001) o PCR é mais seguro e sensível para detectar a cura após o tratamento específico, mas o resultado negativo da PCR após o tratamento específico é indicativo de ausência do DNA do parasito naquele determinado momento, e o resultado negativo quando apenas um ponto de tempo é analisado não pode ser assumido como cura definitiva. A concordância de resultados negativos entre a PCR e a sorologia é provavelmente indicativa de cura.

Neste contexto, os resultados de estudos longitudinais realizados para o estabelecimento do critério de cura após o tratamento específico da doença de Chagas permanecem inconclusivos, indicando a necessidade da identificação de outros marcadores para a padronização de uma metodologia mais eficaz para a definição da cura parasitológica após o tratamento específico da doença de Chagas.

Uma maior atenção deve ser dada aos marcadores sorológicos, pois durante o curso da infecção pelo T. cruzi é observada uma ativação policlonal de linfócitos B e produção de imunoglobulinas, sendo o conhecimento sobre a influência do tratamento específico na cinética de produção das diversas classes e subclasses de imunoglobulinas por diferentes populações do T. cruzi um fator importante para o estabelecimento de

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novos marcadores de cura parasitológica, podendo contribuir para uma padronização mais adequada da metodologia utilizada no controle de cura da doença de Chagas.

Em humanos ocorre a produção de quatro subclasses de imunoglobulina G (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), sendo o controle na produção destas subclasses mediado por diferentes citocinas (Kowano et al., 1994). A reatividade de IgG utilizando preparações antigênicas derivadas de formas epimastigotas do T. cruzi mostrou títulos elevados de IgG1 e IgG3 nos soros de pacientes chagásicos crônicos (Cerban et al., 1993; Morgan et

al., 1996). Cerban et al. (1993) não observaram nenhuma diferença nos níveis dessas

imunoglobulinas entre indivíduos portadores de diferentes formas clínicas da doença. Contudo, Morgan et al. (1996) descreveram níveis mais elevados de anticorpos IgG2 nos soros dos pacientes portadores de formas clínicas, cardíaca e cardio-digestiva. Resultados semelhantes foram observados em cães infectados pelo T. cruzi, nos quais foram observados níveis mais altos de IgG1 em animais com lesões cardíacas menos severas (Guedes et al., 2006). Por outro lado ainda não foi avaliada a influência do tratamento específico na evolução das diferentes subclasses de imunglobulinas G.

Neste contexto, a avaliação da evolução dos níveis de IgG e das diferentes subclasses em diferentes modelos experimentais inoculados com cepas do T. cruzi que apresentam graus de resistência ao Benznidazol variáveis seria importante para a identificação de novos marcadores sorológicos que possam ser utilizados no controle de cura da doença de Chagas.

1.5 - Modelos experimentais utilizados no estudo da doença de Chagas

O T. cruzi é capaz de infectar um grande número de espécies de mamíferos, incluindo muitos dos animais usualmente usados como modelos experimentais na pesquisa científica. Além do camundongo, em algumas circunstâncias outros animais como o rato, cães e hamsters podem ser usados. Todavia, apesar do camundongo mimetizar as características da fase aguda da doença de Chagas, com abundância de parasitos na circulação sanguínea e nos tecidos (Brener, 2000), a avaliação da eficácia terapêutica sobre a evolução das lesões cardíacas é dificultada neste modelo animal devido ao lento desenvolvimento da doença que requer longo período de

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acompanhamento. Desta forma o estabelecimento de modelos experimentais que permita estas avaliações em estudos envolvendo o tratamento específico da doença de Chagas é necessário.

A utilização do modelo cão para estudos de quimioterapia experimental para as fases aguda e crônica da doença de Chagas foi recentemente descrita pelo nosso grupo (Guedes et al., 2002). Neste estudo cães infectados com cepas de T. cruzi sensíveis, parcialmente sensíveis e resistentes ao Benznidazol foram tratados com este fármaco, e o tratamento induziu a índices de cura similares aos reportados em triagens clínicas, em ambas as fases aguda e crônica da doença de Chagas. O cão pode ser considerado como o modelo experimental ideal para quimioterapia da doença de Chagas por duas importantes razões: a primeira é o fato de que cães experimentalmente infectados pelo

T. cruzi desenvolvem uma infecção com características similares à doença de Chagas

humana, tanto na fase aguda, como na fase crônica da doença (Lana et al., 1993; Bahia

et al, 2002). A segunda é que cães experimentalmente infectados e tratados com

Benznidazol apresentam uma resposta similar à observada em humanos em termos de efetividade e de índice de cura nas fases aguda e na crônica (Guedes et al., 2002). Desta forma, este projeto propõe avaliar a eficácia do tratamento específico com Benznidazol sobre as lesões cardíacas e a resposta imune humoral em cães infectados com cepas do

T. cruzi que apresentam diferentes níveis de resistência ao Benznidazol, e determinar a

correlação entre a eficácia do tratamento com Benznidazol em cães e camundongos infectados com as mesmas cepas do T. cruzi.

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CALDAS, I.S. JUSTIFICATIVA

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O tratamento de pacientes chagásicos em ambas as fases da doença de Chagas, aguda e crônica, com o quimioterápico convencional Benznidazol tem fornecido resultados distintos, principalmente quando triagens terapêuticas de diferentes áreas geográficas são comparadas. Um dos fatores que contribuem para os diferentes resultados obtidos com o tratamento da doença humana seria o tipo de cepa do parasito predominante em algumas áreas geográficas. Foi sugerido que a resistência natural do

T. cruzi aos nitroderivados seria a explicação para os baixos índices de cura detectados

em pacientes chagásicos tratados, pois foram descritas diferenças na susceptibilidade de cepas do parasito a estes quimioterápicos.

Considerando os dados da literatura pode ser verificado que cerca de 72,8% das cepas de T. cruzi isoladas de diferentes hospedeiros e de diversas regiões geográficas, e que tiveram a sua sensibilidade a nitroderivados determinada, foram classificadas como sensíveis ou parcialmente resistentes ao Benznidazol, que corresponde ao índice médio de cura observado em pacientes tratados durante a fase aguda da infecção. Neste caso, considerando o risco de falha cardíaca e morte durante a fase crônica, o tratamento com drogas tripanocidas pode ser importante na prevenção da progressão de lesões cardíacas severas, mesmo que a cura parasitológica não seja obtida. Neste contexto é importante a realização de estudos experimentais para a avaliação do benefício do tratamento específico da doença de Chagas na evolução das lesões cardíacas em animais infectados com cepas parcialmente resistentes e resistentes ao Benznidazol, em comparação a grupos de animais infectados com cepas sensíveis e a grupos controle infectados e não tratados.

Além da baixa eficácia do tratamento específico da doença de Chagas os resultados de estudos longitudinais realizados para o estabelecimento do critério de cura permanecem inconclusivos, indicando a necessidade da identificação de novos marcadores para a padronização de uma metodologia mais eficaz para a definição da cura parasitológica após o tratamento específico da doença de Chagas. Marcadores sorológicos devem ser salientados, pois durante o curso da infecção pelo T. cruzi é observada uma ativação policlonal de linfócitos B e produção de imunoglobulinas, sendo o conhecimento sobre a influência do tratamento específico na cinética de produção das diversas classes e subclasses de imunoglobulinas por diferentes

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CALDAS, I.S. JUSTIFICATIVA

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populações do T. cruzi um fator importante para o estabelecimento de novos marcadores de cura parasitológica, podendo contribuir para uma padronização mais adequada da metodologia utilizada no controle de cura da doença de Chagas.

Para a realização deste estudo é importante também a definição do modelo experimental adequado. O cão pode ser considerado como o modelo experimental ideal para quimioterapia da doença de Chagas pelo fato de que cães experimentalmente infectados pelo T. cruzi desenvolvem uma infecção com características similares à infecção humana e devido ao tratamento de cães experimentalmente infectados apresentarem uma resposta similar àquela observada em triagens clínicas em termos do índice de cura nas fases aguda e na crônica, após o tratamento com Bz.

Desta forma, avaliar a eficácia do tratamento específico com Benznidazol na evolução das lesões cardíacas e na resposta imune humoral em cães infectados com cepas do T. cruzi que apresentam diferentes graus de resistência ao Bz, bem como a comparação dos resultados obtidos neste modelo aos obtidos no modelo murino seriam importantes para o melhor entendimento sobre o benefício do tratamento em situações em que a cura parasitológica não é obtida, e também para a avaliação dos critérios de cura utilizados.

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CALDAS, I.S. OBJETIVOS

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3.1 - Objetivo Geral

Avaliar a eficácia do tratamento específico com Benznidazol sobre as lesões cardíacas e a resposta imune humoral em cães infectados com cepas do T. cruzi que apresentam diferentes graus de resistência ao Benznidazol, e determinar a correlação entre a eficácia do tratamento com Bz em cães e camundongos infectados com as mesmas cepas do T. cruzi.

3.2 - Objetivos Específicos

1 - Determinar a porcentagem de cura parasitológica em cães e camundongos infectados com cepas do T.cruzi que apresentam diferentes graus de resistência ao Benznidazol, após o tratamento precoce com esse fármaco.

2 - Avaliar o efeito do tratamento com Bz nas lesões cardíacas dos cães e camundongos infectados com as cepas Berenice-78, Y, ABC, AAS e VL10 do

Trypanosoma cruzi, através da quantificação da área ocupada por inflamação e pela

fibrose.

3 - Avaliar a cinética de Imunoglobulina G (IgG) e isotipos (IgG1 e IgG2), através da ELISA, nos soros de cães tratados com Benznidazol, em relação aos animais controle infectados e não tratados.

4 - Avaliar a cinética de Imunoglobulina G (IgG) e isotipos (IgG1 e IgG2a e IgG2b), através da ELISA, nos soros de camundongos tratados com Benznidazol, em relação aos animais controle infectados e não tratados.

5 - Comparar os resultados do tratamento específico em relação ao índice de cura, na evolução das lesões cardíacas após o tratamento, na evolução dos anticorpos da classe IgG e suas subclasses em cães e camundongos infectados com as mesmas cepas do T. cruzi.

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CALDAS, I.S. ANIMAIS, MATERIAL E MÉTODOS

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4.1 - Delineamento Experimental

4.2 - Cepas de Trypanosoma cruzi

Cepa Berenice-78 (Lana & Chiari, 1986)

A cepa Berenice-78 foi isolada por xenodiagnóstico, em 1978 de um caso humano no Brasil, esta cepa é considerada sensível à quimioterapia com Bz (Veloso et

al., 2001).

Cepa Y

Considerada parcilamente sensível à quimioterapia com Bz, essa cepa foi isolada de um paciente na fase aguda da infecção por Pereira de Freitas em 1950, Marília, São

Cepas de T.cruzi

Inoculação em cães Inoculação em camundongos Swiss

Grupo controle

Curva de parasitemia, avaliação da infectividade, virulência e mortalidade

Hc e PCR, 1 e 6 meses após o tratamento Sorologia Grupo controle Grupo tratado Grupo tratado Tratamento com Bz Necrópsia Histopatologia

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Paulo (Freitas et al., 1953) e, posteriormente estudada e descrita por Silva & Nussenzweig (1953).

Cepa ABC

Isolada por xenodiagnóstico em Minas Gerais de um paciente que apresentava alterações cardíacas e digestivas (Brener, 1965).Considerada parcialmente resistente ao tratamento com Bz (Filardi & Brener, 1987).

Cepa AAS

A cepa AAS foi isolada de um caso de infecção aguda em humano no estado de Minas Gerais. Trata-se de uma cepa parcialmente resistente ao tratamento com Bz em camundongos (Filardi & Brener, 1987).

Cepa VL10

Isolada de paciente na forma indeterminada da doença de Chagas no Estado de Minas Gerais. Esta cepa é considerada resistente ao tratamento com Bz (Filardi & Brener, 1987).

4.3 - Polimorfismo das formas tripomastigotas das cepas estudadas

Para o estudo do polimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas, foram utilizados camundongos Swiss infectados com as cepas Be-78, Y, ABC, AAS e VL10 do T. cruzi. Foi realizada a coleta de 3µl de sangue no momento em que os camundongos se encontravam no pico de parasitemia da fase aguda da infecção e contadas 200 formas tripomastigotas aleatoreamente em microscopia óptica (400x), classificando-as como fina, larga e muito larga (Brener & Chiari, 1963).

4.4 - Animais

Foram utilizados cães sem raça definida, provenientes de uma única ninhada para cada experimento. Os cães foram obtidos e mantidos no canil da Universidade

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Federal de Ouro Preto. Os animais foram alimentados com ração comercial e água ad

libitum. Antes de inclusão no estudo os cães foram tratados com anti-helmínticos e

imunizados contra doenças infecciosas.

Foram utilizados camundongos Swiss, com trinta dias de idade, fêmeas, pesando aproximadamente 20g, nascidos e mantidos no Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto.

4.5 - Inoculação dos animais e confirmação da infecção

Grupos de quatro ou cinco cães para constituir o grupo tratado com Bz e grupos de dois a cinco cães para formar o grupo controle infectado foram inoculados aos 120 dias de idade com 2.000 tripomastigotas sangüíneas/kg, via intraperitoneal, obtidos de camundongos Swiss, infectados com as diferentes cepas do T. cruzi utilizadas neste trabalho. Os camundongos foram obtidos e mantidos no Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto.

A partir do 10o dia de inoculação foi coletado diariamente sangue da veia marginal da orelha dos cães para a confirmação da infecção. O tratamento sempre foi iniciado no primeiro dia em que o cão apresentou parasitemia patente, confirmada pelo exame de sangue à fresco.

Para os experimentos realizados com camundongos, foram inoculados, com 5.000 tripomastigotas sangüíneas, via intraperitoneal, seis animais para constituir o grupo controle infectado e não tratado, e 10 camundongos para constituir o grupo tratado. O grupo tratado foi utilizado para a determinação da susceptibilidade ao Bz, e o grupo controle foi utilizado para a avaliação da infectividade, curva de parasitemia e mortalidade. No parâmetro infectividade foram avaliados, também, além dos seis camundongos não tratados do grupo controle, os outros 10 camundongos do grupo tratado.

4.6 - Infectividade

A infectividade de cada cepa foi verificada pela observação, através do exame de sangue à fresco, de parasitos no sangue periférico dos cães e camundongos inoculados.