LEVINDO ALVES DE OLIVEIRA RELAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DE CD10 E NM23 COM AS CARACTERÍSTICAS

R

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção de Título de Mestre em Ciências.

SÃO PAULO 2009

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

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Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção de Título de Mestre em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Jaques Waisberg

Co-Orientador: Prof. Dr. Ricardo Artigiani Neto

SÃO PAULO 2009

OLIVEIRA, Levindo Alves de

Relação da imunoexpressão de CD10 e NM23 com as características anatomopatológicas e prognósticos do carcinoma colorretal. / Levindo Alves de Oliveira -São Paulo, 2009.

xv, 101f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Gastroenterologia Cirúrgica.

Título em inglês: Relation of imunoexpression of CD10 and NM23 with the anatomopathologics characteristics and prognostic of colorectal carcinoma 1.Neoplasias colorretais; 2.Carcinoma; 3. Marcadores Biológicos de Tumor; 4.Antígenos CD; 5.Nucleosídeo NM23 Difosfato Quinases; 6.Prognóstico

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRURGIA

DISCIPLINA DE GASTROENTEROLOGIA CIRÚRGICA

CHEFE DO DEPARTAMENTO

PROFª.DRª.LYDIA MASAKO FERREIRA

CHEFE DA DISCIPLINA DE GASTROENTEROLOGIA CIRÚRGICA

PROF.DR.GASPAR DE JESUS LOPES FILHO

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GASTROENTEROLOGIA CIRÚRGICA

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PRESIDENTE DA BANCA ________________________________________________ BANCA EXAMINADORA ________________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________

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DEDICATÓRIA

A minha esposa, amiga e companheira, pessoa que tanto amo e que por vários dias e noites conviveu com a minha ausência do lar. Soube compreender a importância desse trabalho me estimulando e apoiando a continuar no propósito de concluir tal empreitada.

As nossas filhas, Beatriz e Juliana, motivação para minha perseverança e alegria do nosso lar.

Ao meu pai, exemplo de homem, de trabalho e de dignidade humana.

A minha mãe pelo simples fato da sua existência.

A todos os doentes cujos espécimes e informes clínicos foram utilizados para elaboração desse trabalho e a todos os demais doentes sem os quais não teríamos razão para nos dedicarmos à elaboração de teses.

São fúteis e cheias de erros as ciências que não nasceram da experimentação, mãe de todo conhecimento”

vi

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, pela oportunidade e por ter-me recebido neste importante período de minha vida.

Ao Prof. Dr. Delcio Matos, Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Gastroenterologia Cirúrgica, exemplo de profissional, ético e acadêmico e que oferece oportunidade para as pessoas interessadas, pelo constante apoio e pelas sugestões providenciais a este estudo.

Ao Prof. Dr. Jaques Waisberg, pela valiosa orientação, pela incansável disponibilidade para ajudar e pela dedicação para que este estudo fosse elaborado em tempo hábil. Ao Prof. Dr. Ricardo Artigiani Neto que me acolheu paternalmente no Serviço de Anatomia Patológica, orientando e colaborando de forma decisiva na elaboração desse trabalho.

Ao Prof. Dr. Luis Cesar Fernandes, mestre e amigo, que muito colaborou para o meu aprimoramento como mestrando e que me conduziu nos meus primeiros passos dentro da Escola Paulista de Medicina.

Ao Prof. Dr. Fernando Soares, diretor do Serviço de Patologia do Hospital A. C. Camargo, pela gentileza da realização do estudo imuno-histoquímico e pelas valiosas sugestões oferecidas.

Ao Prof. Dr. Carlos Bacchi, do laboratório Consultoria em Patologia, pela realização do estudo imuno-histoquímico e pelas valiosas sugestões oferecidas.

Ao Prof. Dr. Flávio Lima, pela colaboração na interpretação do estudo imuno-histoquímico.

Aos alunos de graduação em medicina, Afonso Cândido Lima Junior e Daniel Reis Waisberg, pelas valiosas colaborações na confecção desse estudo.

Aos funcionários do Serviço de Anatomia Patológica, em especial, ao Joaquim, ao Sérgio, a Denise e ao Lobo que, de forma muito prestativa e disponível, colaboraram para o estudo.

Aos funcionários da secretaria do Programa de Pós-Graduação em Gastroenterologia Cirúrgica (Cláudia, Sidney e Mônica) pela constante colaboração.

vii

Aos colegas do Mestrado, em especial à Dra. Cristina Gama que sempre colaborou nos momentos de alegrias e frustrações.

Aos colegas cirurgiões de Roraima que sempre me estimularam a continuar o meu Mestrado, e em especial ao colega Pedro Maciel pelo apoio nos momentos difíceis da vida.

À Universidade Federal de Roraima e ao Curso de Graduação em Medicina, em especial, aos professores Ruy Guilherme de Souza e Jucineide Vieira que, como gestores do Promed, proporcionaram condições para a viabilização financeira de parte expressiva deste estudo.

viii

SUMÁRIO

Dedicatória ... v

Agradecimentos ... vi

Lista de Tabelas ... x

Lista de Figuras e Gráficos ... xi

Lista de Abreviaturas e Siglas ... xiii

Resumo ... xiv 1 INTRODUÇÃO ... 1 1.1. Objetivos ... 3 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 4 2.1. Neoplasia Colorretal ... 4 2.2. Marcadores Tumorais ... 5 2.3. Imuno-histoquímica ... 11

2.4. Tissue Microarray (TMA) ... 11

3 MÉTODO ... 13

3.1. Adequação do projeto ... 13

3.2. Desenho da Pesquisa ... 13

3.3. Amostra ... 14

3.4. Análise Microscópica da Peça Cirúrgica ... 15

3.5. Coleta de Dados ... 21

3.6. Análise Estatística ... 22

4 RESULTADOS ... 23

4.1. Descrição das variáveis clínicas e histológicas 23 4.2. Descrição das variáveis imuno-histoquímicas 29 4.2.1. Avaliação da imunoexpressão de NM23 e CD10 no tecido do carcinoma

colorretal

29 4.2.2. Avaliação da intensidade de coloração e do percentual de células

coradas pelos marcadores CD10 e NM23 no tecido do carcinoma colorretal ...

. 30 4.2.3. Expressão dos marcadores CD10 e NM23 no tecido do carcinoma

colorretal e na mucosa não neoplásica ...

32 4.2.4. Relação da expressão dos marcadores CD10 e NM23 com o local de

acometimento no intestino grosso do carcinoma colorretal ...

34 4.2.5. Relação da expressão dos marcadores CD10 e NM23 com o aspecto

macroscópico do carcinoma colorretal ...

36 4.2.6. Relação entre a expressão dos marcadores CD10 e NM23 e o grau de

diferenciação celular no tecido do carcinoma colorretal ...

38 4.2.7 Relação da expressão de CD10 e NM23 com a infiltração venosa,

linfática e perineural do carcinoma colorretal ...

40 4.2.8. Relação da expressão de CD10 e NM23 com a presença de metástase

linfonodal ...

44

ix

4.2.9. Relação da expressão de CD10 e do NM23 com a ocorrência de metástase hepática do carcinoma colorretal ...

45 4.2.10. Relação da expressão de CD10 e NM23 com o estadiamento do

carcinmoma colorretal ...

47 4.2.11. Relação da expressão de CD10 e NM23 com a sobrevivência livre de

doença nos doentes operados de carcinoma colorretal ... 49

4.2.12. Relação da expressão dos marcadores CD10 e NM23 com a sobrevivência global dos doentes operados de carcinoma colorretal ... 51 4.2.13. Correlação entre as expressões dos marcadores CD10 e NM23 ... 53

5 DISCUSSÃO ... 54

5.1. Características gerais ... 54

5.2. Análise da amostra ... 54

5.3. Metodologia ... 55

5.4. Expressão de CD10 e NM23 no tecido neoplásico e na mucosa não neoplásica adjacente ... 58 5.5. Expressão de CD10 e NM23 relacionada ao grau de diferenciação celular ... 58 5.6. Expressão de CD10 e NM23 relacionada à infiltração angiolinfática e neural ... 59 5.7. Expressão de NM23 e CD10 relacionada ao estadiamento do carcinoma colorretal ... 59 5.8. Expressão de CD10 e NM23 relacionada com o aspecto macroscópico do carcinoma colorretal ... 60 5.9. Expressão de CD10 e NM23 relacionada à localização do carcinoma colorretal ... 60 5.10. Expressão de CD10 e NM23 relacionada à ocorrência de metástase linfonodal do carcinoma colorretal ... 61 5.11. Expressão de CD10 e NM23 relacionada a ocorrência de metástases hepáticas do carcinoma colorretal ... 62 5.12. Expressão de CD10 e NM23 relacionada com a sobrevivência de doentes operados por carcinoma colorretal ... 63 6 CONCLUSÕES ... 64 7 ANEXOS ... 65 8 REFERÊNCIAS ... 75 Abstract Bibliografia Consultada

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Distribuição dos doentes segundo faixa etária 23 Tabela 2. Distribuição do carcinoma colorretal de acordo com sua _{localização no intestino grosso} 23 Tabela 3. Distribuição da freqüência de lesões de acordo com o aspecto _{macroscópico do carcinoma colorretal} 24 Tabela 4. Distribuição dos doentes de acordo com a operação realizada 24 Tabela 5. Distribuição dos doentes segundo o grau de penetração do tumor _{na parede colorretal} 25 Tabela 6. Distribuição dos doentes segundo o comprometimento linfonodal _{do carcinoma colorretal} 25 Tabela 7. Distribuição dos doentes segundo o grau de diferenciação celular _{do carcinoma colorretal} 25 Tabela 8. Distribuição dos doentes segundo a ocorrência de metástase à _{distância constatada no pré e/ou per-operatório} 26 Tabela 9. Distribuição dos doentes segundo a invasão linfática, vascular e _{perineural do carcinoma colorretal} 26 Tabela 10. Distribuição dos doentes nos estádio clínicos da classificação _{TNM (UICC 2002) do carcinoma colorretal} 26 Tabela 11. Distribuição dos doentes segundo ocorrência de recidiva 27 Tabela 12. Distribuição dos doentes segundo a mortalidade global 27 Tabela 13. Distribuição dos doentes de acordo com a sobrevivência após _{operação com intenção curativa ou paliativa do carcinoma}

colorretal

28

Tabela 14. Distribuição do tempo livre de doença nos enfermos submetidos à _{reoperação do carcinoma colorretal} 28 Tabela 15. Índices de imunoexpressão do marcador NM23 no tecido tumoral _colorretal 29 Tabela 16. Índices de imunoexpressão do marcador CD10 no tecido tumoral _colorretal 29 Tabela 17. Imunoexpressão do marcador CD10 de acordo com o aspecto _{macroscópico exofítico ou não exofítico do carcinoma colorretal} 36 Tabela 18. Imunoexpressão do marcador NM23 de acordo com a presença _{ou não de metástase linfonodal do carcinoma colorretal} 44 Tabela 19. Imunoexpressão do marcador CD 10 de acordo coma presença _{ou não de metástase linfonodal} 44

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fotomicrografia de TMA contendo dezenas de amostras teciduais 12

Figura 2. Equipamento para escaneamento de lâminas (WWW.aperio.com) 18 Figura 3. Fotomicrografia de mucosa colorretal não neoplásica com negatividade para

o marcador CD10

19 Figura 4. Fotomicrografia de mucosa colorretal não neoplásica com positividade de

padrão borda em escova para o marcador CD10. 19

Figura 5. Fotomicrografia de tecido de carcinoma colorretal sem imunoexpressão para o anticorpo CD 10.

19 Figura 6. Fotomicrografia de carcinoma colorretal sem positividade citoplasmática

para o marcador CD10. 20

Figura 7. Fotomicrografia de carcinoma colorretal sem positividade citoplasmática de imunoexpressão para o marcador NM23.

20 Figura 8. Fotomicrografia de carcinoma colorretal com positividade citoplasmática

para o marcador NM23. 21

Figura 9. Fotomicrografia de mucosa colorretal não neoplásica com marcador NM23. 21 Figura 10. Relação do percentual e da intensidade de células coradas para CD10 no

tecido do carcinoma colorretal.

30 Figura 11. Relação do percentual e da intensidade de células coradas para o marcador

NM23 no tecido do carcinoma colorretal.

31 Figura 12. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 no tecido

tumoral e na mucosa não neoplásica colorretal.

32 Figura 13. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 no tecido

tumoral e na mucosa não neoplásica colorretal.

33 Figura 14. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com a localização do carcinoma colorretal no intestino grosso.

34 Figura 15. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo

com a localização do carcinoma colorretal no intestino grosso.

35 Figura 16. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo

com o aspecto macroscópico do carcinoma colorretal. 36 Figura 17. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com o aspecto macroscópico exofítico ou não exofítico do carcinoma colorretal.

37

Figura 18 Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo com o grau de diferenciação celular do carcinoma colorretal.

xii

Figura 19. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo com o grau de diferenciação celular do carcinoma colorretal. 39 Figura 20. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com a presença ou não de invasão venosa pelo carcinoma colorretal.

40 Figura 21. Gráficos da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo com a presença

ou não de invasão venosa no carcinoma colorretal. 41 Figura 22. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com a presença ou não de invasão linfática no carcinoma colorretal. 42 Figura 23. Gráficos de intensidade de imunoexpressão do marcador CD10 de acordo

com a presença ou não de invasão linfática no carcinoma colorretal. 42 Figura 24. Gráficos de intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com a presença ou não de invasão perineural no carcinoma colorretal. 43 Figura 25. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo

com a presença ou não de invasão perineural no carcinoma colorretal.

43 Figura 26. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 em relação

à ocorrência ou não de metástase hepática do carcinoma colorretal.

45 Figura 27. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com a presença ou não de metástase hepática do carcinoma colorretal.

46 Figura 28. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo

com o estádio I, II, III e IV da classificação TNM da UICC (2002) do carcinoma colorretal.

47

Figura 29. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo com o estádio da classificação TNM da UICC (2002) do carcinoma colorretal.

48

Figura 30. Sobrevivência livre de doença de acordo com a expressão do marcador NM23 no tecido do carcinoma colorretal (método de Kaplan-Meier).

49 Figura 31. Sobrevivência livre de doença de acordo com a expressão do marcador

CD10 no tecido do carcinoma colorretal (método de Kaplan-Meier).

50 Figura 32. Sobrevivência global dos doentes de acordo com a expressão do marcador

NM23 no tecido do carcinoma colorretal (método de Kaplan-Meier).

51 Figura 33. Sobrevivência global dos doentes de acordo com a expressão do marcador

CD10 no tecido do carcinoma colorretal (método de Kaplan-Meier).

52

Figura 34. Correlação entre a expressão dos marcadores CD10 e NM23 no tecido do carcinoma colorretal.

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AJCC American Joint Cancer Committee

CEA Antígeno carcinoembrionário

CEP Comissão de Ética em Pesquisa

CK Citoqueratinas

CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa DNA Ácido dexorribonucléico

FAP Polipose adenomatosa familiar

HE Hematoxilina e eosina

HNPCC Câncer colorretal hereditário sem polipose INCA Instituto Nacional do Câncer

NDP Nucleosídeo difosfato quinase

PCR Reação em cadeia de polimerase

RNA Ácido ribonucléico

TMA Tissue microarray

TNM Tumor, nódulos e metástase

UICC União Internacional de Combate ao Câncer

xiv

RESUMO

Objetivos: Analisar a expressão das proteínas CD10 e NM23 por estudo

imuno-histoquímico do tecido do carcinoma colorretal e da mucosa adjacente. Avaliar a relação da expressão dessas proteínas com os aspectos anatomopatológicos da neoplasia, estadiamento clínico, ocorrência de metástases hepáticas e prognóstico dos doentes. Método: Cento e trinta doentes operados por carcinoma colorretal foram analisados. Bloco de tissue microarray foi confeccionado com tecido neoplásico e com a mucosa não neoplásica adjacente. Estudo imuno-histoquímico foi realizado com anticorpos monoclonais NM23 e CD10 no tecido neoplásico e no tecido não neoplásico da mucosa adjacente. A leitura foi realizada por aparelho de escaneamento de lâminas. A imunoexpressão foi avaliada pelo percentual de células coradas e foram obtidos escores de intensidade. Foram considerados como positivos para CD 10 os tumores que expressavam o marcador em mais de 10% das células neoplásicas. Para NM 23 considerou-se dois grupos divididos em fortes expressores (mais de 50%) e expressores fracos (menos de 50%) das células coradas. Os resultados foram relacionados com as características morfológicas e histopatológicas do carcinoma colorretal, estadiamento clínico, presença de metástases hepáticas e com o prognóstico. No estudo estatístico foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e exato de Fisher. A sobrevivência foi avaliada utilizando a curva de Kaplan-Meier, e o desfecho de comparação entre as curvas foi calculado pelo teste de Long rank. Resultados: Ambos os marcadores CD10 e NM23 apresentaram expressão maior no tecido do carcinoma do que na mucosa não neoplásica adjacente (p<0,0001 para ambos). A imunoexpressão tecidual das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com o grau de diferenciação celular (p=0,57 e p=0,48, respectivamente), invasão vascular (p=0,85 e p=0,67, respectivamente), invasão linfática (p=0,41 e 0,73, respectivamente), infiltração perineural (p=0,46 e p=0,24, respectivamente) e com o estadiamento pela classificação TNM (p=0,19 para ambos). A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com a incidência de metástases linfonodais (p=0,08 e 0,30, respectivamente). A expressão tecidual dos marcadores NM23 e CD10 não se relacionou com a ocorrência de metástases hepáticas (p=0,59 e p=0,31, respectivamente). A sobrevivência livre de doença mostrou relação significante

xv

(p=0,01) com a maior intensidade de imunoexpressão da proteína NM23 no tecido do carcinoma colorretal, o mesmo não ocorrendo com a imunoexpressão da proteína CD10 (p=0,18). A sobrevivência global não mostrou relação com as expressões das proteínas NM23 e CD10 (p=0,13 e p=0,24, respectivamente). Conclusões: O tecido neoplásico do carcinoma colorretal expressou mais intensamente as proteínas NM23 e CD10 do que a mucosa não neoplásica adjacente. A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não se relacionou com os demais aspectos anatomopatológicos da neoplasia, com a presença de metástase hepática e com o estadiamento do carcinoma colorretal. Os doentes com imunoexpressão aumentada da proteína NM23 apresentaram sobrevivência livre de doença significativamente maior. A intensidade da imunoexpressão tecidual da proteína CD10 não influenciou a sobrevivência livre de doença e a sobrevivência global não se relacionou com a imunoexpressão das proteínas NM23 e CD10.

Descritores: Neoplasias colorretais, Carcinoma, Marcadores biológicos de tumor,

1 INTRODUÇÃO

Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e terapêutica do câncer colorretal, a mortalidade global, a despeito do progresso da terapêutica cirúrgica e das terapias

complementares, não diminuiu nos últimos anos.1-4 _{O fator prognóstico de maior}

significado no carcinoma colorretal continua sendo o estadiamento no momento do diagnóstico. O nível de penetração da neoplasia na parede intestinal, o comprometimento linfonodal e a presença de metástases são considerados os

indicadores de sobrevivência mais fidedignos no carcinoma colorretal.5,6

Estudos procuraram fatores que possam reduzir a morbidade e a mortalidade da neoplasia colorretal e, entre eles, destacam-se os realizados com os marcadores

tumorais.2-4

Apesar do número consistente de pesquisas envolvendo marcadores tumorais, ainda poucos marcadores são utilizados na prática clínica. O alto custo e a sensibilidade e especificidade baixas são os principais motivos para a não utilização rotineira dos diversos marcadores tumorais. Idealmente, o marcador tumoral deveria ser de fácil mensuração, ser detectado em estádios iniciais da doença, além de

relacionar-se com a eficácia do tratamento e com a extensão da neoplasia.3,5-7

O antígeno carcinoembriônico (CEA) é o marcador tumoral mais utilizado, principalmente para o seguimento dos doentes com carcinoma colorretal submetidos à

operação potencialmente curativa e para o diagnóstico precoce de recidivas.6-10 Outros

marcadores teciduais foram estudados e relacionados às neoplasias colorretais e, entre

eles, o CD10 e o NM23.1,4,8

O marcador tecidual CD10 foi originalmente descrito em células neoplásicas de doentes com leucemia e foi utilizado como marcador da leucemia linfoblástica aguda. Posteriormente foi identificado em células renais, mama e células neoplásicas do

intestino grosso.11,12 _{O CD10 é glicoproteína de 100kd com forte expressão na borda}

em escova do epitélio intestinal, nos centros germinativos dos folículos linfóides e nos

microvilos renais. Estudos11-13 _{relacionaram esse marcador ao aparecimento de}

metástases hepáticas em doentes com neoplasia colorretal, à invasão venosa e à progressão destes tumores para estádios mais avançados.

A proteína NM23, membro da família das quinases nucleotídeo difosfato, desempenha papel em várias vias de sinalização celular associadas à diferenciação

celular, à proliferação celular e à apoptose. São consideradas proteínas multifuncionais que interagem com várias proteínas celulares e possuem funções que não estão

relacionadas com sua atividade enzimática.14,15 O gene NM23 está localizado no

cromossoma 17 e codifica duas proteínas: NM23-H1 e a NM23-H2. Estas proteínas podem ser imunoexpressas separadamente ou como proteína única NM23, de acordo

com o anticorpo utilizado.16,17 É também denominado de gene supressor de metástases

e foi identificado nas bases de células do melanoma murino. Autores14 relacionaram a

redução dessas proteínas com prognóstico menos favorável dos doentes com

carcinoma colorretal. No entanto, estudo15 realizado com o NM23 não identificou

relação entre a redução da expressão deste marcador e o prognóstico das neoplasias

colorretais tornando-se conflitantes os resultados encontrados.14-17 Até o presente, não

identificamos estudos publicados com esses marcadores no nosso meio.

Tendo em vista a alta incidência de neoplasia colorretal e a dificuldade na definição do prognóstico de doentes com essa afecção, especialmente aqueles enfermos nos estádio II e III da classificação TNM, julgamos desejável o estudo de marcadores que possam indicar evoluções diferentes em doentes com o mesmo estádio de doença. Doentes com o mesmo estadiamento tumoral podem ter comportamento prognóstico distinto e podem necessitar de tratamento complementar e acompanhamento ambulatorial diferenciados. Desta maneira, propusemos o estudo da imunoexpressão tecidual dos marcadores tumorais CD10 e NM23 e de suas relações com os aspectos anatomopatológicos da neoplasia, com a presença de metástases hepáticas e com o prognóstico dos doentes operados por carcinoma colorretal.

1.1 Objetivos

1. Analisar a expressão das proteínas CD10 e NM23 por estudo imuno-histoquímico do tecido do carcinoma colorretal e da mucosa adjacente à neoplasia.

2. Avaliar a relação da expressão tecidual das proteínas CD10 e NM23 com os aspectos anatomopatológicos, estadiamento clínico, ocorrência de metástases hepáticas, recidiva e com o prognóstico de doentes operados de carcinoma colorretal.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Neoplasia Colorretal

2.1.1. Aspectos Gerais

O câncer colorretal é histopatologicamente adenocarcinoma em mais de 98% dos casos. A sobrevivência de cinco anos atinge cerca de 70% dos doentes para as lesões no estádio I e pode chegar a menos de 6% para lesões no estádio IV da

classificação TNM.2,4,8 No Brasil, estimativas do INCA para 2008 apontaram que o

câncer colorretal representa o 5º tumor maligno mais freqüente entre homens e o 4º entre as mulheres, com expectativa de 14 casos novos para cada 100 mil

habitantes.2,4,18

O câncer colorretal, em sua maioria origina-se do adenoma por meio da seqüência adenoma-carcinoma. A partir da década de 70, tal constatação foi possível

com o advento dos procedimentos colonoscópicos.19,20

Apesar dos avanços no conhecimento da etiopatogênese do carcinoma colorretal, a média de sobrevivência de cinco anos tratados com intenção curativa

permanece aproximadamente, de 50%.19-21

Coube a Vogelstein e Fearon22,23 a descrição dos passos moleculares para a

carcinogênese colorretal. Tais autores propuseram o mecanismo da carcinogênese em etapas múltiplas caracterizadas por ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumor. Tais descobertas levaram à identificação das duas principais síndromes genéticas colorretais: polipose adenomatosa familiar (FAP) e câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) ou síndrome de Lynch.

Grande parte do conhecimento da carcinogênese colorretal se deveu aos estudos das síndromes genéticas HNPCC e FAP. As mutações dos doentes com FAP localizam-se no cromossomo 5 e aquelas relacionadas ao HNPCC caracterizam-se por

mutações nos genes de reparo (MMR).24

Apesar de essas síndromes serem bem conhecidas do ponto de vista da patogênese molecular, elas correspondem apenas a aproximadamente 20% dos casos de neoplasia colorretal. Os restantes 80% de doentes com neoplasia colorretal

2.2. Marcadores tumorais

Os marcadores tumorais podem ser plasmáticos ou séricos e teciduais. Os marcadores plasmáticos ou séricos podem ser relacionados ao diagnóstico da neoplasia e são utilizados no seguimento dos doentes para o diagnóstico precoce de recidivas. Por outro lado, os marcadores teciduais limitam-se a ter a potencialidade de

determinar o estadiamento, prognóstico e a possível resposta terapêutica.4,7,8

2.2.1. Marcadores Teciduais

Diversos marcadores teciduais são descritos na literatura, porém poucos apresentam relevância quanto à condução clínica do doente. Idealmente os marcadores teciduais deveriam alterar-se com o estádio do tumor, servir como marcador de prognóstico e auxiliar na definição da necessidade de realização de

terapêutica complementar nas neoplasias colorretais.4,7,19

Dentre os marcadores teciduais mais estudados encontramos o CEA. Diversos estudos tentam relacionar esse marcador com o prognóstico dos doentes portadores

de neoplasia colorretal25-28 Além do CEA, outros marcadores como p53, CD44,

Caderina E, c-met-HGF, CD 10, NM 23 dentre outros, também têm sido estudados em

tecidos tumorais de origem colorretal.29-33

2.2.2. CD10

É uma glicoproteína do grupo das metaloproteínas de superfície celular associada ao zinco, com peso molecular de 100kd e foi descrita, inicialmente, como antígeno na leucemia linfoblástica aguda. É membro da família das peptidases associadas à membrana e é também denominada de endopeptidase neutral, encefalinase, neprilisina ou antígeno da leucemia linfoblástica aguda. É considerada enzima com capacidade de hidrolisar peptídeos tais como neurotensina, angiotensina,

endotelina, substância P, bradicinina, dentre outras.11-13

Estudos11,12,34 evidenciaram que o CD10 é fortemente expresso nas células

folículos linfóides e nos microvilos renais. O CD10 também foi descrito em tecido estromal normal da medula óssea, do endométrio e em tecido estromal da mama com neoplasia invasiva.

Nos doentes com neoplasia colorretal, o CD10 é expresso pelas células estromais na localização peritumoral e isso ocorre quando a neoplasia se torna maior e invasiva. Essas observações são condizentes com os achados de que o CD10

encontra-se expresso nos casos de carcinoma ductal invasivo na neoplasia mamária.35

Iwase et al.36 avaliaram a superexpressão de CD10 e a redução na expressão

de MUC2 na progressão da neoplasia colorretal e concluíram que níveis elevados de CD10 podem estar associados com o desenvolvimento e progressão do carcinoma colorretal para estádios mais avançados.

Koga et al.13 avaliaram a expressão de CD10 e da β-catenina em lesões

polipóides e em lesões planas com as neoplasias invasivas de alto e de baixo grau. Esses autores verificaram que nas neoplasias invasivas havia a maior expressão de CD10 quando comparada com as lesões polipóides, sugerindo maior tendência desse

tipo de lesão à invasibilidade.

Yao et al.37,38 _{avaliaram a característica fenotípica da neoplasia colorretal com os}

marcadores CD10, MUC2 e HGM. Esses autores identificaram nos tumores com marcação expressiva de CD10, maior tendência da aquisição da característica fenotípica semelhante ao do intestino delgado e maior ocorrência de invasão venosa.

Kalof et al.39 reportaram a expressão de CD10 em células mioepiteliais de mama. Este

achado sugere a possibilidade da utilização do marcador na distinção entre carcinomas invasivos e carcinomas in situ de mama. Embora este marcador apresentasse boa sensibilidade para ser utilizado na diferenciação de neoplasia in situ e neoplasia avançada, a miosina de cadeia pesada do músculo liso apresentou-se mais sensível.

Langner et al.34 avaliaram a importância do CD10 para o diagnóstico e prognóstico das

neoplasias renais e concluíram que o CD10 é marcador sensível para o diagnóstico e prognóstico das neoplasias renais.

2.2.3. CD10 e Metástases Hepáticas

Estudos11,12,38 relacionaram a concentração de CD10 tecidual à progressão

Algumas neoplasias colorretais apresentam tendência fenotípica a se diferenciarem em enterócitos e são esses tumores que apresentam maior tendência a evoluírem com metástases hepáticas. No entanto, o mecanismo pelo qual ocorre o desenvolvimento de metástases hepáticas nesse tipo de tumor e a relação das

mesmas com o CD10 ainda não estão completamente esclarecidos.11,12 .

Yao et al.37,38 investigaram a relação do CD10 e do MUC2 com a incidência de

metástases hepáticas e identificaram elevação na incidência dessas metástases nos doentes com maior expressão tecidual da proteína CD10.

Fujimoto et al.40, em estudo da diferenciação intestinal do tumor através do

método imuno-histoquímico, avaliaram a expressão de CD10 e MUC2 em doentes com neoplasia colorretal. Concluíram que o aumento da expressão de CD10 em tecido da neoplasia colorretal está relacionado com a maior incidência de metástases hepáticas. Esses autores também relataram maior concentração de CD10 nos tumores moderadamente diferenciados do que nas lesões bem diferenciadas. Por sua vez, é exatamente nas lesões moderadamente diferenciadas que se observa maior incidência de metástases hepáticas.

É ainda indefinido o mecanismo que predispõe tumores CD10 positivos a maior

incidência de metástases hepáticas.38

2.2.4. CD10 e Prognóstico

Dois estudos41,42 procuram relacionar a expressão tecidual de CD10 com o

prognóstico das neoplasias colorretais. Oshima et al.41 avaliaram os marcadores P1,

P2, CD10 e MUC1 em tecido tumoral de neoplasia colorretal e não encontraram

relação entre a expressão de CD10 e a sobrevivência. Fujita et al.42, em estudo com

PCR, avaliaram a expressão de CD10 em tecidos cólicos normais e neoplásicos. A expressão de CD10 foi significantemente maior nos tecidos neoplásicos que nos tecidos normais. Além disso, a expressão maior desse marcador foi identificada nos tecidos neoplásicos com estádio mais avançado e com linfonodos metastáticos, porém não foi identificada relação da expressão tecidual do CD10 com o prognóstico dos doentes.

2.2.5. NM23

O gene NM23 está localizado no cromossomo 17 na subunidade 17q21. Dois genes alelos, NM23-H1 e NM23-H2, foram descritos e codificam dois polipeptídeos, subunidades da difosfato quinase nucleosídeo (NDP quinase) e que são em 88% das vezes homólogos. O gene NM23, também denominado de gene supressor de metástases, foi identificado nas bases de células do melanoma murino. Sua imunoexpressão foi descrita em tecido colorretal normal e neoplásico. No epitélio normal, o gene NM23 se expressa principalmente na zona proliferativa na base das

criptas.43,44

A perda da função do gene NM23 pode levar a perda da capacidade de diferenciação e possivelmente a aquisição de fenótipo metastático. No entanto, o mecanismo pelo qual o NM23 influencia o aparecimento de metástases hepáticas não

foi, ainda, completamente definido.14,16,45

O papel do gene NM23 no câncer colorretal ainda é controverso. Autores relataram que a reduzida expressão desse marcador está associada com estádios mais

avançados do tumor e aumento do risco de metástases hepáticas.46 Estudo encontrou

a proteína NM23 com expressão aumentada nos carcinomas colorretais em relação ao

tecido cólico não neoplásico.47 Tais achados podem estar relacionados à mutação ou

deleção parcial do gene resultando em aumento da expressão da proteína NM23 tipo mutante. Esta proteína mutante pode ter papel importante no desenvolvimento de

metástases, como ocorre com o gene p53 mutante.43,48-52

Tanapfel et al.53 _{avaliaram, em estudo imuno-histoquímico, a expressão de}

NM23-H1 em tumores colorretais. Concluíram que os tecidos tumorais com baixa expressão de NM23-H1 apresentavam tumores em estádio avançado e com alta incidência de metástases para linfonodos.

Martinez et al.54 avaliaram a expressão de NM23–H1 e NM23-H2 relacionado ao

estádio dos tumores colorretais. Encontraram superexpressão dos marcadores nos tumores em estádio I e II. As neoplasias em estádios mais avançados tenderam a

apresentar baixa expressão dos genes NM23–H1 e NM23-H2.

Cheah et al.17 investigaram a relação do gene NM23-H1 com a sobrevivência e

com o estadiamento dos tumores colorretais. Esses autores não identificaram relação entre a expressão do marcador e a sobrevivência. No entanto, a concentração do marcador encontrava-se baixa nos tumores em estádios mais avançados.

Campo et al.14, em estudo de DNA com citometria de fluxo, avaliaram a perda da heterozigosidade do gene NM23-H1 em doentes com neoplasia colorretal. Concluíram que a deleção do alelo de NM23–H1 está diretamente relacionada com o comportamento mais agressivo do tumor colorretal.

O NM23 também foi relacionado ao câncer de mama. Estudos evidenciam que as proteínas do gene NM23 apresentam expressão elevada nos tumores mamários com baixo potencial metastático e expressão diminuída nos tumores com maior

incidência de metástases.44

2.2.6. NM23 e Metástases

A imunoexpressão da proteína NM23 foi associada ao aparecimento de

metástases linfonodais e hepáticas.46,55,56

Sarris et al.55 estudaram a expressão da proteína NM23 relacionada com

metástases para linfonodos e fígado. O estudo foi feito por imuno-histoquímica e não foi detectada diferença significante entre a expressão de NM23 nos tumores colorretais com ou sem metástases para linfonodos ou fígado.

Berney et al.46 estudaram as proteínas preditivas de metástases hepáticas em

doentes com carcinomatose peritoneal e concluíram que a expressão de NM23 está relacionada ao aparecimento de metástases hepáticas. Sugeriram que doentes com potencial elevado para o aparecimento de metástases e submetidos à operação pretensamente curativa poderiam ter indicação de tratamento adjuvante em função da expressão do gene NM23.

Delektorskaya et al.56 _{avaliaram, em estudo imuno-histoquímico, a expressão do}

NM23 e do C-erb-2 em tumores primários e em metástases de carcinoma colorretal. Identificaram aumento da expressão de NM23 relacionado à maior incidência de metástases hepáticas. Estes autores sugeriram que a expressão aumentada do NM23 entre os tumores com incidência elevada de metástases não confirma o papel inibitório desta proteína no processo metastático.

Yamaguchi et al.57 avaliaram o gene NM23–H1 pela determinação do mRNA e

por estudo imuno-histoquímico. Esses autores relacionaram a expressão deste gene com o prognóstico e com o aparecimento de metástases hepáticas. Não foi encontrada relação entre o NM23-H1 e a invasão linfática, invasão venosa ou metástases linfonodais. No entanto, a expressão do marcador foi significantemente menor nos

tumores que apresentavam metástases, sugerindo que o gene NM23 pode ter papel supressor para as metástases hepáticas em doentes com carcinoma colorretal.

Heide et al.51 analisaram o gene NM23-H1 em neoplasias colorretais e nas

metástases por meio de estudo de RNA. Não foram detectadas diferenças entre a expressão do marcador em tecido cólico normal, neoplásico e nas metástases. Os autores concluíram que embora o gene NM23–H1 possa estar envolvido no aparecimento de metástases de alguns tipos de neoplasias, a sua função em casos de neoplasia colorretal permanece, entretanto, indeterminada.

Royds et al.44 avaliaram por imuno-histoquímica a expressão do gene NM23 em

tecidos de neoplasia colorretal e a correlacionaram com critérios prognósticos. Não foi comprovada a relação entre a baixa expressão de NM23 e a presença de invasão vascular e de metástases hepáticas na época da ressecção.

Wang et al.45 estudando a expressão de NM23 em neoplasia colorretal por PCR,

mostraram relação entre a mutação e baixa expressão de NM23 com o aparecimento

de metástases hepáticas.

2.2.7. NM23 e Prognóstico

Lindmark16, em estudo imuno-histoquímico, não encontrou relação entre a

expressão do marcador NM23-H1 e a sobrevivência.

Brenner et al.58 _{analisaram por imuno-histoquímica a expressão de NM23–H1 e}

NN 23-H2 em doentes com neoplasia colorretal. Não foi encontrada relação entre a expressão de NM23–H2 e prognóstico. No entanto, houve discreto aumento da sobrevivência em indivíduos com baixa expressão de NM23–H1.

Lee et al.59 avaliaram por imuno-histoquímica a expressão de NM23–H1 em

doentes com neoplasia colorretal e não encontraram relação importante entre a expressão do marcador e os critérios prognósticos.

Anwar et al.43 em revisão sistemática avaliaram os marcadores genéticos

relacionados ao prognóstico da neoplasia colorretal. Identificaram vários estudos que relacionam a mutação ou deleção do gene NM23 e a baixa expressão desse marcador com a piora do prognóstico.

Entretanto, outros estudos50-52 não demonstraram a relação da expressão de

2.3. Imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica compreende técnicas que permitem a identificação de antígenos teciduais por meio de reação antígeno-anticorpo que é visibilizada pelo uso

de marcadores adequados à microscopia ótica, de fluorescência ou eletrônica.19

A partir de 1984 surgiram os anticorpos monoclonais que permitiram maior especificidade do método e maior ampliação do uso da imuno-histoquímica. Os exames tornaram-se mais específicos, pois os anticorpos monoclonais reagem com

apenas um epítopo.19

2.4. Tissue Microarray (TMA)

A primeira tentativa de estudar tecidos agrupados com o propósito de otimizar os

resultados foi feita por Battifora60_{, técnica denominada de Multitumor Tissue Block}

(MTTB) ou técnica da “salsicha”. Essa técnica era limitada, pois não permitia a identificação de cada amostra com cada doente.

Wan et al.61 _{aprimoraram o método obtendo amostras de cada bloco doador com}

agulhas hipodérmicas de 16 gauge com pontas removidas e afiadas em pedra de amolar. Os cores obtidos eram retirados da agulha com guias metálicos e incluídos no bloco receptor manualmente usando parafina parcialmente derretida. A desvantagem desta técnica é que ela era considerada manualmente difícil.

Kononen et al.62 desenvolveram tecnologia usando arrayers. Trata-se de

dispositivo constituído por cilindro semelhante ao punch de biópsia cutânea, em base fixada, com dispositivo para retirada do core e montagem em bloco pré-moldado e vazado, com locus para receber os cores. Este dispositivo facilitou a montagem técnica dos blocos de TMA, permitindo a coloração de até 600 amostras ou cores no mesmo bloco e na mesma lâmina.

O uso do tissue microarray (TMA) apresenta várias vantagens em relação à técnica tradicional: economia de tempo, pois ao invés de vários cortes em várias lâminas é realizada apenas uma lâmina contendo vários fragmentos que representam dezenas a centenas de tumores diferentes; economia de reagentes, pois ao invés de corar várias lâminas apenas uma é corada; simplificação do trabalho, uniformização

Figura 1. Fotomicrografia de TMA contendo dezenas de amostras teciduais (HE, 10X)

Na época de criação do método vários estudos foram realizados com o propósito de validação do mesmo. Hoje o método de TMA, apesar de analisar apenas pequeno fragmento do bloco de parafina, é considerado seguro para estudos de

imuno-histoquímica e de hibridização in situ.63,64

A validação do método de TMA como técnica de pesquisa de marcadores

tumorais e teciduais ocorreu em estudo64 que analisou a imunoexpressão das

citoqueratinas 7 e 20 em 286 doentes com carcinoma colorretal. Os resultados mostraram correlação dos achados dos TMA com os dados clínicos e de estadiamento da neoplasia.

3 MÉTODO

3.1. Adequação do projeto

A realização do estudo obedeceu todas as etapas previstas pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e às exigências do Conselho de Ética em Pesquisa da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) do Ministério da Saúde (Resolução CNS196/96). O presente projeto foi registrado no CEP da UNIFESP sob o número 1958-07.

3.2. Desenho da pesquisa

Trata-se de estudo retrospectivo do banco de dados e prontuários do Grupo de Coloproctologia da Disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP – EPM). Foram analisados dados referentes aos doentes com carcinoma colorretal submetidos à intervenção cirúrgica e acompanhamento ambulatorial no período de fevereiro de 2001 a março de 2005.

Todos doentes aderiram espontaneamente ao tratamento e ao estudo, e assinaram termo de consentimento de participação após serem informados sobre o estudo na qual estavam incluídos. Foi comunicado, ainda, que os mesmos poderiam se excluir da pesquisa a qualquer momento por iniciativa própria e sem prejuízo para o seu tratamento.

O critério de inclusão neste estudo foi doente adulto com adenocarcinoma colorretal confirmado pelo exame anatomopatológico. O critério de exclusão foi doente com carcinoma colorretal hereditário, doença de Crohn ou retocolite ulcerativa, câncer colorretal metacrônico, câncer metacrônico de outra origem ou doente com outro tipo de neoplasia tratada previamente e/ou submetidos à radioterapia e ou à quimioterapia neoadjuvantes.

Na análise da amostra foram consideradas as seguintes variáveis biodemográficas: etnia, faixa etária no momento do diagnóstico e gênero. Em relação à lesão neoplásica foi considerada a localização, características macroscópicas e

microscópicas e estadiamento da lesão primária. Quanto aos doentes foram analisados os seguintes eventos: tipo de intervenção cirúrgica realizada, presença ou não de metástases sincrônicas, tempo de seguimento, perdas do acompanhamento, óbitos e suas causas, tempo livre de doença, índice e tipos de recidivas da neoplasia, sobrevivência global e índice de mortalidade.

Considerou-se recidiva o ressurgimento do carcinoma colorretal, após sua ressecção com intenção curativa, em estruturas locais, adjacentes ou em órgãos à distância passíveis de constituírem sede de metástases de neoplasia.

Sobrevivência global foi definida como o intervalo de tempo decorrido desde a operação com intenção curativa ou paliativa até o último retorno ao hospital ou ocorrência de óbito em determinado doente.

O tempo livre de doença foi caracterizado como o tempo do período pós-operatório em doentes submetidos à operação curativa em que não ocorre detecção de recidiva neoplásica.

O estudo dos blocos parafinados de tecidos do carcinoma colorretal obtidos do produto da operação a que foram submetidos os doentes acima relacionados foi realizado na Disciplina de Anatomia Patológica da UNIFESP-EPM. Realizou-se estudo imuno-histoquímico dos marcadores CD10 e NM23 no tumor e nas bordas de tecidos normais. Obteve-se a relação dos marcadores com as características anatomopatológicas do tumor e com o prognóstico dos doentes.

3.3. Amostra

3.3.1 Características epidemiológicas

Esta série incluiu 130 doentes com carcinoma colorretal, com média de idade de 64,2 anos (29 a 90 anos). Foram estudados 65 doentes de cada sexo. Todos foram operados pela equipe de Coloproctologia do Hospital São Paulo da UNIFESP-EPM, no período de fevereiro de 2001 a março de 2005.

3.4. Análise Microscópica da peça cirúrgica

3.4.1 Técnica Histológica e Construção do TMA

Os processos de fixação, embebição em parafina, cortes e coloração pela hematoxilina-eosina (HE) seguiram os procedimentos de rotina da técnica histológica do Departamento de Patologia da UNIFESP.

Para a confecção do bloco de TMA todos os casos foram examinados por dois patologistas por meio de cortes histológicos corados pela HE para que houvesse acordo sobre o grau histológico, para a confirmação do diagnóstico e para a seleção dos locais para retirada dos cores.

Com o uso de um aparelho BeecherTM (Beecher Instruments, Silver Spring, USA)

foram confeccionados blocos de TMA conforme especificações do fabricante, seguindo-se as etapas conforme descrito: 1. marcação da área seguindo-selecionada no respectivo bloco de parafina; 2. utilização do aparelho para criar espaço vazado no bloco receptor; 3. extração do cilindro tecidual do bloco doador com 1mm de diâmetro da respectiva área de interesse previamente selecionada; 4. transferência do cilindro tecidual obtido do bloco doador para o espaço vazado do bloco receptor; 5. progressão, em frações de milímetros, a novas posições dentro do bloco receptor, de modo a criar coletânea de amostras teciduais seguindo disposição matricial; 6. avaliação da qualidade do bloco final para armazenamento.

Para adesão dos cortes dos blocos de TMA nas lâminas foi utilizado sistema de fitas adesivas (Instrumedics Inc., Hackensak, NJ, USA). As amostras foram cortadas com espessura de 4µm, sendo usado pequeno rolo para pressionar o corte na fita. A fita com o corte histológico aderido foi, então, colocada sobre lâmina revestida com resina e pressionada com o mesmo rolo para melhor aderência do corte. Em seguida, as lâminas com os cortes histológicos aderidos às fitas foram colocadas em luz UV por 20 minutos. As lâminas foram secadas, e as fitas adesivas foram retiradas. As lâminas foram, então, encaminhadas para imuno-histoquímica.

Dos blocos de parafina originais, foram retirados dois cilindros de tecido tumoral de áreas previamente escolhidas e dois cilindros de mucosa não neoplásica. O bloco de TMA resultante é composto por tecido tumoral e não tumoral com imagem original e imagem em espelho conforme mapas preparados em planilhas adequadas para este fim.

Houve perda de, aproximadamente, 20% dos blocos teciduais encaminhados para estudo imuno-histoquímico.

3.4.2 Imuno-histoquímica

Utilizou-se a técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase com os anticorpos monoclonais CD10 e NM23.

Foi utilizado o anticorpo anti-CD10 (Biocare Medical, USA), na diluição de 1:40 no Laboratório Consultoria em Patologia (Botucatu, SP). O estudo imuno-histoquímico com o anticorpo monoclonal anti-NM23 (Neomarkers, USA), com afinidade para os componentes H1 e H2 da proteína NM 23, na diluição de 1:1000 foi realizado no Laboratório de Patologia do Hospital A. C. Camargo (São Paulo, SP). A reação imuno-histoquímica foi realizada da seguinte maneira:

− desparafinização com xilol a 60ºC por 20 minutos e à temperatura ambiente por mais de 20 minutos;

− hidratação dos cortes em concentrações decrescente de etanol (100%, 95%, 80%, e 70% respectivamente) por 30 segundos cada passagem.

− lavagens alternadas em água corrente e destilada;

− bloqueio de peroxidase endógena com água oxigenada (20 vol.) a 6% em quatro banhos de cinco minutos cada;

− lavagens alternadas em água corrente e destilada;

− lavagem com tampão PBS (solução salina tamponada com fosfatos 10mM e pH 7,4) por cinco minutos;

− incubação com o anticorpo primário correspondente, diluído em tampão PBS contendo albumina bovina (BSA 1%, Sigma A9647, USA) e azida sódica

(NaN3 0,1%) por 18 horas a 4º C em câmara úmida;

− lavagem em solução de PBS com três trocas de três minutos cada;

− incubação com o anticorpo secundário biotinilado-reagente C (biotinylated

goat anti-mouse/rabbit Ig) do Kit streptABC Complex/HRP Duet (mouse/rabbit,

DAKO A/S K49, Denmark) no título estabelecido (1/600), diluído em PBS, por 30 minutos a 37ºC;

− incubação com complexo-reagente A (Streptavidin) no título estabelecido (1/600), diluído em PBS, por 30 minutos a 37ºC;

− lavagem em tampão PBS com trocas de três minutos cada;

− incubação com a solução substrato 3,3” tetraidroclorito de diaminobenzidina (DAB) 60 mg% (Sigma Chemical Company, MS, USA); água oxigenada 20 vol. a 6% (1ml); PBS 100ml por cinco minutos a 37º C ao abrigo da luz;

− observação ao microscópio do aparecimento do precipitado castanho-dourado nos controles positivos;

− lavagens alternadas em água corrente e destilada por três minutos cada. − coloração com hematoxilina de Harris por um minuto;

− lavagens alteradas em água corrente e destilada;

− imersão rápida em água amoniacal (hidróxido de amônio 0,5%), e em seguida lavagens alternadas em água corrente e destilada;

− desidratação em etanol (50%, 80%, 95%, e 100%) por 30 segundos cada; − diafanização em xilol por quatro vezes de 30 segundos cada;

− montagem com lamínula em entellan (Merck, USA).

3.4.3 Interpretação da Reação Imuno-histoquímica

Foi considerado positivo para os anticorpos em estudo, o aparecimento da cor marrom na área citoplasmática ou membranosa da célula. Foram usadas como controle positivos cortes do centro germinativo de tonsila normal para o anticorpo

anti-CD10 e carcinoma ductal mamário para o anticorpo anti-NM23. Nas lâminas usadas

como controle negativo, subtraiu-se o anticorpo primário da reação.

Os critérios utilizados para avaliação das proteínas CD10 e NM23 foram como

preconizados por Ogino et al.65 A exemplo de outros autores.16,40,43,4 utilizou-se o

percentual de células coradas como indicador do grau de expressão de ambos os marcadores, Considerou-se como escore 0 quando havia na lâmina menos de 10% de células coradas, escore 1, na presença de 11 a 25% das células coradas, escore 2, quando 26 a 50% das células estavam coradas e escore 3, nas amostras com expressão de mais de 50% das células coradas. Para o marcador CD10 consideramos negativas aquelas amostras que expressavam menos de 10% de células coradas e

positivas aquelas com mais de 10% de células coradas.66 Devido à forte expressão do marcador NM23 no tecido neoplásico, apenas em três oportunidades as lesões apresentaram menos que 10% das células coradas. Tendo em vista essa forte expressão do marcador e a dificuldade de interpretação estatística dividiu-se a amostra em dois grupos: os expressores fracos, com menos de 50% das células coradas e os expressores fortes, com mais de 50% das células coradas

A avaliação da imunoexpressão das proteínas foi realizada no tecido tumoral e na mucosa não neoplásica obtida das margens cirúrgicas adjacentes ao tumor.

Os cortes foram examinados em aparelho de escaneamento de lâminas (Scan Scope*CS System, Aperio, UK). Trata-se de sistema de digitalização de lâminas com imagens de alta resolução (Figura 2). Avaliou-se o percentual de células com reação positiva (400X). As células com coloração duvidosa e as consideradas morfologicamente não tumorais foram excluídas da avaliação da imunoexpressão dos marcadores.

Figura 2. Equipamento com sistema de digitalização de imagens de alta definição utilizado para escaneamento de lâminas (www.aperio.com).

A avaliação da imunoexpressão foi realizada por dois patologistas experientes e de forma isolada. Os casos discordantes foram analisados em conjunto.

As imagens foram capturadas por meio de câmara Sansung com auxílio do programa WinTV32 acoplada em microscópio Olympus Bx40. Foram identificadas expressões positivas e negativas, para ambos marcadores, nos tumores e nas mucosas normais (Figuras 3 a 9)

Figura 3. Mucosa colorretal não neoplásica, com imunoexpressão negativa para o marcador CD10. (Imuno-histoquímica, A 25X e B100X).

Figura 4. Mucosa colorretal não neoplásica com positividade imuno-histoquímica de padrão borda em escova para o marcador CD10. (Imuno-histoquímica, A 100X e B 400X).

Figura 5. Tecido de carcinoma colorretal sem imunoexpressão para o anticorpo CD10. (Imuno-histoquímica. A 25X e B 400X).

A B

A B

B

A

Figura 6. Carcinoma colorretal com positividade citoplasmática e de membrana para o marcador CD10. A) Forte (100X); B) Forte (400X); C) Fraco (400X) e D) Padrão borda em escova (400X). (Imuno-histoquímica).

Figura 7. Carcinoma colorretal com imunoexpressão negativa para o marcador NM23. (Imuno-histoquímica, A 100X e B 400X).

A

B

A

B

Figura 8. Carcinoma colorretal com positividade citoplasmática para o marcador NM23. (Imuno-histoquímica, A 100X e B 400X).

Figura 9. Mucosa colorretal não neoplásica com imuno-histoquímica com o marcador NM23. A) Imunoexpressão negativa (400X) e B) Imunoexpressão positiva (400X).

3.5. Coleta dos Dados

Foram registradas as seguintes informações: características clínicas da amostra (idade, sexo, etnia, data da operação, mortalidade, sobrevivência, recidiva, metástases hepáticas e/ou em outras localizações, estadiamento clínico); características macroscópicas da lesão (localização e aspecto macroscópico); características microscópicas (grau de diferenciação histológica, invasão linfática, vascular e neural, TNM) e imunoexpressão tecidual dos marcadores CD10 e NM23, avaliando-se a

intensidade da coloração versus percentual de células coradas.65

A

B

3.6. Análise Estatística

Os dados referentes a variáveis quantitativas foram resumidos em médias.

As variáveis categóricas foram analisadas pelo teste de Mann-Witney e a correlação entre elas foi realizada pelo teste de Spearman. A análise de variância nas amostras de três grupos ou mais foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis e as variáveis dicotômicas foram analisadas pelo teste exato de Fisher.

Para análise da sobrevivência foram confeccionadas curvas de Kaplan-Meier e a comparação entre as curvas foi realizada pelo teste de Log-rank.

O nível de significância adotado foi inferior a 0,05 ou 5%.

4 RESULTADOS

4.1 Descrição das variáveis clínicas e histológicas

A distribuição etária está descrita na tabela 1. Em 11 doentes (8,5%) não foi possível a obtenção da idade.

Tabela 1. Distribuição dos doentes operados por carcinoma colorretal de acordo com a faixa etária

Faixa etária N° % Até 40 anos 5 4,2 41 a 60 anos 37 31,1 61 a 80 anos 66 55,5 > 81 anos 11 9,2 Total 119 100,0

A localização das neoplasias no intestino grosso é observada na tabela 2. Tabela 2. Distribuição do carcinoma colorretal de acordo com sua localização no intestino grosso

Localização N° % Reto 41 31,5 Colo direito 38 29,2 Sigmóide 28 21,5 Colo esquerdo 14 10,7 Colo transverso 9 6,9 Total 130 100,0

A característica macroscópica da lesão está assinalada na tabela 3. Tabela 3. Distribuição da freqüência de lesões de acordo com o aspecto macroscópico do carcinoma colorretal

Tipo de lesão N° % Ulcerado e infiltrante 59 45,4 Ulcerado 28 21,5 Exofítico 23 17,7 Infiltrativo 19 14,6 Outro 1 0,8 Total 130 100,0

Os procedimentos cirúrgicos realizados foram: reto-sigmoidectomia em 49 (37,7%) doentes, colectomia direita em 38 (29,2%), laparotomia exploradora com ou sem colostomia de desvio em 11 (8,4%), amputação abdômino-perineal em 10 (7,6%), colectomia total em 10 (7,6%), colectomia esquerda em 9 (6,9%) e transversectomia em 3 (2,3%) enfermos (Tabela 4).

Tabela 4. Distribuição dos doentes com carcinoma colorretal de acordo com a operação realizada

Procedimento cirúrgico N° %

Reto-sigmoidectomia 49 37,7

Colectomia direita 38 29,2

Laparotomia com ou sem colostomia 11 8,4

Amputação abdômino-perineal 10 7,6

Colectomia total 10 7,6

Colectomia esquerda 9 6,9

Tranversectomia 3 2,3

Total 130 100

Oitenta e dois (63,1%) doentes foram submetidos a operações com intenção curativa e 48 (36,9%) foram operados paliativamente.

Os tumores ressecados foram estadiados de acordo com a classificação TNM da UICC (2002) em relação ao grau de penetração na parede intestinal e ao acometimento linfonodal (Tabelas 5 e 6).

Tabela 5. Distribuição dos doentes operados por carcinoma colorretal, de acordo com a profundidade de invasão do tumor na parede colorretal Profundidade de Invasão N° % T3 78 60,0 T4 30 23,1 T2 19 14,6 T1 3 2,3 Total 130 100,0

Tabela 6. Distribuição dos doentes de acordo com o comprometimento linfonodal pelo carcinoma colorretal

Linfonodos N° % N0 58 44,6 N1 40 30,8 N2 31 23,8 NX 1 0,8 Total 130 100,0

Quanto ao grau de diferenciação histológica dos tumores, observou-se a distribuição relacionada na Tabela 7.

Tabela 7. Distribuição dos doentes de acordo com o grau de diferenciação histológica do carcinoma colorretal

Grau de diferenciação N° %

Bem diferenciado 52 40,0

Moderadamente diferenciado 70 53,8

Pouco diferenciado 8 6,2

Em relação à presença de metástases à distância no estadiamento pré e/ou per operatório, os dados obtidos estão contidos na tabela 8.

Tabela 8. Distribuição dos doentes de acordo com a ocorrência de metástase à distância constatada no pré e/ou per-operatório

Metástase N° %

Ausente 79 60,8

Outras localizações, exceto hepática 27 20,8

Somente hepática 19 14,6

Hepática e outras localizações 5 3,8

Total 130 100,0

Em relação à presença de invasão vascular, linfática e perineural, a distribuição dos doentes está relacionada na tabela 9.

Tabela 9. Distribuição dos doentes de acordo com a invasão linfática, vascular e perineural do carcinoma colorretal

Invasão (N=130) Não Sim

Linfática 52 (40%) 78 (60%)

Vascular 103 (79,2) 27 (20,8%)

Perineural 92 (70,8%) 38 (29,2%)

Em relação ao estádio clínico do carcinoma colorretal foi utilizada a classificação TNM (UICC, 2002) (Tabela 10).

Tabela 10. Distribuição dos doentes nos estádio clínicos da classificação TNM (UICC 2002) do carcinoma colorretal

Estádio Clínico N° % I 9 6,9 II 44 33,8 III 45 34,6 IV 32 24,6 Total 130 100,0

Os critérios prognósticos foram representados pelos seguintes parâmetros: ocorrência de recidivas, mortalidade global, sobrevivência e tempo livre de doença.

A ocorrência de recidivas nos doentes operados com intenção curativa foi constatada por meio de exames complementares ou por laparotomia e está descrita na tabela 11. Dois (2,4%) doentes faleceram por causa não relacionada à neoplasia e foram excluídos da análise e 5 (6,1%), tiveram perda de seguimento.

Tabela 11. Distribuição dos doentes operados por carcinoma colorretal com intenção curativa (N=80) de acordo com a ocorrência de recidiva

Recidiva N° %

Sim 21 26,25

Não 54 67,5

Sem informação 5 6,3

Total 80 100,0

A mortalidade global nos 90 enfermos com seguimento completo até o final do estudo foi de 34 (37,8%) doentes (Tabela 12). Não foi possível obter a informação da sobrevivência de 40 (30,8%) enfermos.

Tabela 12. Distribuição dos doentes operados por carcinoma colorretal de acordo com a mortalidade global

Mortalidade N° %

Sim 34 37,8

Não 56 62,2

Total 90 100,0

O índice de sobrevivência foi dividido em períodos mensais e está assinalado na tabela 13. Em 23 (17,7%) doentes não foi possível obter a informação quanto à sobrevivência medida em meses.

Tabela 13. Distribuição dos doentes de acordo com a sobrevivência após operação com intenção curativa ou paliativa do carcinoma colorretal

Sobrevivência N° % Até 3 meses 15 14,0 4 a 6 meses 8 7,5 7 a 12 meses 8 7,5 13 a 24 meses 11 10,3 25 a 36 meses 21 19,6 37 a 48 meses 28 26,2 49 a 60 meses 15 14,0 > 60 meses 1 0,9 Total 107 100,0

Em relação ao tempo livre de doença, dos 80 doentes submetidos à operação com intenção curativa com seguimento completo, 10 (12,5%) deles evoluíram com recidiva (Tabela 14). Destes doentes quatro apresentaram recidiva apenas local, quatro apresentaram recidiva local e à distância e dois apenas recidiva à distância. O local mais frequente de recidiva à distância foi o fígado, seguido dos pulmões.

Tabela 14. Distribuição do tempo livre de doença nos enfermos operados com intenção curativa, com recidiva do carcinoma colorretal e submetidos a reoperação

Tempo N° % 7 a 12 meses 3 30,0 13 a 24 meses 2 20,0 25 a 36 meses 2 20,0 > 37 meses 3 30,0 Total 10 100,0

A média do tempo de seguimento dos doentes operados por carcinoma colorretal foi de 25,4 meses (1 a 47,3 meses). Em relação aos doentes tratados com intenção curativa, a média de seguimento foi de 36,4 meses (1 a 47,3 meses).

4.2 Descrição das variáveis imuno-histoquímicas

4.2.1 Avaliação da Imunoexpressão de NM 23 e CD 10 no tecido tumoral colorretal

Os casos discordantes entre a avaliação por dois patologistas da imunoexpressão corresponderam a menos de 10% da amostra e foram reclassificados por comum acordo. Não houve discordância entre os patologistas a respeito dos aspectos anatomopatológicos macroscópicos e microscópicos do carcinoma colorretal.

A análise imuno-histoquímica dos tecidos tumorais para os marcadores NM 23 e CD 10 revelou perda de aproximadamente 20% da amostra (Tabelas 15 e 16).

Tabela 15. Índices de imunoexpressão do marcador NM23 no tecido tumoral colorretal

Índices N° %

0 - 2 11 11,8

3 82 88,2

Total 93 100,0

Tabela 16. Índices de imunoexpressão do marcador CD10 no tecido tumoral colorretal

Índice N° %

0 59 59

1-3 41 41

4.2.2 Avaliação da intensidade de coloração e do percentual de células coradas pelos marcadores CD10 e NM23 no tecido do carcinoma colorretal

A relação entre a intensidade da coloração e o número de células coradas pelo marcador CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi significante (p<0,001) (Figura 10).

Figura 10. Relação do percentual e da intensidade de células coradas para CD10 no tecido do carcinoma colorretal.

0 1 2 3 0 1 2 3 % P<0,0001 r=0,9487 Escore de intensidade Esco re n o . d e célu las p o sitivas

A relação entre a intensidade da coloração e o número de células coradas pelo marcador NM23 no tecido do carcinoma colorretal foi significante (p<0,001) (Figura 11).

Figura 11. Relação do percentual e da intensidade de células coradas para o marcador NM23 no tecido do carcinoma colorretal.

0 1 2 3 0 1 2 3 % P<0,0001 r=0,4243 Escore de intensidade Esco re n o . d e célu las p o sitivas

4.2.3 Expressão dos marcadores CD10 e NM23 no tecido do carcinoma colorretal e na mucosa não neoplásica

A expressão do marcador NM23 no tecido tumoral foi significantemente maior (p<0,0001) do que na mucosa colorretal não neoplásica. Do mesmo modo, a expressão de CD10 também foi significantemente maior (p<0,0001) no tecido do carcinoma colorretal do que na mucosa não neoplásica (Figuras 12 e 13).

N= 109 N=96

Figura 12. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 no carcinoma colorretal e na mucosa não neoplásica.

NM23 Tumor NM23 Mucosa 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 P<0,0001 Esco re NM 23

N=102 N=108

Figura 13. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 no tecido do carcinoma colorretal na mucosa não neoplásica colorretal.

CD10 Tumor CD10 Mucosa 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 P<0,0001 Esco re C D 10

4.2.4. Relação da expressão dos marcadores CD10 e NM23 com o local de acometimento no intestino grosso do carcinoma colorretal

A expressão dos marcadores tumorais CD10 e NM23 não apresentou diferença significante (p=0,79) em relação à sua localização no reto ou nas demais localizações no intestino grosso (Figuras 14 e 15).

. N=45 N=52

Figura 14. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador NM23 de acordo com a localização do carcinoma colorretal no intestino grosso.

RETO CÓLON 0 1 2 3 4 P=0,7956 Esco re NM 23

N= 38 N=53

Figura 15. Gráficos da intensidade da imunoexpressão do marcador CD10 de acordo com a localização do carcinoma colorretal no intestino grosso.

RETO CÓLON 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 P=0,6762 Esco re C D 10