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JULIANA ALVES DE CAMARGO
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO TOLL LIKE
RECEPTOR 2 (TLR2) NO DESENVOLVIMENTO DE
CÂNCER EM ANIMAIS OBESOS
Campinas 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JULIANA ALVES DE CAMARGO
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO TOLL LIKE
RECEPTOR 2 (TLR2) NO DESENVOLVIMENTO DE
CÂNCER EM ANIMAIS OBESOS
Orientador(a): Prof. Dr. José Barreto Campello Carvalheira
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA ALVES DE CAMARGO E ORIENTADA PELO PROFESSOR DR. JOSÉ BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA
Assinatura do Orientador
__________________________________
Campinas 2014
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de pós-graduação em
Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do titulo de Mestra em Ciências.
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v DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Gerson e Sandra Lúcia e às minhas irmãs Alessandra e Carolina.
vi AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Professor José Barreto Campello Carvalheira, pela sua orientação, exemplo profissional e dedicação. Agradeço pela oportunidade, pelo voto de confiança dado a mim e ao meu trabalho.
Ao Prof. Dr. Mário Saad, que permitiu a utilização de seu laboratório, pelo grande exemplo de liderança e pelo conhecimento transmitido,
Ao Prof. Dr. Lício Velloso, por sempre se mostrar solícito, colaborando junto ao seu laboratório, sempre que necessário.
Aos amigos, colegas e funcionários do Laboratório de Oncologia Molecular, LICRI e LABMEX pela ajuda, por estarem ao meu lado durante esses anos e pelo aprendizado.
Aos meus amigos e Professores da Faculdade de Americana, agradeço pelos momentos juntos de aprendizagem e experiências, horas e horas de estudo e também as inesquecíveis alegrias. Agradeço, em especial, aos Professores, pelo apoio e incentivo à pesquisa.
À minha família, meu norte, minha base, minha vida. Agradeço aos meus pais Sandra e Gerson e minhas irmãs Alessandra e Carolina pela educação e pelo exemplo. Sem vocês nada seria possível. Agradeço por aceitarem, entenderem e apoiarem a minha escolha profissional. Obrigada por estarem junto comigo, mesmo de longe, em cada segundo da minha vida.
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Às agências de fomento, Fundação de amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico – CNPQ e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia – INCT de Obesidade e Diabetes, pela bolsa de estudo concedida e financiamento das pesquisas que permitiram o desenvolvimento deste trabalho.
viii LISTA DE ABREVIATURAS
Akt/PKB Proteína quinase B
AOM Azoximetano
AP-1 Proteína de ativação - 1
ASO Antisense
CD células dendríticas
CTL controle
DAB diaminobenzidina
DIO Diet induced obesity (Obesidade induzida por dieta)
DMBA 7,12-dimetillbenz(a)anthraceno
DNA Ácido desoxirribonucleico
DSS Dextran-sulfato de sódio
DTT ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
HBSS Hank’s buffered salt solution
IGF-1 Fator de crescimento análogo à insulina 1
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IKK Inhibitor of IκB Kinase (Complexo de quinases que ativam o NF-κB)
IKKα Inhibitor of IκB Kinaseα
IKKβ Inhibitor of IκB Kinaseβ
IL-1β Interleucina-1β
IL-6 Interleucina -6
INCA Instituto Nacional do Câncer
IP Imunoprecipitado
IR Receptor de insulina
IRAK Interleukin-1 receptor-associated kinase
ITT Teste de tolerância a insulina
JNK Quinase da c-Jun
MAPK8 Proteína quinase ativadora de mitose
mTOR Proteína alvo da rapamicina em mamíferos
MyDD88 diferenciação mielóide resposta primária 88
NF-KB Fator de transcrição nuclear factor kappa B
NK células natural killer
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PAMPs padrões moleculares associados a patógenos
PBS Tampão fosfato salino
PMSF fenilmetilsulfonilfluoreto
SD Sprague Dawley
SDS-PAGE Dodecil sulfato de poliacrilamida
STAT-3 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3
TIR receptor de interleucina 1, chamado Toll/Il-1 recetor
TLR2 Toll like receptor2
TLR4 Toll like receptor4
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa
WINS The Women´s Intervention Study (estudo de intervenção nutricional das mulheres)
xi LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das dietas padrão e hiperlipídica
Tabela 2. Caracterização de Ratas SD alimentadas com ração padrão (SD CTL) e dieta hiperlipídica (SD DIO)
Tabela 3. Caracterização de camundongos fêmea C57BL/6 e knockouts para TLR2 alimentadas com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO).
Tabela 4. Caracterização de camundongos machos C57BL/6 e knockouts para TLR2 alimentados com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO)
xii LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tipos de inflamação na tumorigênese.
Figura 2. Via de sinalização do TLR2.
Figura 3. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em camundongo.
Figura 4. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em ratas.
Figura 5. Esquema do modelo de indução de câncer de cólon em camundongos.
Figura 6. Caracterização de ratas Sprague Dawley após tratamento com DMBA e dieta hiperlipídica.
Figura 7. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 8. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 9. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) em ratas Sprague Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA .
Figura 10. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
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Figura 11. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 12. Dose resposta do zymosan de ratas em ração padrão.
Figura 13. Caracterização da ativação do TLR2 pelo agonista Zymosan (ZY) em ratas Sprague Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA.
Figura 14. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 15. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 16. Caracterização de Camundongos fêmea knockouts para TLR2 e C57BL6 após tratamento com DMBA e dieta hiperlipídica.
Figura 17. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e anexo cutâneo de camundongos fêmea tratadas com DMBA.
Figura 18. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e anexo cutâneo de camundongos fêmea tratadas com DMBA.
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Figura 19. Caracterização inflamatória do cólon e tecido adiposo em camundongos TLR2-/- e C57BL6 em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO) tratados com AOM + 3 doses de DSS.
Figura 20. Atividade das proteínas da via de sinalização inflamatória (A) e de crescimento celular (B) no cólon de camundongos tratados com AOM + 3 doses de DSS.
Figura 21. Caracterização dos animais TLR-/- em ração padrão e dieta hiperlipídica tratados com AOM + 3 doses de DSS.
Figura 22. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) dos animais NODSCID em ração padrão e dieta com inoculação de célula HT-29.
Figura 23. Caracterização da ativação do TLR2 utilizando o agonista Zymosan nos animais NODSCID em ração padrão e dieta com inoculação de célula HT-29.
xv RESUMO
Dentre as doenças com a maior incidência de morte em países ocidentais, destacam-se a obesidade e o câncer, e hoje pode-se dizer que estão fortemente interligadas. Estudos mostraram uma forte associação entre obesidade e câncer de cólon e de mama, sendo que quanto maior a adiposidade, pior é o prognóstico para estas doenças. Entretanto, as razões pelas quais a obesidade eleva o risco destes tipos de câncer ainda não foram completamente elucidadas. Algumas hipóteses foram levantadas, entre elas a associação da adiposidade com a resposta inflamatória subclínica, onde o excesso de tecido adiposo resulta em altos níveis de citocinas inflamatórias, contribuindo para a iniciação e progressão do câncer. Especificamente, a inflamação gerada pela adiposidade apresenta como cerne de sua patogênese a ativação de proteínas inflamatórias, como JNK e IKK. Estas proteínas ativam fatores de transcrição, como NF-kB, Stat-3 e AP-1 que controlam a expressão de genes pró-inflamatórios como o TNF e a IL-6. Recentemente, demonstrou-se a participação do TNFa, como sendo uma molécula importante na promoção de tumores de cólon em animais obesos. Neste estudo avaliamos o papel do TLR2 - um receptor com a função já estabelecida na gênese da inflamação subclínica encontrada na obesidade, no câncer de cólon e de mama mediados pela obesidade. Nossos resultados demonstram que a redução da atividade do TLR2 protege os roedores do desenvolvimento de câncer de mama, cólon e pele. Á semelhança dos animais controle, os animais submetidos à dieta hiperlipídica também apresentaram atenuação do
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desenvolvimento de câncer. Mecanisticamente, a inibição do TLR2 reduz a atividade de IKK e protege do desenvolvimento de câncer por meio da repressão da liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF. Assim, neste trabalho demonstramos que o TLR2 é crucial para o desenvolvimento de diferentes tipos de câncer, tanto em animais controle como submetidos à dieta hiperlipídica.
xvii ABSTRACT
Among the diseases with the highest incidence of death in American countries, obesity and cancer are very important, and today we can say that these are connected. Studies have shown a strong association between obesity and some types of cancer, such as colon and breast cancer. Higher adiposity result in the worse prognosis for these diseases. However, the reasons why obesity increase the risk of these cancers have not been completely elucidated. Several hypotheses have been raised, including the association of adiposity with subclinical inflammatory response, in which excess of adipose tissue results in high levels of inflammatory cytokines, contributing to the initiation and progression of cancer. The inflammation generated by adiposity stimulates the activation of inflammatory proteins such as JNK and IKK. These proteins activate transcription factors such as NF-kB, Stat-3 and AP-1, that control the expression of pro-inflammatory genes such as TNF and IL-6. Recently our group demonstrated that the TNFa is an important molecule in the promotion of colon tumors in obese animals. We evaluated in this study the role of TLR2, as receptor that is already established the role in the genesis of subclinical inflammation found in obesity, colon and breast cancer mediated by obesity. Our results demonstrated that the reduction of TLR2 activity protects the animals from development of breast, colon, and skin cancer. Interestingly, like the animal control, animals in high fat diet also showed attenuation of the development of cancer. Mechanistically, inhibition of TLR2 reduces the activity of IKK and protects the development of cancer through
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repression of the release of IL-6 and TNF pro-inflammatory cytokines. Accordingly, this study demonstrated that TLR2 is crucial for the development of different types of cancer in both animals control and fed with high fat diet.
xix SUMÁRIO Pág. RESUMO XV 1- INTRODUÇÃO 21 1.1 Obesidade e Câncer 22
1.2 Obesidade, Resistência a Insulina e Câncer 24
1.3 Câncer e Inflamação 25
1.3.1 Inflamação e Câncer de Mama 27
1.3.2 Inflamação e Câncer de Cólon 28
1.3.3 Fatores Inflamatórios Associados ao Processo de Tumorigênese 29
1.4 A Via de Sinalização do Toll Like Recetor 2 30
2-OBJETIVOS 33 3- MATERIAIS E MÉTODOS 36 4- RESULTADOS 46 5- DISCUSSÃO 81 6- CONCLUSÃO 86 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88 ANEXO 95
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22 1. INTRODUÇÃO
1.1 Obesidade e Câncer
Obesidade pode ser definida como um estado de aumento de peso corpóreo, caracterizado pelo desequilíbrio entre o excesso de calorias consumidas e o gasto energético, em uma magnitude suficiente para gerar consequências adversas, como reduzir a qualidade de vida e aumentar o risco de doenças como diabetes tipo 2, hipertenção arterial, doenças coronarianas, hipercolesterolemia, esteatose hepática e diversos tipos de câncer. (Spiegelman and Flier 2001);(Calle, Rodriguez et al. 2003); (Singla, Bardoloi et al. 2010).
Estudos apontam que 68 % dos adultos nos EUA, hoje, com idade acima de 20 anos estão com sobrepeso ou são obesos, sendo que de 1988-1994, apenas 56 % dos adultos com idade acima de 20 anos estavam com sobrepeso ou obesidade (Ballard-Barbash, Hunsberger et al. 2009). O impacto que tem o excesso de peso sobre o risco de câncer, incidência e mortalidade vem sendo estudado. As estimativas apontam para aproximadamente 30% de casos de câncer em obesos nos países ocidentais. Em consonância, estudos epidemiológicos predizem que a obesidade poderá levar a cerca de 500 000 casos de câncer nos Estados Unidos até 2030 (Wang, McPherson et al. 2011). Estimativas apontam que a redução dos níveis de obesidade no Brasil pode evitar 19% dos casos de câncer (INCA, 2010).
Dados históricos revelam que nos últimos 25 anos a obesidade pode ter sido a causa de aproximadamente 14% de morte por câncer em homens e 20% de morte por câncer em mulheres.Especificamente a obesidade é considerada o principal agente causador de aproximadamente 11% dos casos de câncer de cólon, 9% de câncer de mama na
pós-23
menopausa, 39% dos casos de câncer endometrial, 25% dos casos de câncer de rim e 37% dos casos de câncer de esôfago. Além disso, dados revelam que a obesidade pode estar relacionada à mortalidade por câncer de fígado, câncer de pâncreas, linfoma não-Hodgkin, próstata, estômago, tireoide e mieloma (Wolin, Carson et al. 2010).
Além do aumento da incidência, o sobrepeso e obesidade estão correlacionados com o aumento do risco da recorrência do câncer de mama e da diminuição da sobrevida de pacientes portadores do mesmo (Vainio, Kaaks et al. 2002); (Caan, Kwan et al. 2008). Interessantemente, o estudo de intervenção nutricional das mulheres, The Women´s Intervention Study (WINS) mostrou que a redução de 22% do consumo de gordura na dieta pode reduzir em 24% o risco de câncer. (Chlebowski, Blackburn et al. 2006). De modo semelhante, o consumo da típica dieta "ocidental" entre os sobreviventes de câncer colorretal tem sido associada a um aumento de 3,5 vezes o risco de recidiva da doença (Meyerhardt, Niedzwiecki et al. 2007)
Alguns mecanismos foram descritos, explicando a possível associação entre a adiposidade e o aumento do risco de câncer, como por exemplo, o câncer de mama na pós-menopausa, o qual pode ser fortemente associado à obesidade pelo aumento dos níveis de estradiol (Key, Appleby et al. 2003); (Missmer, Eliassen et al. 2004). Outro fator considerado importante no desenvolvimento do câncer mediado pela obesidade é a produção de adipocinas, como a leptina, que está presente em maior concentração nos obesos, promovendo o crescimento celular,ao passo que a adiponectina, que é menos abundante em pessoas obesas, pode ter efeitos anti-proliferativos (Roberts, Dive et al. 2010). Outro mecanismo descrito é que o aumento da adiposidade apresenta efeitos diretos e indiretos sobre outros reguladores de
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crescimento de tumores, incluindo a proteína mTOR, a qual possui uma atividade essencial nesse contexto (Laplante and Sabatini 2012).
1.2 Obesidade, Resistência a Insulina e Câncer
O tecido adiposo é importante na regulação do balanço energético e metabolismo lipídico através da liberação de hormônios, como a leptina, adiponectina, resistina e o fator de necrose tumoral (TNF). O aumento da liberação de ácidos graxos livres, resistina e TNF pelo tecido adiposo e liberação reduzida de adiponectina estão envolvidos diretamente na gênese da resistência à insulina, um estado metabólico caracterizado pela redução da ativação da via de sinalização da insulina de tecidos como músculo, fígado e tecido adiposo, bem como hiperinsulinemia compensatória (Reaven 1988, Wajchenberg 2000). O excesso de peso, baixos níveis de atividade física e alguns fatores dietéticos podem elevar as concentrações circulantes de insulina. Estudos sugerem que cronicamente aumentados, os níveis de insulina podem ser associados a alguns modelos tumorais, com o câncer de cólon, câncer de mama, pâncreas e endométrio (Weiderpass, Partanen et al. 1998). Primeiramente estes efeitos pró-tumorigênicos provenientes do aumento de insulina poderiam ser diretamente mediados por ativação de receptores IGF-1 nas células alvo pré-neoplásicas. Neste sentido, a insulina promove a ativação de IGF-1R, receptor que tem uma estrutura molecular bastante semelhante ao do IR e está envolvido na regulação da proliferação celular. Desta maneira, elevados níveis circulantes de insulina, provenientes do excesso de peso, poderiam estimular o crescimento de alguns tumores e inibir a morte celular (Shafie and Grantham 1981).
Recentemente, foi demonstrada uma forte associação entre inflamação subclínica da obesidade e carcinogênese (Park, Lee et al. 2010). O entendimento atual é que o principal
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mecanismo envolvido na obesogênese é também um dos fatores essenciais na tumorigênese mediada pela obesidade, ou seja, foram publicados alguns trabalhos mostrando que a inflamação subclínica proveniente do excesso de tecido adiposo gera uma infiltração de células inflamatórias, como macrófagos. Estas células, juntamente com os adipócitos, secretam citocinas inflamatórias, que são essenciais na tumorigênese (Grivennikov and Karin 2010);(Grivennikov, Greten et al. 2010);(Bromberg and Wang 2009). Esse processo se dá pelo fato de que a adiposidade está fortemente associada ao estado inflamatório crônico de baixo grau.
1.3 Câncer e Inflamação
No século 19, Rudolf Virchow mostrou as primeiras evidências da presença de células inflamatórias em tumores, sugerindo uma possível associação entre inflamação e câncer. Entretanto, este assunto não foi explorado naquela época. Recentemente esse processo foi novamente investigado, indicando que a inflamação possui um papel crítico na carcinogênese (Figura1) (Karin 2006).
O microambiente inflamatório é um componente essencial para a progressão dos tumores (Mantovani, Allavena et al. 2008). Apenas uma minoria de todos os cânceres é causada por mutações germinativas, sendo que a vasta maioria (90%) está relacionada a mutações somáticas e fatores ambientais. Muitas causas ambientais e fatores de risco para cânceres em geral estão associadas a alguma forma de inflamação crônica. Mais de 20% dos cânceres estão relacionados a infecções; 30% podem ser atribuídos ao tabaco e poluentes inalados e 35% estão possivelmente atribuídos a fatores dietéticos; (20% dos cânceres estão ligados à obesidade (Aggarwal, Vijayalekshmi et al. 2009).
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Como pode ser observado na Figura 1, a inflamação é um dos fatores ambientais mais importantes para a carcinogênese (Grivennikov, Greten et al. 2010).
Figura 1. Tipos de inflamação na tumorigênese e Câncer A
inflamação crônica associada à infecção ou doença autoimune precede o desenvolvimento do tumor e pode contribuir para isso através da indução de mutações oncogênicas, instabilidade genômica, promoção tumor e precoce e aumento da angiogênese. A exposição prolongada a irritações ambientais, bem como a obesidade também podem resultar em baixo grau de inflamação crônica que precede o desenvolvimento do tumor. Pode-se dizer que a inflamação caminha de mãos dadas com o dePode-senvolvimento do tumor. Esta resposta inflamatória pode contribuir com a neoangiogênese, promover a progressão tumoral e disseminação metastática, causando imunossupressão local, e aumenta ainda mais a instabilidade genômica. A terapia contra o câncer também pode desencadear uma resposta inflamatória causando trauma, necrose e injúria tecidual, que estimula a re-emergência e resistência à terapia. Entretanto, em alguns casos a inflamação induzida pela terapia pode aumentar a apresentação de antígenos, levando à erradicação do tumor, mediada pelo sistema imune. Adaptado de Grivenikov et al 2010.
Como resultado destas diferentes formas de inflamação, o microambiente tumoral contém células da imunidade inata (incluindo macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e células NK) e do sistema imune adaptativo (linfócitos B e T) além de células tumorais e o estroma
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circunjacente (o qual consiste de fibroblastos, células endoteliais e células mesenquimais) (de Visser, Eichten et al. 2006). Essas diversas células se comunicam por meio de contato direto e também pela produção de citocinas e quimiocinas, que atuam no sistema de crescimento tumoral. Esta é a expressão de vários mediadores e moduladores imunológicos, que estão ativados no microambiente tumoral (Karin 2007); (Smyth, Dunn et al. 2006).
As células do sistema imunológico mais frequentes no microambiente tumoral são os macrófagos associados a tumores e células T. Os macrófagos, principalmente, promovem o crescimento tumoral e possivelmente angiogênese, invasão e metástases (Condeelis and Pollard 2006). Consequentemente, grandes concentrações de macrófagos podem estar relacionados a um pior prognóstico (Murdoch, Muthana et al. 2008).
1.3.1 Inflamação e câncer de mama
A Associação entre obesidade e o risco para o desenvolvimento do câncer de mama é dependente dos períodos pré e pós-menopausa. Há uma evidência consistente para esta associação em mulheres na pós-menopausa (Brodie, Lu et al. 2001). O efeito negativo da obesidade no prognóstico do câncer de mama pode ser explicado pelo efeito biológico da adiposidade, onde estão presentes maiores concentrações de estradiol, demonstrando um maior risco para o desenvolvimento de câncer de mama. Outro hormônio que também já foi associado ao câncer de mama é a leptina, a qual também está em altas concentrações em mulheres obesas (Surmacz 2007).
Além disso, estudos mostraram que a obesidade e o excesso de peso podem levar a um estado inflamatório no tecido mamário, em camundongos e humanos, tendo um acúmulo de células inflamatórias, principalmente macrófagos, os quais secretam citocinas
pró-28
inflamatórias entre outros hormônios (Maccio and Madeddu 2011). Em conjunto, esses dados sugerem que a inflamação pode aumentar o risco de câncer de mama em mulheres com sobrepeso no período de pós-menopausa (Rose and Vona-Davis 2013).
1.3.2 Inflamação e câncer de cólon
Somente cerca de 20% dos casos de câncer de cólon são provenientes de histórico familiar (Rustgi 2007). No entanto, a maior fração desses tumores foi associado a condições ambientais e não alterações genéticas. Os fatores de risco incluem ambientais e mutagênicos de origem alimentar, patógenos e inflamação intestinal crônica, que precede o desenvolvimento do tumor. Câncer de cólon associado à colite é o subtipo de câncer que está associado à doença inflamatória do intestino, onde há um infiltrado de células imunes. As células do sistema imune inato, tal como neutrófilos, mastócitos, células natural killer (NK), células dendríticas (CD) e macrófagos associados a tumores podem ser facilmente detectadas nestes tumores. Além disso, tumores avançados podem recrutar subconjuntos mieloides específicos, que ajudam a suprimir o efeito antitumoral da resposta imunológica e favorece a angiogênese. (Gabrilovich and Nagaraj 2009). Por outro lado, células do sistema imune adaptativo também são recrutadas para o microambiente tumoral, onde podem exercer um papel anti-tumorigênico, como as células T, por exemplo, que apresentam um mecanismo de “imunovigilância”. Esse processo se da pelo fato de que durante a metástase, quando um pequeno número ou células metastáticas individuais se deslocam, podem ser atacados por células imunes antitumorais, como as células T, que geralmente estão associadas a um bom prognóstico de câncer de cólon (Guidoboni, Gafa et al. 2001).
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A inflamação subclínica mediada pela obesidade, onde há um infiltrado de células do sistema imune inato, pode ser um forte indutor de câncer de cólon. Já se sabe que a produção de TNFα está aumentada nesses casos. Recentemente foi descrito que essas proteínas e vias de sinalização inflamatórias também estão associadas à carcinogênese do cólon (Terzic, Grivennikov et al. 2010).
1.3.3 Fatores inflamatórios associados ao processo de tumorigênese
Proteínas intracelulares tais como JNK e IKK, que transmitem o sinal inflamatório na imunidade inata, controlam a expressão de genes pró-inflamatórios, o que induz à ativação de células como neutrófilos, células NK, células endoteliais, e também ao processo de angiogênese, motilidade, migração e proliferação celular. Estes fatores estão associados ao processo de tumorigênese e desenvolvimento metastático, associado a um pior prognóstico em diversos tipos de câncer (Popovic, DeMarco et al. 2006);(Ito, DeMarco et al. 2007) Existem fatores de transcrição, como NF-Kb, STAT3 e AP1, que são ativados pelas proteínas JNK, IKK entre outras. Esses fatores induzem a expressão de genes, que são responsáveis pelo aumento de citocinas inflamatórias, como IL-6, TNFα, IL-1β, etc (Grivennikov, Greten et al. 2010);(Karin 2006). Recentemente o nosso grupo demonstrou que o aumento do TNF-α, mediado pela obesidade, está envolvido na carcinogênese (Flores, Rocha et al. 2012)
Por outro lado, alguns trabalhos mostram que o Toll Like Receptor 2 (TLR2) também atua neste contexto inflamatório. Foi observado em células mieloides, que o TLR2 aumenta o TNFα, que age como indutor de metástase no carcinoma de pulmão. Mecanisticamente, as células tumorais apresentam aumento de proliferação através do NF-kB e redução da apoptose (Luo, Maeda et al. 2004).
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1.4 A via de sinalização do Toll Like Receptor 2
Toll-like receptors (TLRs) são amplamente distribuídos em células do sistema imunológico e caracterizados como sensores imunológicos de patógenos invasores. As vias de sinalização são desencadeadas pela detecção desses patógenos, iniciando a resposta imune inata (Xie, Wang et al. 2009).
Os TLRs são reconhecidos por detectar padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) incluindo vírus, bactérias, fungos e parasitas (Liew, Xu et al. 2005). Atualmente foram identificados 11 receptores da família dos TLRs com a característica de possuírem um domínio extracelular, constituindo múltiplas repetições ricas em leucina, um domínio transmembrana e um domínio intracelular (Akira and Sato 2003).
A sinalização do TLR2 é iniciada com a ligação do receptor a ácidos graxos, particularmente saturados. As subunidades do TLR se associam, levando à formação de um complexo da região de interação Toll com proteínas adaptadoras da família MyD88, caracterizada como um componente essencial para a ativação da imunidade inata em todos os TLRs (Figura 2). Esta proteína é recrutada para o receptor através do domínio TIR, proteína que tem similaridade com o receptor de interleucina 1, chamado Toll/Il-1 recetor (TIR) o qual interage com o receptor TLR. Quando estimulada, a MyD88 se associa ao IRAK, identificada como uma serina/threonina kinase associada ao receptor de Il-1.
Existem quatro membros da família de IRAK identificados como IRAK1, IRAK2, IRAKM e IRAK4. Essas proteínas consistem em um domínio N-terminal, responsável pela interação com a MyD88 e um domínio central kinase. O IRAK4, então, fosforila o IRAK1. Quando o IRAK 1 é fosforilado, é ativado e associado ao TRAF6, que se dissocia do receptor e interage com o TAK1, TAB1 E TAB2. Este complexo se associa a Ubc13 e Uev1A, o qual induz ativação de TAK1. A TAK1 ativada, fosforila o complexo IKK, constituído de IKKα, IKKβ, e
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NEMO/IKKY, levando à ativação de duas vias de sinalização distintas, com a finalidade de ativar JNK e NF-kB- um fator de transcrição que estimula a expressão de genes- alvos responsáveis por estimular a liberação de citocinas inflamatórias (Figura2) (Takeda and Akira 2004); (Liew, Xu et al. 2005)
Estudos recentes identificaram certos receptores de TLRs em células que não são do sistema imune, como por exemplo o TLR2, encontrado em células tronco com o papel de controlar a diferenciação celular, e o TLR4 em adipócitos, relacionado à resistência à insulina (Xie, Wang et al. 2009). Novas evidências têm mostrado que os TLRs estão presentes em algumas células tumorais de camundongos. Por exemplo, o TLR4 em tumor de cólon, facilita a evasão de vigilância imune. A ativação do TLR2 promove o crescimento tumoral no fígado, via IL-6.
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Recentemente, o nosso grupo descreveu a inibição da expressão do TLR2, que diminui a ativação de IKK e MAPK8. Porém, aumenta a ativação de JNK e a resistência à insulina em camundongos, indicando que o TLR2 pode ser um modulador chave na inflamação e vias metabólicas (Caricilli, Picardi et al. 2011). Entretanto, a função do TLR2 na carcinogênese mediada pela obesidade é desconhecida.
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34 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar o efeito da inibição do TLR2 no desenvolvimento de tumores em animais controles e obesos.
2.2 Objetivos específicos
Verificar a incidência e número de tumores de mama e investigar a via de sinalização do TLR2 e de proliferação em ratas Sprague Dawley, com obesidade induzida por dieta hiperlipídica.
Investigar o efeito da inibição do TLR2 no desenvolvimento de câncer de mama em ratas Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
Investigar o efeito da ativação do TLR2 no desenvolvimento de câncer de mama em ratas Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
Verificar a incidência e número de tumores de pele em camundongos fêmea C57/BL6 e knockout para TLR2 submetidos a dieta hiperlipídica e investigar a ativação de proteínas da via de sinalização do TLR2 e de proliferação celular.
Verificar a incidência e número de tumores de cólon em camundongos machos C57/BL6 e knockout para TLR2 submetidos a dieta hiperlipídica e investigar a ativação de proteínas da via de sinalização do TLR2 e de proliferação celular.
Investigar o efeito da inibição de TLR2 no crescimento de células tumorais de câncer de cólon HT-29 em camundongos NODSCID com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
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Investigar o efeito da inibição de TLR2 no crescimento de células tumorais de câncer de cólon HT-29 em camundongos NODSCID controle
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37 3. MATERIAS E MÉTODOS
3.1 Animais
Os camundongos knockout para TLR2, seus controles C57BL6 , ratos fêmeas Sprague Dawley e camundongos NOD.CB17-Prkdcscid/JUnib com 8 semanas de vida foram divididos em 2 grupos, sendo um grupo submetido à obesidade induzida por dieta hiperlipídica e outro grupo com dieta padrão. Todos os animais foram obtidos do Centro de Bioterismo da Unicamp (CEMIB) e mantidos em condições de fotoperíodo (12 horas no claro e 12 horas no escuro). A temperatura do biotério foi mantida entre 21-23°C. Os animais foram mantidos em gaiolas com maravalha, sendo 5 animais por gaiola.
3.2 Materiais
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Oncologia Molecular e no Laboratório de Investigação Clínica de Resistência a Insulina no período de 08/2011 – 08/2014. Os reagentes e os aparelhos para gel de dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) foram (Richmond CA). Foi utilizado TRIS-HCL, fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), aprotinina e ditiotreitol (DTT) comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A membrana de nitrocelulose (0,25mm) foi proveniente da Bio-Rad. Todos os anticorpos utilizados foram provenientes da Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA); Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Para indução de tumor de mama e de pele foi utilizado o 7,12-dimetillbenz(a)anthraceno (DMBA) da Sigma Chemical Co. As ratas foram tratadas com oligonucleotídeo inibidor do TLR2, cujas sequências são: antisense (5´- GCA GGG AAT AGA GGT 3´) e sense (5´- ACC TCT ATT CCC TGC 3´) por 30 dias, com injeções intraperitoneais de 8 nmol. Foi utilizado o Zymosan, agonista do TLR2 na dose crônica de
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2,5mg/kg durante todo o experimento. Para indução de tumor de cólon, foi utilizado o carcinógeno Azoximetano (AOM) (12,5mg/kg) e Dextran-sulfato de sódio (DSS) a 2,5%. Em animais NODSCID foi feito o xenoenxerto com inoculação de 1x106 células da linhagem celular HT-29 para câncer de cólon. Esses animais foram tratados com oligonucleotídeo inibidor do TLR2, cujas sequências são: antisense (5´-GAG CTC GCA TCC TCT-3´) e sense (5´-GCT CTA TGA CTC CCA G-3´) por 30 dias, com injeções intraperitoneais de 4 nmol.
3.3 Dietas
As composições das dietas padrão e hiperlipídica estão descritas na tabela abaixo.
Tabela 1. Composição das dietas padrão e hiperlipídica
Ingredientes Ração padrão (g/kg) Kcal/kg Dieta hiperlipídica Kcal/kg Kcal/kg
Amido de milho 397,5 1590 115,5 462 Caseina 200 800 200 800 Açúcar 100 400 100 400 Amido dextrinizado 132 528 132 528 Gordura saturada - - 312 2808 Óleo de soja 70 630 40 360 Celulose 50 - 50 - Mistura de minerais 35 - 35 - Mistura de vitaminas 10 - 10 - L-Cystina 3 - 3 - Colina 2,5 - 2,5 -
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3.4 Protocolo para indução de tumor de mama em Camundongos fêmea.
O DMBA dissolvido em óleo de soja foi administrado em 5 doses, por gavagem, na concentração de 1mg/dose por animal após 5 semanas de nascimento (Blanco-Aparicio, Perez-Gallego et al. 2007). Os animais foram sacrificados 26 semanas após o tratamento (Figura 3).
Figura 3. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em camundongo
3.5 Protocolo para indução de tumor de mama em ratos fêmea
O DMBA dissolvido em óleo de soja foi administrado em uma dose, por gavagem, na concentração de 100mg/kg por animal após 16 semanas de nascimento (Barros, Muranaka et al. 2004). Os animais foram sacrificados 12 semanas após o tratamento (Figura 4).
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Figura 4. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em ratas
3.6 Protocolo para indução de tumor de cólon em Camundongos macho.
Animais C57 e TLR2-/- foram mantidos em dieta controle (proteína, 20%; carboidrato, 70%; lipídio,10%) ou em dieta hiperlipídica (proteína,20%; carboidrato, 35%; lipídio, 45%). O Azoximetano (AOM) (12,5 mg/kg) foi injetado intraperitonealmente nos dois grupos após 8 semanas de tratamento com dieta hiperlipídica ou controle. Uma semana após a aplicação do AOM os animais receberam o tratamento com dextran-sulfato de sódio (DSS) a 2,5% na água a eles oferecida aos animais por cinco dias. O tratamento com DSS foi repetido mais duas vezes, na quinta e oitava semanas após o tratamento com AOM(Popivanova, Kitamura et al. 2008). Os animais foram sacrificados 10 dias após o último tratamento com DSS (Figura 5).
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Figura 5. Esquema do modelo de indução de câncer de cólon em camundongos
3.7 Protocolo de extração de tecidos
Os animais foram sacrificados com uma overdose de anestésico Tiopental sódico Thiopentax, da Cristália, 40mg/kg diluído em soro fisiológico, assegurando-se a eutanásia através da avaliação da perda dos reflexos da perna e córnea. Foi coletado aproximadamente 800µl de sangue para as dosagens séricas por Elisa. Foi feita a avaliação macroscópica dos tecidos, os quais foram extraídos e encaminhados aos procedimentos de western blotting e análise histopatológica, como descrito abaixo.
3.8 Protocolos de Extração e análise protéica por immunoblotting
Os tecidos extraídos dos animais foram embebidos em tampão de extração (1% Triton X-100, 100 mM Tris (pH 7.4), 100 mM pirofosfato de sódio, 100 mM fluoreto de sódio, 10 mM EDTA, 10 Mm vanadato de sódio, 2 mM fluoreto de fenilmetanossulfonila e 0.1 mg/ml aprotinina) e homogeneizado com Politron PTA 20S Generator, Brinkmann Instruments model PT 10/35, ajustado à velocidade máxima. Foi feita a centrifugação do material extraído em microcentrífuga refrigerada a 4ºC (Bioanalytical) a 12.000 rpm por 40 minutos; parte do sobrenadante foi utilizada para determinação da concentração de proteínas por fragmento de tecido extraído e outra para aplicação de SDS-PAGE.
Foi utilizado o método fotocolorimétrico do reagente biureto (Bradford, M.M., 1976) da Bio Rad para a determinação da concentração protéica.
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O sobrenadante das amostras obtidas foi aliquotado com tampão de Laemmli (Laemmli 1970) acrescido de DTT 200mM, numa proporção de 1:5 (400 µl do sobrenadante em 100 µl do tampão de Laemmli com DTT). Este material foi, então, fervido a 100ºC por 5 minutos e submetido à eletroforese gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). O gel foi balizado por marcador de alto peso molecular da Bio Rad. A eletroforese foi realizada em cuba de minigel da Bio Rad, com solução tampão para eletroforese previamente diluída. O SDS-PAGE sempre submetido a 30 volts inicialmente, até a passagem pela fase de empilhamento (stacking) e 100 volts até o final do gel de resolução (resolving).
A transferência das proteínas separadas no gel foi feita eletricamente para uma membrana de nitrocelulose, através de um aparelho também da Bio Rad por 90 minutos a 120 volts, como descrito por Towbin (Towbin, Staehelin et al. 1979).
As membranas com as proteínas transferidas foram incubadas em solução bloqueadora (leite desnatado Molico 5%, Tris 10mM, NaCl 150mM e Tween 20 0,02%) por duas horas a temperatura ambiente a fim de diminuir a ligação inespecífica dos anticorpos à membrana de nitrocelulose. Após lavadas em solução basal, estas membranas foram então incubadas com anticorpos específicos para as proteínas MyD88, IKKβ, IκB e JNK, mantidas a 4°C overnight sob agitação contínua. Após este procedimento as membranas foram outra vez lavadas com solução basal, durante quatro sessões de dez minutos cada. A seguir, as membranas foram submetidas à solução de quimioluminescência SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, da Pierce, por cerca de três minutos, sob agitação manual constante, sendo, posteriormente, expostas ao filme de RX (Eastman Kodak, Rochester, NY) com uso de intensificador (Cronex Lightning Plus intensifying screens – DuPont, Washington, DE) por cerca de vinte minutos. Após a primeira revelação, foi feita a avaliação da qualidade
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da imagem obtida, e, quando necessário, novas exposições ao filme de RX foram realizadas, em intervalos de tempos maiores ou menores do que o primeiro. As bandas identificadas nas autorradiografias, foram encaminhadas ao processo de leitura por densitometria óptica, quantificando suas áreas, utilizando-se, para isso, o software Scion. A partir de então foi realizada a análise dos dados, comparando-se o tecido do animal - controle com o outro em experimento, de maneira que sempre haverá controle intra-experimento.
3.9 Imunoprecipitação
Após a extração dos tecidos, as amostras foram centrifugadas por 45 minutos a 11 000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi preservado e a leitura proteica foi realizada através do método de Biureto. O volume das amostras foi normalizado por concentração proteica e as amostras foram incubadas com o anticorpo específico e permaneceram sob agitação contínua a 4ºC overnight. Foram adicionados 60 µl de proteína A-Sepharose 6MB para a precipitação do complexo proteína A anticorpo, mantida sob agitação por 2 horas. As amostras foram novamente centrifugadas por 15 minutos a 11.000 rpm a 4ºC e o sobrenadante foi descartado. Foi feita a lavagem do precipitado com o tampão específico para lavagem de imunoprecipitado 3 vezes (2mmol/l Ortovanadato de Sódio; 100mmol/l Trisma; 1mmol/l EDTA e 0,5% Triton X-100). Foi adicionado tampão de Laemmili com 100mM de DTT as proteínas precipitadas e aquecidas por 5 minutos. Foi feita a análise por immunoblotting.
3.10 Análise histopatológica
Os tumores foram ressecados durante a necrópsia, imersos overnight em paraformoldeído 4% para fixação. Em seguida, o material foi desidratado com diferentes
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concentrações de etanol (70%, 80% 95% e 100%, xilol e emblocado em parafina. O material foi cortado em micrótomo e fixado em lâminas de microscopia. As lâminas foram coradas com Hematoxilina e Eosina. Para análise de proliferação celular, através do kit Ki-67, as lâminas foram desparafinizadas com xilol e hidratadas com diferentes concentrações de etanol (100% - 70%). A recuperação antigênica do tecido foi realizada em forno microondas doméstico a 700W e foi distribuído nas lâminas imersas em um tampão de citrato a 0,01 mol/l e pH igual a 6, 9 minutos, com intervalo de 2 minutos entre as imersões. As lâminas foram mantidas em temperatura ambiente para resfriarem, antes de serem retiradas do forno microondas. Em seguida foi realizado o bloqueio com a peroxidade endógena (1% H2O2 em
metanol) por 15 minutos. Após o bloqueio com BSA 3%, o material foi incubado overnight, a 4 ºC com o anticorpo monoclonal de origem murina para Ki-67 clone MIB-1 anti-humano (Dako Cytomation). As lâminas foram então incubadas com o kit LSAB+ e complexadas com avidina-biotina (Dako Cytomation), por 30 minutos, seguido da adição de tetrahidrocloreto diaminobenzidina (DAB) (Sigma Aldrich) como uma solução de substrato cromógeno. Após coloração com hematoxilina e desidratação, as lâminas foram montadas em Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha). Os experimentos foram realizados pelo menos em triplicata para cada animal.
3.11 ELISA
Foi utilizado soro dos animais para detecção de citocinas inflamatórias, como Il-6 e TNF-α por ELISA através do kit da Millipore, St. Charles, MO, USA.
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3.12 Protocolo de separação de adipócito e estroma vascular
O tecido adiposo visceral foi fragmentado e embebido em tampão de Krebs (118mM NaCl; 4,7mM KCl; 1,2mM MgSO4; 1,25mM CaCl2; mM KH2PO4; 23mM NaHCO3; 11mM
Glicose). Foi adicionado colagenase tipo 2 (1mg/ml) em 10ml de tampão de Krebs. As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC por 30 min. O material foi passado por um filtro de 100µm. O sobrenadante foi separado do corpo de fundo e ambos foram lavados com tampão de Krebs. Tanto o sobrenadante quanto o corpo de fundo foram preservados e ressuspendidos em tampão para extração de proteínas.
3.13 Protocolo de isolamento de macrófagos do cólon
O cólon foi fragmentado e lavado com PBS 0,1M. Em seguida o tecido foi embebido em tampão HBSS (Hank’s buffered salt solution) e adicionado 1mM de EDTA e 1mM de DTT por 15 minutos a 37ºC. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado o meio de cultura RPMI com 0,02% de colagenase tipo 5 e mantido sob agitação por 30 minutos a 37ºC. O material foi passado por um filtro de 100µm e centrigugado a 1500rpm por 5 minutos a 4ºC. O corpo de fundo foi preservado e ressuspendido em tampão para extração de proteínas.
3.14 Análise estatística
Neste trabalho foram realisados os testes estatísticos Test T, One-way ANOVA e Kaplan-Meier. Projeto aprovado pelo Comitê de ética 2413-1
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47 4.0 RESULTADOS
4.1 O Efeito da obesidade induzida por dieta hiperlipídica em ratas Sprague Dawley tratadas com DMBA.
Primeiramente, avaliamos a importância da obesidade no processo de tumorigênese, especificamente adenocarcinoma de mama, em ratas tratadas com o carcinógeno DMBA. Os animais que foram alimentados com dieta hiperlipídica por um período de 2 meses, apresentaram um aumento significativo de tecido adiposo, que equivale a aproximadamente 20% da massa corporal em relação ao grupo controle (TABELA2). Observamos também um aumento na concentração de insulina no soro de animais com obesidade induzida por dieta hiperlipídica (TABELA2). Sendo assim, avaliamos os parâmetros inflamatórios destes animais e encontramos um aumento substancial nas concentrações séricas da citocina inflamatória IL-6 (TABELA2).
Tabela 2. Caracterização de Ratas SD alimentadas com ração padrão (SD CTL) e dieta hiperlipídica (SD DIO) SD CTL SD DIO Peso corporal (g) 261,5 ± 1,29 471 ± 1,28 Tecido adiposo ovariano (g) 3,71 ± 0,66 4,9 ± 0,28 Insulina (ng/ml) 0,23 ± 0,01 0,44 ± 0,05 Il-6 (ng/ml) 2,1 ± 2,0 7,25 ± 2,72 N=10 por grupo. P<0,05 em relação aos animais controle.
Em relação à tumorigênese, observamos que os animais tratados com o carcinógeno DMBA, desenvolveram neoplasia maligna composta principalmente por ductos neoformados, associada a um estroma desmoplásico. Além disso, observamos uma ligeira deposição de
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colágeno intersticial e discretos focos de necrose. Estas alterações são condizentes com carcinoma ductal (Figura 6A e B).
O grupo dos animais obesos induzidos por dieta hiperlipídica apresentou maior incidência tumoral e tendência a um aumento no número de tumores quando comparado ao grupo controle (Figura 6C e E). Em relação ao crescimento tumoral, nós não observamos diferença entre os grupos. Porém, os tumores dos animais obesos apresentaram um desenvolvimento mais precocemente. Sendo assim, sua sobrevida livre de tumor foi significativamente mais baixa (Figura 6D e F). Portanto, nossos dados sugerem que a obesidade pode estar associada à carcinogênese dos tumores de mama, agindo provavelmente nas fases de iniciação e promoção dos tumores.
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A
B
C
D
E
F
SD CTL SD DIO SD CTL SD DIO SD CTL SD DIO 0 20 40 60 80 100 In c id ê n c ia %Incidência Tumoral
Sobrevivência livre de tumor
Número de tumores SD CTL SD DIO 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Crescimento tumoral 60 80 100 0 2000 4000 6000 8000 SD HFD SD CTL
Dias depois do tratamento com DMBA
V o lu m e (m m ³)
*
0 50 100 150 70 80 90 100 110 SD CTL SD HFDDias depois do tratamento com DMBA
P o rc e n ta g e m d e s o b re v iv ê n c ia
*
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Figura 6. Caracterização de ratas Sprague Dawley após tratamento com DMBA e dieta hiperlipídica: (A) Análise macroscópica de tumores de mama de animais controle (SD CTL) e animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO). (B) Análise microscópica de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO) método de coloração com Hematoxilina e Eosina (HE). (C) Incidência tumoral de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO). (D) Sobrevivência livre de tumor de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO). (E) Número de tumores de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO). (F) Crescimento tumoral de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Tendo em vista esta associação entre obesidade e promoção tumoral, fomos investigar a atividade das proteínas da via de sinalização inflamatória pelo método de western blot, inicialmente no tecido e tumoral e mamário sem tumor dos animais obesos e controle. Fizemos um imunoprecipitado (IP) com o TLR2 e blotamos com a proteína MYD88. Obervamos uma maior interação entre essas proteínas nos animais obesos. Sendo assim, fomos investigar a ativação de outras proteínas desta via inflamatória e observamos um aumento da fosforilação das proteínas IKK e JNK em ambos os tecidos, nos animais com obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Observamos também um aumento da proteína IkBα total nos animais controle em relação aos animais obesos. Esses dados caracterizam um visível estado inflamatório nos animais obesos, quando comparados com os animais controle (Figura 7). Diante desses resultados observamos a importância especificamente dessas proteínas no processo tumorigênico.
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Figura 7. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL) e grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Investigamos também as proteínas da via de sinalização de crescimento celular. Observamos uma diferença na ativação e fosforilação das proteínas AKT, mTOR e p70S6K no tecido tumoral e mamário desses animais em relação aos animais controle (Figura 8).
Figura 8. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL) e
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grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB).
4.2 O Efeito da inibição do TLR2 em ratas Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta hiperlipídica tratadas com DMBA.
Com base nesses resultados, decidimos então avaliar a função do TLR2 na condição de obesidade associada à tumorigênese. Os animais submetidos à dieta hiperlipídica por 8 semanas e seus controles alimentados com ração padrão foram tratados com o antisense (ASO) - sequência de nucleotídeos bloqueadora do TLR2. Observamos que os animais desenvolveram neoplasia maligna classificada como adenocarcinoma mamário (Figura 9A e B). No entanto, os animais tratados com o inibidor de TLR2 (ASO) apresentaram uma menor incidência tumoral, tanto do grupo obeso quanto do grupo em dieta padrão, quando comparados com os animais controle. Avaliamos também o número de tumores e, da mesma forma, observamos um menor número de tumores nos animais tratados com ASO, tanto obesos quanto em ração padrão (Figura 9C e E). Ao analisarmos o crescimento destes tumores, não encontramos diferença entre os grupos, entretanto, os animais obesos e os animais alimentados com dieta padrão, tratados com ASO, apresentaram um desenvolvimento tumoral mais tardio em relação aos seus controles, apresentando uma maior sobrevida livre de tumor (Figura 9D e F).
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Figura 9. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) em ratas Sprague Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA: (A) Análise macroscópica de tumores de mama de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO). (B) Análise microscópica de tumores de mama de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO). método de coloração com Hematoxilina e Eosina (HE). (C) Incidência tumoral de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO) (D) Sobrevivência livre de tumor de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO) (F) Crescimento tumoral animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Com esses resultados, investigamos a atividade das proteínas inflamatórias da via de sinalização do TLR2 pelo método de western blot no tecido tumoral e mamário destes animais. Como esperado, pudemos notar a ausência da interação entre o receptor TLR2 e a proteína MYD88 nos animais tratados com ASO. Em relação às outras proteínas desta via, observamos uma diminuição da fosforilação de proteínas IKK e JNK no tecido tumoral e mamário sem tumor dos animais tratados com ASO, tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica. Observamos também um aumento da proteína IkBα total nos animais alimentados com ração padrão e animais obesos tratados com ASO, em relação aos animais controle (Figura 10).
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Figura 10. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL), grupo em ração padrão tratado com ASO (SD CTL ASO), grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado com ASO (SD DIO ASO). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Ao avaliar as proteínas da via de sinalização de crescimento celular, notamos uma maior ativação e fosforilação das proteínas AKT, mTOR e p70S6K no tecido tumoral e mamário em relação aos animais obesos tratados com ASO (SD DIO ASO) e em dieta padrão tratados com ASO (SD CTL ASO) (Figura 11).
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Figura 11. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL), grupo em ração padrão tratado com ASO (SD CTL ASO), grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado com ASO (SD DIO ASO). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB)
4.3 O papel do TLR2 na promoção tumoral em ratas Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta hiperlipídica tratadas com DMBA.
Para avaliar a importância do receptor TLR2 na promoção e progressão tumoral, decidimos estimular a ativação do mesmo com o agonista Zymosan (ZY) o qual ativa o receptor e as proteínas de sua via de sinalização.
Fizemos um tratamento crônico com ZY na dose de 2,5mg/kg, para que os animais desenvolvessem o mesmo perfil inflamatório de um animal obeso (Figura 12) .
Figura 12. Dose resposta do zymosan de ratas em ração padrão. Ratas SD em ração padrão foram tratadas com diferentes doses de Zymosan comparadas com um animal obeso sem tratamento (SD DIO). Avaliamos a ativação do TLR2 no tecido adiposo por immunoblot (IB).
Ao estabelecermos uma dose crônica de ZY, tratamos os animais em ração padrão e com obesidade induzida por dieta hiperlipídica diariamente após a administração do DMBA até o final do experimento.
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Sendo assim, observamos que os animais obesos e os animais alimentados com ração padrão tratados com o ZY desenvolveram adenocarcinoma mamário, assim como seus controles (Figura 13A e B). Porém, notamos que os animais tratados com o ZY apresentaram uma maior incidência tumoral, tanto do grupo obeso quanto do grupo em dieta padrão. Da mesma forma, o número de tumores nos animais tratados com ZY, tanto obesos quanto em ração padrão, foi maior do que nos animais controle (Figura 13C e E). Ao avaliarmos o crescimento destes tumores, não encontramos diferença entre os grupos, porém, os animais obesos e os animais alimentados com ração padrão, tratados com ZY, desenvolveram tumores mais precocemente. Consequentemente, os animais tratados com ZY obtiveram uma menor sobrevida livre de tumor (Figura 13D e F).
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Figura 13. Caracterização da ativação do TLR2 pelo agonista Zymosan (ZY) em ratas Sprague Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA: (A) Análise macroscópica de tumores de mama de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY). (B) Análise microscópica de tumores de mama de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY). Método de coloração com Hematoxilina e Eosina (HE). (C) Incidência tumoral de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY) (D) Sobrevivência livre de tumor de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY) (F) Crescimento tumoral animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Desta forma, fomos investigar a atividade das proteínas inflamatórias da via de sinalização do TLR2 pelo método de western blot no tecido tumoral e mamário destes animais. Observamos uma maior interação entre o receptor TLR2 e a proteína MYD88 nos animais tratados com ZY. Em relação às outras proteínas desta via, pudemos notar um aumento da fosforilação de proteínas IKK e JNK no tecido tumoral mamário sem tumor dos animais tratados com ZY tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica. Observamos também uma diminuição da proteína IkBα total nos animais alimentados com ração padrão e animais obesos tratados com ZY em relação aos animais controle (Figura 14).
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Figura 14. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL), grupo em ração padrão tratado com ZY (SD CTL ZY), grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado com ZY (SD DIO ZY). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Analisando as proteínas da via de sinalização de crescimento celular, atentamos para uma maior ativação e aumento da fosforilação nos animais obesos tratados com ZY (SD DIO ZY) e em dieta padrão (SD CTL ZY) das proteínas AKT, mTOR e p70S6K no tecido tumoral e mamário em relação aos animais obesos (SD DIO) e em dieta padrão (SD CTL) (Figura 15), sugerindo que a ativação do TLR2 pode ser um mecanismo chave em tumores de mama.
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Figura 15. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL), grupo em ração padrão tratado com ZY (SD CTL ZY), grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado com ZY (SD DIO ZY). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB)
4.4 O papel do TLR2-/- na tumorigênese associada à obesidade em camundongos -fêmea tratadas com o carcinógeno DMBA.
Com base nos resultados descritos acima, investigamos o perfil de camundongos knockout para TLR2 (TLR2-/-) no processo tumorigênico com o carcinógeno DMBA. O grupo TLR2-/- e o grupo dos animais selvagem (C57BL6), que foram alimentados com dieta hiperlipídica após completarem 8 semanas de vida, não apresentaram diferença significativa de peso corporal no período em que começaram a desenvolver tumores, possivelmente devido ao pouco tempo em dieta hiperlipídica. (Tabela 3). Porém, mesmo assim pudemos observar que alguns parâmetros metabólicos associados à obesidade, como a dosagem de insulina sérica, nossos dados mostraram um aumento significativo no grupo TLR2-/- quando comparado com o grupo C57BL6 (TABELA 3), ambos alimentados com dieta hiperlipídica. Em relação à inflamação, nossos dados demonstraram uma diminuição significativa das
62 citocinas IL-6 e TNFα nos grupos TLR2
quando comparados aos grupos C57BL6, ambos em dieta hiperlipídica e dieta padrão (TABELA 3).
Tabela 3. Caracterização de camundongos fêmea C57BL/6 e knockouts para TLR2 alimentadas com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO).
C57 CTL TLR2 CTL C57 DIO TLR2 DIO Peso corporal (g) 21 ± 1,2 22,1 ± 2,45 23,21 ± 1,19 22,4 ± 1,04 Tecido adiposo ovariano (g) 0,041 ± 1,43 0,043 ± 0,53 0,041 ± 1,48 0,05 ± 1,2 Insulina (ng/ml) 0,32 ± 0,67 0,73 ± 1,4ª 1,43 ± 1,71ª 2,40 ± 2,1ª Il-6 (ng/ml) 63,67 ± 1,26 16,75 ± 1,32ª 87,5 ± 2,7ª 38,9 ± 2,79ª TNFα (ng/ml) 34,67 ± 1,67 16,73 ± 1,2ª 42,38 ±2,8ª 22,41 ± 1,67ª
N=10 por grupo. ª P<0,05 em relação aos animais controle.
Após o tratamento com o carcinógeno DMBA, observamos a iniciação e progressão de tumores nesses animais. Na análise macroscópica e microscópica, os animais de ambos os grupos apresentaram carcinoma epidermóide moderadamente diferenciado com áreas de diferenciação basalóide (Figura 16A e B).
O grupo TLR2-/-, tanto controle quanto alimentado com dieta hiperlipídica, apresentou uma tendência à diminuição da incidência tumoral e número de tumores (Figura 16C e E). Em relação ao crescimento tumoral, nós não encontramos uma diferença significativa entre os grupos, porém pudemos observar que os grupos dos C57, tanto alimentados com dieta hiperlipídica quanto controles, apresentaram uma diferença significativa no tempo de surgimento dos tumores, de maneira que nos animais TLR2-/- o surgimento dos tumores ocorreu mais tardiamente (Figura 16D e F).
